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Immunology and Infection

Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/57171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies
* These authors contributed equally

Summary

La capsule de polysaccharide est le facteur de virulence primaire à Cryptococcus neoformans, et sa taille est corrélé avec la virulence de la souche. Mesures de diamètre capsule sont utilisées dans les tests phénotypiques et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Une méthode standard d’induction capsule est présentée ici, et on a comparé deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre.

Abstract

La capsule de polysaccharide de Cryptococcus neoformans est le facteur de virulence primaire et un des plus couramment étudié les aspects de cette levure pathogène. Taille de la capsule peut varier considérablement entre les souches, a la capacité de croître rapidement lorsque vorstellen conditions nutritives stressantes ou faibles et a été positivement corrélée avec la virulence de la souche. Pour ces raisons, la taille de la capsule est d’un grand intérêt pour les chercheurs de c. neoformans . La croissance de la capsule de c. neoformans est induite pendant le test phénotypique pour aider à comprendre les effets des différents traitements sur les différences de levure ou de taille entre les souches. Nous décrivons ici une des méthodes standards de capsule induction et comparer deux méthodes de coloration et de mesurer le diamètre de la capsule : (i) de l’encre de Chine, un colorant négatif, utilisé en conjonction avec la microscopie optique conventionnelle et (ii) coloration conjointement avec colorants fluorescents de la paroi cellulaire et capsule suivie par microscopie confocale. Enfin, nous montrons comment la mesure du diamètre capsule des échantillons colorés à l’encre de Chine peut être automatisé en utilisant l’analyse de l’image numérique.

Introduction

Affectant un quart de million de personnes chaque année et qui ont fait plus de 180 000 morts chaque année, Cryptococcus neoformans est une levure pathogène intracellulaire et l’agent causal de la cryptococcose1,2, 3. les plus durement touchées sont les patients séropositifs dans les pays pauvres qui n’ont pas facilement accès aux traitements antirétroviraux, ce qui les rend extrêmement sensibles à la maladie4,5,6. Les données de la CDC indiquent qu’en Afrique subsaharienne, c. neoformans tue plus de personnes que la tuberculose chaque année et plus chaque mois à une épidémie d’Ebola sur record1. La voie d’exposition la plus courante se produit à l’inhalation de spores desséchés qui sont monnaie courante dans l' environnement7. En entrant dans les poumons, il y a plusieurs facteurs de virulence qui contribuent au succès de c. neoformans chez les individus infectés. La capsule polysaccharidique est considérée comme facteur de virulence primaire de microbe, que capsulée souches non virulentes8.

La capsule cryptococcique se compose de trois éléments de principe : glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) et mannoprotéines (MPs)9. Alors que les députés sont une composante relativement mineure d’associée à la paroi cellulaire de la capsule, ils sont immunogènes et peuvent favoriser une réponse essentiellement pro-inflammatoire9,10. En revanche, les GXM et GalXM forment l’essentiel de la capsule (> 90 % en poids) et ont des effets immunosuppressifs11. Outre ses effets immunomodulateurs, l’élargissement rapide de la capsule en vivo crée une barrière mécanique à l’ingestion par l’hôte des cellules phagocytaires (c.-à-d., des neutrophiles et macrophages)12. La capsule de c. neoformans et sa synthèse sont complexes, mais dans l’ensemble, une augmentation de diamètre capsule est corrélée avec une virulence accrue de13,6,14. Ceci étant, il est important pour les chercheurs de c. neoformans pouvoir rapidement et précisément quantifier les mesures capsules.

La cellule c. neoformans tant sa capsule de polysaccharide sont des structures dynamiques et montrent des changements au fil du temps15. La capsule peut changer dans la densité, la taille et l’Assemblée en réponse aux changements dans l’hôte environnement16,17,18. Faible teneur en fer ou niveaux d’éléments nutritifs, exposition au sérum, le pH physiologique humain et une augmentation du CO2 sont connus pour ouvrir la capsule croissance16,18,19,20. En outre, les chercheurs ont montré des changements structurels, ce qui entraîne des différences significatives dans l’immunoréactivité lors d’une infection, prêt un avantage à c. neoformans sur son hôte21,22. Ceci est connu parce que l’architecture de la capsule de c. neoformans a été analysée dans une variété de façons. Microscopie électronique, par exemple, a révélé que la capsule a une matrice hétérogène avec une couche interne dense aux électrons sous une couche extérieure, plus perméable23. Diffusion de la lumière et l’utilisation de pinces optiques ont permis aux chercheurs d’élucider davantage ses propriétés macromoléculaires24. Analyse des résultats de ces deux mesures de diffusion de la lumière statique et dynamique, nous savons que la capsule polyosidique a un complexe de la structure ramification23. Des pinces optiques ont été utilisés pour tester la rigidité de la structure mais aussi à évaluer son anticorps réactivité24. Cependant, l’analyse de loin le plus souvent indépendants de la capsule de c. neoformans est la mesure de sa taille.

Afin de quantifier la taille de la capsule, les chercheurs utilisent ce que devrait être une mesure simple : le diamètre linéaire de la capsule. Microscopes numériques sont utilisées pour capturer des images de plusieurs cellules de c. neoformans (généralement des centaines) colorés avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents. La taille de chaque corps cellulaire et de la capsule environnante est mesurée. Les données sont compilées, et le diamètre moyen de la capsule est calculé en soustrayant le diamètre du corps cellulaire du diamètre à germes entiers (corps cellulaire + capsule). Jusqu'à présent, ces mesures ont été faites manuellement. Bien que généralement exacte, cette méthode a des inconvénients pour les chercheurs. Ensembles de données volumineux peut prendre des jours ou même des semaines pour analyser à la main. Et parce que ces mesures sont effectuées manuellement, la subjectivité et l’erreur humaine peuvent affecter le résultat.

Analyse d’image informatique automatisé est devenu un outil indispensable pour les chercheurs dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et moléculaire, permettant une analyse plus rapide et plus fiable des images biologiques 25,26,27. Techniques d’analyse précise de l’image sont nécessaires pour extraire des informations quantitatives de ce qui sont souvent des ensembles de données complexes et immenses. Toutefois, certaines mesures, notamment la mesure de la capsule de c. neoformans , été difficiles à automatiser. Identifier avec précision l’interface entre la paroi cellulaire et de la capsule, qui apparaît généralement comme un anneau sombre lorsqu’imagée par microscopie à contraste de phase, peut être gênante résoudre à l’aide d’un simple seuil. En outre, les cellules en culture de c. neoformans ont tendance à s’agglomérer et segmentation précise des cellules est nécessaire pour des mesures précises.

Ce projet vise à (i) illustrent un des protocoles standards pour capsule induction dans c. neoformans, (ii) comparer et contraster l’encre de Chine et coloration de fluorescence en ce qui concerne pour capsule mesures de diamètre, (iii) développer simple, méthodes de calcul pour mesurer le diamètre capsule à l’aide d’images d’encre teinté de cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse image et, (iv) évaluent les avantages et les limites de mesure diamètre capsule manuellement et à l’aide d’automation de logiciel. Nous conclure que les deux méthodes de coloration, fluorescent d’étiquetage de la paroi cellulaire et de la capsule, alors que plus de temps, a fourni les résultats les plus cohérents entre les expériences. Toutefois, les deux méthodes nous a permis de distinguer avec succès entre le laboratoire et clinique c. neoformans souches présentant différents capsule tailles. En outre, nous avons pu automatiser la mesure du diamètre capsule de l’encre de Chine coloré des images et trouvé que c’était une alternative viable à la mesure manuelle de la capsule.

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Protocol

Remarque : C. neoformans est un pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et les chercheurs qui travaillent avec elle doivent prendre des précautions appropriées. Des procédures détaillées sur comment à en toute sécurité travail avec BSL-2 pathogènes se trouvent sur le Center for Disease Control (CDC), site Web, mais il est important de noter que toutes les personnes entrant en contact avec c. neoformans soient correctement formés à la manipulation agents pathogènes et doivent toujours porter approprié équipement de protection individuelle (EPI), généralement au latex ou des gants en nitrile. En outre, rotors sur les centrifugeuses doivent être étanches pour empêcher l’aérosolisation des échantillons et les renversements nettoyés immédiatement à l’aide d’une solution de 10 % de Javel28.

1. capsule Induction

Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées à la température ambiante à moins d’indication contraire.

  1. La culture de c. neoformans dans un bouillon de dextrose (DPJ) levure peptone (pH 6.5 +/-0,2) et incuber à 37 ° C sous agitation, jusqu'à ce qu’ils soient en phase logarithmique (environ 18-36 h).
  2. Centrifuger à 870 x g pendant 5 min à 21 ° C, les cellules et laver trois fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
  3. Utilisez un hémocytomètre (ou un compteur de cellules automatisées) pour compter les cellules et remettre en suspension à 2 x 105 cellules/2 mL dans les milieu essentiels minimal de Dulbecco (DMEM).
  4. Pour induire la capsule, incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 18 h.
    Remarque : La combinaison de l’absence d’éléments nutritifs dans les médias et la présence de CO2 stimule la croissance de capsule de c. neoformans .
  5. Après incubation, récolter les cellules par centrifugation (comme ci-dessus) et en enlevant tout sauf 5 à 10 µL surnageant. Dans le même temps, récolter un échantillon non-induite de cellules correspondant pour chaque souche à mesurer. Utilisez-les comme témoins négatifs.
    Remarque : Les boulettes de cellule seront très faible et peuvent être difficiles à voir. Soyez prudent lors de l’aspiration du liquide surnageant.
  6. Coloration à l’encre de Chine (Section 2.1) ou des colorants fluorescents (Section 2.2).

2. la coloration

  1. Coloration à l’encre de Chine seulement
    1. Pour souiller la levure avec l’encre de Chine, resuspendre le culot dans le surnageant restant et ajouter 4μL (environ la moitié) de la suspension cellulaire et 4μL d’encre sur une lame de microscope de verre. Doucement, mélanger et éviter la formation de mousse.
    2. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.
  2. Coloration avec uniquement des colorants fluorescents
    1. Pour souiller la levure avec un colorant fluorescent, resuspendre le culot dans 50 µL PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
    2. Incuber la culture avec un volume égal de Calcofluor blanc (CFW) (1 µg/mL) et 18B7 capsule mAb (voir Table des matières) conjugué à la AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) pendant 30 min à 37 ° C.
    3. Centrifuger à 870 x g pendant 5 min à 21 ° C après incubation des cellules et aspirer le surnageant.
    4. Resuspendre le culot dans 10 µL de PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).
    5. Distribuer 8 µL de suspension cellulaire sur une lame de microscope de verre.
    6. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.
  3. La coloration à l’encre de Chine et colorants fluorescents
    1. Pour comparer plus directement l’efficacité de l’encre de Chine de coloration à celle des colorants fluorescents, co tacher la même population de cellules avec les deux types de taches. Pour ce faire, tout d’abord Incuber les cellules avec une capsule fluorescent et teinté de paroi cellulaire, comme par les Etapes 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Ensuite, distribuer des quantités égales (4 µL) de la suspension cellulaire fluorescent tachées et encre de Chine sur une lame de verre. Mélanger doucement.
    3. Appliquez une lamelle de verre 13 mm (épaisseur 1.5) et sceller les bords avec un produit d’étanchéité non toxique (vernis à ongles transparent) pour empêcher l’échantillon ne se dessèchent pas.

3. image Acquisition/microscopie

  1. Imagerie de cellules colorées avec l’encre de Chine.
    1. Acquisition d’images à l’aide d’un microscope optique standard (grossissement de X 100).
    2. Un minimum de 50 cellules / état de l’image.
      Remarque : Le nombre de cellules par champ variera, et cela est acceptable. Il est important, cependant, les cellules de ce chevauchement être réduites au minimum, car ceux-ci sont difficiles à mesurer (manuellement ou avec un logiciel automatisé). Pour ces expériences, les images ont été acquises à une profondeur de 16 bits avec des durées d’exposition optimisées pour maximiser le contraste de l’image tout en réduisant le flou causé par les petits mouvements des cellules.
  2. Imagerie de cellules colorées avec les colorants fluorescents
    1. Pour les cellules d’images en microscopie à fluorescence, ouvrez le microscope logiciel d’imagerie et sélectionnez les approprié longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour les fluorophores utilisés (CFW et AF488 sont excités à l’aide de la 405nm et 488 nm lumières, respectivement). Acquisition d’images à l’aide d’un microscope à fluorescence.
    2. Un minimum de 50 cellules / état de l’image.
      Remarque : Le nombre de cellules par champ variera, et cela est acceptable. Il est important, cependant, les cellules de ce chevauchement être réduites au minimum, car ceux-ci sont difficiles à mesurer (manuellement ou avec un logiciel automatisé).
    3. Acquérir une série d’image z-pile des cellules pour s’assurer que le diamètre maximal de capsule pour chaque cellule dans un domaine donné.
      1. Dans le logiciel de contrôle de microscope, cliquez sur la barre de « z-pile » pour ouvrir le panneau de configuration « z-pile », puis sélectionnez l’option « Première/dernière » dans le coin supérieur gauche du panneau.
      2. Utilisez le contrôle de l’amende-focus sur le microscope se concentrer à un niveau qui est en dessous du point le plus large d’une cellule de levure simple et les capsules pour tous dans la champ de vue actuel, puis cliquez sur « Définir d’abord ».
      3. Utilisez le contrôle de la mise au point fine pour discussion au-dessus du point le plus large du corps cellulaire de la même cellule et de la capsule pour toutes les cellules dans le champ de vue actuel et cliquez sur « Set ».
      4. Puis, cliquez sur « Commencer l’expérience » sur l’onglet « Acquisition » d’acquérir la z-pile pour la position actuelle. Répétez le processus à plusieurs positions jusqu'à ce que z-empiler les images d’un minimum de 50 cases ont été acquis.
        Remarque : Pour ces expériences, le trou d’épingle confocal était égale à 1.0 UA et un z-series qui se chevauchent de 10 à 20 tranches couvrant 0,7 µM de chaque ont été acquises à la position souhaitée. UA = unité aérée.
    4. Ensuite, convertissez chaque série z-pile dans les projections de l’intensité maximale (MIP) à l’aide de logiciels d’analyse image appropriée.
      NOTE : MIPs du projet la plus grande intensité à chaque plan de l' image empilées29. Création de MIPs permet de produire une représentation 2D des images qui correspondent à la cellule maximale et la capsule diamètre dans la pile 3D capturée.
  3. Imagerie de cellules colorées avec l’encre de Chine et colorants fluorescents
    1. Acquisition d’images avec un microscope confocal widefield (grossissement de 40 X) ou (63 X ou à grossissement X 100). Pour cellules colorées avec l’encre de Chine et colorants fluorescents, capturer des images à l’aide d’un microscope widefield avec une scène contrôlée par ordinateur et un objectif à immersion d’huile.
      Remarque : Le microscope utilisé doit être contrôlé à l’aide d’un logiciel d’imagerie CFW. fluorescence qui est excité par un filtre d’excitation de 340-380 nm et émis lumière devrait être détecté à travers un filtre de barrière 435-485 nm réfléchi par un miroir dichroïque 400 nm. AF488 fluorescence peut être excité à travers un filtre d’excitation 465-495 nm, et la lumière émise peut être détectée par un filtre de barrière 515-555 nm réfléchi par un miroir dichroïque 505 nm.
    2. Un minimum de 50 cellules / condition pour chaque méthode de coloration de l’image.

4. Manuel mesure de Capsule

  1. Pour les cellules colorées avec l’encre de Chine ou taches fluorescentes, utiliser un logiciel de mesure portable manuellement mesure capsule et cellule de diamètre (voir Table des matières). Pour ce faire, allez dans « Fichier » > « Ouvrir l’Image » > « Mesure » et utiliser le curseur pour dessiner une ligne droite passant par le point le plus large de la cellule entière (diamètre total).
  2. Ensuite, cliquez de nouveau sur « Mesure » et dessiner une ligne droite à travers le corps de la cellule (diamètre de corps de la cellule).
    Remarque : Les mesures sont auto-enregistrés sur les cellules.
  3. Répétez ce processus pour toutes les cellules (minimum de 50/groupe).
  4. Pour sauvegarder les images une fois qu’ils sont mesurés, cliquez sur « Fichier » > « Enregistrer sous » et de nommer les images correctement.
  5. Sélectionnez les fichiers nouvellement mesurés et exporter des données vers un tableur.
  6. Calculer le diamètre moyen de capsule à l’aide de l’équation : ([Diamètre total] - [diamètre corps cellulaire]).

5. automatisé de mesure de la Capsule

Remarque : Pour la mesure automatisée avec succès, utilisez des images 16 bits avec un haut niveau de contraste et qui portent bien avec un logiciel d’analyse image approprié (voir la Table des matières). Lorsque c. neoformans d’imagerie pour la mesure de capsule, il est important de se concentrer sur l’anneau sombre à la limite entre la paroi cellulaire et de la capsule. Cela permet au logiciel de délimiter correctement la cellule et la capsule.

  1. Inverser et créer une copie d’encre toutes colorées des images de cellules à l’aide d’un logiciel de retouche d’image approprié (voir la Table des matières). Pour ce faire, cliquez sur « Fichier » > « Ouvrir » pour ouvrir l’encre de Chine coloré des images et puis « Control » + « I » pour inverser l’image. Cliquez sur « Fichier » > « Enregistrer sous » pour enregistrer l’image inversée.
  2. Pour importer l’original et inversé les images dans le logiciel cliquez sur « Fichier » > « Importer la séquence » > « Load Image » > « Définir des séquences (manuellement) » > « Dimensions (canal) » > « Importer » > « Appliquer ».
    Remarque : Les corps cellulaires c. neoformans et les capsules peuvent être identifiés et masqués à l’aide d’algorithmes spécifiques - dénommés « recettes » - inclus dans le logiciel.
  3. Utilisez la recette de la « Colonie Analyzer (Fluorescence) » sur l’image inversée de détecter et de masquer le corps cellulaire, puis cliquez sur « appliquer ». Dans l’image inversée, l’anneau sombre définissant la limite de la cellule c. neoformans devient plus lumineux que la capsule environnante.
  4. Utilisez la recette de la « Colonie Analyzer (Fluorescence) » sur l’image inversée pour segmenter les corps cellulaires de c. neoformans de leurs capsules, puis cliquez sur « appliquer ». Cela crée un masque de comte. Renommez ce masque comte « Corps cellulaire » par un clic droit sur l’onglet « masque de comte ».
    NOTE : La recette se compose de plusieurs étapes de traitement d’image : suppression, détection d’objet, séparation de l’objet et le filtrage de sous-ensemble de fond.
  5. Ensuite, utilisez la recette de « La prolifération des cellules » sur l’image d’origine pour détecter et masquer la capsule et cliquez sur « appliquer ». Cela crée un masque de comte. Renommez ce masque comte « Capsule » en cliquant droit sur l’onglet « masque de comte ».
  6. À l’aide de la recette, « Capsule Partition », créez un nouveau masque sur l’image originale pour partitionner des capsules adjacents l’un de l’autre. Pour ce faire, cliquez sur « Capsule Partition » dans le menu déroulant de recette. Dans la boîte de Partition de Capsule, choisissez le masque du comte rebaptisé « Capsule » (5.5) pour la région de la Capsule. Choisir le masque du comte rebaptisé « Corps cellulaire » pour les cellules de Crypto (5.4). Choisissez « Original » pour le canal d’entrée et « Create Mask pour Capsule partitionné. Cliquez sur « appliquer
    NOTE : La recette génère des cellules et diamètre capsule, définie comme la moyenne des plus longues et la plus courtes axes traversant le centre de la cellule et la capsule et les mesures de surface des masques de détection. Trouver la sortie qui se trouve sous l’onglet de la feuille de calcul dans ce logiciel. Répétez ce processus pour toutes les images (minimum de 50 cellules/groupe). Paramètres de la recette pourraient être à l’écoute afin d’optimiser la détection des images individuelles ou optimisés pour la détection par lots de plusieurs images. Mesures supplémentaires peuvent être calculées par la recette pour la caractérisation complète de la cellule et la morphologie de la capsule.
  7. Exporter des données vers un tableur de choix pour une analyse ultérieure.

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Representative Results

Pour illustrer la capsule induction, coloration de la cellule, imagerie et techniques de mesure, nous avons utilisé trois souches de c. neoformans : souche le laboratoire commun, bien caractérisé, H99S30, ainsi que deux souches isolées sur le plan clinique de précédemment diamètre capsule inconnue, B18 et B5231.

Le workflow de capsule induction, coloration et acquisition d’images à l’aide de l’encre de Chine est montré dans la Figure 1 a. Images tirées de trois souches sont indiquées dans la Figure 1 b avant et après induction. Le chercheur saura si l’induction capsule a été un succès en comparant les cellules qui ont subi une capsule induction à ceux de la même culture que n’ont pas. Une augmentation de taille de claire est généralement après induction de la plupart des souches, bien que certaines souches exposera naturellement petites capsules même après induction (Voir images de B18 dans la Figure 1 b). Il est à noter que capsule induction échoue si richmedia résiduelle n’est pas retiré avant induction ou CO2 n’est pas présent. Dans ces cas, on remarquera les augmentations modestes (le cas échéant) dans la taille de la capsule. Diamètres de toutes les trois souches ont été mesurées manuellement et les résultats sont illustrés dans la Figure 1. Dans deux des trois expériences, il n’y avait aucune différence de taille entre H99S et B18. Toutefois, une différence significative dans la taille a été constamment observée entre la souche plus grande, B52 et H99S et B18 (p < 0,001 et p < 0,001, respectivement, des places moins standards test avec contrastes simples, taille de l’échantillon = 50 cellules/souche ).

Figure 2 a représente le flux de travail de la capsule induction, coloration et acquisition d’images à l’aide de deux colorants fluorescents, un pour la capsule (18B7-AF488) et l’autre de la paroi cellulaire (Calcofluor White). Des images ont été capturés comme z-piles pour tous les trois souches après induction, veiller à ce que le diamètre maximal de la capsule et le corps cellulaire a été capturé pour chaque cellule à mesurer (Figure 2 b). Chaque pile-z ont été traitée pour produire des projections de l’intensité maximale, comprimant la pile 3-dimensionnelle en une image 2D avant l’analyse (Figure 2). Ceux-ci étaient ensuite mesurés manuellement (Figure 2D). À la différence des mesures pour l’encre de Chine teinté de cellules, le fluorescent coloration activé nous d’établir une discrimination entre les trois souches sur la base de leur capsule diamètre dans les trois répétitions de l’expérience. Ici, nous avons constaté que B18 avait le plus petit diamètre capsule et B52 le plus important (p < 0,001 pour toutes les comparaisons, test standard des moindres carrés avec des effets simples, taille de l’échantillon = 50 cellules/souche).

Pour évaluer plus précisément les deux méthodes de coloration capsule c. neoformans , mesures de toutes les trois souches ont été comparées. Il n’y avait aucune différence significative entre les tailles capsules déterminé en utilisant les deux méthodes de coloration (Figure 3 a) (analyse de la variance multivariée avec effets simples, taille de l’échantillon = 50 cellules/souche). Cette conclusion est conforme aux résultats d’une autre expérience où la souche de laboratoire, H99S, a été conjointement colorée avec l’encre de Chine et des colorants fluorescents (Figure 3 b-C). Cependant, il y avait une plus grande variabilité entre les expériences utilisant l’encre de Chine, comme en témoigne le fait que seul un des trois expériences ont montré une différence significative dans la taille de la capsule entre H99S et B18, par rapport à la différence significative observée entre ces souches et tous les trois expériences de fluorescence (Figure3D-E) (analyse de la variance multivariée avec effets simples, taille de l’échantillon = 50 cellules/souche).

L’encre de Chine coloré des images qui répondent aux critères énumérés dans le protocole (article 5) peut être mesurée à l’aide d’un système automatisé. Le workflow illustré à la Figure 4 a guides l’utilisateur à travers les étapes nécessaires pour utiliser les recettes conçues pour mesurer la capsule c. neoformans . Après avoir développé le flux de travail, elle a été validée en mesurant un cache d’images existantes des cellules de c. neoformans par trois chercheurs qui utilisent des méthodes manuelles et automatisées. Il n’y a aucune différence significative entre les mesures du chercheur lorsque faite manuellement, et cela est également vrai lorsque les mesures ont été effectuées à l’aide de logiciels d’analyse automatique d’image (Figure 4 b) (analyse de la variance, taille de l’échantillon = 50 cellules/chercheur). Cependant, il y avait une petite mais une différence significative dans la taille de la capsule signalée entre les deux méthodes (Figure 4) ANOVA, taille de l’échantillon = 150 cellules/groupe. Diamètre de la capsule a été constamment légèrement plus petite lorsqu’elle est mesurée via automation que mesures manuelles (0,3 µm, p < 0,001). En outre, lors de la comparaison entre les mesures de taille capsule faites par des chercheurs distincts de l’ensembles d’images même, l’écart-type était plus faible lorsque le logiciel d’analyse image a été utilisée pour la quantification au lieu des méthodes manuelles, qui est suggestif de plus mesures précises et reproductibles à l’aide de la méthode automatisée. Pour la mesure automatisée réussie, cellules doivent être mise au point, ont une moyenne à grande capsule et ne pas être trop en cluster (Figure 4). Nous avons constaté que des images mal ciblées des cellules en cluster avec des petites capsules ne pouvant être automatiquement mesurés dans le logiciel. Cependant, nous affirmons que ceux-ci soient difficiles à mesurer avec précision à l’aide de méthodes manuelles.

Figure 1
Figure 1 : Coloration pour mesurer l’encre de Chine C. neoformans capsule. (A) Représentation schématique de c. neoformans capsule mesure par coloration de l’encre de Chine. En bref, capsule expression est induite à l’aide de privation en éléments nutritifs et l’exposition au CO2, les cellules sont remises en suspension dans l’encre de Chine et montés sur lames de verre. Images de cellules colorées sont acquises par microscopie photonique, avec des champs que soit sélectionnée par l’utilisateur ou par tuile-numérisation à l’aide d’une étape contrôlée par ordinateur. Des images peuvent être analysés manuellement ou transformées pour la segmentation d’images automatisée et l’analyse. (B) des Images de la souche commune de laboratoire, de H99S et de deux souches cliniques, B18 et B52, pre- et post-capsule induction. Barres d’échelle représentent 10 µm (C) graphique d’un représentant expérimenter diamètre capsule montrant toutes les trois souches colorés à l’encre de Chine et mesuré manuellement (erreur est représentée comme une erreur-type (et)). Signification statistique est indiquée comme suit : *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; et ***, p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Coloration fluorescente pour mesurer C. neoformans capsule. (A) Représentation schématique de c. neoformans capsule mesure par Calcofluor blanc (CFW) et 18B7-AF488 co coloration. Après l’induction de la capsule et coloration, les cellules sont montées et imagés par microscopie confocale à balayage laser. Les cellules peuvent être dans différents plans focaux, z-piles sont acquis dans chaque position. Elles sont traitées pour produire des projections d’intensité maximale qui peuvent être utilisées pour mesurer avec précision le diamètre maximal de capsule pour chaque cellule. (B) Images de la souche commune de laboratoire, de H99S et de deux souches cliniques, B18 et B52, capsule après induction. Remarque : Les barres d’échelle représentent 10 µm pour toutes les images. (C) Maximum projections d’intensité de fluorescent étiquetés c. neoformans cellules. (D) Graphique d’une expérience représentative montrant manuellement mesuré le diamètre capsule toutes les trois souches colorées avec le CFW et 18B7-AF488 (erreur est représentée comme une erreur-type (et)). Signification statistique est indiquée comme suit : *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; et ***, p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des résultats entre l’encre de Chine et coloration fluorescente. (A) analyse des trois souches de c. neoformans colorés à l’encre de Chine ou des colorants fluorescents, n = 3 (erreur est représentée comme une erreur-type (et)). (B) des Images d’une seule cellule c. neoformans colorés à l’encre de Chine et les deux colorants fluorescents (barre d’échelle représente 13 µm). Lignes horizontales délimitent les bords de la capsule et lignes verticales délimitent les bords du corps cellulaire. Quantification (C) d’une expérience représentative de H99S co coloré avec l’encre de Chine et des colorants fluorescents (erreur est représentée comme une erreur-type (et)). (D, E) Représentation de la variabilité de la capsule de diamètre entre les expériences de l’encre de Chine (D) et les expériences fluorescents (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse computationnelle de C. neoformans capsule diamètre des images d’encre teinté cellules. (A) Représentation schématique de la segmentation d’images et de c. neoformans mesure capsule à l’aide d’une technique de mesure automatisée (voir Table des matières). (B) Comparaison de capsules mesures effectuées par 3 chercheurs distincts à l’aide de manuel (Manual 1-3) et des méthodes automatisées (Automated 1-3). Chaque chercheur utilisé un cache identique de c. neoformans images par les deux méthodes (erreur est représenté comme StDev). (C) combinée moyenne des mesures manuelles et des mesures automatisées (erreur est représentée comme une erreur-type (et)). Exemples de deux idéal (D) et images non idéal (E) de c. neoformans. Des images non-idéal ne peuvent être mesurés avec succès dans le logiciel. Signification statistique est indiquée comme suit : *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; et ***, p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pendant des décennies, la capsule a été un élément majeur de la recherche pour les mycologues et les cliniciens intéressés par c. neoformans et cryptococcose en raison de son rôle comme un facteur de virulence important pour l’agent pathogène. En utilisant la microscopie à mesurer les différences dans la taille de la capsule entre les souches et en vertu de la croissance de différente conditions peuvent fournir des informations importantes concernant l’agent pathogène et ses réponses aux divers stimuli (c.-à-d., des conditions environnementales différentes, les traitements médicamenteux possibles, etc.) ici, nous avons défini une méthode pour induire la croissance de la capsule dans c. neoformans, et contre deux autres capsules protocoles de coloration. Enfin, nous avons montré comment image analyse logiciel peut être utilisé pour automatiser la mesure du diamètre capsule d’images d’encre colorées des cellules, des résultats qui étaient comparables aux méthodes de mesure manuelle.

Dans nos expériences, nous avons comparé deux souches cliniques, B18 et B52, avec H99S, une souche de laboratoire standard de taille connue de capsule18. Les deux taches méthodes ont montré que la souche clinique, B52, a eu le plus grand diamètre capsule des trois souches testées. Toutefois, les résultats de mesures fluorescents étaient capables de discerner une différence entre les deux souches avec capsule plus petite où l’encre de Chine des mesures n’étaient pas. Les résultats de ces deux méthodes de coloration étaient conformes, ce qui suggère que les deux sont valides, mais que l’utilisation d’images de fluorescent tachée c. neoformans peut permettre une sensibilité accrue à la mesure des souches avec la petite capsule. L’utilisation maximums générés à partir des images de z-pile de fluorescent cellules colorées permet aux chercheurs de s’assurer que des mesures précises de diamètre capsule peuvent être faites même lorsque les cellules imagés sont dans différents plans focaux. Ces mesures sont plus difficiles pour c. neoformans imagés à l’aide de l’encre de Chine et de la microscopie optique standard. Dans n’importe quelle image donnée, des cellules adjacentes peuvent siéger en légèrement différents plans focaux, rendant difficile à régler avec précision la limite de la capsule-corps de cellule pour toutes les cellules. Cela pourrait éventuellement confondre la capacité des chercheurs à détecter les petits changements dans la taille de la capsule ou de petites différences entre les souches.

Chaque méthode a ses propres avantages inhérents. L’encre de Chine est le plus couramment utilisé par les chercheurs en raison de son accessibilité, facilité d’utilisation et de la stabilité (il ne se dégrade au fil du temps comme certaines taches fluorescentes peuvent). Parce que l’encre de Chine est une tache simple, négative, qu'il peut être utilisé en conjonction avec des microscopes de lumière standards, qui sont plus facilement disponibles que les microscopes fluorescents. Cependant, si ne pas utilisé dans les proportions correctes (India Ink : buffer), la tache peut créer un fond « plumeux » lorsque l’image, qui peut compliquer l’analyse d’images automatisée. Bien que long et plus coûteux à utiliser, colorants fluorescents peuvent être avantageuses pour leur flexibilité, et comme nous le montrent, leur sensibilité. Ils sont particulièrement utiles pour la mesure de la capsule fardeau de taille et de la cellule dans les expériences impliquant c. neoformans ont été phagocytés par les cellules immunitaires et qui sont nécessaires pour l’examen histologique de la capsule, c. neoformans dans des échantillons de tissu (une technique ne sont ne pas décrite dans cet article)32. Si la coloration avec des colorants fluorescents, tels que le calcofluor blanc ou anticorps fluorescent étiqueté anti-GXM, pose problème (par exemple, coloration insuffisante), cela peut généralement être surmonté en optimisant le protocole de coloration (augmentation/réduction de la fois la concentration et/ou d’incubation avec le colorant).

Quelle que soit la méthode de coloration, nous trouvons que la capsule induction et capture d’image appropriée sont des étapes cruciales dans le protocole. Le protocole décrit dans le présent document est une des nombreuses méthodes standards pour l’induction capsule dans c. neoformans et a été utilisé avec succès dans les laboratoires de la levure pour plusieurs années23. C. neoformans capsule induction est CO2-dépendants et ne se produit que dans des conditions stressantes23,,33. Par conséquent, il est essentiel qu’elle se produit dans une étuve à2 CO 5 % utilisant un milieu de croissance déficiente en nutriments appropriés. Si l'on soupçonne cette capsule n’a pas été amené après une période standard d’incubation (en général 18 à 24 heures), les cellules doivent être comparées à une culture de contrôle non induits qui n’était pas exposée à des conditions stressantes. En comparant les deux déterminera si l’induction était efficace. Une induction réussie est un dans lequel la majorité des cellules font une capsule plus grande, par rapport au contrôle non induit. Parce que pas toutes les cellules vont entraîner, les cellules à mesurer doivent être une représentation hétérogène des cellules disponibles.

L’importance de l’acquisition de l’image cohérente ne peut être surestimée, surtout si la mesure automatisée est l’objectif. Mise au point, contraste, fluorescence de fond, ainsi que la profondeur de bit et compression d’image des fichiers est toutes importantes considérations. Lorsque cela est possible, grands amas de cellules qui ne siègent pas dans un seul plan focal devraient être évitées, bien que certains en herbe et toucher les cellules sont acceptables et peuvent être inévitables (cette règle doit être suivie pour les manuels et automatiques de mesure). Ce problème peut être contourné dans une certaine mesure, lorsqu’elle est à l’aide d’imagerie confocale de fluorescent colorée des cellules. L’utilisation de z-piles pour produire des projections de l’intensité maximale permet une mesure précise des cellules dans les différents plans focaux d’une seule image29. En outre, les images devraient être acquises rapidement après préparation de l’échantillon. Cela est particulièrement important pour l’encre de Chine teinté échantillons que lorsqu’ils commencent à sécher, le contraste entre les éléments d’arrière-plan et de premier plan (les cellules) peut diminuer et caractéristiques fond indésirable peuvent encore être améliorés, ce qui conduit à réduite automatisé précision de la segmentation.

Bien que les mesures de diamètre capsule sont monnaie courante dans la communauté de c. neoformans , jusqu'à ce point qu’ils sont généralement réalisées manuellement, qui exige beaucoup de temps et de main-d'oeuvre. Cependant, mesures manuelles sont acceptés dans le domaine et les résultats peuvent être obtenus à peu de frais. Avancements dans le logiciel d’analyse image ont permis de faire les premiers pas vers l’automatisation de ces mesures. La nature simple de corps cellulaire c. neoformans et capsule - apparaissant comme un cercle inscrit dans un cercle - en images 2D fait la mesure de leurs tailles relativement simple pour les packages de logiciels de segmentation automatique d’image, sans la nécessité d’élaborer de nouveaux algorithmes. Au lieu de cela, en reliant les algorithmes existants, capsules et cellules de c. neoformans peuvent être détectés, segmentés et mesurées. En utilisant cette approche, nous avons automatisé les mesures du diamètre capsule c. neoformans de cellules colorées avec les plus couramment utilisé capsule colorant, l’encre de Chine et ont comparé ces mesures manuelles pour les mêmes ensembles de données. Cette méthode offre l’avantage de la reproductibilité et supprimer une grande partie de l’erreur humaine associée à une mesure manuelle tout en économisant le temps du chercheur. En outre, des mesures additionnelles peuvent être incorporés avec un minimum d’effort dans le flux de travail analyse automatisée. Nous estimons que l’analyse d’images automatisée est une approche prometteuse qui permet aux chercheurs de mesurer un grand nombre de c. neoformans capsule avec un degré élevé d’exactitude et d’efficacité.

Dans l’ensemble, nous avons démontré comment avec succès induire la croissance capsule c. neoformans, détachant les échantillons avec l’encre de Chine ou colorants fluorescents et mesurez le diamètre capsule à l’aide de mesures manuelles et automatisées dans une analyse de l’image logiciel. Nos résultats suggèrent que les deux méthodes de coloration sont viables et produisent généralement des résultats cohérents (bien qu’il n’y a plus de variabilité avec les mesures de l’encre de Chine). En outre, les méthodes manuelles et automatiques de mesure ont la capacité de discerner les différentes tailles de capsules.

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Disclosures

L’auteur, Hoyin Lai, est le chef de produit chez connaissance qui édite le logiciel d’analyse automatique d’image, Aivia.

Acknowledgments

Nous remercions le programme doctoral de Biosciences moléculaires (MOBI) et le département de biologie à Middle Tennessee State University (MTSU) pour assurer le financement de cette étude. Le projet est également financé en partie par une subvention de projets spéciaux à recevoir par la Fondation MTSU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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References

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Immunologie numéro 132 Cryptococcus Neoformans Capsule Virulence Pattern Recognition analyse d’Image Automated Analysis levure
Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à <em>Cryptococcus neoformans</em>
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Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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