Summary
Polysakkarid kapsel er primære virulens faktor i Cryptococcus neoformans, størrelsen korrelerer med belastning virulens. Kapsel diameter målinger brukes i fenotypiske testing og å måle terapeutiske effekten. Her en standardmetode for kapsel induksjon er presentert, og to metoder for flekker og måle diameter sammenlignes.
Abstract
Polysakkarid kapsel av Cryptococcus neoformans er primære virulens faktor og en av mest studerte vanlige aspekter av dette patogene gjær. Kapsel størrelse varierer mellom stammer, evnen til å vokse raskt når introdusert belastende eller lavt næringsinnhold forhold og har blitt positivt korrelert med belastning virulens. For disse grunner er størrelsen på kapselen av stor interesse for C. neoformans forskere. Veksten av C. neoformans kapselen er indusert under fenotypiske testing til å forstå effekten av ulike behandlinger på gjær eller størrelsen forskjellen stammer. Her beskriver vi en av standardmetodene kapsel induksjon og sammenligne to akseptert metoder for flekker og måle kapsel diameter: (i) tusj, en negativ flekken, brukes i forbindelse med konvensjonelle * lys og (ii) co-farging med fluorescerende fargestoffer i både cellevegg og kapsel etterfulgt av AC confocal mikroskopi. Endelig vi viser hvordan måling av kapselen diameter fra India blekk-beiset prøver kan automatisert benytter beregningsorientert bildeanalyser.
Introduction
Påvirker en kvart million mennesker hvert år, og resulterer i mer enn 180.000 dødsfall årlig er Cryptococcus neoformans en sykdomsfremkallende, intracellulær gjær og den utløsende agenten for cryptococcosis1,2, 3. hardest rammet er HIV-positive pasienter i fattige land som ikke har tilgang til antiretroviral behandling, noe som gjør dem akutt utsatt for sykdom4,5,6. Data fra CDC indikerer at i Sahara, C. neoformans dreper flere mennesker enn tuberkulose årlig og mer hver måned enn noen Ebola utbrudd på post1. Den vanligste ruten eksponering oppstår fra inhaling desiccated spores som er vanlig i miljøet7. Når du kommer inn i lungene, finnes det flere virulens faktorer som bidrar til suksess for C. neoformans i infiserte individer. Polysakkarid kapsel anses den mikrobe primære virulens faktor, som acapsular stammer ikke virulente8.
Cryptococcal kapselen består av tre prinsippet komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), og mannoproteins (MPs)9. Mens MPs er en relativt mindre celleveggen-assosiert komponent av kapselen, de er immunogenic og kan fremme en mest pro-inflammatorisk respons9,10. I kontrast, GXM og GalXM utgjør hoveddelen av kapselen (> 90% av vekten) og har suppressive effekter11. I tillegg til sin immunmodulerende effekter skaper raske utvidelsen av kapselen i vivo en mekanisk barriere til inntak av verten phagocytic celler (dvs., nøytrofile og makrofager)12. C. neoformans kapsel og syntese dens er kompleks, men samlet, økt kapsel diameter er korrelert med økt virulens6,13,14. Gitt dette, er det viktig for C. neoformans forskere å raskt og nøyaktig kvantifisere kapsel målinger.
Både C. neoformans cellen og dens polysakkarid kapsel er dynamiske strukturer og vise endringer over tid15. Kapselen kan endre tetthet, størrelse og montering i respons på endringer i vert miljøet16,17,18. Lav jern eller nivåer av næringsstoffer, eksponering for serum, menneskets Fysiologiske pH og økt CO2 er kjent for å starte kapsel vekst16,18,19,20. Videre, har forskere vist strukturelle endringer som fører til betydelige forskjeller i immunoreactivity under en infeksjon, utlån en fordel å C. neoformans over vertsstasjonen21,22. Dette er kjent fordi arkitektur C. neoformans kapselen er analysert i en rekke måter. Elektronmikroskop, for eksempel har avdekket at kapselen har en heterogen matrise med en indre elektron-tette laget under en ytre, mer gjennomtrengelig lag23. Lysspredning og bruk av optiske pinsett har tillatt forskere å ytterligere belyse sin macromolecular egenskaper24. Analysere resultatene fra både statiske og dynamiske lysspredning målinger, vet vi at polysakkarid kapsel har en kompleks forgrening struktur23. Optisk pinsett har blitt brukt til å teste stivhet av strukturen samt vurdere sin antistoff reaktivitet24. Men er langt den mest næringsdrivende analyse av C. neoformans kapselen måling av størrelsen.
For å kvantifisere kapsel størrelse, forskere bruke hva som bør være en enkel måling: lineær diameteren på kapselen. Digital mikroskop brukes til å ta bilder av flere C. neoformans celler (vanligvis hundrevis) med blekk eller fluorescerende fargestoffer. Størrelsen på hver celle kroppen og omkringliggende kapsel måles. Dataene er hentet, og gjennomsnittlig diameter på kapselen beregnes ved å trekke fra celle kroppen diameter fra hele cellen diameter (celle kroppen + kapsel). Frem til dette punktet, har disse målingene gjort manuelt. Mens generelt nøyaktig, har denne metoden ulemper for forskere. Datasett kan ta dager eller uker å analysere for hånd. Og fordi disse mål gjøres manuelt, subjektivitet og menneskelig feil kan påvirke resultatet.
Automatisert beregningsorientert bildeanalyser har blitt et uunnværlig verktøy for forskere i mange områder av molekylære cellebiologi, muliggjør raskere og mer pålitelig analyse av biologiske bilder 25,26,27. Nøyaktig bilde analyseteknikker er nødvendig til mine kvantitativ informasjon fra det som ofte kompleks og enorme datasett. Men har noen målinger, spesielt måling av C. neoformans capsule, vært vanskelig å automatisere. Nøyaktig identifiserer grensesnittet mellom cellen vegg og kapsel, som vanligvis vises som en mørk ring når fotografert av kontrast mikroskopi, kan være plagsom å løse ved hjelp av en enkel terskel. Videre C. neoformans celler i kultur tendens til å klumpe seg sammen og nøyaktig segmentering av cellene er nødvendig for nøyaktige målinger.
Målet med dette prosjektet var å (i) illustrere en av standardprotokoller for kapsel induksjon i C. neoformans, (ii) Sammenlign og kontrast tusj og fluorescens flekker som de hører for å kapsel diameter målinger, (iii) utvikle enkel, beregningsorientert metoder for å måle kapsel diameter med bilder av blekk for farget celler ved hjelp av en analyseprogramvare, og, (iv) vurdere fordelene og begrensningene for måling kapsel diameter manuelt og automatisering programvare. Vi finner at av to flekker metoder, fluorescerende merking av celle veggen og kapsel, mens mer tidkrevende, gitt de mest konsekvente resultatene mellom eksperimenter. Men begge metodene mulig for oss å kunne skille mellom lab og klinisk C. neoformans stammene viser forskjellige kapsel størrelser. Videre, vi var i stand til å automatisere måling av kapselen diameter fra India blekk farget bilder og funnet at dette var et levedyktig alternativ til manuell måling av kapselen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: C. neoformans er en grad 2 (BSL-2) patogen og forskere arbeider med det må ta passende forholdsregler. Detaljerte prosedyrer på hvordan å trygt arbeid med BSL-2 patogener kan bli funnet på Center for Disease Control (CDC) nettsted, men det er viktig å merke seg at alle personer som kommer i kontakt med C. neoformans bør være riktig trent i håndtering patogene agenter og bør alltid ha riktig personlig verneutstyr (PVU), vanligvis latex eller nitrilhansker. Videre skal rotorer på sentrifuger tettes for å hindre aerosolization av prøver og noen søl ryddet opp umiddelbart med en 10% blekemidler løsning28.
1. kapsel induksjon
Merk: Alle trinnene bør utføres ved romtemperatur, med mindre annet er angitt.
- Kultur C. neoformans i gjær pepton druesukker (YPD) kjøttkraft (pH 6,5 +/-0,2) og ruge på 37 ° C med skjelvende før de er i loggen fase (ca 18-36 h).
- Sentrifuger celler 870 x g i 5 min på 21 ° C og vask tre ganger med fosfat bufret saltvann (PBS).
- Bruke en hemocytometer (eller en automatisert celle teller) å telle celler og resuspend på 2 x 105 celler/2 mL i Dulbecco's minimal viktige medier (DMEM).
- For å indusere kapselen, ruge på 37 ° C og 5% CO2 18 h.
Merk: Kombinasjonen av fravær av næringsstoffer i media og tilstedeværelsen av CO2 stimulerer C. neoformans kapsel vekst. - Etter inkubasjon høste celler ved sentrifugering (som ovenfor) og fjerne alle men 5-10 µL supernatant. Samtidig, høste en tilsvarende un indusert celle prøve for hver stamme skal måles. Bruk disse negative kontroller.
Merk: Cellen pellets vil være svært liten og kan være vanskelig å se. Vær forsiktig når aspirating nedbryting. - Flekker med blekk (seksjon 2.1) eller fluorescerende fargestoffer (delen 2.2).
2. flekk
-
Flekker med bare tusj
- Til stain gjær med blekk, resuspend pellet i gjenværende nedbryting og legge 4μL (omtrent halvparten) av cellen fjæring og 4μL av India blekk på en barometer microscope skyve. Forsiktig bland og unngå skummende.
- Bruker en 13 mm glass dekkglassvæske (#1.5 tykkelse) og forsegle kantene med en giftfri tetningsmasse (klart neglelakk) å hindre prøven tørker ut.
-
Flekker med bare fluorescerende fargestoffer
- Til stain gjær med et fluorescerende fargestoff, resuspend celle pellet i 50 µL PBS med 1% bovin serum albumin (BSA).
- Inkuber kultur med en lik mengde Calcofluor hvit (CFW) (1 µg/mL) og kapsel mAb 18B7 (se Tabell for materiale) konjugert til AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) for 30 min på 37 ° C.
- Sentrifuge celler 870 x g i 5 min på 21 ° C etter inkubasjon og Sug opp nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 10 µL PBS med 1% bovin serum albumin (BSA).
- Pipetter 8 µL av cellen suspensjon på en barometer microscope skyve.
- Bruker en 13 mm glass dekkglassvæske (#1.5 tykkelse) og forsegle kantene med en giftfri tetningsmasse (klart neglelakk) å hindre prøven tørker ut.
-
Flekker med både tusj og fluorescerende fargestoffer
- Mer direkte sammenligne effekten av blekk flekker som fluorescerende fargestoffer, co flekken samme celle befolkningen med begge typer flekken. Gjør først ruge celler med både fluorescerende capsule og cellevegg flekken, per trinn 2.2.1 - 2.2.3.
- Deretter Pipetter like volum (4 µL) fluorescently farget celle suspensjon og tusj på et glass lysbilde. Bland forsiktig.
- Bruk en 13 mm glass dekkglassvæske (#1.5 tykkelse) og forsegle kantene med en giftfri tetningsmasse (klart neglelakk) å hindre prøven tørker ut.
3. image oppkjøpet/mikroskopi
-
Imaging celler farget med blekk.
- Hente bilder ved hjelp av standard lys mikroskop (100 X forstørrelse).
- Bildet minst 50 celler per tilstand.
Merk: Antall celler per felt varierer, og dette er akseptabelt. Det er viktig, men at overlappende cellene holdes på et minimum, som disse er vanskelig å måle (både manuelt og med automatisert programvare). For disse eksperimentene, ble bildene anskaffet i en dybde på 16 biter med eksponeringstider optimalisert for å maksimere bilde kontraster og minimere uskarphet forårsaket av små bevegelser i cellene.
-
Imaging celler beiset med fluorescerende fargestoffer
- For å bilde cellene av fluorescens mikroskopi, åpne mikroskopet tenkelig programvare og velg de riktige eksitasjon og utslipp bølgelengdene for fluorophores brukes (CFW og AF488 er glade med 405nm og 488 nm lys, henholdsvis). Hente bilder bruker fluorescens mikroskop.
- Bildet minst 50 celler per tilstand.
Merk: Antall celler per felt varierer, og dette er akseptabelt. Det er viktig, men at overlappende cellene holdes på et minimum som disse er vanskelig å måle (både manuelt og med automatisert programvare). - Kjøpe en z-stack bildet serien celler slik at maksimal kapsel diameteren for hver celle i et gitt felt hentes.
- I mikroskopet Kontrollprogramvaren, klikk på "z-stack" for å åpne opp "z-stack" kontrollpanelet og velg alternativet "Første/siste" i øvre venstre hjørne av panelet.
- Bruk kontrollen fine fokus på mikroskopet å fokusere på et nivå som er under bredeste punktet på en enkelt gjær celle og kapsler for alle gjeldende synsfelt og klikk "Sette første".
- Bruke kontrollen fine fokus å fokusere over bredeste punktet på celle kroppen av samme celle og kapselen for alle cellene i gjeldende synsfelt og klikk "Sette siste".
- Klikk "Start eksperiment" kategorien "Erverv" å erverve z-stakken for gjeldende posisjon. Gjenta prosessen på flere posisjoner til z-stakk bilder av minimum 50 celler har anskaffet.
Merk: Disse eksperimentene, AC confocal hullet ble satt til 1.0 AU og en overlappende z-serien av 10-20 skiver dekker 0,7 µM anskaffet på de valgte posisjonene. AU = luftige enhet.
- Deretter konvertere Serienavn z stabel til maksimum styrke anslag (MIP) bruker riktig analyseprogramvare.
Merk: MIPs prosjektet største intensiteten på hvert fly stablet bilde29. Opprette MIPs gjør det mulig å produsere en 2D-fremstilling av bilder som svarer til den maksimale og kapsel diameter i fanget 3D stabelen.
-
Imaging celler beiset med både tusj og fluorescerende fargestoffer
- Hente bilder ved hjelp av en widefield (40 X forstørrelse) eller AC confocal mikroskop (63 X eller 100 X forstørrelse). For celler med både tusj og fluorescerende fargestoffer, ta bilder med widefield mikroskop utstyrt med datastyrt scenen og oljeobjektiv nedsenking.
Merk: Mikroskopet i bruk bør kontrolleres ved hjelp av en programvare CFW. fluorescens som er begeistret gjennom en 340-380 nm eksitasjon filter og slippes ut lys skal oppdages gjennom et 435-485 nm barriere filter reflekteres fra et 400-nm dichroic speil. AF488 fluorescens kan bli spennende gjennom et 465-495 nm eksitasjon filter, og lyset fra cellen kan oppdages gjennom et 515-555 nm barriere filter reflekteres fra et 505-nm dichroic speil. - Bildet minst 50 celler per betingelse for hver flekker metode.
- Hente bilder ved hjelp av en widefield (40 X forstørrelse) eller AC confocal mikroskop (63 X eller 100 X forstørrelse). For celler med både tusj og fluorescerende fargestoffer, ta bilder med widefield mikroskop utstyrt med datastyrt scenen og oljeobjektiv nedsenking.
4. manuell måling av kapsel
- For celler med blekk eller fluorescerende flekker, bruk en celle måling programvare manuelt mål capsule og celle diameter (se Tabell for materiale). For å gjøre dette, gå til "Fil" > "Åpne bilde" > "Tiltak" og bruke markøren for å tegne en rett linje gjennom bredeste punktet på hele cellen (totalt diameter).
- Deretter klikker "Tiltak" igjen og tegne en rett linje gjennom celle kroppen (celle kroppen diameter).
Merk: Målingene er lagret automatisk på cellene. - Gjenta denne prosessen for alle celler (minimum 50/gruppe).
- Hvis du vil lagre bilder når de måles, klikk "Fil" > "Lagre som" og navnet bildene riktig.
- Velg nylig målt filene og eksportere data til et regnearkprogram.
- Beregne gjennomsnittlig kapsel diameter ved hjelp av ligningen: ([totalt diameter] - [celle kroppen diameter]).
5. automatisert måling av kapsel
Merk: For vellykket automatisert måling, bruke 16-bits bilder med høy kontrast og som er riktig fokusert sammen med en riktig analyseprogramvare (se Tabell for materiale). Når imaging C. neoformans for kapsel måling, er det viktig å fokusere på det mørke ringen på grensen mellom cellen vegg og kapsel. Dette tillater programvaren å avgrense riktig celle- og kapsel.
- Inverter og lage en kopi av alle India blekk farget celle bilder ved hjelp av en passende bilderedigeringsprogram programvare (se Tabell for materiale). Gjør klikk "Fil" > "Åpne" åpne blekk farget bilder og deretter "kontroll" + "I" Slik inverterer bildet. Klikk "Fil" > "Lagre som" for å lagre det inverterte bildet.
- Importere både den opprinnelige og invertert bilder til programvaren klikker "Fil" > "Importere Sequence" > "Load Image" > "Definer sekvens (manuelt)" > "Dimensjoner (kanal)" > "Import" > "Apply".
Merk: C. neoformans cellen legemer og kapsler kan identifiseres og maskert bruker spesielle algoritmer - referert til som "oppskrifter" - inkludert i programvaren. - Bruke 'Colony Analyzer (fluorescens)' oppskriften på det inverterte bildet å oppdage og maske celle kroppen, og klikk "apply". I det inverterte bildet blir det mørke ringen definere grensen C. neoformans cellen lysere enn omkringliggende kapselen.
- Bruk 'Colony Analyzer (fluorescens)' oppskriften på det inverterte bildet segmentere C. neoformans celle organer fra deres kapsler, og klikk "apply". Dette skaper en teller maske. Gi denne teller maske "Celle kroppen" ved å høyreklikke på fanen merket "antall maske".
Merk: Oppskriften består av flere bildeprosessering trinn: bakgrunn fjerning, objekt gjenkjenning, objektet separasjon og delsett filtrering. - Deretter bruker 'Celle spredning' oppskriften på originalbildet å oppdage og maske kapselen, og klikk "apply". Dette skaper en teller maske. Gi denne teller maske "Kapsler" ved å høyreklikke på fanen merket "antall maske".
- Bruke oppskriften, "Capsule partisjon", opprette en ny maske på originalbildet partisjonere tilstøtende kapsler fra hverandre. Gjør klikk «Capsule deling» fra nedtrekksmenyen oppskrift. Velg nå omdøpt teller masken "Kapsler" (5.5) for Capsule regionen boksen Capsule partisjon. Velge nå omdøpt teller masken "Celle kroppen" Crypto celler (5.4). Velg "Original" for input kanalen og "Opprett maske for Partitioned kapsel. Klikk på "Apply
Merk: Oppskriften genererer cellen og kapsel diameter, definert som gjennomsnittet av de lengste og korteste aksene krysser sentrum av celle- og kapsel, og området mål fra oppdagelsen masker. Finne utdataene som finnes under kategorien regneark i denne programvaren. Gjenta denne prosessen for alle bilder (minimum 50 celler/gruppe). Oppskriften parametere kan være justert for å optimere påvisning av enkeltbilder eller optimalisert for satsvis påvisning av flere bilder. Flere målinger kan beregnes med oppskriften på omfattende karakterisering av cellen og kapsels morfologi. - Eksportere data til et regneark programvaren til valg for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere kapsel induksjon, celle flekker, bildebehandling og måling teknikker, vi brukte tre stammer av C. neoformans: felles, godt karakterisert laboratoriet belastning, H99S30og to klinisk isolert stammer av tidligere Ukjent kapsel diameter, B18 og B5231.
Arbeidsflyten kapsel induksjon, flekker og bildeopptak bruker blekk er vist i figur 1A. Bilder tatt fra alle tre stammer er vist i figur 1B både før og etter induksjon. Hun vil vite hvis kapselen induksjon ble en suksess ved å sammenligne cellene har gjennomgått kapsel induksjon til dem fra samme kulturen har. Klart størrelsen økes er vanligvis tydelig i de fleste stammer etter induksjon, selv om noen stammer har naturlig liten kapsler selv etter induksjon (se bilder av B18 i figur 1B). Det bør bemerkes at kapselen induksjon vil mislykkes hvis gjenværende medierik ikke fjernes før induksjon eller CO2 ikke finnes. I slike tilfeller vil bare beskjeden (hvis noen) øker i kapselen størrelse respekteres. Diameter fra alle tre stammer ble målt manuelt, og resultatene vises i figur 1 c. I to av tre eksperimenter var det ingen forskjell i størrelse mellom H99S og B18. Imidlertid en betydelig forskjell i størrelse var konsekvent observert mellom den største belastningen, B52, H99S og B18 (p < 0,001 og p < 0,001, henholdsvis standard minste kvadrater test med enkel kontraster, utvalgsstørrelsen = 50 celler/belastninger ).
Figur 2A viser arbeidsflyten kapsel induksjon, flekker og bildeopptak to fluorescerende fargestoffer, en for kapselen (18B7-AF488) og en for cellen vegg (Calcofluor White). Bildene ble tatt som z-stabler for alle tre stammer etter induksjon, sikre at maksimale capsule og celle kroppen diameter ble tatt for hver celle som skal måles (figur 2B). Hver z-stack ble behandlet for å produsere maksimal intensitet anslag, komprimere 3-dimensjonale stakken i et 2D-bilde før analyse (figur 2C). Dette ble deretter målt manuelt (figur 2D). I motsetning til målene for blekk farget celler, gjentar fluorescerende flekker aktivert oss å skille mellom alle tre belastninger på grunnlag av deres kapsel diameter i alle tre av eksperimentet. Her fant vi at B18 hatt minste kapsel diameter og B52 største (p < 0.001 alle sammenligninger, standard minste kvadraters test med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/belastning).
For å ytterligere vurdere de to metodene for C. neoformans kapsel flekker, ble målinger fra alle tre stammer sammenlignet. Det var ingen signifikant forskjell mellom kapsel størrelsene bestemmes ved hjelp av de to metodene for flekker (figur 3A) (multivariabel VARIANSANALYSE med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/belastning). Denne konklusjonen var forenlig med resultatene av en separat eksperiment der lab belastningen, H99S, var co beiset med blekk og fluorescerende fargestoffer (figur 3BC). Men var det større variasjon mellom eksperimenter med blekk, noe som gjenspeiles av det faktum at bare én av tre viste en betydelig forskjell i kapselen størrelse mellom H99S og B18, sammenlignet med betydelig forskjellen observert mellom disse stammer i alle tre fluorescerende eksperimenter (figur3D-E) (multivariabel VARIANSANALYSE med enkle effekter, prøve størrelse = 50 celler/belastning).
India blekk farget bilder som oppfyller kriteriene i protokollen (del 5) kan måles ved hjelp av et automatisert system. Arbeidsflyten som vises i figur 4A guider brukeren gjennom trinnene nødvendig å benytte oppskrifter utviklet for å måle C. neoformans kapselen. Etter å utvikle arbeidsflyten, ble det bekreftet ved å måle en buffer for eksisterende bilder av C. neoformans celler av forskere ved hjelp av både manuelle og automatiserte metoder. Det var ingen betydelige forskjeller mellom forskerens målinger når gjort manuelt, og dette var også sant når målingene ble gjort ved hjelp av automatiserte image analyseprogramvare (figur 4B) (ANOVA, utvalgsstørrelsen = 50 celler og forskeren). Men det var en liten, men signifikant forskjell i kapselen størrelsen rapportert mellom de to metodene (figur 4C) ANOVA, utvalgsstørrelsen = 150 celler/gruppe. Kapsel diameter var konsekvent litt mindre målt via automatisering enn manuelle målinger (0,3 µm, p < 0,001). I tillegg, ved sammenligning mellom kapsel størrelse målinger gjort av egen forskere fra samme bilde settene, var standardfeilen mindre når analyseprogramvare ble brukt for kvantifisering i stedet for manuelle metoder, som er tankevekkende mer presis, reproduserbare mål med det automatiserte metoden. For vellykket automatisert måling, celler må være i fokus, har en middels til stor capsule og ikke være altfor klynger (Figur 4 d). Vi fant at dårlig fokusert bilder av grupperte cellene med små kapsler ikke kunne automatisk måles i programvaren. Men hevde vi at dette kan også være utfordrende å måle nøyaktig bruke manuelle metoder.
Figur 1 : Tusj flekker for å måle C. neoformans kapsel. (A) Skjematisk fremstilling av C. neoformans kapsel måling av blekk flekker. I korthet, kapsel uttrykk er indusert næringsstoffer deprivasjon og eksponering for CO2, cellene er resuspended i India blekk og montert på glass lysbilder. Bilder av farget celler er kjøpt av * lys, med felt valgt enten av brukeren eller av flis-skanning ved hjelp av en datastyrt stage. Bilder kan enten være analysert manuelt eller behandlet for automatiserte image segmentering og analyse. (B) bilder av vanlige lab belastning, H99S og to klinisk stammer, B18 og B52, både før og etter kapsel induksjon. Skala stolper representerer 10 µm (C) graf av en representant eksperimentere viser kapsel diameteren på alle tre stammer beiset med blekk og målt manuelt (feil angis som standard feil (SE)). Statistisk signifikans indikeres som følger: *, p < 0,05; **, p < 0.01; og ***, p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fluorescerende flekker for å måle C. neoformans kapsel. (A) skjematisk fremstilling av C. neoformans kapsel måling av Calcofluor White (CFW) og 18B7-AF488 co flekker. Etter kapsel induksjon og flekker, er cellene montert og fotografert av laserskanning AC confocal mikroskopi. Som cellene kan være i ulike fokal plan, er z-stabler ervervet på hver posisjon. Dette behandles for å produsere maksimal intensitet anslag som kan brukes til å måle maksimale kapsel diameter for hver celle. (B) Bilder av vanlige lab belastning, H99S og to klinisk stammer, B18 og B52, etter kapsel induksjon. Merk: Skala barer representerer 10 µm for alle bilder. (C) maksimum intensitet projeksjoner av fluorescently merket C. neoformans celler. (D) Fremstilling av en representant eksperiment viser manuelt målt kapsel diameteren på alle tre stammer med CFW og 18B7-AF488 (feil angis som standard feil (SE)). Statistisk signifikans indikeres som følger: *, p < 0,05; **, p < 0.01; og ***, p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Sammenligning av resultater mellom tusj og fluorescerende farging. (A) analyse av tre C. neoformans stammene farget blekk eller fluorescerende fargestoffer, n = 3 (feil angis som standard feil (SE)). (B) bilder av en enkelt C. neoformans celle beiset med blekk og begge fluorescerende fargestoffer (skala bar representerer 13 µm). Vannrette linjer avgrense kantene av kapselen, og loddrette linjer avgrense kantene av celle kroppen. (C) kvantifisering av en representant eksperimentet av H99S farget co med både tusj og fluorescerende fargestoffer (feil angis som standard feil (SE)). (D, E) Fremstilling av kapselen diameter variasjon mellom tusj eksperimenter (D) og fluorescerende eksperimenter (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Beregningsorientert analyse av C. neoformans kapsel diameter fra bilder av blekk for farget celler. (A) skjematisk fremstilling av bildesegmentering og C. neoformans kapsel måling ved hjelp av en automatisert måleverdien teknikken (se Tabell for materiale). (B) sammenligning av kapselen målinger utført av 3 separate etterforskerne bruke manual (manuell 1-3) og automatiserte metoder (automatisert 1-3). Hver etterforsker brukt en identisk cache C. neoformans bilder av begge metodene (feil er representert som STDAV). (C) kombinert gjennomsnitt manuelle målinger og automatisert målinger (feil angis som standard feil (SE)). Eksempler på begge (D) ideelle og (E) ikke-ideelle bilder av C. neoformans. Ikke-ideelle bilder ikke kan måles i programvaren. Statistisk signifikans indikeres som følger: *, p < 0,05; **, p < 0.01; og ***, p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I flere tiår, har kapsel vært fokus for forskning både mycologists og klinikere interessert i C. neoformans og cryptococcosis på grunn av sin rolle som en stor virulens faktor for patogen. Bruke mikroskopi å måle forskjellene i kapselen størrelse stammer og under forskjellige vekst forhold kan gi viktig informasjon om patogen og svarene på ulike stimuli (dvs., ulike miljøforhold, potensielle medikamentelle behandlinger, etc.) her har vi skissert en metode for å indusere veksten av kapselen i C. neoformans, og sammenlignet med to forskjellige kapsel flekker protokoller. Til slutt, vi viste hvordan analyseprogramvare kan brukes til å automatisere måling av kapselen diameter fra bilder av India blekk farget celler, resultater som var sammenlignes med manuell målemetoder.
I vårt forsøk sammenlignet vi to klinisk stammer, B18 og B52, med H99S, en standard lab stamme av kjente kapsel størrelse18. Begge flekker metoder viste at kliniske belastningen, B52, hadde den største kapsel diameteren av de tre stammene testet. Men klarte resultatene fra fluorescerende målinger å skjelne en forskjell mellom de to stammene med mindre kapsel størrelse der tusj mål ikke var. Resultatene fra begge metoder for flekker var konsekvent, tyder på at begge er gyldig, men at bruker bilder av fluorescently farget C. neoformans tillate økt følsomhet måle stammer med liten kapsel. Bruker maksimal anslag generert fra z-stakk bilder av fluorescently farget celler kan forskere å sikre at nøyaktig kapsel diameter målinger kan gjøres selv når fotografert cellene er i forskjellige fokal fly. Disse målingene er vanskeligere for C. neoformans fotografert tusj og standard * lys. I et gitt bilde, kan tilstøtende celler sitte i litt forskjellige fokal fly, gjør det vanskelig å nøyaktig løse celle kroppen-kapsel grensen for alle celler. Dette kan muligens forvirre evne til etterforskerne å oppdage små endringer i kapselen størrelse eller små forskjeller mellom stammer.
Hver metode har sine egne iboende fordeler. Tusj brukes de vanligste av forskere sine kostnader, brukervennlighet, og stabilitet (den ikke forringes over tid som noen fluorescerende flekker kan). Fordi blekk er en enkel, negative flekk det kan brukes i forbindelse med standard lys mikroskoper, som er mer tilgjengelig enn lysstoffrør mikroskop. Hvis ikke brukes i riktig blandingsforhold (India blekk: buffer), kan imidlertid flekken opprette en "fjærlett" bakgrunn når avbildes, som kan komplisere automatisert bildeanalyser. Mens dyrere og mer tidkrevende å bruke fluorescerende fargestoffer kan være fordelaktig for sin fleksibilitet, og som vi viser, deres følsomhet. De er spesielt nyttig for måling av kapselen størrelse og celle byrden eksperimenter med C. neoformans som har vært phagocytosed av immunceller og er nødvendig for histologiske undersøkelse av C. neoformans capsule i vevsprøver (en teknikk ikke beskrevet i denne artikkelen)32. Hvis farging med fluorescerende fargestoffer, for eksempel calcofluor hvite eller fluorescently merket anti-GXM antistoffer, er problematisk (f.eksutilstrekkelig flekker), dette kan vanligvis løses ved å optimalisere fargeprotokoll (øke/redusere den konsentrasjon og/eller inkubasjon tid med fargestoff).
Uansett flekker metodikk, finner vi at både kapsel induksjon og riktig image fange er avgjørende skritt i protokollen. Protokollen beskrevet i dette dokumentet er en av flere standard metoder for kapsel induksjon i C. neoformans og har vært brukt med hell i gjær labs i mange år23. C. neoformans kapsel induksjon er CO2-avhengige og oppstår bare under stressende forhold23,33. Derfor er det avgjørende at det skjer i en 5% CO2 inkubator ved hjelp av en passende næringsstoffer mangelfull vekst medium. Hvis det er mistanke om at kapsel ikke har blitt indusert etter en standard perioden med inkubering (vanligvis 18-24 h), skal cellene sammenlignes en uninduced kontroll kultur som ikke var eksponert for stressende forhold. Sammenligne to vil avgjøre om induksjon var effektiv. En vellykket induksjon er en som fleste cellene gjøre en større kapsel, sammenlignet med kontrollen uninduced. Fordi ikke alle cellene vil indusere, bør cellene skal måles være en heterogen representasjon tilgjengelig cellene.
Betydningen av konsekvent bildeopptak kan ikke overvurderes, spesielt hvis automatisert måling er målet. Fokus, kontrast, bakgrunn fluorescens, samt bitdybden og bilde komprimering av filer er alle viktige hensyn. Når store klynger som ikke sitter i en enkelt fokalplanet bør unngås, selv om noen spirende og rørende celler er akseptabelt og kan være uunngåelig (denne regelen bør følges for bde manuell og automatisk måling). Dette problemet kan omgås til en viss grad når ved hjelp av AC confocal imaging av fluorescently farget celler. Bruk av z-stabler for å produsere maksimal intensitet anslag kan aktivere nøyaktig måling av celler i forskjellige fokal fly fra et enkelt bilde29. I tillegg bør bilder være ervervet raskt etter forberede prøven. Dette kan være spesielt viktig for blekk farget prøver som når de begynner å tørke, kontrasten mellom bakgrunn og forgrunn elementene (cellene) kan minske og uønsket bakgrunn funksjoner kan bli styrket, noe som fører til redusert automatisert segmentering nøyaktighet.
Selv om kapselen diameter målinger er vanlig i C. neoformans samfunnet, frem til dette punktet er de vanligvis utført manuelt, som krever betydelig tid og arbeidskraft. Imidlertid, manuelle målinger er tillatt i feltet og resultater kan oppnås på liten kostnad. Fremskritt i analyseprogramvare har gjort det mulig å ta de første skrittene mot automatisere disse målingene. Enkel natur C. neoformans celle kroppen og kapsel - vises som en sirkel i en sirkel - i 2D-bilder er av størrelsene relativt enkelt for automatiserte image segmentering programvarepakker, uten behov for å utvikle romanen algoritmer. I stedet ved å koble eksisterende algoritmer, kan C. neoformans celler og kapsler oppdages, segmentert, og målt. Bruker denne tilnærmingen, har vi automatisert målinger av C. neoformans kapsel diameteren for celler beiset med de mest brukte kapsel fargestoff, blekk, og sammenlignet disse manuelle målinger for de samme datasettene. Denne metoden har fordelen av reproduserbarhet og fjerne mye av menneskelig feil forbundet med manuelt måling under lagringstiden forsker. Videre kan flere målinger bli innlemmet med minimal innsats i arbeidsflyten automatisk analyse. Vi føler at automatiserte image analyse er en lovende metode som tillater forskere å måle stort antall C. neoformans kapsel med en høy grad av nøyaktighet og effektivitet.
Total, vi har vist hvordan vellykket indusere kapsel vekst i C. neoformans, beis prøvene med blekk eller fluorescerende fargestoffer og måle kapsel diameter med bde manuell og automatisk mål i en bildeanalyser programvare. Våre resultater tyder på at begge metoder for flekker er levedyktig og generelt gi konsistente resultater (men det er mer variasjon med blekk mål). Videre har både manuelle og automatiserte metoder for måling muligheten til å skjelne varierende kapsel størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren, Hoyin Lai, er produktsjef hos DRVision som utgir automatiserte image analyseprogramvare, Aivia.
Acknowledgments
Vi takker molekylær biovitenskap (MOBI) doktorgrad programmet og biologi avdeling på Middle Tennessee State University (MTSU) for å gi midler til denne studien. Prosjektet ble også finansiert delvis av spesielle prosjekter stipend tildeles D.E.N. av MTSU Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
