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Immunology and Infection

Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/57171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies
* These authors contributed equally

Summary

La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.

Abstract

La cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans es el factor de virulencia principal y uno de los más comúnmente estudiados aspectos de esta levadura patógena. Tamaño de la cápsula puede variar ampliamente entre cepas, tiene la capacidad de crecer rápidamente cuando introdujo a estrés o bajo condiciones de nutrientes y se ha correlacionado positivamente con la virulencia de la cepa. Por estas razones, el tamaño de la cápsula es de gran interés para los investigadores de C. neoformans . El crecimiento de la cápsula de C. neoformans es inducido durante la prueba fenotípica para ayudar a comprender los efectos de diferentes tratamientos sobre las diferencias entre cepas de levadura o el tamaño. Aquí describimos uno de los métodos estándar de cápsula inducción y comparar dos métodos aceptados de coloración y diámetro de la cápsula de medición: tinta de la India (i), una tinción negativa, utilizado conjuntamente con microscopía óptica convencional y (ii) Co la coloración con tintes fluorescentes de la pared celular y cápsula seguido por microscopia confocal. Por último, os mostramos cómo medida de diámetro cápsula de muestras manchadas de tinta de la India puede ser automatizado usando análisis de imagen Computacional.

Introduction

Afectando a un cuarto de millón de personas cada año y resultando en más de 180.000 muertes al año, Cryptococcus neoformans es una levadura patógena, intracelular y el agente causante de la criptococosis1,2, 3. más afectados son los pacientes VIH-positivos en los países pobres que no tienen acceso a tratamiento antirretroviral, lo que los hace muy susceptibles a la enfermedad4,5,6. Datos de los CDC indican que en el África subsahariana, C. neoformans mata más personas que la tuberculosis anualmente más cada mes y que cualquier brote de Ébola en el registro1. La vía más común de exposición ocurre por inhalación de esporas desecadas que son comunes en el medio ambiente7. Al entrar en los pulmones, hay varios factores de virulencia que contribuyen al éxito de C. neoformans en los individuos infectados. La cápsula de polisacárido se considera factor de virulencia principal del microbio, como acapsular cepas no virulentas8.

La cápsula de Cryptococcus se compone de tres componentes del principio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) y manoproteínas (MPs)9. Mientras que los diputados son un componente relativamente de menor importancia asociada a la pared celular de la cápsula, son inmunogénicos y pueden promover una respuesta sobre todo pro-inflamatoria9,10. Por el contrario, GXM y GalXM conforman la mayor parte de la cápsula (> 90% en peso) y tienen efectos inmunosupresores11. Además de sus efectos inmunomoduladores, la ampliación rápida de la cápsula en vivo crea una barrera mecánica a la ingestión por las células fagocíticas (es decir, neutrófilos y macrófagos) del anfitrión12. La cápsula de C. neoformans y la síntesis son complejas, pero en general, mayor diámetro cápsula se correlaciona con mayor virulencia6,13,14. Ante esto, es importante para los investigadores de C. neoformans ser capaces de forma rápida y precisa cuantificar las mediciones de la cápsulas.

Las células de C. neoformans y su cápsula de polisacáridos son estructuras dinámicas y muestran cambios en tiempo15. La cápsula puede cambiar en densidad, tamaño y montaje en respuesta a cambios en el entorno de host16,17,18. Hierro bajo o los niveles de nutrientes, exposición al suero, el pH fisiológico humano y aumento de CO2 se saben que iniciar crecimiento cápsula16,18,19,20. Además, los investigadores han demostrado cambios estructurales dando como resultado diferencias significativas en el immunoreactivity durante una infección, una ventaja a C. neoformans sobre su huésped los préstamos21,22. Esto se conoce porque la arquitectura de la cápsula de C. neoformans ha sido analizada en una variedad de maneras. Por ejemplo, microscopía electrónica, ha revelado que la cápsula tiene una matriz heterogénea con una capa interna de electrón-densos debajo de una capa externa, más permeable23. Dispersión de la luz y el uso de pinzas ópticas han permitido a los investigadores aclarar más lejos sus características macromoleculares24. Analizar los resultados de ambas mediciones de la dispersión ligera estática y dinámica, sabemos que la cápsula de polisacárido tiene una compleja ramificación de la estructura23. Pinza óptica se han utilizado para probar la rigidez de la estructura así como evaluar su reactividad anticuerpo del24. Sin embargo, el más frecuentemente empleado análisis de la cápsula de C. neoformans es la medida de su tamaño.

Para cuantificar el tamaño de la cápsula, los investigadores utilizan lo que debería ser una medida simple: el diámetro lineal de la cápsula. Microscopios digitales se utilizan para capturar imágenes de múltiples células de C. neoformans (generalmente cientos) teñidos con tinta china o con colorantes fluorescentes. Se mide el tamaño de cada cuerpo celular y la cápsula circundante. Los datos son compilados, y el diámetro medio de la cápsula se calcula restando el diámetro del cuerpo de la célula del diámetro entero de la célula (célula corporal + cápsulas). Hasta este punto, estas mediciones se han realizado manualmente. Mientras que generalmente precisa, este método tiene inconvenientes para los investigadores. Conjuntos de datos grandes puede tomar días o incluso semanas para analizar con la mano. Y ya que estas mediciones se hacen manualmente, subjetividad y el error humano pueden afectar el resultado.

Análisis de imagen Computacional automatizado se ha convertido en una herramienta indispensable para los investigadores en muchas áreas de la biología molecular de la célula, lo que posibilita un análisis más rápido y más fiable de imágenes biológicas 25,26,27. Técnicas de análisis de imágenes precisos son necesarias para extraer información cuantitativa de lo que a menudo son complejos e inmensos conjuntos de datos. Sin embargo, algunas medidas, especialmente la medición de la cápsula de C. neoformans , han sido difíciles de automatizar. Identificar con precisión la interfaz entre la pared celular y cápsula, que generalmente aparece como un anillo oscuro cuando imágenes por microscopia de contraste de fase, puede ser problemática a resolver mediante un simple umbral. Además, las células de C. neoformans en cultivo tienden a agruparse y precisa segmentación de las células es necesario para las medidas exactas.

El objetivo de este proyecto fue para (i) ilustrar uno de los protocolos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans, (ii) Comparar y contrastar la tinta India y tinción de fluorescencia relativas para mediciones del diámetro de la cápsula (iii) desarrollar simple, métodos computacionales para medir diámetro cápsula utilizando imágenes de tinta de la India manchadas las células usando un software de análisis de imagen y, (iv) evaluación los beneficios y limitaciones de diámetro de la cápsula de medición manualmente y utilizando la automatización del software. Encontramos que de los dos métodos de tinción, fluorescentes de la pared celular y cápsula, mientras más desperdiciadores de tiempo, proporciona los resultados más consistentes entre experimentos. Sin embargo, ambos métodos nos permitieron distinguir correctamente entre laboratorio y clínica C. neoformans exhibe diferentes cepas cápsula tamaños. Además, fuimos capaces de automatizar la medición de diámetro cápsula de tinta manchada imágenes y encontró que ésta era una alternativa viable para medición manual de la cápsula.

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Protocol

Nota: C. neoformans es un patógeno de bioseguridad nivel 2 (BSL-2) y los investigadores que trabajan con él deben tomar las precauciones adecuadas. Procedimientos detallados sobre cómo con seguridad trabajo con patógenos de BSL-2 se encuentra en el centro for Disease Control (CDC) sitio web, pero es importante tener en cuenta que todas las personas que entran en contacto con C. neoformans deben ser debidamente entrenadas en el manejo de agentes patógenos y deben usar siempre equipo de protección personal (EPP), generalmente de látex o guantes de nitrilo. Además, los rotores en las centrífugas deben sellarse para evitar aerosolización de muestras y cualquier derrame, limpiada inmediatamente con una solución de cloro 10%28.

1. cápsula inducción

Nota: Todas las medidas deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

  1. Cultura de C. neoformans en caldo de levadura peptona dextrosa (YPD) (pH 6.5 +/-0.2) e incube a 37 ° C con agitación hasta que estén en fase logarítmica (aproximadamente 18-36 h).
  2. Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C y lavar tres veces con tampón fosfato salino (PBS).
  3. Utilizar un hemocitómetro o un contador de células automatizado para contar las células y resuspender en 2 x 105 células/2 mL en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM).
  4. Para inducir la cápsula, incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 18 h.
    Nota: La combinación de la ausencia de nutrientes en los medios de comunicación y la presencia de CO2 estimula el crecimiento de cápsula de C. neoformans .
  5. La incubación, cosechar las células por centrifugación (como arriba) y quitando todo, pero 5-10 μl de sobrenadante. Al mismo tiempo, recoger una muestra celular no inducida correspondiente para cada cepa que se medirá. Utilizarlos como controles negativos.
    Nota: Los pellets de células serán muy pequeños y pueden ser difíciles de ver. Tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.
  6. Tinción con tinta china (sección 2.1) o con colorantes fluorescentes (sección 2.2).

2. coloración

  1. Tinción con tinta de la India sólo
    1. Para teñir la levadura con la tinta de la India, Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y añadir 4μL (aproximadamente la mitad) de la suspensión celular y 4μL de tinta de la India sobre un portaobjetos de vidrio. Suavemente la mezcla y evitar la formación de espuma.
    2. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.
  2. Tinción con sólo tintes fluorescentes
    1. Para teñir la levadura con un colorante fluorescente, Resuspender el precipitado de células en 50 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
    2. Incubar el cultivo con un volumen igual de blanco de calcoflúor (CFW) (1 μg/mL) y mAb cápsula 18B7 (véase Tabla de materiales) conjugado con AlexaFluor488 (AF488) (10 μg/mL) durante 30 min a 37 ° C.
    3. Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C la incubación y aspirar el sobrenadante.
    4. Resuspender el precipitado de células en 10 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
    5. Pipeta 8 μl de suspensión celular en un portaobjetos de vidrio.
    6. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.
  3. Tinción con tinta china y colorantes fluorescentes
    1. Para comparar más directamente la eficacia de la tinta de la India la coloración a la de los tintes fluorescentes, conjuntamente se tiñen de la misma población celular con ambos tipos de manchas. Para ello, primero incubar las células con una cápsula fluorescente y la mancha de la pared celular, según pasos 2.2.1 - 2.2.3.
    2. A continuación, pipetear volúmenes iguales (4 μL) de la suspensión celular tinción fluorescente y tinta china sobre un portaobjetos de vidrio. Mezclar suavemente.
    3. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.

3. imagen adquisición/microscopía

  1. Imagen de células teñidas con tinta de la India.
    1. Adquisición de imágenes mediante un microscopio óptico estándar (100 aumentos).
    2. Imagen de un mínimo de 50 células por condición.
      Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo, ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado). Para estos experimentos, se adquirieron imágenes a una profundidad de 16 bits con tiempos de exposición optimizados para maximizar el contraste de la imagen al tiempo que minimiza el desenfoque causado por pequeños movimientos de las células.
  2. Imagen de células teñidas con colorantes fluorescentes
    1. Para las células de la imagen por microscopía de fluorescencia, abra el software de imágenes de microscopio y seleccione adecuados longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos utilizado (CFW y AF488 están entusiasmados con el 405 nm y luces de 488 nm, respectivamente). Adquisición de imágenes mediante un microscopio de fluorescencia.
    2. Imagen de un mínimo de 50 células por condición.
      Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado).
    3. Adquirir una serie de imágenes z-stack de las células para asegurar que se obtiene el diámetro máximo de la cápsula para cada celda dentro de un campo determinado.
      1. En el software de control de microscopio, haga clic en la barra "z-stack" para abrir el panel de control "z-stack", luego seleccione la opción "Primero, último" en la esquina superior izquierda del panel.
      2. Utilice el control fino de enfoque en el microscopio para enfocar a un nivel que está por debajo del punto más ancho de una célula de levadura sola y las cápsulas para todos dentro del campo de visión actual y haga clic en "Establecer primero".
      3. Utilice el control fino de enfoque para enfocar sobre el punto más ancho del cuerpo celular de la célula misma y de la cápsula para todas las celdas dentro del campo de visión actual y haga clic en "Set pasado".
      4. Haga clic en "Iniciar el experimento" en la pestaña de "Adquisición" para adquirir el z-stack para la posición actual. Repita el proceso en varias posiciones hasta que se han adquirido imágenes z-stack de al menos 50 células.
        Nota: Para estos experimentos, el agujero de alfiler confocal se establece en 1.0 UA y una superposición serie z de 10-20 rebanadas cubriendo 0,7 μm fueron adquiridas en las posiciones elegidas. UA = unidad de Airy.
    4. A continuación, convertir cada serie z-stack proyecciones de máxima intensidad (MIP) utilizando el software de análisis de imagen adecuada.
      Nota: MIPs proyecto la mayor intensidad en cada plano de la imagen apilada29. Creación de MIPs permite producir una representación 2D de imágenes que corresponden a la célula máxima y el diámetro cápsula dentro de la pila 3D capturado.
  3. Imagen de células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes
    1. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal o campo amplio (40 aumentos) (63 X o 100 X de ampliación). Para las células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes, capturar imágenes mediante un microscopio de campo amplio equipado con una etapa controlada por ordenador y el objetivo de inmersión de aceite.
      Nota: El microscopio en uso debe controlarse mediante un software de proyección de imagen CFW. fluorescencia que es excitado a través de un filtro de excitación de 340-380 nm y emite luz debe ser detectada a través de un filtro de barrera 435-485 nm reflejado por un espejo dicroico de 400 nm. AF488 fluorescencia puede ser excitada a través de un filtro de excitación de 465-495 nm y luz emitida puede ser detectada a través de un filtro de barrera de 515-555 nm reflejado por un espejo dicroico de 505 nm.
    2. Un mínimo de 50 células por condición para cada método de coloración de la imagen.

4. manual medición de cápsula

  1. Para las células teñidas con tinta de la India o las manchas fluorescentes, utiliza un software de medición célula manualmente medida cápsula y célula de diámetro (véase Tabla de materiales). Para ello, vaya a "Archivo" > "Abrir imagen" > "Medida" y utilice el cursor para trazar una línea recta a través del punto más ancho de la célula entera (diámetro total).
  2. A continuación, haga clic en "Medida" otra vez y trazar una línea recta a través del cuerpo de la célula (diámetro del cuerpo de la célula).
    Nota: Las mediciones son almacenados automáticamente en las células.
  3. Repita este proceso para todas las celdas (mínimo 50/grupo).
  4. Para guardar las imágenes una vez que se midieron, haga clic en "Archivo" > "Guardar como" y nombrar las imágenes adecuadamente.
  5. Seleccione los archivos recién medidos y exportar datos a un software de hoja de cálculo.
  6. Calcular el diámetro medio de la cápsula mediante la ecuación: ([diámetro total] - [cuerpo de la célula diámetro]).

5. automáticos de medición de la cápsula

Nota: Para éxito automáticos de medición, utilice imágenes de 16 bits con un alto nivel de contraste y que están correctamente enfocados junto con un software de análisis de imagen apropiado (véase Tabla de materiales). Cuando proyección de imagen C. neoformans para la medición de la cápsula, es importante centrarse en el anillo oscuro en el límite entre la pared celular y cápsula. Esto permite que el software delinear correctamente el celular y la cápsula.

  1. Invertir y crear una copia de toda la tinta India manchados imágenes de celular utilizando un software de edición de imágenes adecuado (véase Tabla de materiales). Para ello, haga clic en "Archivo" > "Abrir" para abrir tinta India teñida de imágenes y luego de "Control" + "I" para invertir la imagen. Haga clic en "Archivo" > "Guardar como" para guardar la imagen invertida.
  2. Importar tanto el original como invertida imágenes en el software haga clic en "Archivo" > "Importar secuencia" > "Carga de imagen" > "Definir secuencia (manualmente)" > "Dimensiones (canal)" > "Importar" > "Aplicar".
    Nota: Los cuerpos celulares de C. neoformans y cápsulas pueden identificarse y enmascararon utilizando algoritmos específicos - contempladas como 'recetas' - incluidos en el software.
  3. Utilice la receta de la 'Colonia analizador (fluorescencia)' la imagen invertida para detectar y enmascaran el cuerpo de la célula, y haga clic en "aplicar". En la imagen invertida, el anillo oscuro de definir el límite de la célula de C. neoformans se convierte en más brillante que la cápsula circundante.
  4. Use la receta del 'Analizador (fluorescencia) de la Colonia' en la imagen invertida a los cuerpos celulares de C. neoformans de sus cápsulas del segmento, a continuación, haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cuerpo celular" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta".
    Nota: La receta consiste en múltiples pasos de procesamiento de la imagen: fondo de retiro, detección de objetos, separación de objeto y subconjunto filtrado.
  5. A continuación, utilice la receta de 'Proliferación celular' en la imagen original para detectar y enmascaran el cápsula y haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cápsula" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta".
  6. La receta, 'Cápsula de partición', crear una nueva máscara a la imagen original para particionar cápsulas adyacentes uno del otro. Para ello, haga clic en "Partición de cápsula" en el menú desplegable de receta. En el cuadro de la partición de la cápsula, elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cápsula" (5.5) para la región de la cápsula. Elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cuerpo celular" para las células Crypto (5.4). Elegir "Original" para el canal de entrada y "crear máscara de cápsula de particionado. Haga clic en "aplicar
    Nota: La receta genera células y diámetro de la cápsula, definido como el promedio de los ejes más largo y más cortos atravesando el centro de la célula y la cápsula y las mediciones de área de máscaras de detección. Encontrar la salida que se encuentra en la pestaña de la hoja de cálculo de este software. Repita este proceso para todas las imágenes (mínimo de 50 células/grupo). Parámetros de la receta podrían ajustados para optimizar la detección de imágenes individuales u optimizados para la detección de lotes de varias imágenes. Medidas adicionales pueden calcularse por la receta para la caracterización completa de la célula y morfología de la cápsula.
  7. Exportar datos a un software de hoja de cálculo de elección para su posterior análisis.

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Representative Results

Para ilustrar la cápsula inducción celular tinción, proyección de imagen y técnicas de medición, se utilizaron tres cepas de neoformans de la C.: colar el laboratorio común, bien caracterizado, H99S30y dos cepas clínicamente aisladas de previamente diámetro cápsula desconocido, B18 y B5231.

El flujo de trabajo de inducción cápsula, tinción y adquisición de la imagen usando la tinta de la India se muestra en la figura 1A. Imágenes tomadas de las tres cepas se muestran en la figura 1B pre- y post-inducción. El investigador sabrá si la inducción cápsula fue un éxito mediante la comparación de las células que han sido sometidos a inducción cápsula a los de la misma cultura que tienen no. Un aumento de tamaño claro es generalmente evidente en la inducción la mayoría de cepas, aunque algunas cepas exhibirá naturalmente pequeñas cápsulas incluso después de la inducción (ver imágenes de B18 en la figura 1B). Cabe señalar que no cápsula inducción residual multimedia no se quita antes de la inducción o CO2 no está presente. En estos casos, se observará sólo modestos (si hubiera) aumentos de tamaño de la cápsula. Diámetros de las tres cepas se midió manualmente y los resultados se muestran en la figura 1. En dos de los tres experimentos, no hubo diferencias en tamaño entre H99S y B18. Sin embargo, constantemente se observó una diferencia significativa en tamaño entre la tensión más grande, B52 y H99S y B18 (p < 0,001 y p < 0.001, respectivamente, plazas menos estándar prueba con contraste simple, tamaño de la muestra = 50 células, cepa ).

Figura 2A muestra el flujo de trabajo de inducción cápsula, tinción y adquisición de imágenes con dos colorantes fluorescentes, uno para la cápsula (18B7-AF488) y otro para la pared de célula (Calcofluor White). Imágenes fueron capturadas como z-pilas para todos tres cepas post inducción, asegurándose que el diámetro máximo de la cápsula y el cuerpo de la célula fue capturado para que cada celda a medirse (figura 2B). Cada pila de z fue procesado para producir proyecciones de máxima intensidad, compresión de la pila de 3 dimensiones en una imagen 2D antes del análisis (figura 2). Éstos entonces fueron medidos manualmente (Figura 2D). A diferencia de las mediciones para tinta china, tinción de las células, el fluorescente manchas habilitado para discriminar entre las tres cepas en base a su diámetro cápsula en los tres repeticiones del experimento. Aquí, encontramos que B18 tenía el diámetro más pequeño de cápsula y B52 el más grande (p < 0,001 para todas las comparaciones, la prueba estándar de mínimos cuadrados con efectos simples, tamaño de la muestra = 50 células/cepa).

Evaluar más los dos métodos de tinción de cápsula de C. neoformans , se compararon las mediciones de las tres cepas. No hubo diferencias significativas entre los tamaños cápsulas determinado utilizando los dos métodos de tinción (Figura 3A) (ANOVA multivariado con efectos simples, tamaño de la muestra = 50 células/cepa). Esta conclusión era constante con los resultados de un experimento independiente donde la cepa de laboratorio, H99S, co teñida con tinta china y colorantes fluorescentes (figura 3B-C). Sin embargo, hubo mayor variabilidad entre experimentos usando la tinta de la India, según lo evidenciado por el hecho de que sólo uno de cada tres experimentos mostraron una diferencia significativa en el tamaño de la cápsula entre H99S y B18, comparado con la diferencia significativa observada entre estas cepas en los tres experimentos fluorescentes (figura3D-E) (ANOVA multivariado con efectos simples, tamaño de la muestra = 50 células/cepa).

Tinta de la India teñida de imágenes que cumplan con los criterios establecidos en el protocolo (sección 5) se puede medir utilizando un sistema automatizado. El flujo de trabajo que se muestra en la Figura 4A guia al usuario a través de los pasos es necesario utilizar las recetas diseñado para medir la cápsula de C. neoformans . Después de desarrollar el flujo de trabajo, se validó mediante la medición de una caché de las imágenes existentes de células de C. neoformans por tres investigadores utilizando métodos manuales y automatizados. No hubo diferencias significativas entre las mediciones de los investigadores cuando manualmente, y esto también era cierto cuando las mediciones se realizaron utilizando el software de análisis de imagen automatizado (Figura 4B) (ANOVA, tamaño de la muestra = 50 células/investigador). Sin embargo, hubo una pequeña pero informó diferencia significativa en el tamaño de la cápsula entre los dos métodos ANOVA (figura 4), tamaño de la muestra = 150/grupo celdas. Diámetro de la cápsula fue siempre un poco más pequeño cuando se mide mediante la automatización de mediciones manuales (0,3 μm, p < 0.001). Además, al comparar entre las mediciones de tamaño de la cápsula hechas por investigadores independientes de los mismos conjuntos de imagen, el error estándar fue menor cuando software de análisis de imagen se utilizó para la cuantificación en vez de métodos manual, que es sugestivo de más mediciones precisas y reproducibles mediante el método automatizado. Para la medición automatizada exitosa, células deben estar en foco, tienen un medio a gran y no ser demasiado agrupadas (figura 4). Encontramos que los imágenes mal enfocadas de células agrupadas con cápsulas pequeñas no podrían medirse automáticamente en el software. Sin embargo, afirmamos que estos también pueden ser difíciles de medir con precisión utilizando métodos manuales.

Figure 1
Figura 1 : Tinta china, tinción para medir C. neoformans cápsula. (A) Representación esquemática de la medición de cápsula de C. neoformans por manchas de tinta de la India. En Resumen, cápsula expresión se induce mediante privación de nutrientes y la exposición al CO2, las células se resuspendió en tinta de la India y montadas en portaobjetos de vidrio. Se adquieren imágenes de células por microscopía de luz, con los campos que ya sea seleccionado por el usuario o por análisis de azulejo con una etapa controlada por ordenador. Imágenes pueden analizar manualmente o procesadas para la segmentación automatizada y análisis. (B) imágenes de la cepa de laboratorio común, H99S y dos cepas clínicas, B18 y B52, inducción previa y la cápsula. Barras de escala representan 10 μm (C) gráfico de un representante de experimentar diámetro cápsula que muestra de las tres cepas teñidos con tinta de la India y medido manualmente (error es representado como error estándar (SE)). Significación estadística se indica como sigue: *, p < 0.05; **, p < 0.01; y ***, p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Tinción fluorescente para medir C. neoformans cápsula. (A) representación esquemática de medida cápsula de C. neoformans por blanco de calcoflúor (CFW) y 18B7 AF488 Co manchas. Después de la inducción de la cápsula y la coloración, las células son montadas y reflejadas por microscopía confocal de barrido láser. Como las células pueden ser en diferentes planos focales, pilas de z se adquieren en cada posición. Estos son procesados para producir proyecciones de máxima intensidad que pueden ser utilizadas para medir con precisión el diámetro máximo de la cápsula para cada celda. (B) Imágenes de la cepa de laboratorio común, H99S y dos cepas clínicas, B18 y B52, cápsula posterior inducción. Nota: Las barras de escala representan 10 μm para todas las imágenes. Máximo (C) proyecciones de la intensidad de fluorescencia etiquetada células de C. neoformans . (D) Gráfica de un experimento representativo Mostrar manualmente mide diámetro de la cápsula de las tres cepas con CFW y 18B7-AF488 (error es representado como error estándar (SE)). Significación estadística se indica como sigue: *, p < 0.05; **, p < 0.01; y ***, p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Comparación de resultados entre la tinta de la India y la coloración fluorescente. (A) análisis de tres cepas de C. neoformans manchados con tinta de la India o tintes fluorescentes, números = 3 (el error es representado como error estándar (SE)). (B) imágenes de una sola célula de C. neoformans manchados con tinta de la India y dos colorantes fluorescentes (barra de escala representa 13 μm). Líneas horizontales delimitarán los bordes de la cápsula y líneas verticales demarcaran los bordes del cuerpo celular. (C) la cuantificación de un experimento representativo de H99S Co teñido con tinta china y colorantes fluorescentes (error es representado como error estándar (SE)). (D, E) Representación de la variabilidad de la cápsula de diámetro entre experimentos de tinta de la India (D) y fluorescentes experimentos (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análisis computacional de C. neoformans diámetro cápsula imágenes de tinta de la India de teñido células. (A) representación esquemática de la segmentación de la imagen y medida cápsula de C. neoformans usando una técnica de medición automatizado (véase Tabla de materiales). (B) comparación de cápsulas mediciones realizadas por investigadores independientes 3 utilizando métodos automatizados (Automated 1-3) y manual (Manual 1-3). Cada investigador utiliza un caché idéntico de C. neoformans imágenes por ambos métodos (el error es representado como DesvEst). (C) combinado promedio de medidas manuales y automatizadas (error es representado como error estándar (SE)). Ejemplos de ambos ideal (D) y imágenes de no ideal (E) de neoformans de la C.. Imágenes no-ideal no se puede medir con éxito en el software. Significación estadística se indica como sigue: *, p < 0.05; **, p < 0.01; y ***, p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Durante décadas, la cápsula ha sido un importante foco de investigación para micólogos y médicos interesados en C. neoformans y criptococosis debido a su papel como factor de virulencia importante para el patógeno. Mediante microscopía para medir diferencias en el tamaño de la cápsula entre cepas y bajo crecimiento diferentes condiciones pueden proporcionar información importante sobre el patógeno y sus respuestas a varios estímulos(es decir, diferentes condiciones ambientales, posibles tratamientos farmacológicos, etc.) aquí, hemos descrito un método para inducir el crecimiento de la cápsula de C. neoformans, y en comparación con dos diferentes protocolos de tinción de la cápsula. Finalmente, hemos mostrado cómo el software de análisis de imagen se puede utilizar para automatizar la medición de diámetro cápsula de imágenes de tinta de la India teñida de las células, produciendo resultados que fueron comparables a los métodos de medición manual.

En nuestros experimentos, hemos comparado dos cepas clínicas, B18 y B52, con H99S, una cepa de laboratorio estándar de tamaño de cápsula conocido18. Tinción de ambos métodos mostraron que la cepa clínica, B52, tenía el mayor diámetro de la cápsula de las tres cepas probadas. Sin embargo, los resultados de las mediciones fluorescentes fueron capaces de discernir la diferencia entre las dos cepas con menor tamaño de la cápsula donde no eran medidas de tinta de la India. Los resultados de ambos métodos de tinción fueron constantes, lo que sugiere que ambas son válidas pero que utilizando las imágenes de fluorescencia había manchado C. neoformans puede permitir mayor sensibilidad en la medición de las tensiones con la pequeña cápsula. Usando proyecciones máximo generadas a partir de imágenes z-stack de fluorescencia células permite a los investigadores asegurar que las mediciones de diámetro cápsula precisa pueden hacerse incluso cuando las células reflejadas en diferentes planos focales. Estas medidas son más difíciles para C. neoformans reflejada usando tinta de la India y la microscopia ligera estándar. En cualquier imagen, celdas adyacentes pueden sentarse en ligeramente diferentes planos focales, lo que es difícil de resolver con precisión los límites de la cápsula de cuerpo celular para todas las células. Posiblemente esto podría confundir la capacidad de los investigadores para detectar pequeños cambios en el tamaño de la cápsula o pequeñas diferencias entre cepas.

Cada método tiene sus propias ventajas inherentes. Tinta de la India es el más comúnmente utilizada por los investigadores debido a su asequibilidad, facilidad de uso y estabilidad (no degrada con el tiempo como algunas manchas fluorescentes). Porque la tinta de la India es una tinción simple, negativa que puede ser utilizado en conjunción con los microscopios de luz estándar, que son más fácilmente disponibles que microscopios fluorescentes. Sin embargo, si no en las proporciones correctas (tinta: tampón de India), la mancha puede crear un fondo "plumosos" cuando desliza que puede complicar el análisis de imagen automatizado. Mientras que caro y más desperdiciadores de tiempo a utilizar, tintes fluorescentes pueden ser ventajosos por su flexibilidad, y como nos muestran, su sensibilidad. Son particularmente útiles para la medición de carga de tamaño y de la célula cápsula en experimentos con C. neoformans que han sido fagocitados por las células inmunes y son necesarias para el examen histológico de la cápsula de C. neoformans en las muestras de tejido (una técnica no descrita en este artículo)32. Si la coloración con colorantes fluorescentes, como el blanco de calcoflúor o anticuerpos anti-GXM fluorescencia de etiquetado, es problemática (p. ej., tinción insuficiente), generalmente esto se puede solucionar mediante la optimización del Protocolo de tinción (aumentar/disminuir el concentración o incubación tiempo con el tinte).

Independientemente de la metodología de tinción, encontramos que la cápsula inducción y captura de la imagen adecuada son pasos críticos en el protocolo. El protocolo descrito en este documento es uno de varios métodos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans y se ha utilizado con éxito en los laboratorios de levadura para muchos años23. Inducción de cápsula de C. neoformans es CO2-dependiente y sólo ocurre bajo condiciones estresantes23,33. Por lo tanto, es fundamental que se produce en una 5% CO2 incubadora con un medio de crecimiento deficiente nutrientes apropiados. Si se sospecha que la cápsula no ha sido inducida después de un período estándar de incubación (generalmente 18-24 h), las células deben ser comparadas con una cultura de control uninduced que no fue expuesta a condiciones estresantes. Comparación de los dos va a determinar si la inducción era eficaz. Una inducción exitosa es una en la que la mayoría de las células hace una cápsula más grande, en comparación con el control uninduced. Porque no todas las células inducen, las células a medir deben ser una representación heterogénea de las células disponibles.

No se puede exagerar la importancia de la adquisición de la imagen consistente, especialmente si de medición automatizado es el objetivo. Enfoque, contraste, fluorescencia del fondo, así como la compresión de imagen y profundidad de bits de los archivos es consideraciones importantes. Cuando sea posible, grandes grupos de células que no se sientan en un solo plano focal deben evitarse, aunque algunos de florecimiento y tocar las células son aceptables y pueden ser inevitables (esta regla se debe seguir para la medición manual y automatizado). Este problema puede eludirse en cierto grado cuando usando imagen confocal de fluorescencia manchado las células. El uso de z-pilas para producir proyecciones de máxima intensidad puede permitir una medición precisa de las células en diferentes planos focales de una sola imagen29. Además, las imágenes se deben adquirir rápidamente después de preparar la muestra. Esto puede ser particularmente importante para la tinta de la India teñida muestras cuando empiezan a secarse, puede disminuir el contraste entre los elementos de fondo y primer plano (las células) y características de fondo no deseados se pueden mejorar, que conduce a la reducción automática precisión de la segmentación.

Aunque las mediciones de diámetro cápsula son comunes en la comunidad de C. neoformans , hasta este punto normalmente se han realizado manualmente, que requiere mucho tiempo y mano de obra. Sin embargo, mediciones manuales son aceptadas en el campo y se pueden obtener resultados en poco gasto. Los avances en software de análisis de imagen han permitido dar los primeros pasos hacia la automatización de las mediciones. La naturaleza simple del cuerpo de la célula de C. neoformans y la cápsula - que aparece como un círculo dentro de un círculo - en 2D imágenes hace la medición de su tamaño relativamente simple para las paquetes de software de la segmentación de imagen automatizada, sin la necesidad de desarrollar la novela algoritmos. En su lugar, uniendo algoritmos existentes, cápsulas y células de C. neoformans pueden ser detectadas, segmentadas y medidas. Usando este acercamiento, hemos automatizado las mediciones del diámetro cápsula de C. neoformans células teñidas con el más comúnmente usado cápsula tinte, tinta de la India, y han comparado a mediciones manuales para los mismos conjuntos de datos. Este método ofrece la ventaja de reproducibilidad y extirpación de gran parte de los errores humanos asociados con la medición manual mientras que ahorra el tiempo del investigador. Además, las medidas adicionales pueden incorporarse con un mínimo esfuerzo el flujo de trabajo de análisis automatizado. Creemos que el análisis de imagen automatizado es un enfoque prometedor que permite a los investigadores medir grandes cantidades de cápsula de C. neoformans con un alto grado de precisión y eficiencia.

En general, hemos demostrado cómo inducir crecimiento cápsula de C. neoformans, teñir las muestras con tintas o colorantes fluorescentes y medir diámetro cápsula utilizando mediciones manuales y automáticas en un análisis de la imagen con éxito software. Nuestros resultados sugieren que ambos métodos de tinción son viables y generalmente producen resultados consistentes (aunque hay más variabilidad con las mediciones de la tinta de la India). Además, métodos manuales y automatizados de medición tienen la capacidad para discernir los diferentes tamaños de cápsulas.

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Disclosures

El autor, Hoyin Lai, es el Gerente de producto en DRVision que publica el software de análisis de imagen automatizado, Aivia.

Acknowledgments

Agradecemos al programa de doctorado de biociencias moleculares (MOBI) y el Departamento de biología en Tennessee medio estado Universidad (MTSU) para proporcionar el financiamiento para este estudio. El proyecto también fue financiado en parte por una subvención de proyectos especial concedida al D.E.N. de la Fundación de MTSU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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References

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Inmunología número 132 Cryptococcus Neoformans cápsula virulencia reconocimiento de patrones análisis de imagen automatizado análisis levadura
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Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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