Summary
Полисахаридной капсулы является фактором первичного вирулентности Cryptococcus neoformans, и его размер коррелирует с вирулентности штамма. Капсула диаметр измерения используются в фенотипических тестирования и оценки терапевтической эффективности. Здесь представлен стандартный метод капсула индукции, и сравниваются два методы окрашивания и измерения диаметра.
Abstract
Полисахаридной капсулы Cryptococcus neoformans является фактором первичного вирулентности и один из самых часто изучал аспекты этой патогенных дрожжей. Капсула размер может широко варьироваться между штаммами, обладает способностью быстро расти, когда стресс или низкой питательных условий и был положительно коррелирует с вирулентности штамма. По этим причинам размер капсулы представляет большой интерес для исследователей, C. neoformans . Рост C. neoformans капсула индуцируется во время тестирования фенотипические чтобы помочь понять последствия различных методов лечения на дрожжи или размер различия между штаммами. Здесь мы описываем один из стандартных методов капсула индукции и сравнить два признанных методов окрашивания и измерительная капсула диаметр: (i) чернила Индии, отрицательные пятно, используется в сочетании с обычными светлую микроскопию и (ii) совместно окрашивание с Краски люминесцентные, флуоресцентные клеточной стенки и капсула, следуют confocal микроскопии. Наконец, мы покажем, как измерение капсул диаметром от окрашенных чернил Индии образцы могут быть автоматизированы с помощью анализа вычислительных изображений.
Introduction
Влияющих на четверть миллиона человек каждый год и в результате более чем 180 000 смертей ежегодно, Cryptococcus neoformans является патогенным, внутриклеточный дрожжей и возбудителя криптококкоза1,2, 3. наибольшей являются ВИЧ позитивных пациентов в бедных странах, которые не имеют доступ к антиретровирусной терапии, что делает их крайне восприимчивы к болезни4,5,6. Данные из CDC показывают, что в Африке к югу от Сахары, C. neoformans убивает больше людей, чем туберкулеза, ежегодно и более каждый месяц, чем любой вспышки лихорадки Эбола на запись1. Наиболее распространенные пути воздействия происходит от вдыхания сморщившимися споры, которые являются обычным явлением в среду7. При входе в легкие, существует несколько факторов вирулентности, которые внести вклад в успех C. neoformans в инфицированных лиц. Полисахаридной капсулы считается фактором первичного вирулентности микроба, acapsular штаммы являются не вирулентные8.
Криптококковый капсула состоит из трех компонентов принцип: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) и mannoproteins (MPs)9. Хотя м/с являются относительно незначительными клеточной стенки связанный компонент капсулы, они иммуногенность и может способствовать в основном про воспалительной реакции9,10. В отличие от GXM и GalXM составляют основную часть капсулы (> 90% по весу) и иммуносупрессивные последствия11. В дополнение к его иммуномодулирующие эффекты быстрое расширение капсулы в естественных условиях создает механический барьер для употребления, принимающих фагоцитирующих клеток (то есть, нейтрофилы и макрофаги)12. C. neoformans капсулу и его синтеза являются сложными, но в целом, увеличение диаметра капсулы коррелирует с повышенной вирулентности6,,1314. Учитывая это, важно для C. neoformans исследователей иметь возможность быстро и точно подсчитать капсула измерений.
C. neoformans ячейки и ее полисахаридной капсулы являются динамические структуры и показать изменения за время15. Капсулы можно изменить плотность, размер и Ассамблея в ответ на изменения в принимающей среде16,17,18. Инициировать капсулы рост16,18,,1920известны низкой железа или уровни питательных веществ, воздействие сыворотки, человеческого физиологических рН и увеличение CO2 . Кроме того исследователи показали структурные изменения, что привело к значительным различиям в иммунореактивности во время инфекции, кредитование преимущество C. neoformans над его пребывания21,22. Это известно, потому что архитектура C. neoformans капсулы были проанализированы в различных способами. Электронная микроскопия, например, показал, что капсула имеет гетерогенной матрицы с электронно плотные внутренний слой под более проницаемым слоем23. Рассеяние света и использование Оптический пинцет позволили исследователям для дальнейшего выяснения его макромолекулярных свойства24. Анализируя результаты из обоих измерений статического и динамического рассеяния света, мы знаем, что полисахарид капсулы имеет сложной разветвленной структуры23. Оптический пинцет были использованы для тестирования жесткость структуры, а также оценить его антитела реактивности24. Однако на сегодняшний день наиболее часто занятых анализ C. neoformans капсулы является измерение его размер.
Для количественного определения размера капсулы, исследователи используют, что должно быть простой измерения: линейный диаметр капсулы. Цифровые микроскопы, используются для захвата изображения нескольких C. neoformans клеток (как правило сотни) окрашенных чернил Индии или флуоресцентными красителями. Размер каждой клетки тела и окружающего капсулы измеряется. Данные компилируются, и средний диаметр капсулы рассчитывается путем вычитания клетки тела диаметром от диаметра всей клетки (клетки тела + капсула). До этого момента эти измерения были сделаны вручную. Хотя в целом точной, этот метод имеет недостатки для исследователей. Большие наборы данных может занять дни или даже недели, чтобы анализировать вручную. И потому, что эти измерения выполняются вручную, субъективности и человеческой ошибки могут повлиять на результат.
Анализ автоматизированной вычислительной изображений стал незаменимым инструментом для исследователей во многих областях молекулярной клеточной биологии, позволяя более быстрый и надежный анализ биологических изображения 25,,2627. Методы анализа точных изображений необходимо добывать количественную информацию от того, что часто сложных и огромных наборов данных. Однако некоторые измерения, особенно измерения C. neoformans капсула, были трудно автоматизировать. Точно определить интерфейс между клеточной стенки и капсула, которая обычно появляется как кольцо тьмы, когда imaged при фазово контрастной микроскопии, может быть хлопотно для разрешения с помощью простой порог. Кроме того C. neoformans клеток в культуре, как правило, слипаются и точная сегментация клеток необходима для точных измерений.
Цель этого проекта заключалась в (i) иллюстрируют один из стандартных протоколов для капсула индукции в C. neoformans, (ii) сравнить и сопоставить чернил Индии и флуоресценции окрашивание как они относятся к капсуле диаметром измерения, (iii) разработка простой, вычислительные методы для измерения капсул диаметром, с использованием изображений чернил Индии, окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений и, (iv) оценить преимущества и ограничения измерения диаметра капсулы вручную и с помощью программного обеспечения автоматизации. Мы обнаружить, что из двух пятная методов, люминесцентные маркировки клеточной стенки и капсула, пока больше времени при условии наиболее последовательных результатов между экспериментов. Однако, оба метода позволило нам успешно проводить различие между лаборатории и клинической C. neoformans экспонируется различных штаммов капсулы размеров. Кроме того мы смогли автоматизировать измерения капсул диаметром от чернил Индии, окрашенные образы и обнаружил, что это была жизнеспособной альтернативой ручного измерения капсулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: C. neoformans патогена 2-го уровня биобезопасности (BSL-2) и исследователей, работающих с ним должны принимать соответствующие меры предосторожности. Подробные процедуры на как для безопасной работы с патогенами BSL-2 можно найти на центр по контролю заболеваний (CDC) веб-сайт, но это важно отметить, что все люди, соприкасаясь с C. neoformans должны быть надлежащим образом подготовлены в обработке патогенных агентов и должны всегда носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), как правило латекса или перчатки из нитрила. Кроме того роторы на центрифуг должны быть закрыты для предотвращения аэрозолизации образцов и любых разливов, очистке, немедленно с помощью отбеливателя 10% раствор28.
1. капсула индукции
Примечание: Если не указано иное, все действия следует выполнить при комнатной температуре.
- Культура C. neoformans в дрожжи Пептон Декстроза (YPD) бульон (рН 6,5 +/-0.2) и инкубировать при 37 ° C с тряски до тех пор, пока они находятся в фазе журнала (около 18-36 ч).
- Центрифуга клетки на 870 x g 5 минут при температуре 21 ° C и промойте три раза-фосфатный буфер (PBS).
- Используете Горяева (или счетчик автоматизированных клеток) для подсчета клеток и Ресуспензируйте в 2 x 105 клеток/2 мл в Дульбекко в минимальных основных СМИ (DMEM).
- Чтобы побудить капсулу, Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 для 18 h.
Примечание: Сочетание отсутствие питательных веществ в средствах массовой информации и наличие CO2 стимулирует C. neoformans капсулы рост. - После инкубации, урожай клетки путем центрифугирования (см. выше) и удаления всех, но 5-10 мкл супернатант. В то же время урожай соответствующий образец ООН индуцированных клеток для каждого напрягаться, чтобы быть измерены. Используйте их как негативный контроль.
Примечание: Гранулы ячейки будет очень мала и может быть трудно увидеть. Будьте внимательны при аспирационных супернатант. - Пятно с тушью (раздел 2.1) или Краски люминесцентные, флуоресцентные (раздел 2.2).
2. Окрашивание
-
Окрашивание с только чернила Индии
- Пятно дрожжей с тушью, Ресуспензируйте гранулы в оставшихся супернатант и добавить 4μL (около половины) суспензии клеток и 4μL чернил Индии на стекло микроскопа. Осторожно смешать и избегая образования пены.
- Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.
-
Окрашивание только флуоресцентными красителями
- Пятно дрожжи с флуоресцентной краской, Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
- Инкубировать культуры с равным объемом Calcofluor белый (CFW) (1 мкг/мл) и 18B7 капсула МАБ (см. Таблицу материалы) конъюгированных с AlexaFluor488 (AF488) (10 мкг/мл) за 30 мин при температуре 37 ° C.
- Центрифуга клетки на 870 x g за 5 мин при 21 ° C после инкубации и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мкл PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
- Пипетка 8 мкл суспензии клеток на стекло микроскопа.
- Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.
-
Окрашивание с тушью и флуоресцентных красителей
- Более непосредственно сравнить эффективность чернил Индии, окрашивание, флуоресцентных красителей, совместно пятна же популяции клеток с обоими типами пятно. Чтобы сделать это, сначала Инкубируйте клетки с Люминесцентная капсула и клеточной стенки пятно, согласно шаги 2.2.1 - 2.2.3.
- Далее Пипетка равных объемах (4 мкл) суспензии дневно окрашенных клеток и тушью на стеклянное скольжение. Аккуратно перемешайте.
- Применить coverslip 13-мм стекла (толщиной 1.5) и уплотнение края с нетоксичных герметик (ясно лак) для предотвращения образца от высыхания.
3. изображение приобретение/микроскопия
-
Imaging клеток окрашенных чернил Индии.
- Получение изображений с помощью стандартных световой микроскоп (100 крат).
- Изображение как минимум 50 ячеек на условие.
Примечание: Количество ячеек на поле будет меняться, и это приемлемым. Важно, однако, что перекрытие клетки быть сведены к минимуму, как это трудно измерить (как вручную, так и с автоматизированного программного обеспечения). Для этих экспериментов изображения были приобретены на глубине 16 бит с временем экспозиции, оптимизирован для максимальной контрастность изображения при сведении к минимуму размытие, возникшее при небольших движений клеток.
-
Imaging клетки окрашивали флуоресцентных красителей
- Для изображения клетки по микроскопии флуоресцирования, откройте Микроскоп, обработки изображений и выберите соответствующие волны возбуждения и выбросов в флуорофоров используется (CFW и AF488 рады с помощью 405nm и 488 нм огни, соответственно). Получение изображений с помощью микроскопа флуоресценции.
- Изображение как минимум 50 ячеек на условие.
Примечание: Количество ячеек на поле будет меняться, и это приемлемым. Важно, однако, что перекрытие клетки храниться как минимум, как это трудно измерить (как вручную, так и с автоматизированного программного обеспечения). - Приобрести изображения серии z стек клеток для обеспечения максимального диаметра капсулы для каждой ячейки в пределах данной области.
- В программном обеспечении управления микроскопом нажмите на панели «z стека», чтобы открыть панель управления «z стека», а затем выберите параметр «Фамилия» в левом верхнем углу панели.
- Используйте элемент штраф фокус на микроскопе сосредоточиться на уровне, который ниже точки широкого единого дрожжевых клеток и капсулы для всех в рамках текущего поля зрения и нажмите кнопку «Задать первый».
- Используйте элемент штраф фокус сосредоточиться над широкой точки тела клетки из той же клетке и капсулы для всех ячеек в пределах текущего поля зрения и нажмите кнопку «Установить последний».
- Затем нажмите «Начать эксперимент» на вкладке «Приобретение», чтобы приобрести z стека для текущей позиции. Повторите этот процесс на несколько позиций, до тех пор, пока изображения z стек как минимум 50 клеток были приобретены.
Примечание: Для этих экспериментов, конфокальная Пинхол был равным 1.0 АС и перекрывающихся z серии 10-20 фрагментов, охватывающих 0.7 мкм были приобретены в выбранной позиции. АС = светлые блок.
- Далее конвертировать каждой серии z стека в максимальной интенсивности прогнозы (МИП) с помощью программного обеспечения для анализа соответствующего изображения.
Примечание: MIPs проекта наибольшей интенсивностью в каждой плоскости сложены изображения29. Создание MIPs позволяет производить 2-D представление изображения, которые соответствуют максимальной клеток и капсул диаметром в пределах захваченных 3-D стека.
-
Визуализации ячейки окрашенных чернил Индии и флуоресцентных красителей
- Получение изображений с помощью widefield (40 кратном) или конфокального микроскопа (63 X или 100 крат). Для клеток окрашенных чернил Индии и флуоресцентные краски захвата изображения с помощью widefield микроскопом с компьютерным управлением стадии и цель погружения нефти.
Примечание: Микроскоп в использование должно контролироваться с помощью изображений программного обеспечения CFW. флуоресцирование, что спешит через фильтр возбуждения 340-380 Нм и испускаемого света должно быть обнаружено через фильтр барьер Нм 435-485, отраженный от 400 Нм дихроичное зеркало. AF488 флюоресценции может быть взволнованным через фильтр возбуждения 465-495 нм, и испускаемого света может быть обнаружена через фильтр барьер 515-555 Нм, отраженный от 505 нм дихроичное зеркало. - Изображение как минимум 50 ячеек на условие для каждого метода окрашивания.
- Получение изображений с помощью widefield (40 кратном) или конфокального микроскопа (63 X или 100 крат). Для клеток окрашенных чернил Индии и флуоресцентные краски захвата изображения с помощью widefield микроскопом с компьютерным управлением стадии и цель погружения нефти.
4. ручное измерение капсулы
- Для клеток окрашенных чернил Индии или флуоресцентные пятна, использовать программное обеспечение измерения ячейку вручную мера капсулу и клеток диаметра (см. Таблицу материалы). Для этого перейдите в меню «Файл» > «Открыть изображение» > «Мера» и используйте курсор, чтобы нарисовать прямую линию через точку максимально всей ячейки (диаметр).
- Далее снова нажмите кнопку «Мера» и нарисовать прямую линию через тело клетки (клетки тела диаметр).
Примечание: Измерения автоматически сохраняются на клетки. - Повторите этот процесс для всех клеток (минимум 50/группы).
- Для сохранения изображений, как только они измеряются, нажмите кнопку «Файл» > «Сохранить как» и соответствующим образом имя изображения.
- Выберите файлы, недавно измеренных и экспортировать данные в программу электронных таблиц.
- Рассчитать средний диаметр капсул, используя уравнение: ([Диаметр] - [диаметр клетки тела]).
5. автоматизированное измерение капсулы
Примечание: Для успешного автоматизированного измерения, использовать 16-битные изображения с высоким уровнем контрастности и что ориентированы должным образом наряду с программного обеспечения для анализа соответствующего изображения (см. Таблицу материалы). При визуализации C. neoformans капсула измерения, важно сосредоточить внимание на темные кольца на границе между клеточной стенки и капсулы. Это позволяет программное обеспечение, чтобы правильно определить ячейки и капсулы.
- Инвертировать и создайте копию всех чернил Индии, окрашенных клеток изображения с помощью соответствующего программного обеспечения редактирования изображений (см. Таблицу материалы). Чтобы сделать это, нажмите кнопку «Файл» > «Открыть» чтобы открыть чернил Индии, витражные изображения и затем «контроль» + «Я», чтобы инвертировать изображение. Нажмите кнопку «Файл» > «Сохранить как», чтобы сохранить перевёрнутое изображение.
- Для импорта как оригинальные, так и перевернутый изображений в программное обеспечение и нажмите «Файл» > «Импортировать последовательность» > «Загрузка изображения» > «Определить последовательность (вручную)» > «Размеры (канал)» > «Импорт» > «Применить».
Примечание: C. neoformans клеток органов и капсулы могут быть определены и масках с помощью определенных алгоритмов - называют «рецепты» - включены в программное обеспечение. - Использовать «Колонии анализатор (флуоресценции)» рецепт на обращенное изображение для обнаружения и маска тела клетки, а затем нажмите кнопку «Применить». Инвертированное изображение кольцо тьмы, определяющие границы ячейки C. neoformans становится ярче, чем окружающие капсулу.
- Используйте «Колонии анализатор (флуоресценции)» рецепт на обращенное изображение сегмента C. neoformans клеток тела от их капсулы, а затем нажмите кнопку «Применить». Это создает маску игр. Переименуйте этот Фото Маска «Клетки тела», щелкнув правой кнопкой мыши вкладку «Фото Маска».
Примечание: Рецепт состоит из нескольких этапов обработки изображений: удаление фона, обнаружения объекта, объект разделения и фильтрация подмножества. - Далее использовать «Пролиферации» рецепт на исходное изображение для обнаружения и маска капсулы и нажмите кнопку «Применить». Это создает маску игр. Переименуйте этот Фото Маска «Капсулы», щелкните правой кнопкой мыши вкладку «Фото Маска».
- С помощью рецепта, «Капсула раздела», создайте новую маску на исходное изображение для разделения смежные капсулы друг от друга. Для этого нажмите «Капсула раздела» в раскрывающемся меню рецепт. В диалоговом окне раздел капсула выберите теперь переименован Фото Маска «Капсулы» (5.5) для региона капсула. Выберите теперь переименован Фото Маска «Клетки тела» для шифрования клетки (5.4). Выберите «Оригинал» для входной канал и «создать маску для секционированные капсулы. Нажмите кнопку «применить
Примечание: Рецепт генерирует клеток и капсул диаметром, определяется как среднее наименьшим и наибольшим осей, пересекая центр ячейки и капсула и области измерений от обнаружения маски. Найти выход, расположен на вкладке таблицы в этом программном обеспечении. Повторите этот процесс для всех изображений (минимум 50 клеток/группы). Рецепт параметры могут быть настроены для оптимизации обнаружения отдельных изображений или оптимизирован для пакетного обнаружения нескольких изображений. Дополнительные измерения можно рассчитать по рецепту для всеобъемлющей характеристика капсулы по морфологии и ячейки. - Экспорт данных в таблицу программного выбора для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать капсула индукции, окрашивания клеток, изображений и методов измерения, мы использовали три штамма C. neoformans: общей, хорошо изученных лаборатории штамм, H99S30и две клинически изолированные штаммы ранее неизвестные капсула диаметр, B18 и B5231.
Процесс капсула индукции, окрашивание и захвата изображений с использованием чернил Индии показан на рисунке 1A. Изображения взяты из всех трех штаммов показаны на рисунке 1B как до, так и после индукции. Исследователь будет знать, если капсулы индукции был успех, сравнивая клетки, которые претерпели капсула индукции тем из той же культуры, которые не имеют. Увеличение размера ясно обычно проявляется в большинство штаммов после индукции, хотя некоторые штаммы представят естественно небольшие капсулы даже после индукции (см. изображения B18 в рис. 1B). Следует отметить, что капсула индукции завершится ошибкой, если остаточная богатые средства массовой информации не удаляется до индукции или CO2 отсутствует. В этих случаях будет соблюдаться только скромный (если таковые имеются) увеличение размера капсулы. Диаметры от всех трех штаммов были измерены вручную и результаты показаны на рисунке 1 c. В двух из трех экспериментов нет никакой разницы в размерах между H99S и B18. Однако, значительная разница в размерах последовательно наблюдается между крупнейшим штамм, B52 и H99S и B18 (p < 0,001 и p < 0,001, соответственно, стандартные наименее квадраты теста с простой контрастов, размер выборки = 50 клеток/сорт ).
Рисунок 2A изображает процесс капсула индукции, окрашивание и захвата изображений с помощью двух флуоресцентных красителей, один для капсула (18B7-AF488) и один для клеточной стенки (Calcofluor белый). Изображения были захвачены как z стеки для всех трех штаммов после индукции обеспечивая максимальный диаметр капсул и клетки тела был взят в плен для каждой ячейки быть измерены (рис. 2B). Каждый z стек был обработан для получения максимальной интенсивности прогнозы, сжимая 3-мерной стека в 2D-изображение до анализа (рис. 2 c). Они были затем измеряется вручную (Рисунок 2D). В отличие от измерения для чернил Индии, окрашенных клеток люминесцентные, окрашивание включен, нам различать всех трех штаммов на основе их диаметр капсул во всех трех повторяет эксперимента. Здесь, мы обнаружили, что B18 наименьший диаметр капсул и B52 крупнейших (p < 0,001 для всех сравнений, тест стандартный метод наименьших квадратов с простых эффектов, размер выборки = 50 клеток/штамма).
Для дальнейшей оценки два метода окраски капсулы C. neoformans , были сопоставлены измерения от всех трех штаммов. Не было никакого существенного различия между капсульных размеров, определяется с использованием двух методов окрашивания (рис. 3A) (многомерный дисперсионный анализ с простых эффектов, размер выборки = 50 клеток/штамма). Этот вывод согласуется с выводами отдельный эксперимента где лаборатории штамм, H99S, был совместно окрашенных чернил Индии и флуоресцентных красителей (рисунок 3B-C). Однако существует больше изменчивость между эксперименты с использованием чернил Индии, о чем свидетельствует тот факт, что лишь один из трех экспериментов показали значительная разница в размера капсулы между H99S и B18, по сравнению с наблюдается значительная разница между этими штаммами в всех трех флуоресцентных экспериментов (рис.3D-E) (многомерный дисперсионный анализ с простых эффектов, размер выборки = 50 клеток/штамма).
Тушь, окрашенные образы, которые соответствуют критериям, перечисленным в протоколе (статья 5) может быть измерена с помощью автоматизированной системы. Показано на рисунке 4A руководства пользователя через шаги необходимо использовать рецепты рабочий процесс предназначен для измерения C. neoformans капсулу. После разработки рабочего процесса, она была проверена путем измерения кэш существующие изображения клеток C. neoformans тремя исследователями с помощью ручных и автоматических методов. Там были статистически значимых различий между измерениями исследователя когда сделаны вручную, и это также было верно, когда измерения были сделаны с помощью программного обеспечения для анализа автоматизированных изображения (рис. 4B) (ANOVA, размер выборки = 50 клеток/исследователь). Однако, там был небольшой, но значительная разница в размера капсулы сообщили между двумя методами (рис. 4 c) ANOVA, размер выборки = 150 клеток/группа. Капсула диаметр был последовательно немного меньше, когда измеряется через механизм автоматизации, чем ручной измерений (0,3 мкм, p < 0,001). Кроме того при сравнении между капсулы размер измерения, сделанные отдельные исследователи из одинаковых изображений, стандартная ошибка была меньше, когда программное обеспечение для анализа изображений используется для количественной оценки вместо ручных методов, который наводит на мысль о более точные и воспроизводимые измерения с помощью автоматического метода. Для успешного автоматизированного измерения, клетки должны быть в фокусе, имеют от среднего до большого капсула и не быть чрезмерно кластерного (рис. 4 d). Мы обнаружили, что плохо сфокусированные изображения кластерных клеток с небольшой капсулы не может быть измерена автоматически в программном обеспечении. Однако мы утверждают, что они также могут быть сложно измерить точно с использованием ручных методов.
Рисунок 1 : Тушь, пятнать для измерения C. neoformans капсулу. (A) Схематическое представление C. neoformans капсула измерения путем пятнать чернил Индии. Вкратце капсула выражение наведено с помощью питательных лишений и подверженности CO2, клетки высокомобильна в чернилах Индии и монтируется на стеклянных вставках. Изображения, окрашенные клетки приобретают световой микроскопии, с полями, либо выбранный пользователем или плитка сканирование с помощью управляемых компьютером стадии. Изображения можно либо проанализировать вручную или обработаны для сегментации автоматизированных изображений и анализа. (B) изображения общей лаборатории штамм, H99S и два клинических штаммов, B18 и B52, до и после капсула индукции. Масштаб бары представляют 10 мкм, граф (C) представителя эксперимент капсула диаметр показ всех трех штаммов окрашенных чернил Индии и измеряется вручную (ошибка представлена как стандартная ошибка (SE)). Статистическая значимость обозначается следующим образом: *, p < 0,05; **, p < 0,01; и ***, p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Флуоресцентные окрашивания для измерения C. neoformans капсулу. (A) схематическое представление C. neoformans капсула измерения Calcofluor белый (CFW) и 18B7-AF488 совместно окрашивания. После капсула индукции и окрашивания клетки монтируются и образы лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Как клетки могут быть в разных плоскостях фокуса, z стеки приобретаются на каждой позиции. Они обрабатываются для получения максимальной интенсивности прогнозов, которые могут быть использованы для точного измерения максимальный диаметр капсул для каждой ячейки. (B) Изображения общей лаборатории штамм, H99S и два клинических штаммов, B18 и B52, пост капсулы индукции. Примечание: Масштаб бары представляют 10 мкм для всех изображений. (C) максимум интенсивности прогнозы дневно помечены C. neoformans клетки. (D) Граф представитель эксперимента, показаны вручную измеряется капсула диаметр всех трех штаммов, окрашенных с CFW и 18B7-AF488 (ошибка представлена как стандартная ошибка (SE)). Статистическая значимость обозначается следующим образом: *, p < 0,05; **, p < 0,01; и ***, p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сравнение результатов между чернил Индии и флуоресцентные пятнать. (A) анализ трех штаммов C. neoformans окрашенных чернил Индии или флуоресцентными красителями, n = 3 (ошибка представлена как стандартная ошибка (SE)). (B) изображения одного C. neoformans клеток окрашенных чернил Индии и оба Краски люминесцентные, флуоресцентные (линейки шкалы представляет 13 мкм). Горизонтальные линии демаркации границы капсулы и вертикальные линии демаркации по краям клетки тела. Количественная оценка (C) представитель эксперимента H99S совместно окрашенных чернил Индии и Краски люминесцентные, флуоресцентные (ошибка представлена как стандартная ошибка (SE)). (D, E) Изображением капсул диаметром изменчивость между чернил Индии экспериментов (D) и флуоресцентные экспериментов (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Вычислительный анализ C. neoformans капсул диаметром от изображений чернил Индии окрашенных клеток. (A) схематическое представление сегментации изображений и C. neoformans капсула измерения с использованием автоматических измерений (см. Таблицу материалы). (B) сравнение капсула измерений 3 отдельных следователей, используя ручной (Manual 1-3) и автоматизированных методов (автоматизированная 1-3). Каждый следователь используются идентичные кэш изображений C. neoformans обоими методами (ошибка представлена как StDev). (C) объединены в среднем ручных измерений и автоматизированных измерений (ошибка представлена как стандартная ошибка (SE)). Примеры как идеал (D) и (E) неидеальной изображения C. neoformans. Non идеальный изображения нельзя измерить успешно в программном обеспечении. Статистическая значимость обозначается следующим образом: *, p < 0,05; **, p < 0,01; и ***, p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На протяжении десятилетий капсулы был одним из основных направлений исследований для микологи и клиницисты заинтересованы в C. neoformans и криптококкоз из-за его роль как фактор основных вирулентности возбудителя. С помощью микроскопии для измерения размера капсулы различия штаммов и под различными роста условиях могут обеспечить важную информацию о возбудителя и ее ответы на различные раздражители (т.е., различных экологических условий, потенциальных лекарств и т.д.) здесь, мы разработали метод, чтобы вызвать рост капсулы в C. neoformans, и по сравнению двух разных капсулы пятная протоколы. Наконец мы показали, как программное обеспечение для анализа изображений может использоваться для автоматизации измерений капсул диаметром от изображений чернил Индии, окрашенных клеток, дают результаты, которые были сопоставимы с методов ручного измерения.
В наших экспериментах мы сравнили два клинических штаммов, B18 и B52, с H99S, Стандартный лаборатории штамм известных капсулы размер18. Оба пятная методы показали, что клинические штамм, B52, имел самый большой диаметр капсула трех штаммов, тестирование. Однако результаты измерений флуоресцентные смогли разглядеть разницу между двумя штаммами с меньшего размера капсулы, где чернила Индии измерения не были. Результаты из обоих методов окрашивания согласуются, предполагая, что оба являются действительными, но что с использованием изображений дневно окрашенных C. neoformans может позволить повышенная чувствительность в измерении штаммы с небольшой капсуле. Используя максимальный прогнозов, созданных от z стек изображений дневно окрашенных клеток позволяет исследователям для обеспечения что точная капсула диаметр измерения могут быть сделаны даже тогда, когда образ клетки находятся в разных плоскостях фокуса. Эти измерения являются более трудными для C. neoformans образы с помощью чернил Индии и стандартные световой микроскопии. В любое данное изображение смежные ячейки могут сидеть в слегка различных координационных плоскостях, что делает его трудно точно решить границы тела клетки капсула для всех ячеек. Это может возможно смешивать следователей способность обнаружить небольшие изменения размера капсулы или небольшие различия между штаммами.
Каждый метод имеет свои собственные преимущества. Чернила Индия наиболее часто используется исследователями из-за своей доступности, простоты использования и стабильности (он не деградирует со временем, как могут некоторые флуоресцентные пятна). Потому что тушь является простой, негативные пятно она может использоваться в сочетании с стандартным света Микроскопы, которые являются более доступными, чем люминесцентные микроскопы. Однако если не используется в правильных пропорциях (Индия чернил: буфер), пятно может создать «пушистые» фон при записи образа, который может усложнить анализ автоматизированной изображений. В то время как дорогие и больше времени использовать, флуоресцентных красителей может быть выгодным для их гибкости, и как мы, их чувствительность. Они особенно полезны для измерения капсулы размер и ячейки бремя в экспериментах, связанных с C. neoformans , которые были phagocytosed иммунных клеток и необходимы для гистологического исследования C. neoformans капсулы в образцы тканей (техника, не описанных в этой статье)32. Если окрашиванию флуоресцентными красителями, например calcofluor белый или дневно меткой анти GXM антител, проблематично (например, недостаточно окрашивание), это правило может быть преодолено путем оптимизации окрашивание протокол (увеличения/уменьшения концентрация и/или инкубации время с красителем).
Независимо от окраски методологии, мы находим, что капсула индукции и надлежащего образа захвата являются важнейшие шаги в протоколе. Протокол, изложенных в настоящем документе, является одним из нескольких стандартных методов для капсула индукции в C. neoformans и успешно используется в лабораториях дрожжи для многих лет23. C. neoformans капсула индукции, CO2-зависимых и происходит только в стрессовых условиях23,33. Таким образом важно, что это происходит в 5% CO2 инкубатора, с использованием надлежащих питательных недостаточным роста среднего. Если есть подозрение, что капсула не были индуцированных после стандартного периода инкубации (обычно 18-24 ч), клетки следует сравнить с uninduced управления культуры, которая не была подвержена стрессовых условиях. Сравнение двух определит ли индукции было эффективным. Успешный индукции-один в котором большинство клеток сделать капсулу большей, по сравнению с uninduced управления. Потому что не все ячейки будут побуждать, клетки, чтобы быть измерены должно быть гетерогенной представление доступных ячеек.
Нельзя переоценить важность приобретения последовательной изображения, особенно если целью является автоматизированное измерение. Фокус, контраст, флуоресценции фон, а также глубину и сжатия изображения файлов находятся все важные соображения. Когда это возможно, следует избегать больших скоплениях клеток, которые не сидят в одной фокальной плоскости, хотя некоторые многообещающий и трогательно клетки являются приемлемыми и может быть неизбежным (это правило следует использовать для ручного и автоматического измерения). Эту проблему можно обойти в определенной степени, при помощью конфокальной визуализационная диагностика дневно окрашенных клеток. Использование z стеки для получения максимальной интенсивности прогнозы можно включить точное измерение клеток в разных плоскостях фокуса с одного изображения29. Кроме того изображения должны быть приобретены быстро после подготовки образца. Это может быть особенно важно для чернил Индии, витражи образцы как когда они начинают сушить, может уменьшить контраст между элементами фона и переднего плана (клетки) и нежелательный фон возможности могут быть расширены, что приводит к снижается автоматизированных точности сегментации.
Хотя капсула диаметр измерения являются обычным явлением в общине C. neoformans , вплоть до этого момента они обычно выполнены вручную, что требует значительного времени и людских ресурсов. Однако ручные измерения принимаются в области и результаты могут быть получены в мало счет. Выдвижения в программное обеспечение для анализа изображений сделали возможным предпринять первые шаги в направлении автоматизации этих измерений. Простой характер C. neoformans клетки тела и капсулы - появляться как круг внутри круга - в 2D изображения делает измерения их размеры относительно простой для автоматизированных изображения сегментации пакетов программного обеспечения, без необходимости разработки Роман алгоритмы. Вместо этого, путем увязки существующих алгоритмов, C. neoformans клетки и капсулы может быть обнаружен, сегментированные и измеряется. Используя этот подход, мы автоматизировали измерения диаметра капсулы C. neoformans клеток окрашенных с наиболее часто используемых капсул краска, тушь, и сравнили их ручного измерения для же наборов данных. Этот метод предлагает преимущество воспроизводимость и удаление большую часть человеческой ошибки, связанные с ручного измерения при сохранении время исследователь. Кроме того дополнительные измерения могут быть включены с минимальными усилиями в процесс автоматического анализа. Мы считаем, что анализ автоматизированной изображений является многообещающим подходом, который позволяет исследователям для измерения большого числа C. neoformans капсула с высокой степенью точности и эффективности.
В целом мы продемонстрировали, как успешно вызвать капсулы рост в C. neoformans, пятно образцы с тушью или флуоресцентными красителями и измерить капсула диаметр с помощью ручных и автоматических измерений в анализ изображений программное обеспечение. Наши результаты показывают, что оба метода окрашивания жизнеспособных и обычно производят последовательные результаты (хотя есть больше изменчивость с измерениями чернил Индии). Кроме того ручных и автоматических методов измерения имеют способности различать различных капсульных размеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор, Hoyin лай, является менеджером продукта в DRVision, который публикует анализ программного обеспечения автоматизированных изображения, Aivia.
Acknowledgments
Мы благодарим Департамент биологии и молекулярной бионаукам (MOBI) докторской программы в середине университета штата Теннесси (MTSU) за предоставление финансирования для этого исследования. Проект также был частично финансируется Фондом MTSU гранта в специальных проектов для д.э.н..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
