Summary
Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.
Abstract
Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.
Introduction
Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l'agente causativo di dermatosi da criptococco1,2, 3. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record1. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente7. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti8.
Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)9. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi11. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l'ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)12. La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.
Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di15. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell'host ambiente16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l'esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO2 sono noti per avviare la crescita capsula16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un'infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito21,22. Questo è noto perché l'architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile23. Dispersione della luce e l'uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari24. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione23. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell'anticorpo24. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.
Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l'inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l'errore umano può influenzare il risultato.
Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l'analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini 25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l'interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.
Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell'inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.
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Protocol
Nota: C. neoformans è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) e i ricercatori che lavorano con esso devono prendere le dovute precauzioni. Procedure dettagliate su come sicuro lavoro con agenti patogeni BSL-2 può essere scoperto sul Center for Disease Control (CDC) sito Web, ma è importante notare che tutte le persone che vengono a contatto con il c. neoformans devono essere adeguatamente addestrate nella gestione gli agenti patogeni e dovrebbe sempre indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE), generalmente in lattice o nitrile guanti. Ulteriormente, rotori su centrifughe devono essere sigillati per evitare la nebulizzazione dei campioni e tutte le cadute ripulite immediatamente utilizzando una soluzione di candeggina al 10%28.
1. capsula induzione
Nota: Se non specificato diversamente, tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti a temperatura ambiente.
- Cultura di c. neoformans in brodo di lievito peptone destrosio (YPD) (pH 6,5 + /-0.2) e incubare a 37 ° C con agitazione fino a quando sono in fase di log (circa 18-36 h).
- Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a 21 ° C e lavare tre volte con tamponato fosfato salino (PBS).
- Utilizzare un emocitometro (o un contatore di cellule automatizzato) per contare le celle e risospendere a 2 x 105 cellule/2 mL in media essenziali minimi di Dulbecco (DMEM).
- Per indurre la capsula, incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 18 h.
Nota: La combinazione di assenza di sostanze nutritive nei media e la presenza di CO2 stimola la crescita capsula c. neoformans . - Post-incubazione, raccogliere le cellule centrifugazione (come sopra) e rimuovendo tutti, ma 5-10 µ l di supernatante. Allo stesso tempo, raccogliere un campione di ONU-indotta delle cellule corrispondenti per ogni sforzo deve essere misurata. Utilizzare questi come controlli negativi.
Nota: Il pellet cellulare sarà molto piccolo e può essere difficile da vedere. Prestare attenzione quando aspirare il surnatante. - Macchiare con l'inchiostro di India (sezione 2.1) o coloranti fluorescenti (sezione 2.2).
2. colorazione
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Colorazione con solo inchiostro di India
- Per macchiare il lievito con l'inchiostro di India, risospendere il pellet nel surnatante restante e aggiungere 4μL (circa metà) della sospensione cellulare e 4μL di inchiostro di China su un vetrino per microscopio. Delicatamente mescolare ed evitare la formazione di schiuma.
- Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
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Colorazione con solo le tinture fluorescenti
- Per macchiare il lievito con un colorante fluorescente, risospendere il pellet cellulare in 50 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
- Incubare la cultura con un volume uguale di Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e capsula mAb 18B7 (Vedi Tabella materiali) coniugato con AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) per 30 min a 37 ° C.
- Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a post-incubazione 21 ° C e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 10 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).
- Pipettare 8 µ l di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio.
- Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
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Colorazione con inchiostro di China e tinture fluorescenti
- Per confrontare più direttamente l'efficacia di inchiostro di India di colorazione a quella di coloranti fluorescenti, co-macchia stessa popolazione cellulare con entrambi i tipi di macchia. A tale scopo, prima di incubare le cellule con una capsula fluorescente e la macchia di parete cellulare, come da procedura 2.2.1 - 2.2.3.
- Successivamente, Pipettare volumi uguali (4 µ l) della sospensione cellulare fluorescente macchiato e inchiostro di China su una lastra di vetro. Mescolare delicatamente.
- Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.
3. immagine acquisizione/microscopia
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Cellule di imaging colorato con inchiostro.
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio a luce standard (ingrandimento 100 X).
- Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo, come questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato). Per questi esperimenti, le immagini sono state acquisite a una profondità di 16 bit con tempi di esposizione ottimizzati per massimizzare il contrasto dell'immagine riducendo al minimo la sfocatura causata da piccoli movimenti delle cellule.
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Cellule di imaging tinto con coloranti fluorescenti
- Per realizzare l'immagine delle cellule mediante microscopia a fluorescenza, aprire il software di imaging di microscopio e selezionare l'appropriato eccitazione e emissione lunghezze d'onda per i fluorofori utilizzati (CFW e AF488 sono eccitati utilizzando il 405nm e 488 nm luci, rispettivamente). Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
- Immagine un minimo di 50 cellule per condizione.
Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo in quanto questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato). - Acquisire una serie di immagini dello stack z delle cellule per garantire che si ottiene il massimo diametro capsula per ogni cella all'interno di un determinato campo.
- Del software di controllo del microscopio, fare clic sulla barra "z-stack" per aprire il pannello di controllo "z-stack", quindi selezionare l'opzione "Primo/ultimo" nell'angolo superiore sinistro del pannello.
- Utilizzare il controllo di fine-fuoco il microscopio per mettere a fuoco a un livello che è di sotto del punto più largo di una cellula di lievito singolo e le capsule per tutti entro il campo di vista corrente e fare clic su "Primo Set".
- Utilizzare il controllo di fine-fuoco per mettere a fuoco sopra il punto più largo del corpo cellulare della cellula stessa e della capsula per tutte le celle all'interno del campo di vista corrente e fare clic su "Imposta l'ultimo".
- Quindi, fai clic su "Avviare esperimento" nella scheda "Acquisizione" per acquisire lo z-stack per la posizione corrente. Ripetere il processo in più posizioni fino a quando sono state acquisite immagini dello stack z di un minimo di 50 cellule.
Nota: Per questi esperimenti, il foro stenopeico confocale è stato impostato su 1.0 AU e una sovrapposizione z-serie di 10-20 fette che coprono 0,7 µM ogni sono stati acquisiti presso le posizioni selezionate. AU = unità arioso.
- Successivamente, è possibile convertire ogni serie z-stack in proiezioni di massima intensità (MIP) utilizzando software di analisi di immagine appropriata.
Nota: La massima intensità a ogni piano dell' immagine impilata29del progetto MIPs. Creazione di MIPs permette di produrre una rappresentazione 2-D di immagini che corrispondono alla massima della cella e capsula diametro all'interno dello stack 3D acquisito.
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Cellule di imaging macchiato con l'inchiostro di India e tinture fluorescenti
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale o widefield (ingrandimento 40x) (63 X o 100 X ingrandimento). Per le cellule colorate con inchiostro di China e tinture fluorescenti, catturare immagini utilizzando un microscopio di widefield equipaggiato con un palco comandato da calcolatore e obiettivo a immersione in olio.
Nota: Il microscopio in uso dovrebbe essere controllato utilizzando un software di imaging CFW. la fluorescenza che è eccitato attraverso un filtro di eccitazione di 340-380 nm e la luce emessa deve essere rilevata attraverso un filtro di barriera di 435-485 nm riflettuto da uno specchio dicroico 400 nm. AF488 fluorescenza possa essere eccitato attraverso un filtro di eccitazione 465-495 nm, e la luce emessa può essere rilevato attraverso un filtro di barriera 515-555 nm riflettuto da uno specchio dicroico 505 nm. - Immagine un minimo di 50 cellule di ogni metodo di macchiatura per patologia.
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale o widefield (ingrandimento 40x) (63 X o 100 X ingrandimento). Per le cellule colorate con inchiostro di China e tinture fluorescenti, catturare immagini utilizzando un microscopio di widefield equipaggiato con un palco comandato da calcolatore e obiettivo a immersione in olio.
4. misura manuale della capsula
- Per le cellule colorate con inchiostro di China o macchie fluorescenti, utilizzare un software di misurazione di cella al diametro manualmente di capsula e cella di misura (Vedi Tabella materiali). Per fare questo, andare su "File" > "Apri immagine" > "Misura" e utilizzare il cursore per disegnare una linea retta attraverso il punto più largo della cella intera (diametro totale).
- Successivamente, fare nuovamente clic su "Misura" e disegnare una linea retta attraverso il corpo cellulare (diametro corpo cellulare).
Nota: Le misure sono salvati automaticamente sulle celle. - Ripetere questo processo per tutte le celle (minimo 50/gruppo).
- Per salvare le immagini una volta che sono misurati, fare clic su "File" > "Salva come" e il nome le immagini in modo appropriato.
- Selezionare i file appena misurati ed esportare dati in un software di foglio di calcolo.
- Calcolare il diametro medio capsula utilizzando l'equazione: ([diametro totale] - [Diametro corpo cellulare]).
5. automatici di misurazione della capsula
Nota: Per il successo di misura automatici, utilizzare immagini a 16 bit con un elevato livello di contrasto e che sono correttamente a fuoco insieme a un software di analisi di immagine appropriata (Vedi Tabella materiali). Quando imaging c. neoformans per capsula misurazione, è importante concentrarsi sull'anello scuro al confine tra la parete delle cellule e la capsula. Questo permette al software di delineare correttamente la cella e la capsula.
- Inverti e creare una copia di tutti i India inchiostro macchiato immagini cellulare utilizzando un appropriato software di fotoritocco (Vedi Tabella materiali). Per effettuare questa operazione, fare clic su "File" > "Apri" per aprire India inchiostro macchiato immagini e quindi su "controllo" + "I" per invertire l'immagine. Fare clic su "File" > "Salva con nome" per salvare l'immagine invertita.
- Per importare l'originale e invertito immagini nel software, fare clic su "File" > "Importa sequenza" > "Carica immagine" > "Definisci sequenza (manualmente)" > "Dimensioni (canale)" > "Importare" > "Applica".
Nota: I corpi delle cellule di c. neoformans e capsule possono essere identificati e mascherato utilizzando algoritmi specifici - indicati come 'ricette' - inclusi nel software. - Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' l'immagine invertita per rilevare e mascherare il corpo della cella, quindi fare clic su "applica". Nell'immagine invertita, l'anello scuro che definiscono i margini della cella c. neoformans diventa più luminoso della capsula circostante.
- Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' sull'immagine invertita per segmentare i corpi delle cellule di c. neoformans dalle loro capsule, quindi fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Corpo cellulare" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
Nota: La ricetta è costituito da più passaggi di elaborazione: sfondo rimozione, rilevamento di oggetti, separazione di oggetto e il filtro di sottoinsieme. - Successivamente, utilizzare la ricetta 'Proliferazione' sull'immagine originale per rilevare e mascherare la capsula e fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Capsula" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".
- Utilizzando la ricetta, 'Capsula partizione', creare una nuova maschera sull'immagine originale per partizionare capsule adiacente uno da altro. Per effettuare questa operazione, fare clic su "Capsula partizione" dal menu a discesa di ricetta. Nella finestra di partizione capsula, scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Capsula" (5,5) per capsula regione. Scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Corpo cellulare" per le celle Crypto (5,4). Scegliete "Originale" per il canale di ingresso e "Crea maschera per capsula partizionate. Fare clic su "applica
Nota: La ricetta crea delle cellule e diametro capsula, definita come la media degli assi più lungo e più breve attraversando il centro della cellula e capsula e misure di zona da maschere di rilevamento. Trovare l'uscita che si trova sotto la scheda di foglio di calcolo in questo software. Ripetere questo processo per tutte le immagini (minimo 50 cellule/gruppo). Parametri di ricetta potrebbero essere sintonizzati per ottimizzare la rilevazione di singole immagini o ottimizzati per il rilevamento di batch di immagini multiple. Ulteriori misurazioni è calcolabile con la ricetta per la completa caratterizzazione della cella e morfologia della capsula. - Esportare dati in un software di foglio di calcolo di scelta per ulteriori analisi.
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Representative Results
Per illustrare la capsula induzione, macchiatura delle cellule, imaging e tecniche di misurazione, abbiamo utilizzato tre ceppi di c. neoformans: ceppo il laboratorio comune, ben caratterizzato, H99S30e due ceppi clinicamente isolati di precedentemente diametro capsula sconosciuto, B18 e B5231.
Il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagini usando inchiostro di India è mostrato in Figura 1A. Immagini tratte da tutti e tre i ceppi sono mostrati in Figura 1B sia pre- che post-induzione. Il ricercatore saprà se l'induzione capsula era un successo confrontando le cellule che hanno subito la capsula induzione a quelli della stessa cultura che non hanno. Un aumento delle dimensioni chiaro risulta generalmente in maggior parte post-induzione di ceppi, anche se alcuni ceppi esporrà naturalmente piccole capsule anche dopo induzione (Vedi immagini di B18 in Figura 1B). Si deve osservare che la capsula induzione avrà esito negativo se residui contenuti multimediali non viene rimosso prima dell'induzione o CO2 non è presente. In questi casi, si osserverà solo modesto (se qualsiasi) aumenta di dimensioni capsula. Diametri da tutti e tre i ceppi sono stati misurati manualmente e i risultati sono mostrati nella Figura 1. In due dei tre esperimenti, non c'era differenza di dimensioni tra H99S e B18. Tuttavia, una differenza significativa nella dimensione costantemente è stata osservata fra il più grande sforzo, B52 e H99S e B18 (p < 0,001 e p < 0,001, rispettivamente, quadrati almeno standard test con semplici contrasti, dimensione di campione = 50 cellule/deformazione ).
Figura 2A raffigura il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagini utilizzando due coloranti fluorescenti, uno per la capsula (18B7-AF488) e uno per la parete cellulare (Calcofluor White). Le immagini sono state acquisite come z-pile per tutti e tre i ceppi post-induzione, assicurando che il diametro massimo di capsula e corpo cellulare è stato catturato per ogni cella deve essere misurata (Figura 2B). Ogni z-stack è stato elaborato per produrre proiezioni di massima intensità, comprimendo lo stack 3-dimensionale in un'immagine 2D prima dell'analisi (Figura 2). Questi allora sono stati misurati manualmente (Figura 2D). A differenza le misurazioni per inchiostro macchiato le cellule, la colorazione abilitato per discriminare tra tutti e tre i ceppi sulla base del loro diametro capsula in tutti e tre di fluorescente ripetizioni dell'esperimento. Qui, abbiamo trovato che B18 aveva il più piccolo diametro capsula e B52 il più grande (p < 0,001 per tutti i confronti, test di minimi quadrati standard con semplici effetti, modella indossa la taglia = 50 cellule/ceppo).
Per valutare ulteriormente i due metodi di colorazione capsula c. neoformans , misure da tutti e tre i ceppi sono state confrontate. Non c'era differenza significativa tra le dimensioni capsule determinato utilizzando i due metodi di colorazione (Figura 3A) (ANOVA multivariata con semplici effetti, modella indossa la taglia = 50 cellule/ceppo). Questa conclusione è coerenza con i risultati di un esperimento separato dove il ceppo di laboratorio, H99S, è stato co-macchiato con l'inchiostro di India e coloranti fluorescenti (Figura 3B-C). Tuttavia, c'era una maggiore variabilità tra gli esperimenti usando inchiostro di India, come dimostra il fatto che solo uno su tre esperimenti hanno mostrato una differenza significativa nella capsula dimensione tra H99S e B18, rispetto alla differenza significativa osservata tra questi ceppi in tutti e tre gli esperimenti fluorescenti (Figura3D-E) (ANOVA multivariata con semplici effetti, modella indossa la taglia = 50 cellule/ceppo).
Inchiostro di India tinto immagini che soddisfano i criteri elencati nel protocollo (sezione 5) può essere misurata utilizzando un sistema automatico. Il flusso di lavoro riportato in Figura 4A guide l'utente attraverso i passi necessari per utilizzare le ricette progettato per misurare la capsula di c. neoformans . Dopo aver sviluppato il flusso di lavoro, è stata convalidata misurando una cache di immagini esistenti delle cellule di c. neoformans da tre ricercatori utilizzando metodi manuali e automatizzati. Non c'erano differenze significative tra le misurazioni del ricercatore quando effettuata manualmente, e questo era vero anche quando le misurazioni sono state effettuate utilizzando il software di analisi di immagine automatizzato (Figura 4B) (ANOVA, dimensione di campione = 50 cellule/ricercatore). Tuttavia, c'era una piccola ma significativa differenza nelle dimensioni capsula segnalato tra i due metodi ANOVA (Figura 4), dimensione del campione = 150 cellule/gruppo. Diametro capsula era costantemente leggermente più piccola di quando misurato tramite l'automazione di misurazioni manuali (0,3 µm, p < 0,001). Inoltre, quando si confrontano tra capsula dimensione misurazioni fatte da ricercatori separati dagli stessi insiemi di immagine, l'errore standard era più piccola quando software di analisi di immagine è stato usato per la quantificazione invece di metodi manuali, che è indicativa di più misurazioni precise, riproducibili utilizzando il metodo automatizzato. Per successo di misura automatizzato, cellule devono essere a fuoco, dispone di un mezzo alla capsula di grandi dimensioni e non essere eccessivamente cluster (Figura 4). Abbiamo trovato che immagini mal messe a fuoco delle cellule in cluster con piccole capsule non possono essere misurate automaticamente nel software. Tuttavia, affermiamo che questi possono anche essere difficili da misurare con precisione utilizzando metodi manuali.
Figura 1 : Inchiostro di India macchiatura per misurare C. neoformans capsula. (A) Rappresentazione schematica di c. neoformans capsula misura macchiando di inchiostro di India. In breve, capsula espressione è indotta tramite la privazione nutriente e l'esposizione a CO2, le cellule sono risospese in inchiostro di India e montate su vetrini. Immagini di cellule marcate sono acquisite da microscopia chiara, con campi che o selezionati dall'utente o da piastrelle-scansione utilizzando una fase controllati dal computer. Immagini possono essere analizzati manualmente o trattati per analisi e segmentazione di immagini automatizzata. (B) immagini del comune sforzo di laboratorio, H99S e due ceppi clinici, B18 e B52, induzione sia pre- che post-capsula. Barre della scala rappresentano 10 µm (C) il grafico di un rappresentante sperimentare il diametro capsula visualizzando tutti i tre ceppi colorato con inchiostro e misurato manualmente (errore è rappresentato come errore standard (SE)). Significatività statistica è indicata come segue: *, p < 0,05; * *, p < 0.01; e * * *, p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Colorazione fluorescente per misurare C. neoformans capsula. (A) rappresentazione schematica di c. neoformans misura capsula di Calcofluor White (CFW) e 18B7-AF488 co-macchiatura. Dopo induzione capsula e colorazione, le cellule sono montate e ripreso da microscopia confocale a scansione laser. Come le cellule possono essere in diversi piani focali, z-stack vengono acquisiti in ogni posizione. Questi vengono elaborati per produrre proiezioni di intensità massima che possono essere utilizzate per misurare con precisione il diametro capsula massimo per ogni cella. (B) Immagini del ceppo di laboratorio comuni, H99S e due ceppi clinici, B18 e B52, post-capsula induzione. Nota: Barre della scala rappresentano 10 µm per tutte le immagini. (C) massimo proiezioni di intensità di fluorescente etichettati cellule di c. neoformans . (D) Grafico di un esperimento rappresentanza risultati manualmente misurato diametro capsula di tutti e tre i ceppi macchiato con CFW e 18B7-AF488 (errore è rappresentato come errore standard (SE)). Significatività statistica è indicata come segue: *, p < 0,05; * *, p < 0.01; e * * *, p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Confronto dei risultati tra inchiostro di India e colorazione fluorescente. (A) analisi dei tre ceppi di c. neoformans macchiato con l'inchiostro di India o tinture fluorescenti, n = 3 (errore è rappresentato come errore standard (SE)). (B) immagini di una singola cella di c. neoformans macchiato con l'inchiostro di India e due coloranti fluorescenti (barra della scala rappresenta 13 µm). Linee orizzontali delimitano i bordi della capsula e linee verticali delimitano i bordi del corpo cellulare. (C) quantificazione di un esperimento di rappresentante di H99S co-macchiato con l'inchiostro di India e coloranti fluorescenti (errore è rappresentato come errore standard (SE)). (D, E) Raffigurazione della variabilità di diametro capsula tra esperimenti di inchiostro di India (D) ed esperimenti fluorescenti (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi computazionale di C. neoformans capsula diametro da immagini di India inchiostro macchiato cellule. (A) rappresentazione schematica di segmentazione di immagini e di c. neoformans capsula misura utilizzando una tecnica di misura automatizzati (Vedi Tabella materiali). (B) confronto delle capsule misure eseguite da 3 investigatori separati utilizzando metodi automatizzati (Automated 1-3) e manual (manuale 1-3). Ogni investigatore utilizzato una cache identica di c. neoformans immagini con entrambi i metodi (errore è rappresentato come StDev). (C) combinato media delle misurazioni manuali e misure automatizzate (errore è rappresentato come errore standard (SE)). Esempi di ideale sia (D) e immagini non ideale (E) di c. neoformans. Immagini non-ideale non possono essere misurati correttamente nel software. Significatività statistica è indicata come segue: *, p < 0,05; * *, p < 0.01; e * * *, p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l'agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l'agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti farmacologici, ecc.) qui, che abbiamo descritto un metodo per indurre la crescita della capsula in c. neoformans, e confrontati due differenti protocolli di colorazione della capsula. Infine, abbiamo mostrato come software di analisi di immagine consente di automatizzare la misura del diametro capsula da immagini di India inchiostro macchiato le cellule, producendo risultati che erano paragonabili ai metodi di misurazione manuale.
Nei nostri esperimenti, abbiamo confrontato due ceppi clinici, B18 e B52, con H99S, un ceppo di laboratorio standard di dimensione capsula Nota18. Entrambi macchiatura metodi hanno dimostrato che il ceppo clinico, B52, aveva il più grande diametro capsula dei tre ceppi testati. Tuttavia, risultati dalle misure di fluorescenza sono stati in grado di discernere la differenza tra i due ceppi con dimensione capsula inferiore dove l'inchiostro di India misure non erano. I risultati di entrambi i metodi di colorazione erano costanti, suggerendo che entrambi sono validi ma che utilizza immagini di fluorescente macchiato c. neoformans può consentire per una maggiore sensibilità nei ceppi con la piccola capsula di misurazione. Utilizzando proiezioni massime generate dalle immagini dello stack z di fluorescente cellule marcate permette ai ricercatori di garantire che diametro capsula accurate misurazioni possono essere eseguite anche quando le cellule imaged sono in diversi piani focali. Queste misurazioni sono più difficili per c. neoformans Imaging utilizzando inchiostro di India e microscopia luce standard. In una data immagine, celle adiacenti possono riunirsi in leggermente diversi piani focali, che lo rende difficile da risolvere con precisione il contorno del corpo cellulare-capsula per tutte le celle. Ciò forse potrebbe confondere la capacità degli investigatori di rilevare piccole variazioni nella capsula dimensione o piccole differenze tra i ceppi.
Ogni metodo ha i suoi vantaggi intrinseci. Inchiostro di India è il più comunemente usato dai ricercatori per la sua convenienza, facilità d'uso e la stabilità (non degrada nel tempo come alcune macchie fluorescenti possono). Perché l'inchiostro di India è una macchia semplice, negativa, che può essere utilizzato in combinazione con microscopi ottici standard, che sono più facilmente disponibili di microscopi fluorescenti. Tuttavia, se non utilizzato nelle proporzioni corrette (India Ink: buffer), la macchia può creare uno sfondo "pennuto" quando immaginata, che può complicare l'analisi automatizzata delle immagini. Mentre costosi e più laborioso da usare, tinture fluorescenti possono essere vantaggiose per la loro flessibilità, e come ci mostrano, la loro sensibilità. Sono particolarmente utili per la misurazione degli oneri di dimensione e cella capsula negli esperimenti che coinvolgono c. neoformans che hanno stato phagocytosed dalle cellule del sistema immunitario e sono necessari per l'esame istologico di c. neoformans capsula in campioni di tessuto (una tecnica non descritta in questo articolo)32. Se la colorazione con coloranti fluorescenti, come calcofluor white o anticorpi anti-GXM fluorescente contrassegnati, è problematico (ad es., colorazione insufficiente), questo in genere può essere superato attraverso l'ottimizzazione del protocollo di colorazione (aumentando/diminuendo il Ora concentrazione e/o di incubazione con il colorante).
Indipendentemente dalla metodologia di colorazione, troviamo che la cattura dell'immagine corretta sia l'induzione capsula sono passaggi critici nel protocollo. Il protocollo descritto in questa carta è uno dei diversi metodi standard per l'induzione capsula nelle c. neoformans ed è stato utilizzato con successo nei laboratori di lievito per molti anni23. C. neoformans capsula induzione è CO2-dipendente e si verifica solo in condizioni di stress23,33. Pertanto, è fondamentale che si verifica in un incubatore di2 CO 5% utilizzando un supporto appropriato sviluppo carente dei nutrienti. Se si sospetta che capsula non è stata indotta dopo un periodo di incubazione (generalmente 18-24 h) standard, le cellule devono essere confrontate con una coltura di controllo uninduced che non è stato esposto a condizioni di stress. Confrontando i due determinerà se l'induzione è stata efficace. Una riuscita induzione è uno in cui la maggior parte delle cellule produce una capsula più grande, rispetto al controllo uninduced. Perché non tutte le celle indurrà, le cellule da misurare devono essere una rappresentazione eterogenea di cellule disponibili.
L'importanza dell'acquisizione di un'immagine coerente non può essere sopravvalutata, soprattutto se misura automatizzato è l'obiettivo. Messa a fuoco, contrasto, fluorescenza di fondo, così come la profondità di bit e immagine compressione dei file è tutti importanti considerazioni. Quando possibile, grandi aggregati di cellule che non siedono in un unico piano focale dovrebbero essere evitati, anche se alcuni in erba e toccare le cellule sono accettabili e può essere inevitabile (questa regola deve essere seguita per manuali e automatizzati di misurazione). Questo problema può essere aggirato in una certa misura quando utilizzando imaging confocale di fluorescente macchiato le cellule. L'uso di z-stack per produrre proiezioni di massima intensità possibile abilitare misura accurata delle cellule in diversi piani focali da una singola immagine29. Inoltre, immagini dovrebbero essere acquisiti rapidamente dopo la preparazione del campione. Questo può essere particolarmente importante per l'inchiostro di India tinto campioni come quando cominciano ad asciugare, può diminuire il contrasto tra gli elementi di sfondo e primo piano (le cellule) e possono essere migliorate caratteristiche di sfondo indesiderati, che conduce al ridotto automatizzato precisione di segmentazione.
Sebbene misure di diametro capsula sono all'ordine del giorno nella comunità di c. neoformans , fino a questo punto essi sono in genere stati effettuati manualmente, che richiede notevole tempo e risorse umane. Tuttavia, misurazioni manuali sono accettati in campo e risultati possono essere ottenuti a spese poco. Progressi nel software di analisi di immagine hanno reso possibile prendere i primi passi verso l'automazione di queste misurazioni. La natura semplice del corpo cellulare c. neoformans e capsula - che appare come un cerchio all'interno di un cerchio - immagini 2D rende la misurazione delle loro dimensioni relativamente semplice per i pacchetti di software di segmentazione automatica immagine, senza la necessità di sviluppare il romanzo algoritmi. Invece, collegando gli algoritmi esistenti, capsule e cellule di c. neoformans possono essere rilevati, segmentati e misurati. Utilizzando questo approccio, abbiamo automatizzato le misurazioni del diametro capsula c. neoformans per cellule colorate con il più comunemente usata capsula tintura, inchiostro di India e hanno confrontato questi per misurazioni manuali per i set di dati stessi. Questo metodo offre il vantaggio di riproducibilità e rimozione gran parte dell'errore umano associato di misura manuale, risparmiando il tempo di ricercatore. Inoltre, ulteriori misure possono essere incorporate con il minimo sforzo nel flusso di lavoro di analisi automatizzata. Riteniamo che l'analisi automatizzata delle immagini sono un approccio promettente che permette ai ricercatori di misurare un numero elevato di c. neoformans capsula con un alto grado di precisione ed efficienza.
Nel complesso, abbiamo dimostrato come per indurre la crescita capsula in c. neoformans, macchia i campioni con inchiostro di China o tinture fluorescenti e misurare diametro capsula utilizzando misurazioni manuali e automatizzati in un'analisi di immagine software. I nostri risultati suggeriscono che entrambi i metodi di colorazione sono vitali e generalmente producono risultati coerenti (anche se non c'è più variabilità con misurazioni dell'inchiostro di India). Inoltre, metodi manuali e automatizzati di misura hanno la capacità di discernere le diverse dimensioni capsule.
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Disclosures
L'autore, Hoyin Lai, è il product manager di DRVision che pubblica il software di analisi di immagine automatizzato, Aivia.
Acknowledgments
Ringraziamo il programma di dottorato di scienze biologiche molecolari (MOBI) e il dipartimento di biologia a Middle Tennessee State University (MTSU) per fornire i finanziamenti per questo studio. Il progetto è stato inoltre finanziato in parte da una sovvenzione di progetti speciali per D.E.N. dalla Fondazione MTSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
