Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Size Matters: Måling af kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/57171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies
* These authors contributed equally

Summary

Polysaccharid kapsel er den primære virulens faktor i Cryptococcus neoformans, og dens størrelse korrelerer med stamme virulens. Kapsel diameter målinger bruges i fænotypiske test og til at måle terapeutiske virkning. En standardmetode til kapsel induktion præsenteres her, og to metoder til farvning og måling diameter sammenlignes.

Abstract

Polysaccharid kapsel af Cryptococcus neoformans er den primære virulens faktor og en af mest studerede almindeligt aspekter af denne patogene gær. Kapsel størrelse kan variere meget mellem stammer, har evnen til at vokse hurtigt, når introduceret til stressende eller lave næringsstof betingelser, og er blevet positivt korreleret med stamme virulens. Af disse grunde er størrelsen af kapslen af stor interesse for C. neoformans forskere. Vækst af C. neoformans kapsel er induceret under fænotypiske test til at hjælpe med at forstå virkningerne af forskellige behandlinger på de gær eller størrelse forskelle mellem stammer. Her beskriver vi en af de standard metoder af kapsel induktion og sammenligne to anerkendte metoder til farvning og måling kapsel diameter: a tusch, en negativ pletten, anvendes i forbindelse med konventionelle lysmikroskopi og (ii) Co-farvning med fluorescerende farvestoffer cellevæg og kapsel efterfulgt af Konfokal mikroskopi. Endelig vil vi vise hvordan måling af kapsel diameter fra Indien blækplettede prøver kan være automatiseret ved hjælp af computational billedanalyse.

Introduction

Påvirker en kvart million mennesker hvert år og resulterer i mere end 180.000 dødsfald om året, er Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulære gær og det agens af cryptococcosis1,2, 3. hårdest ramt er HIV-positive patienter i de fattige lande, der ikke har adgang til antiretroviral behandling, hvilket gør dem meget modtagelige for sygdom4,5,6. Data fra CDC viser, at i Sahara, C. neoformans dræber flere mennesker end tuberkulose årligt og mere hver måned end nogen Ebola-udbrud på post1. Den mest almindelige eksponeringsvej for opstår fra indånde udtørret sporer, der er almindeligt forekommende i miljøet7. Ved ankomsten til lungerne, er der flere virulens faktorer, der bidrager til succes af C. neoformans inden for inficerede individer. Polysaccharid kapsel anses mikrobes primære virulens faktor, da acapsular stammer ikke er ondartet8.

Cryptococcal kapslen er sammensat af tre princippet komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), og mannoproteins (MPs)9. MPs er et relativt mindre cellevæg-forbundet komponenten af kapslen, de er immunogen og kan fremme en overvejende pro-inflammatoriske respons9,10. I modsætning hertil er GXM og GalXM udgør hovedparten af kapslen (> 90% efter vægt) og har immunosuppressive effekter11. Ud over sin immunmodulerende effekt skaber den hurtige udvidelse af kapsel i vivo en mekanisk barriere for indtagelse af vært fagocyterende celler (dvs., neutrofiler og makrofager)12. C. neoformans kapsel og sin Sammenfattende er komplekse, men generelt, øget kapsel diameter er korreleret med øget virulens6,13,14. I betragtning af dette, er det vigtigt for C. neoformans forskere til at være i stand til hurtigt og nøjagtigt kvantificere kapsel målinger.

Både C. neoformans cellen og dets polysaccharid kapsel er dynamiske strukturer og Vis ændringer over tid15. Kapslen kan ændre i tæthed, størrelse og forsamling som svar på ændringer i vært miljø16,17,18. Lavt jern eller næringsstof niveauer, eksponering for serum, den menneskelige fysiologisk pH og øget CO2 er kendt for at indlede kapsel vækst16,18,19,20. Yderligere, har forskere vist strukturelle ændringer resulterer i betydelige forskelle i immunoreactivity under en infektion, udlån en fordel til C. neoformans over sin vært21,22. Dette er kendt fordi arkitektur af C. neoformans kapsel er blevet analyseret i en række forskellige måder. Elektronmikroskopi, for eksempel, har afsløret at kapslen har en heterogen matrix med en indre elektron-tætte lag nedenunder en ydre, mere gennemtrængelige lag23. Lysspredning og brugen af optiske tweezers har tilladt forskere til yderligere belyse dens makromolekylære egenskaber24. Analysere resultaterne fra både statisk og dynamisk lysspredning målinger, ved vi, at polysaccharid kapsel har en kompleks forgrening struktur23. Optisk pincet har været brugt til at teste stivheden struktur samt vurdere dens antistof reaktivitet24. Men langt den hyppigst ansat analyse af C. neoformans kapsel er måling af dens størrelse.

For at kvantificere kapsel størrelse, forskere bruger hvad der bør være en simpel måling: lineær diameteren af kapslen. Digital mikroskoper er brugt til at fange billeder af flere C. neoformans celler (generelt hundredvis) farves med tusch eller fluorescerende farvestoffer. Størrelsen af hver celle organ og omkringliggende kapsel er målt. Data er indsamlet, og den gennemsnitlige diameter af kapslen er beregnet ved at fratrække cellen kroppen diameter fra hele cellen diameter (cellen kroppen + kapsel). Indtil dette tidspunkt, er disse målinger blevet gjort manuelt. Mens generelt præcis, har denne metode ulemper for forskere. Store datasæt kan tage dage eller endda uger til at analysere i hånden. Og fordi disse målinger er udført manuelt, subjektivitet og menneskelige fejl kan påvirke resultatet.

Automatiseret beregningsmæssige billedanalyse er blevet et uundværligt redskab for forskere i mange områder af Molekylær cellebiologi, muliggør hurtigere og mere pålidelig analyse af biologiske billeder 25,26,27. Præcise billede analyseteknikker er nødvendige for at mine kvantitative oplysninger fra hvad er ofte komplekse og enorme datasæt. Nogle målinger, især måling af C. neoformans kapsel, har dog været vanskeligt at automatisere. Præcist identificerer grænsefladen mellem cellevæg og kapsel, der normalt vises som en mørk ring når afbildet af fasekonstrastmikroskopi, kan være besværlige at løse ved hjælp af en simpel tærskel. Yderligere, C. neoformans celler i kultur har tendens til at klumpe sammen og præcis segmentering af celler er nødvendige for nøjagtige målinger.

Formålet med dette projekt var at (i) illustrere en af standardprotokoller til kapsel induktion i C. neoformans, (ii) Sammenlign og kontrast tusch og fluorescens farvning som de gælder for at kapsel diameter målinger, (iii) udvikle simple, beregningsmæssige metoder til at måle kapsel diameter ved hjælp af billeder af Indien blæk farves celler ved hjælp af et billede analyse software og (iv) vurdere fordele og begrænsninger af måling kapsel diameter manuelt og ved hjælp af software automatisering. Vi finder, at de to farvning metoder, fluorescerende, mærkning af cellevæggen og kapsel, mens mere tidskrævende, forudsat de mest konsistente resultater mellem eksperimenter. Men begge metoder aktiveret os til at kunne skelne mellem lab og kliniske C. neoformans kapsel stammer udstiller forskellige størrelser. Yderligere, vi var i stand til at automatisere måling af kapsel diameter fra Indien blæk farves billeder og fandt, at dette var et levedygtigt alternativ til manuel måling af kapsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: C. neoformans er en biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) patogen og forskere, der arbejder med det skal tage passende forholdsregler. Detaljerede procedurer på hvordan til sikkert arbejde med BSL-2 patogener kan findes på Center for Disease Control (CDC) hjemmeside, men det er vigtigt at bemærke, at alle personer, der kommer i kontakt med C. neoformans skal være ordentligt uddannet i håndtering patogener og bør altid bære passende personlige værnemidler (PPE), generelt latex eller nitrilhandsker. Yderligere, rotorerne på centrifuger skal være forseglet for at forhindre aerosolization af prøver og eventuelle spild, ryddet op straks ved hjælp af en 10% blegemiddel løsning28.

1. kapsel induktion

Bemærk: Alle trin skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Kultur C. neoformans i gær pepton dextrose (YPD) bouillon (pH 6,5 +/-0,2) og inkuberes ved 37 ° C under omrystning indtil de er i log fase (ca. 18-36 h).
  2. Centrifugeres celler på 870 x g i 5 min ved 21 ° C og vaskes tre gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  3. Brug en hemocytometer (eller en automatiseret celle counter) til at tælle cellerne og resuspend på 2 x 105 celler/2 mL i Dulbecco's minimal essential medier (DMEM).
  4. For at fremkalde kapslen, der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 til 18 h.
    Bemærk: Kombinationen af mangel af næringsstoffer i medierne og tilstedeværelsen af CO2 stimulerer C. neoformans kapsel vækst.
  5. Efter inkubation, høste cellerne ved centrifugering (som ovenfor) og fjerne alle, men 5-10 µL supernatanten. På samme tid, høste en tilsvarende un-induceret celle prøve for hver stamme skal måles. Bruge disse som negative kontroller.
    Bemærk: Celle pellets vil være meget lille og kan være svært at se. Vær forsigtig, når sugning supernatanten.
  6. Pletten med enten tusch (afsnit 2.1) eller fluorescerende farvestoffer (afsnit 2.2).

2. farvning

  1. Farvning med kun tusch
    1. For at pletten gær med tusch, resuspenderes i de resterende supernatanten og tilføje 4μL (omkring halvdelen) af cellesuspension og 4μL af tusch på et glas objektglas. Forsigtigt blandes og undgå skumdannelse.
    2. 13-mm glas dækglas (#1.5 tykkelse) og forsegle kanterne med en ikke-giftig fugemasse (klar neglelak) at forhindre prøven fra udtørring.
  2. Farvning med fluorescerende farvestoffer
    1. For at pletten gær med et fluorescerende farvestof, resuspenderes celle i 50 µL PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA).
    2. Inkuber kultur med et lige saa stort volumen af Calcofluor hvid (CFW) (1 µg/mL) og kapsel mAb 18B7 (Se Tabel af materialer) konjugeret med AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) i 30 minutter ved 37 ° C.
    3. Centrifugeres celler ved 870 x g i 5 min. ved 21 ° C efter inkubation og Opsug supernatanten.
    4. Resuspend celle pellet i 10 µL PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA).
    5. Der afpipetteres 8 µL af cellesuspension på et glas objektglas.
    6. 13-mm glas dækglas (#1.5 tykkelse) og forsegle kanterne med en ikke-giftig fugemasse (klar neglelak) at forhindre prøven fra udtørring.
  3. Farvning med tusch og fluorescerende farvestoffer
    1. For at direkte sammenligne effekten af tusch farvning til med fluorescerende farvestoffer, co bejdse den samme celle population med begge typer af pletten. Det gør du ved først Inkuber celler med både en fluorescerende kapsel og cellevæg plet, som pr trin 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Derefter afpipetteres lige store mængder (4 µL) af fluorescently farvede cellesuspension og tusch på et glas dias. Forsigtigt blandes.
    3. 13-mm glas dækglas (#1.5 tykkelse) og forsegle kanterne med en ikke-giftig fugemasse (klar neglelak) at forhindre prøven fra udtørring.

3. billede erhvervelse/mikroskopi

  1. Imaging celler farves med tusch.
    1. Erhverve billeder ved hjælp af en standard lysmikroskop (100 X forstørrelse).
    2. Billede et minimum af 50 celler pr. betingelse.
      Bemærk: Antallet af celler pr. felt vil variere, og det er acceptabelt. Det er vigtigt, men at overlappende celler holdes på et minimum, da disse er vanskeligt at måle (både manuelt og med automatiseret software). For disse eksperimenter, blev billeder erhvervet ved en dybde på 16 bits med eksponering gange optimeret for at maksimere kontrasten i billedet og minimere sløring forårsaget af små bevægelser af celler.
  2. Imaging celler farves med fluorescerende farvestoffer
    1. For at billede cellerne af Fluorescens mikroskopi, åbne mikroskopet imaging software og vælg de passende excitations- og bølgelængder for fluorophores bruges (CFW og AF488 er begejstrede ved hjælp af 405 og 488 nm lys, henholdsvis). Erhverve billeder ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
    2. Billede et minimum af 50 celler pr. betingelse.
      Bemærk: Antallet af celler pr. felt vil variere, og det er acceptabelt. Det er vigtigt, men at overlappende celler holdes på et minimum, da disse er vanskeligt at måle (både manuelt og med automatiseret software).
    3. Erhverve en z-stakken billede serie af cellerne til at sikre, at den maksimale kapsel diameter for hver celle i et givent felt er opnået.
      1. I mikroskopet kontrol software, skal du klikke på "z-stack" bar til at åbne Kontrolpanel "z-stakken" og derefter vælge indstillingen "Første/sidste" i øverste venstre hjørne af panelet.
      2. Bruge kontrolelementet bøde-fokus på mikroskop til at fokusere på et niveau, der ligger under det bredeste sted en enkelt gærcellen og kapsler for alle inden for de nuværende synsfelt og klik på "Angiv først".
      3. Bruge kontrolelementet bøde-fokus fokus over det bredeste punkt på cellen kroppen af den samme celle og af kapslen for alle celler inden for det nuværende synsfelt og klik på "Angiv sidste".
      4. Klik derefter på "Start eksperiment" under fanen "Tilegnelse" til at erhverve z-stakken for den aktuelle position. Gentag processen på flere positioner, indtil z-stak billeder af et minimum af 50 celler har opnået.
        Bemærk: For disse eksperimenter, Konfokal pinhole blev sat til 1,0 AU og en overlappende z-serie af 10-20 skiver der dækker 0,7 µM er anskaffet på de udvalgte positioner. AU = luftige enhed.
    4. Næste, konvertere hver z-stakken serie til maksimal intensitet fremskrivninger (MIP) ved hjælp af passende billede analyse software.
      Bemærk: MIPs projekt det største intensitet på hvert fly af stablede billede29. At skabe MIPs tillader en at producere en 2D repræsentation af billeder, der svarer til den maksimale celle og kapsel diameter inden for hentede 3D-stakken.
  3. Imaging celler farves med tusch og fluorescerende farvestoffer
    1. Erhverve billeder ved hjælp af enten en widefield (40 X forstørrelse) eller Konfokal mikroskop (63 X eller 100 X forstørrelse). Celler farves med tusch og fluorescerende farvestoffer, fange billeder ved hjælp af en widefield mikroskop udstyret med en computer-kontrollerede fase og oliebestandighedsobjektet.
      Bemærk: Mikroskop i brug bør kontrolleres ved hjælp af en billedbehandlingsprogrammer CFW. Fluorescens, der er glade for gennem en 340-380 nm excitation filter, og udsendte lys bør påvises gennem en 435-485 nm barriere filter reflekteres fra en 400-nm dichroic spejl. AF488 fluorescens kan være ophidset gennem en 465-495 nm excitation filter, og udsendte lys kan påvises gennem en 515-555 nm barriere filter reflekteres fra en 505-nm dichroic spejl.
    2. Billede et minimum af 50 celler pr. betingelse for hver farvning metode.

4. manuel måling af kapsel

  1. For celler farves med tusch eller fluorescerende pletter, bruger en celle måling software til manuelt foranstaltning kapsel og celle diameter (Se Tabel af materialer). For at gøre dette, gå til "File" > "Åbn billede" > "Foranstaltning" og brug markøren til at tegne en lige streg gennem det bredeste punkt på hele cellen (samlede diameter).
  2. Næste, klik på "Foranstaltning" igen og trækker en lige linje gennem selve celle (celle organ diameter).
    Bemærk: Målinger er auto-gemt på cellerne.
  3. Gentag denne proces for alle celler (mindst 50/gruppe).
  4. Hvis du vil gemme billeder, når de måles, skal du klikke på "File" > "Gem som" og navngiv billederne korrekt.
  5. Vælg de nyligt målte filer og eksportere data til et regneark software.
  6. Beregner den gennemsnitlige kapsel diameter ved hjælp af ligningen: ([samlede diameter] - [cellen kroppen diameter]).

5. automatisk måling af kapsel

Bemærk: For vellykket automatiseret måling, bruge 16-bit billeder med høj kontrast og der er ordentligt fokuseret sammen med et passende billede analyse software (Se Tabel af materialer). Når imaging C. neoformans kapsel måling, er det vigtigt at fokusere på den mørke ring på grænsen mellem cellevæg og kapsel. Dette tillader software til korrekt afgrænse celle og kapsel.

  1. Invertere og oprette en kopi af alle Indien blæk farves celle billeder ved hjælp af et passende billede-redigeringssoftware (Se Tabel af materialer). For at gøre dette, skal du klikke på "File" > "Åbn" åbne Indien blæk farves billeder og derefter "styre" + "Jeg" at vende billedet. Klik på "File" > "Gem som" for at gemme den omvendt billede.
  2. Importere både de oprindelige og omvendt billeder i softwaren Klik på "File" > "Importer sekvens" > "Load billede" > "Definer sekvens (manuelt)" > "Dimensioner (kanal)" > "Importer" > "Anvend".
    Bemærk: C. neoformans celle organer og kapsler kan identificeres og maskeret ved hjælp af særlige algoritmer - omtales som 'opskrifter' - inkluderet i softwaren.
  3. Bruge 'Koloni Analyzer (Fluorescens)' opskriften på den inverterede billede til at opdage og maske cellen kroppen og derefter på "Anvend". I den omvendt billede bliver den mørke ring definerer grænsen af C. neoformans celle lysere end de omkringliggende kapsel.
  4. Bruge 'Koloni Analyzer (Fluorescens)' opskriften på den inverterede billede at segmentere C. neoformans celle organer fra deres kapsler, så klik på "Anvend". Dette skaber en Grev maske. Omdøbe denne tæller maske "Cellen kroppen" ved at højreklikke på fanen mærket "count maske".
    Bemærk: Opskriften består af flere billedbehandling trin: baggrund fjernelse, objekt detektion, objekt adskillelse og delmængde filtrering.
  5. Næste, bruge 'Celleproliferation' opskriften på det oprindelige billede til at opdage og maske kapslen, og klik på "Anvend". Dette skaber en Grev maske. Omdøbe denne tæller maske "Kapsel" ved at højreklikke på fanen mærket "count maske".
  6. Ved hjælp af opskriften, 'Kapsel Partition', oprette en ny maske på det oprindelige billede at partitionere tilstødende kapsler fra hinanden. For at gøre dette, skal du klikke på "Kapsel Partition" fra rullemenuen opskrift. Vælg nu omdøbt count maske "Kapsel" (5.5) for kapsel Region i boksen kapsel Partition. Vælg nu omdøbt count maske "Cellen kroppen" for Crypto celler (5.4). Vælg "Original" for input channel, og "Opret maske for Partitioned kapsel. Klik på "Anvend
    Bemærk: Opskriften genererer celle og kapsel diameter, defineret som gennemsnittet af de længste og korteste akser krydser midten af cellen og kapsel og området målinger fra afsløring masker. Find det output, der er placeret under fanen regneark i denne software. Gentag denne proces for alle billeder (mindst 50 celler/gruppe). Den opskrift parametre kunne tunet til at optimere påvisning af de enkelte billeder eller optimeret til batch påvisning af flere billeder. Yderligere målinger kan beregnes af opskriften på omfattende karakterisering af cellen og kapsels morfologi.
  7. Eksportere data til et regneark software valg for yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere kapsel induktion, celle farvning, billedbehandling og målemetoder, vi brugte tre stammer af C. neoformans: fælles, godt karakteriseret laboratoriet stamme, H99S30, og to klinisk isolerede stammer af tidligere Ukendt kapsel diameter, B18 og B5231.

Arbejdsprocessen kapsel induktion, farvning og image erhvervelse ved hjælp af tusch er vist i figur 1A. Billeder taget fra alle tre stammer er vist i figur 1B , både før og efter induktion. Forskeren vil vide, hvis den kapsel induktion var en succes ved at sammenligne de celler, der har undergået kapsel induktion til dem fra den samme kultur, der ikke har. En klar størrelse stigning er generelt viser sig i de fleste stammer efter induktion, selv om nogle stammer vil udstille naturligvis små kapsler selv efter induktion (se billeder af B18 i figur 1B). Det skal bemærkes, at kapsel induktion vil mislykkes, hvis resterende rig medier ikke er fjernet før induktion eller hvis CO2 ikke er til stede. I disse tilfælde vil kun beskeden (hvis nogen) stigning i kapsel størrelse observeres. Dimensioner: diameter fra alle tre stammer blev målt manuelt og resultaterne er vist i figur 1 c. I to af de tre forsoeg var der ingen forskel i størrelse mellem H99S og B18. Imidlertid en betydelig forskel i størrelse var konsekvent observeret mellem den største stamme, B52, og H99S og B18 (p < 0,001 og p < 0,001, henholdsvis standard mindste kvadrater test med enkle kontraster, prøvestørrelse = 50 celler/stamme ).

Figur 2A skildrer arbejdsproces kapsel induktion, farvning og image erhvervelse ved hjælp af to fluorescerende farvestoffer, én for kapsel (18B7-AF488) og én til cellens væg (Calcofluor White). Billeder blev taget til fange som z-stakke for alle tre stammer efter induktion, at sikre, at den maksimale kapsel og cellen kroppen diameter blev erobret for hver celle skal måles (figur 2B). Hver z-stakken blev behandlet for at producere maksimal intensitet fremskrivninger, komprimere den 3-dimensionelle stak ind i et 2D-billede inden analyse (figur 2 c). Disse blev derefter målt manuelt (figur 2D). I modsætning til målinger for Indien blæk farves celler, gentager fluorescerende farvning aktiveret os til at skelne mellem alle tre stammer på grundlag af deres kapsel diameter i alle tre af eksperimentet. Her, vi fandt, at B18 havde den mindste kapsel diameter og B52 den største (p < 0,001 for alle sammenligninger, standard mindste kvadraters test med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/stamme).

Hvis du vil yderligere vurdere de to metoder af C. neoformans kapsel farvning, blev målinger fra alle tre stammer sammenlignet. Der var ingen signifikant forskel mellem de kapsel størrelser bestemmes ved hjælp af de to metoder til farvning (figur 3A) (multivariat ANAVA med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/stamme). Denne konklusion var i overensstemmelse med resultaterne af en særskilt eksperiment hvor lab stamme, H99S, var Co farves med tusch og fluorescerende farvestoffer (figur 3B-C). Der var dog større variabilitet mellem eksperimenter med tusch, som det fremgår af det faktum, at kun en ud af tre eksperimenter viste en betydelig forskel i kapsel størrelse mellem H99S og B18, sammenlignet med den væsentlige forskel observeret mellem disse stammer i alle tre fluorescerende eksperimenter (figur3D-E) (multivariat ANAVA med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/stamme).

Indien blæk farves billeder, der opfylder de kriterier, der er anført i protokol (afsnit 5) kan måles ved hjælp af en automatiseret system. Arbejdsprocessen vist i figur 4A guider brugeren gennem trinene nødvendigt at udnytte opskrifterne beregnet til måling af C. neoformans kapsel. Efter udvikling af arbejdsprocessen, var det valideret ved at måle en cache af eksisterende billeder af C. neoformans celler af tre forskere bruger både manuelle og automatiske metoder. Der var ingen signifikant forskel mellem forskernes målinger når manuelt, og dette var også tilfældet, når målingerne blev foretaget ved hjælp af automatiserede billede analyse software (figur 4B) (ANOVA, prøvestørrelse = 50 celler/forsker). Men der var en lille, men signifikant forskel i kapsel størrelsen rapporteret mellem de to metoder (figur 4 c) ANOVA, prøvestørrelse = 150 celler/gruppe. Kapsel diameter var konsekvent lidt mindre når målt via automatisering end manuel målinger (0,3 µm, p < 0,001). Derudover ved sammenligning mellem kapsel størrelse målinger foretaget af separate forskere fra de samme billede sæt, var standardafvigelsen mindre da billede analyse software blev brugt til kvantificering i stedet for manuelle metoder, som er tyder på mere præcise og reproducerbar måling ved hjælp af den automatiserede metode. For vellykket automatiseret måling, celler skal være i fokus, har et medium til store kapsel, og ikke være alt for grupperet (figur 4D). Vi fandt, at dårligt fokuserede billeder af grupperet celler med små kapsler ikke kunne automatisk måles i softwaren. Men vi hævder, at disse også kan være udfordrende at måle præcist ved hjælp af manuelle metoder.

Figure 1
Figur 1 : Tusch farvning for at måle C. neoformans kapsel. (A) Skematisk fremstilling af C. neoformans kapsel måling af tusch farvning. Kort sagt, kapsel udtryk er foranlediget ved hjælp af næringsstof afsavn og eksponering til CO2, cellerne er genopslemmes i tusch og monteret på glas dias. Billeder af farvede celler er erhvervet ved lysmikroskopi, med felter enten valgt af brugeren eller af flise-scanning ved hjælp af en computerstyret stage. Billeder kan enten være analyseret manuelt eller forarbejdet til automatiseret billedsegmentering og analyse. (B) billeder af den fælles lab stamme, H99S og to kliniske stammer, B18 og B52, både før og efter kapsel induktion. Skala søjler repræsenterer 10 µm (C) grafen for en repræsentant eksperiment viser kapsel diameter af alle tre stammer farves med tusch og målt manuelt (fejl er repræsenteret som standard fejl (SE)). Statistisk signifikans angives som følger: *, p < 0,05; **, p < 0,01; og ***, p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Fluorescerende farvning for at måle C. neoformans kapsel. (A) skematisk gengivelse af C. neoformans kapsel måling af Calcofluor hvid (CFW) og 18B7-AF488 Co farvning. Efter kapsel induktion og farvning, er cellerne monteret og afbildet ved laser scanning Konfokal mikroskopi. Som celler kan have forskellige fokale planer, er z-stakke erhvervet ved hver position. Disse behandles for at producere maksimal intensitet fremskrivninger, der kan bruges til at præcist at måle den maksimale kapsel diameter for hver celle. (B) Billeder af den fælles lab stamme, H99S og to kliniske stammer, B18 og B52, kapsel efter induktion. Note: Skalaen søjler repræsenterer 10 µm af alle billeder. (C) maksimal intensitet fremskrivninger af fluorescently mærket C. neoformans celler. (D) Grafen for en repræsentativ eksperiment viser manuelt målte kapsel diameter af alle tre stammer farves med CFW og 18B7-AF488 (fejl er repræsenteret som standard fejl (SE)). Statistisk signifikans angives som følger: *, p < 0,05; **, p < 0,01; og ***, p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Sammenligning af resultater mellem tusch og fluorescerende farvning. (A) analyse af tre C. neoformans stammer farves med tusch eller fluorescerende farvestoffer, n = 3 (fejl er repræsenteret som standard fejl (SE)). (B) billeder af en enkelt C. neoformans celle farves med tusch og begge fluorescerende farvestoffer (skalalinjen repræsenterer 13 µm). Vandrette linjer afgrænse kanter af kapsel og lodrette streger afgrænse kanterne af cellen kroppen. (C) kvantificering af en repræsentativ eksperiment af H99S farves Co med tusch og fluorescerende farvestoffer (fejl er repræsenteret som standard fejl (SE)). (D, E) Skildring af kapsel diameter variabiliteten mellem tusch eksperimenter (D) og fluorescerende eksperimenter (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Beregningsmæssige analyse af C. neoformans kapsel diameter fra billeder af tusch farvede celler. (A) skematisk gengivelse af billedsegmentering og C. neoformans kapsel måling ved hjælp af en automatiseret måleteknik (Se Tabel af materialer). (B) sammenligning af kapsel målinger foretaget af 3 separate efterforskere bruger manual (manuel 1-3) og automatiserede metoder (Automated 1-3). Hver investigator bruges en identisk cache af C. neoformans billeder af begge metoder (fejl er repræsenteret som STDAFV). (C) kombinerede gennemsnit af manuelle målinger og automatiserede målinger (fejl er repræsenteret som standard fejl (SE)). Eksempler på både (D) ideal og (E) ikke-ideal billeder af C. neoformans. Ikke-ideelle billeder ikke kan måles med succes i softwaren. Statistisk signifikans angives som følger: *, p < 0,05; **, p < 0,01; og ***, p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I årtier været kapslen større fokus på forskningsområdet for både mycologists og klinikere interesseret i C. neoformans og cryptococcosis på grund af sin rolle som en større virulens faktor for patogenet. Ved hjælp af mikroskopi til at måle forskelle i kapsel størrelse mellem stammer og under forskellige vækst betingelser kan give vigtige oplysninger om patogenet og sine reaktioner på forskellige stimuli (dvs., forskellige miljøforhold, potentielle lægemiddelsbehandlinger m.m.)her, vi har skitseret en metode til at fremkalde vækst af kapsel i C. neoformans, og sammenlignede to forskellige kapsel farvningsprotokoller. Endelig viste vi, hvordan billedet analyse software kan bruges til at automatisere måling af kapsel diameter fra billeder af Indien blæk farves celler, giver resultater, der kunne sammenlignes med manuel målemetoder.

I vores forsøg og, sammenlignede vi to kliniske stammer, B18 og B52, med H99S, en standard lab stamme af kendte kapsel størrelse18. Begge farvning metoder viste, at den kliniske stamme, B52, havde den største kapsel diameter af de tre stammer testet. Resultater fra fluorescerende målinger kunne imidlertid at skelne en forskel mellem de to stammer med mindre kapsel størrelse hvor tusch målingerne ikke var. Resultaterne fra begge metoder til farvning var konsekvent, foreslår, at begge er gyldig, men at bruge billeder af fluorescently plettet C. neoformans kan give mulighed for øget følsomhed i måling stammer med lille kapsel. Ved hjælp af maksimal fremskrivninger genereret fra z-stak billeder af fluorescently farvede celler giver forskere til at sikre, at nøjagtige kapsel diameter målinger kan foretages, selv når de afbildede celler er i forskellige fokale planer. Disse målinger er vanskeligere for C. neoformans afbildet med tusch og standard lysmikroskopi. I et givet billede, kan tilstødende celler sidde i lidt forskellige fokale planer, hvilket gør det vanskeligt at præcist løse cellen kroppen-kapsel grænsen for alle celler. Dette kunne måske forvirre efterforskere evne til at detektere små ændringer i kapsel størrelse eller små forskelle mellem stammer.

Hver metode har sine egne iboende fordele. Tusch der oftest bruges af forskere på grund af dets overkommelige priser, brugervenlighed, og stabilitet (det ikke forringes med tiden ligesom nogle fluorescerende pletter kan). Fordi tusch er en enkel, negative plet det kan bruges sammen med standard lys mikroskoper, som er mere let tilgængelige end fluorescerende mikroskoper. Men hvis de ikke anvendes i de korrekte proportioner (Indien blæk: buffer), pletten kan oprette en "flagrende" baggrund når afbildet, hvilket kan komplicere automatiseret billedanalyse. Mens dyrere og mere tidskrævende at bruge, fluorescerende farvestoffer kan være fordelagtig for deres fleksibilitet, og som vi viser, deres følsomhed. De er særligt nyttige til måling af kapsel størrelse og celle byrde i eksperimenter, der involverer C. neoformans har været phagocytosed af immunceller, der er nødvendige for den histologiske undersøgelse af C. neoformans kapsel i vævsprøver (en teknik ikke er omtalt i denne artikel)32. Hvis farvning med fluorescerende farvestoffer, som calcofluor hvid eller fluorescently tagged anti-GXM antistoffer, er problematisk (f.eks.utilstrækkelige farvning), dette kan normalt løses ved at optimere farvnings-protokollen (stigende/faldende de koncentration og/eller inkubation tid med farvestoffet).

Uanset farvning metode, finde vi, at både kapsel induktion og ordentlig billedoptagelse er kritisk trin i protokollen. Den protokol, der er skitseret i dette papir er en af flere standard metoder for kapsel induktion i C. neoformans og har været anvendt med succes i gær labs for mange år23. C. neoformans kapsel induktion er CO2-afhængige og kun forekommer under stressende forhold23,33. Derfor er det afgørende, at det sker i en 5% CO2 inkubator ved hjælp af en passende næringsstof mangelfuld vækstmediet. Hvis der er mistanke om, at kapsel ikke har blevet induceret efter en standard periode af inkubationen (normalt 18-24 h), bør cellerne sammenlignes med en uninduced kontrol kultur, der ikke var udsættes for stressende forhold. Sammenligne to vil afgøre, hvorvidt induktion er effektive. En vellykket induktion er en, hvor fleste celler gøre en større kapsel, i forhold til den uninduced kontrol. Fordi ikke alle celler vil fremkalde, bør cellerne, der måles en heterogen repræsentation af de ledige celler.

Betydningen af ensartet billede erhvervelse kan ikke overvurderes, især hvis automatiseret måling er målet. Fokus, kontrast, baggrund fluorescens, såvel som den bitdybde og billede komprimering af filer er alle vigtige overvejelser. Når det er muligt, store klynger af celler, der ikke sidder i en enkelt brændplanet bør undgås, selv om nogle spirende og rørende celler kan accepteres og kan være uundgåelig (denne regel bør følges for både manuel og automatiseret måling). Dette problem kan omgås til en vis grad, når ved hjælp af Konfokal imaging af fluorescently farvede celler. Brug af z-stakke til at producere maksimal intensitet fremskrivninger kan aktivere nøjagtige målinger af celler i forskellige fokale planer fra et enkelt billede29. Derudover bør billeder erhverves hurtigt efter udarbejdelsen af prøven. Dette kan være særlig vigtig for Indien blæk farves prøver som når de begynder at tørre, kontrast mellem baggrunds- og forgrundsviden elementer (celler) kan mindske og uønsket baggrund funktioner kan blive styrket, hvilket fører til reduceret automatiseret segmentering nøjagtighed.

Selvom kapsel diameter målinger er hverdagskost i C. neoformans Fællesskabet, indtil dette tidspunkt har de typisk været udføres manuelt, som kræver betydelig tid og arbejdskraft. Men manuel målinger er accepteret i feltet og resultater kan opnås på lille udgift. Fremskridt i billed analyse software har gjort det muligt at tage de første skridt mod automatisere disse målinger. Den enkle karakter af C. neoformans cellen kroppen og kapsel - vises som en cirkel inden for en cirkel - i 2D-billeder gør måling af deres størrelser relativt enkel for automatiseret billede segmentering softwarepakker, uden at skulle udvikle roman algoritmer. I stedet, ved at sammenkæde eksisterende algoritmer, C. neoformans celler og kapsler kan registreres, segmenteret, og målt. Brug denne fremgangsmåde, har vi automatiserede målinger af C. neoformans kapsel diameter for celler farves med de mest almindeligt brugte kapsel farvestof, tusch, og har sammenlignet disse til manuel målinger for de samme datasæt. Denne metode giver gavn for reproducerbarhed og fjerner meget af den menneskelige fejl i forbindelse med manuel måling mens tidsbesparelse forsker. Desuden kan yderligere målinger integreres med en minimal indsats i arbejdsprocessen automatiseret analyse. Vi føler, at automatiserede billedanalyse er en lovende tilgang, der gør det muligt for forskere at måle stort tal af C. neoformans kapsel med en høj grad af nøjagtighed og effektivitet.

Samlet set har vi vist hvordan man med held at fremkalde kapsel vækst i C. neoformans, pletten prøver med tusch eller fluorescerende farvestoffer og måle kapsel diameter ved hjælp af både manuelle og automatiske målinger i en billedanalyse software. Vores resultater tyder på, at begge metoder til farvning er levedygtig og generelt producere ensartede resultater (selvom der er mere variation med tusch målinger). Yderligere, både manuelle og automatiske metoder til måling har evnen til at skelne varierende kapsel størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren, Hoyin Lai, er produktchef på DRVision, der udgiver den automatiserede billede analyse software, Aivia.

Acknowledgments

Vi takker Molekylær biovidenskab (MOBI) ph.d.-program og departementet biologi på Middle Tennessee State University (MTSU) for at yde støtte til denne undersøgelse. Projektet var også delvis finansieret af særlige projekter tilskud tildeles D.E.N. af MTSU Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Tags

Immunologi sag 132 Cryptococcus Neoformans kapsel virulens mønstergenkendelse billedanalyse automatiseret analyse gær
Size Matters: Måling af kapsel Diameter i <em>Cryptococcus neoformans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guess, T., Lai, H., Smith, S. E.,… More

Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter