Summary
다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.
Abstract
다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.
Introduction
매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 요인 있다. Acapsular 변종 악성8되지 않는 다 당 류 캡슐 미생물의 기본 독성 요인으로 간주 됩니다.
Cryptococcal 캡슐의 3 개의 원리 구성 요소를 만든: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), mannoproteins (MPs)9. MPs는 캡슐의 비교적 작은 세포 벽 관련 구성 요소, 면역성 이며 주로 프로 염증 반응을9,10를 홍보할 수 있습니다. GXM 및 GalXM 캡슐의 대부분을 확인 하는 반면, (> 90% 무게에 의해) 면역 효과11있다. 그것의 immunomodulatory 효과 이외에는 캡슐 vivo에서 의 급속 한 확대는 호스트 phagocytic 세포 (즉, 중 성구 및 대 식 세포)12섭취에 기계적인 장벽을 만듭니다. C. neoformans 캡슐과 그것의 종합은 복잡 하지만 전반적으로, 증가 캡슐 직경 증가 독성6,,1314와 상관 된다. 이 감안할 때, 신속 하 고 정확 하 게 계량 캡슐 측정 수 C. neoformans 연구에 대 한 중요 하다.
C. neoformans 세포와 그것의 다 당 류 캡슐 동적 구조 이며 시간15변화 표시. 캡슐은 밀도, 크기, 및 호스트 환경16,,1718의 변화에 대 한 응답에서 어셈블리에서 변경할 수 있습니다. 낮은 철 또는 영양 수준, 혈 청, 인간의 생리 적 pH를 증가 CO2 노출 캡슐 성장16,18,,1920를 시작으로 알려져 있습니다. 또한, 연구원은 보여주었다는 감염 시 immunoreactivity에 큰 차이가 발생 하는 구조적인 변화 대출 호스트 C. neoformans 를 이점을21,22. 이것은 C. neoformans 캡슐의 아키텍처는 다양 한 방법으로 분석 하기 때문에 알려져 있다. 전자 현미경 검사 법, 예를 들어 캡슐 외부, 더 투과 층23아래 내부 전자 밀도 레이어와 이기종 매트릭스는 계시 했다. 산란 및 광학 족집게를 사용 하 여 연구자의 고분자 속성24더 명료를 허용 했습니다. 둘 다 정적 및 동적 산란 측정에서 결과 분석, 우리는 알고 다 당 류 캡슐 복잡 한 분기 구조23있다. 광학 핀셋 구조 강성을 테스트 하 고 평가 하는 그것의 항 체 반응24사용 되었습니다. 그러나, 지금까지 가장 자주 고용된 분석 C. neoformans 캡슐의 그것의 크기의 측정 이다.
캡슐 크기 척도, 연구원은 간단한 측정 해야 사용: 캡슐의 선형 직경. 디지털 현미경 인도 잉크 또는 형광 염료와 스테인드 여러 C. neoformans 셀 (일반적으로 수백)의 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 각 셀 몸과 주변 캡슐의 크기 측정 됩니다. 데이터는 컴파일하고 캡슐의 평균 직경 (셀 바디 + 캡슐) 전체 셀 직경에서 세포 체 직경을 빼서 계산 됩니다. 이 시점까지이 측정 수행 되었습니다 수동으로. 그러나 일반적으로 정확 하 고, 연구자에 대 한이 메서드는 단점이 있습니다. 큰 데이터 집합 며칠이 걸릴 수 있습니다 또는 직접 분석 하는 주. 그리고 이러한 측정 수동으로 할 수 있습니다, 때문에 주관과 인간의 오류 영향을 미칠 수 결과.
자동화 된 컴퓨터 이미지 분석 생물 이미지 25,,2627의 더 빠르고 더 신뢰할 수 있는 분석을 사용 하는 분자 세포 생물학의 여러 분야에서 연구자 불가 결 한 도구가 되고있다. 정확한 이미지 분석 기법 무엇입니까 종종 복잡 하 고 거 대 한 데이터 집합에서 양적 정보 내 필요 하다. 그러나, 일부 측정, 특히 C. neoformans 캡슐의 측정을 자동화 하기 어려운 되었습니다. 정확 하 게 식별 하는 세포 벽과 캡슐, 일반적으로 어두운 링 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 군데 나타나는 간의 인터페이스 간단한 임계값을 사용 하 여 해결 성가신 될 수 있습니다. 또한, C. neoformans 세포 문화에 함께 덩어리 하는 경향이 셀의 정확한 세분화 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
이 프로젝트의 목표는 (i) C. neoformans, (ii) 비교 및 대비 인도 잉크 캡슐 유도 대 한 표준 프로토콜 중 하나를 설명 했다 고 형광 얼룩으로 직경 측정 캡슐 관련 된 (iii) 개발 간단 하 고, 계산 방법 인도 잉크 얼룩이 이미지 분석 소프트웨어, (iv)를 사용 하 여 셀의 이미지를 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 이점 및 제한 수동으로 캡슐 직경을 측정 하 고 소프트웨어 자동화를 사용 하 여의 평가 합니다. 우리 두 착 방법, 형광 세포 벽 및 캡슐의 라벨의 찾을, 더 시간이 걸리는 반면, 실험 사이 가장 일관 된 결과 제공. 그러나 두 방법 모두 성공적으로 구별을 사용 하는, 실험실 및 임상 C. neoformans 사이 긴장 다른 전시 캡슐 크기. 또한, 우리는 인도 잉크 얼룩이 이미지에서에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하 고 이것은 캡슐의 수동 측정에 대안을 발견 수 있었다.
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Protocol
참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 항상 착용 해야 합니다. 또한, 샘플 및 어떤 유출2810% 표 백제 솔루션 사용 하 여 즉시 정리의 aerosolization를 방지 하기 위해 원심 분리기에로 터를 봉인 한다.
1. 캡슐 유도
참고: 모든 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행 되어야 합니다.
- C. neoformans 효 모 펩 포도 당 (YPD) 국물 (pH 6.5 ± 0.2)에서 문화 그리고 로그 단계 (약 18-36 h) 때까지 떨고와 37 ° C에서 품 어.
- 870 x g 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 세 번 세척.
- 사용 하 여 셀을 계산 하 여 Dulbecco의 최소한의 필수 미디어 (DMEM)에서 2 × 105 셀/2 mL에 resuspend는 hemocytometer (또는 자동화 된 셀 카운터).
- 캡슐을 유도를 37 ° C, 5% CO2 18 h에서 품 어.
참고: 미디어에 영양소의 부재와 CO2 의 존재의 조합 C. neoformans 캡슐 성장을 자극. - 후 보육 (위에서) centrifuging 표면에 뜨는 모든 하지만 5-10 µ L을 제거 하 여 세포를 수확. 동시에 각 스트레인 측정에 대 한 해당 취소 유발된 셀 샘플을 수확. 이러한 부정적인 컨트롤을 사용 합니다.
참고: 셀 펠 릿 아주 작은 되며 볼 하기 어려울 수 있습니다. 상쾌한 발음 할 때 주의 해야 합니다. - 인도 잉크 (섹션 2.1) 또는 형광 염료 (섹션 2.2) 얼룩.
2. 얼룩
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만 인도 잉크 얼룩
- 인도 잉크와 누 룩 얼룩, 나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend와 4μL를 추가 (약 절반) 세포 현 탁 액 및 유리 현미경 슬라이드에 인도 잉크의 4μL의. 부드럽게 혼합 하 고 거품을 방지.
- 13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.
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형광 염료와 염색
- 형광 염료와 누 룩 얼룩, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 50 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.
- Calcofluor 화이트 (CFW)의 동등한 양으로 문화를 품 어 (1 µ g/mL) 및 캡슐 mAb 18B7 AlexaFluor488을 활용 ( 재료의 표참조) (AF488) (10 µ g/mL) 37 ° c.에 30 분
- 870 x g 후 보육 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.
- 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 유리 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 8 µ L 플라스틱
- 13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.
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인도 잉크와 형광 페인트 얼룩
- 인도 잉크 형광 페인트의 얼룩의 효능을 직접 비교를 공동 얼룩의 두 종류와 같은 세포 인구 얼룩. 이렇게 하려면 먼저 셀 형광 캡슐와 단계 2.2.1-2.2.3에 의하여 세포 벽 얼룩을 품 어.
- 다음, 붙일 스테인드 세포 현 탁 액 및 인도 잉크를 유리 슬라이드에 동일 볼륨 (4 µ L) 플라스틱. 부드럽게 섞는다.
- 13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 비-독성 실 란 (투명 매니큐어)와 가장자리를 밀봉.
3. 이미지 수집/현미경
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인도 잉크 얼룩이 세포 이미징.
- 표준 가벼운 현미경 (100 X 배율)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다.
참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼, 최소한 지켜질. 이 실험에 대 한 이미지는 노출 시간 셀의 작은 움직임으로 인 한 흐림 효과 최소화 하면서 이미지 대비를 극대화 하기 위해 최적화 된 16 비트 깊이에 인수 했다.
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형광 염료와 스테인드 세포 이미징
- 형광 현미경 검사 법에 의해 셀을 이미지를 현미경 이미징 소프트웨어 열고 fluorophores 사용에 대 한 적절 한 여기 및 방출 파장 선택 (CFW와 AF488는 흥분는 405nm 전등과 488 nm, 각각 사용 하 여). 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다.
참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼 최소한 지켜질. - 특정된 필드 내에서 각 셀에 대 한 최대 캡슐 직경 얻을 수 있도록 셀의 z-스택 이미지 시리즈를 취득 합니다.
- 현미경 제어 소프트웨어에서 "z-스택" 바 "z-스택" 컨트롤 패널을 열고 패널의 왼쪽된 위 모퉁이에서 "첫 번째/마지막" 옵션을 선택을 클릭 합니다.
- 초점을 현미경에 정밀한 초점 제어를 사용 하 여 단일 효 모 세포와 모든 현재 시야 내에서 캡슐의 넓은 포인트 이며 클릭 "설정 첫 번째" 수준.
- 현재 시야 내에서 셀의 모든 캡슐과 같은 셀의 셀 시체의 포인트로 위에 초점을 정밀한 초점 컨트롤을 사용 하 고 "마지막 설정"을 클릭 합니다.
- 그런 다음 현재 위치에 대 한 z-스택 얻으려고 "수집" 탭에서 "실험 시작"을 클릭 합니다. 여러 위치에 프로세스를 반복 하 여 최소 50 셀의 z-스택 이미지 획득.
참고: 이러한 실험 confocal pinhole 설정 되었습니다 1.0 AU와 0.7 µ M를 커버 하는 10-20 조각의 겹치는 z 시리즈는 선택한 위치에 인수 했다. AU = 공기 단위.
- 다음, 각 z 스택 시리즈 변환 최대 강도 예측 (MIP) 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여.
참고: MIPs 프로젝트 스택된 이미지29의 모든 면에서 가장 큰 강도. MIPs를 만드는 생산 최대 셀 및 스택 내에 캡처된 3 차원 캡슐 직경에 해당 하는 이미지의 2 차원 표현을 하나 있습니다.
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인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 세포 이미징
- Widefield (40 배 확대) 나 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 (63 X 또는 100 배 확대). 인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 셀에 대 한 컴퓨터 제어 단계와 기름 침수 목표 widefield 현미경을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.
참고: 사용 중인 현미경 해야 제어할 수 CFW 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 340-380 nm 여기 필터를 통해 흥분 하 고 빛을 방출 하는 형광은 400 nm dichroic 거울에서 반영 435-485 nm 배리어 필터를 통해 감지 한다. AF488 형광 465-495 nm 여기 필터를 통해 흥분 수 그리고 방출된 빛 515-555 nm 배리어 필터 505 nm dichroic 거울에서 반사를 통해 검출 될 수 있다. - 각 착 방법에 대 한 조건 당 50 셀의 최소 이미지.
- Widefield (40 배 확대) 나 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 (63 X 또는 100 배 확대). 인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 셀에 대 한 컴퓨터 제어 단계와 기름 침수 목표 widefield 현미경을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.
4. 수동 측정 캡슐의
- 인도 잉크 또는 형광 성 얼룩으로 얼룩이 셀, 수동으로 측정 캡슐 및 셀 직경 셀 측정 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면, "파일"로 이동 > "이미지 열기" > "측정"을 커서를 사용 하 여 전체 셀 (전체 직경)의 가장 넓은 지점을 통해 직선을 그립니다.
- 다음, 다시 "측정"을 클릭 하 고 세포 체 (세포 체 직경)를 통해 직선을 그립니다.
참고: 측정 셀에 자동으로 저장 됩니다. - 모든 셀 (최소 50/그룹)에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
- 그들은 측정 됩니다 일단 이미지를 저장 하려면 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장" 하 고 이미지를 적절 하 게 이름을.
- 새로 측정된 파일을 선택 하 고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어를 내보낼.
- 방정식을 사용 하 여 캡슐 평균 직경을 계산: ([총 직경]-[셀 본체 지름]).
5. 자동화 측정 캡슐의
참고: 성공적인 자동화 된 측정을 위해 16 비트 이미지를 사용 대비 높은 수준 하 고는 제대로 적절 한 이미지 분석 소프트웨어 함께 초점을 맞추고 있다 ( 재료의 표참조). C. neoformans 캡슐 측정에 대 한 이미지 때 그것은 세포 벽과 캡슐 사이 경계에 어두운 반지에 집중 하는 것이 중요. 소프트웨어를를 제대로 셀 및 캡슐을 나타내는 수 있습니다.
- 반전 및 모든 인도 잉크 묻은 적절 한 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 셀 이미지의 복사본을 만듭니다 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면 "파일" > "열기" 인도 잉크 얼룩이 이미지를 연 다음 "제어" + "나"는 이미지를 반전. 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장"을 거꾸로 이미지를 저장.
- 원래와 거꾸로 가져올 소프트웨어에 이미지 클릭 "파일" > "가져오기 순서" > "로드 이미지" > "정의 시퀀스 (수동으로)" > "치수 (채널)" > "가져오기" > "적용".
참고: C. neoformans 세포 시체 및 캡슐 확인 될 수 있다 고 '조리법'-는 소프트웨어에 포함 된로-특정 알고리즘을 사용 하 여 마스크. - 거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 검색 하 고 셀 바디 마스크 다음 "적용"을 클릭 합니다. 거꾸로 이미지에서 C. neoformans 세포의 경계를 정의 하는 어두운 반지 주변 캡슐 보다 밝게 된다.
- 거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 그들의 캡슐에서 C. neoformans 세포 시체를 세그먼트 다음 "적용" 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "셀 몸"를 이름을 바꿉니다.
참고: 여러 이미지 처리 단계 제조 법 구성: 배경 제거, 물체 감지, 개체 분리 및 하위 집합 필터링. - 다음, 원본 이미지에 ' 세포 증식 ' 제조 법을 사용 하 여 캡슐, 마스크를 감지 하 고 "적용"을 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "캡슐"을 이름을 바꿉니다.
- 서로 인접 한 캡슐을 분할 하는 원본 이미지에 새로운 마스크를 만들기 제조 법, ' 캡슐 파티션 '을 사용 하 여. 이렇게 하려면 제조 법 드롭 다운 메뉴에서 "파티션 캡슐"을 클릭 합니다. 캡슐 파티션 상자에서 캡슐 영역에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "캡슐" (5.5)을 선택 합니다. Crypto 셀 (5.4)에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "바디 셀"을 선택 합니다. 입력된 채널, 및 "분할 캡슐에 대 한 마스크 만들기"원본 "를 선택입니다. 클릭 "적용
참고: 제조 법 셀 및 캡슐 직경, 길고 짧은 축 검출 마스크에서 셀과 캡슐, 및 지역 측정의 센터를 교차의 평균으로 정의 생성 합니다. 이 소프트웨어의 스프레드시트 탭 아래에 있는 출력을 찾아. 모든 이미지 (최소 50 셀/그룹)에 대해이 프로세스를 반복 합니다. 제조 법의 매개 변수 개별 이미지의 최적화를 조정 하거나 여러 개의 이미지의 일괄 검색에 대 한 최적화 된 수 있습니다. 추가 측정 셀 및 캡슐의 형태학의 포괄적인 특성화에 대 한 제조 법으로 계산할 수 있습니다. - 추가 분석을 위해 선택의 스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.
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Representative Results
캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231.
캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 그림 1A에 표시 됩니다. 모든 3 개의 긴장에서 촬영 한 이미지는 사전 및 사후 유도 그림 1B 에서 표시 됩니다. 연구원은 캡슐 유도 하지 않은 동일한 문화에서 그 캡슐 유도 받은 셀을 비교 하 여 성공 했는지 알 수 있습니다. 분명 크기 증가 대부분 긴장 후 유도, 일반적으로 명백한 약간 긴장 유도 후에 자연스럽 게 작은 캡슐을 전시할 것 이다 ( 그림 1B에서 B18의 이미지 참조). 그것은 잔여 리치 미디어 유도 전에 제거 되지 또는 CO2 없으면 캡슐 유도 실패 합니다 주목 해야한다. 이러한 경우에 캡슐 크기에서 (있는 경우)에 겸손 한 증가 관찰 됩니다. 모든 3 개의 긴장에서 직경 수동으로 측정 하 고 결과 그림 1C에 표시 됩니다. 3 실험의 2, H99S 및 B18 사이 크기에 차이가 없었다. 그러나, 크기에 상당한 차이 일관 되 게 큰 스트레인, b 52, 및 H99S 및 B18 사이 관찰 되었다 (p < 0.001와 p < 0.001, 단순 대조, 샘플 크기와 함께 각각 표준 최소 제곱 테스트 = 50 셀/스트레인 ).
그림 2A 캡슐 유도, 얼룩, 및 2 개의 형광 염료, 캡슐 (18B7-AF488)에 대 한 및 세포 벽 (Calcofluor 화이트)를 사용 하 여 이미지 수집의 워크플로 보여 줍니다. 이미지는 모든 세 후 유도, 보장 최대 캡슐과 세포 체 직경 측정 각 셀에 대 한 체포 됐다 (그림 2B)에 대 한 z-스택으로 점령 했다. 각 z-스택 최대 강도 예측, 분석 (그림 2C) 이전 2D 이미지에 3 차원 스택 압축 생산을 처리 했다. 이들은 다음 수동으로 측정 했다 (그림 2D). 인도 잉크 묻은 셀에 대 한 측정, 달리 모든 3에서 그들의 캡슐 직경에 근거 하 여 모든 세 가지 변종 사이의 차별을 우리 사용 얼룩 형광 실험의 반복. 여기, 우리가 발견 B18 했다 작은 캡슐 직경 및 B52 가장 큰 (p < 0.001 모든 비교, 간단한 효과 함께 표준 최소 제곱 테스트에 대 한 표본 크기 = 50 셀/긴장).
추가 평가 C. neoformans 캡슐 얼룩의 두 가지 방법, 모든 3 개의 긴장에서 측정 비교 되었다. 얼룩 (그림 3A)의 두 가지 방법을 사용 하 여 결정 하는 캡슐 크기 사이 상당한 차이가 없었다 (간단한 효과, 다변량 ANOVA 표본 크기 = 50 셀/긴장). 이 결론은 별도 실험의 결과와 일치 어디 실험실 긴장, H99S, 인도 잉크와 형광 염료 (그림 3B-C) 공동 스테인드. 그러나, 단 1 점에 3 실험 H99S 사이의 B18, 관찰 하는 중요 한 차이에 비해 캡슐 크기에 상당한 차이 보였다는 사실에 의해 입증으로 인도 잉크를 사용 하 여 실험 사이 큰 가변성이 있었습니다. 모든 3 개의 형광 실험 (그림3D-E)에서 이러한 긴장 사이 (간단한 효과, 다변량 ANOVA 표본 크기 = 50 셀/긴장).
인도 잉크 얼룩 프로토콜 (5 절)에 나열 된 기준을 충족 하는 이미지는 자동된 시스템을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 표시 된 그림 4A 가이드에 단계를 통해 사용자는 조리법을 활용 하는 데 필요한 워크플로 C. neoformans 캡슐을 측정 하도록 설계 되었습니다. 워크플로 개발, 그것은 수동 및 자동 방법을 사용 하 여 3 명의 연구에 의해 C. neoformans 세포의 기존 이미지 캐시를 측정 하 여 확인 했다. 수동으로 만든 연구원의 측정 사이 상당한 차이가 있었고 이것은 또한 사실 때 측정 자동화 된 이미지 분석 소프트웨어 (그림 4B)를 사용 하 여 만들어졌다 (ANOVA, 샘플 크기 50 셀/연구원 =). 그러나, 거기 작은 하지만 캡슐 크기에 큰 차이 두 가지 방법 사이 (그림 4C) ANOVA, 샘플 크기 보고 = 150 셀/그룹. 캡슐의 직경은 수동 측정 보다 자동화를 통해 측정 하는 때 지속적으로 약간 더 작은 (0.3 µ m, p < 0.001). 또한, 동일한 이미지 집합에서 별도 연구원에 의해 캡슐 크기 측정 사이 비교, 표준 오차는 작은 이미지 분석 소프트웨어에 사용 된 수동 방법 대신 정량화는 더 많은 것의 암시 하는 경우 정확 하 고 재현 가능한 측정 자동화 된 방법을 사용 하 여 성공적인 자동 측정 셀 해야 합니다 초점에, 매체에 큰 캡슐, 있고 지나치게 되지 클러스터 (그림 4D). 우리는 작은 캡슐에 포함 된 클러스터 된 셀의 저조한 집중된 이미지 수 측정할 수 없습니다 자동으로 소프트웨어에서 발견. 그러나, 우리는이 수동 메서드를 사용 하 여 정확 하 게 측정 하는 도전 하지 수도 있습니다 것을 주장 한다.
그림 1 : 인도 잉크 얼룩을 측정 C. neoformans 캡슐. (A) 인도 잉크 얼룩으로 C. neoformans 캡슐 측정의 도식 적인 표현입니다. 간단히, 캡슐 식 영양 부족과 노출 CO2를 사용 하 여 유도 된다, 셀 인도 잉크 resuspended 고 유리 슬라이드에 탑재. 얼룩진된 셀의 이미지 중 사용자가 선택한 타일-컴퓨터 제어 단계를 사용 하 여 검색 하 여 필드와 가벼운 현미경 검사 법에 의해 획득 됩니다. 이미지 수동으로 분석 하거나 자동화 된 이미지 세분화 및 분석에 대 한 처리 될 수 합니다. (B) 일반적인 실험실 긴장, H99S 및 2 개의 임상 긴장, B18, b 52, 사전 및 사후 캡슐 유도의 이미지. 스케일 바 대표 대표자의 (C) 그래프 실험의 모든 3 개의 긴장 인도 잉크 얼룩이 지 고 수동으로 측정 표시 캡슐 직경 10 μ m (오류 표준 오차 (SE)으로 표시 됩니다). 통계적 의미는 다음과 같이 표시 됩니다: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; 그리고 * * *, p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 측정을 얼룩이 지기 형광 C. neoformans 캡슐. (A) Calcofluor 화이트 (CFW)와 18B7-AF488 공동 얼룩 C. neoformans 캡슐 측정의 도식 적인 표현입니다. 캡슐 유도 및 얼룩, 후 셀 장착 되며 레이저 confocal 현미경 검사 법을 검색 하 여 몇 군데. 세포는 다른 초점 평면에 있을 수 있습니다, 각 위치에서 z-스택 획득 됩니다. 이러한 각 셀에 대 한 최대 캡슐 직경을 정확 하 게 측정 하는 데 사용할 수 있는 최대 강도 예측 생산 처리 됩니다. (B) 의 일반적인 실험실 긴장, H99S 및 2 개의 임상 긴장, B18, b 52, 이미지 포스트 캡슐 유도. 참고: 모든 이미지에 대해 10 µ m를 나타내는 규모 막대입니다. (C) 최대의 강도 예측 붙일 C. neoformans 세포를 표시. (D) 수동으로 보여주는 대표적인 실험의 그래프 CFW와 18B7 AF488 얼룩이 모든 3 개의 긴장의 캡슐 직경 측정 (오류 표준 오차 (SE)으로 표시 됩니다). 통계적 의미는 다음과 같이 표시 됩니다: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; 그리고 * * *, p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 인도 잉크 및 형광 얼룩 사이 결과의 비교. 3 C. neoformans 긴장의 (A) 분석 물 인도 잉크 또는 형광 염료, n = 3 (오류 표준 오차 (SE)으로 표시 됩니다). (B) 단일의 이미지 C. neoformans 세포 인도 잉크 (눈금 막대 나타냅니다 13 µ m) 두 형광 염료와 스테인드. 수평 라인 구분 캡슐의 가장자리와 수직 라인 구분 세포 체의 가장자리. H99S의 대표적인 실험의 부 량 (C) 공동 인도 잉크와 형광 염료 (오류 표준 오차 (SE)으로 표시 됩니다) 스테인드. (D, E) 인도 잉크 실험 (D) 및 (E) 형광 실험 사이 캡슐 직경 변화 묘사 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 전산 분석 C. neoformans 인도 잉크의 이미지에서 캡슐 지름 스테인드 셀. (A) 회로도 표현의 이미지 세분화 및 C. neoformans 캡슐 측정 자동화 측정 기술을 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 캡슐 측정의 (B) 비교 3 별도 조사 매뉴얼 (수동 1-3)를 사용 하 여 수행 하며 자동 (자동 1-3). 각 조사 (오류 StDev로 표시 됨) 두 가지 방법 C. neoformans 이미지의 동일한 캐시를 사용 합니다. (C) 수동 측정 및 자동된 측정 (오류는 표준 오차 (SE)으로 표시)의 평균 결합. (D) 이상 두의 예과 (E) 비 이상적 이미지의 C. neoformans. 비-이상적인 이미지 소프트웨어에 성공적으로 측정 될 수 없습니다. 통계적 의미는 다음과 같이 표시 됩니다: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; 그리고 * * *, p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (즉, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료, 등) 여기, 우리 C. neoformans에서 캡슐의 성장을 유도 하는 방법을 설명 했습니다과 비해 2 다른 얼룩 프로토콜을 캡슐. 마지막으로, 우리는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인도 잉크 묻은 셀, 수동 측정 방법에 비해 결과 생산의 이미지에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하는 방법을 보였다.
우리의 실험에서 우리는 두 임상 변종, B18, b 52, H99S, 알려진된 캡슐 크기18의 표준 실험실 스트레인과 비교. 모두 얼룩 테스트 3 개의 긴장의 큰 캡슐 직경을 했다 방법을 임상 스트레인, b 52, 보여주었다. 그러나, 형광 측정 결과 어디 인도 잉크 측정 되지 않은 작은 캡슐 크기 두 긴장 사이 차이 분별할 수 있었다. 얼룩이 지기의 두 방법에서 결과 일관성, 둘 다 유효 하 그러나 작은 캡슐에와 함께 긴장을 측정 감도 증가 수는 C. neoformans 스테인드 붙일의 이미지를 사용 하 여 제안 했다. 최대 예측 붙일의 z-스택 이미지 생성을 사용 하 여 얼룩진된 셀 이미지 셀 다른 초점 평면에 경우에 정확한 캡슐 직경 측정에 만들 수 있도록 연구원을 수 있습니다. 이 측정은 C. neoformans 인도 잉크 그리고 표준 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지에 대 한 더 어렵습니다. 어떤 주어진된 이미지에서 인접 한 셀 모든 셀 셀 바디 캡슐 경계를 정확 하 게 해결 하 고 어려운 약간 다른 초점 비행기에 앉아 수 있습니다. 이 가능 하 게 캡슐 크기 또는 긴장 사이 작은 다름에 작은 변화를 감지 하는 수 사관의 능력을 혼동 수 있습니다.
각 메서드는 자체 고유의 장점이 있습니다. 인도 잉크의 경제성, 사용의 용이성과 안정성 (약간 형광 얼룩 수 있는 시간이 지남에 저하 되지 않습니다) 연구원은 가장 일반적으로 사용 됩니다. 인도 잉크는 간단 하 고, 부정적인 얼룩 때문에 표준 가벼운 현미경, 형광 현미경 보다 더 쉽게 사용할 수 있는와 함께에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 비율 (인도 잉크: 버퍼)에 사용 하지 않는 얼룩 자동된 이미지 분석을 복잡 하 게 할 수 있는 "깃털" 배경 군데, 만들 수 있습니다. 비싸고 사용 시간이 더, 형광 염료 수 그들의 유연성에 대 한 유리 그리고 우리가 보여, 그들의 감도. 그들은 면역 세포에 의해 phagocytosed 고에서 C. neoformans 캡슐의 조직학 검사에 필요한 C. neoformans 를 포함 하는 실험에서 캡슐 크기와 셀 부담의 측정에 특히 유용 조직 샘플 (하지이 문서에서 설명 하는 기술)32. Calcofluor 흰색 등 붙일 태그가 안티-GXM 항 체, 형광 염료, 얼룩 문제가 된 경우 (예를 들어, 부족 한 얼룩),이 일반적으로 얼룩 프로토콜을 최적화 하 여 극복 될 수 있다 (증가/감소는 농도 및 부 화 시간 염료와 함께).
방법론, 얼룩이 지기에 우리 캡슐 유도 및 적절 한 이미지 캡처는 프로토콜에서 중요 한 단계는 찾으십시오. 이 문서에 설명 된 프로토콜 C. neoformans 캡슐 유도 대 한 몇 가지 표준 방법 중 하나 이며 많은 년23에 대 한 효 모 연구소에서 성공적으로 사용 되어 있다. C. neoformans 캡슐 유도 CO2-종속 및 스트레스 조건23,33에서만 발생 합니다. 그러므로, 그것을 적절 한 영양소 결핍 성장 매체를 사용 하 여 5% CO2 인큐베이터에서 발생 하는 것이 중요 하다. 그것은 그 캡슐의 외피 (일반적으로 18-24 h) 표준 기간 후 하지 유도 하고있다 의심, 셀 하지 스트레스 상황에 노출 되었다 uninduced 제어 문화에 비교 한다. 비교 하는 두 유도 효과 였는 지 여부를 결정 합니다. 성공적인 유도 세포의 대다수 uninduced 컨트롤에 비해 더 큰 캡슐을 확인 하나입니다. 셀의 모든 유도 합니다, 때문에 측정 셀 사용 가능한 셀의 다른 유형의 표현 이어야 한다.
일관 된 이미지 수집의 중요성 수 없습니다 과장 된 수, 자동화 된 측정은 목표 하는 경우에 특히. 초점, 명암, 배경 형광, 뿐만 아니라 비트-깊이 및 이미지 압축 파일의 모든 중요 한 고려 사항이 있습니다. 가능 하면 대형 클러스터의 단일 초점 비행기에 앉아 셀의 피해 야 한다, 일부 신진 셀을 만지고 허용 및 피할 수 있지만 (이 규칙은 모두 수동 및 자동 측정에 따라야 한다). 세포를 얼룩이 confocal 붙일의 이미징 사용 하 여 때이 문제가 어느 정도 피할 수 있습니다. Z-스택 최대 강도 계획 생산에 사용 단일 이미지29에서 다른 초점 평면에 셀의 정확한 측정을 설정할 수 있습니다. 또한, 이미지 샘플을 준비 후 신속 하 게 취득 될 해야 합니다. 특히 인도 잉크 묻은 샘플의 건조 하기 시작, 배경 및 전경 요소 (셀) 사이의 대조를 감소 하 고 바람직하지 않은 배경 기능 향상 될 수 있습니다, 감소를 자동화에 대 한 중요 한 수 있습니다. 세그먼트화 정확도입니다.
캡슐 직경 측정 C. neoformans 커뮤니티에서 평범 하지만,이 시점까지 그들은 일반적으로 수행 되었습니다 수동으로, 상당한 시간과 인력을 필요로 하. 그러나, 수동 측정 필드에 허용 되 고 결과 작은 비용에 얻어질 수 있다. 이미지 분석 소프트웨어에 있는 전진이이 측정 자동화 쪽으로 첫 번째 조치를 취할 수 만들었습니다. 그들의 크기의 측정 자동화 된 이미지 세분화 소프트웨어 패키지, 소설 개발 하는 필요 없이 비교적 간단 하 게 원-2D 이미지에서에서 원으로 표시 C. neoformans 세포 체와 캡슐-간단한 자연 알고리즘입니다. 대신, 기존 알고리즘을 연결 하 여 C. neoformans 세포와 캡슐 감지, 세그먼트, 고 측정. 이 방법을 사용 하 여, 셀 물 가장 일반적으로 사용 된 캡슐 염료, 인도 잉크, 그리고이 동일한 데이터 집합에 대 한 수동 측정 비교 C. neoformans 캡슐 직경의 측정을 자동화는 우리. 이 방법은 재현성의 혜택을 제공 및 인간의 실수의 대부분을 제거 하는 것은 연구원 시간을 절약 하는 동안 수동 측정. 또한, 추가 측정을 자동된 분석 작업 흐름에는 최소의 노력으로 통합할 수 있습니다. 우리 자동된 이미지 분석 정확성과 효율성의 높은 학위를 가진 C. neoformans 캡슐의 많은 수를 측정 하는 연구를 허용 하는 유망한 접근 생각 합니다.
전반적으로, 우리가 성공적으로 C. neoformans캡슐 성장을 유도, 인도 잉크 또는 형광 염료 샘플 얼룩 및 이미지 분석에 수동 및 자동화 된 측정을 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 방법 증명 소프트웨어입니다. 우리의 결과 얼룩의 두 방법 모두 가능한 (하지만 인도 잉크 측정 더 많은 다양성을 확인 하 고는) 일반적으로 일관 된 결과 생성 좋습니다. 또한, 수동 및 자동화 된 측정 방법 캡슐 크기 변화를 분별 하는 기능이 있다.
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Disclosures
저자, Hoyin 라는 DRVision Aivia 자동된 이미지 분석 소프트웨어를 게시 하는 제품 관리자입니다.
Acknowledgments
우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
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