Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/57171
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies
* These authors contributed equally

Summary

Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.

Abstract

Cryptococcus neoformans polisakkarit kapsülü birincil virülans faktörü olduğunu ve en sık bu patojenik Maya yönlerini okudu. Kapsül boyutu çok suşları arasında değişebilir, stresli ya da düşük besin koşulları tanıttığında hızla büyümeye yeteneğine sahiptir ve olumlu zorlanma virülans ile ilişkili. Bu nedenlerden dolayı kapsül C. neoformans araştırmacılar büyük ilgi boyutudur. C. neoformans kapsül büyüme fenotipik test sırasında farklı tedaviler suşları Maya veya boyutu farklılıkları üzerinde etkileri anlamak için indüklenen olduğu. Burada biz boyama ve kapsül Çap ölçüm kapsül indüksiyon ve karşılaştırma iki yöntemden kabul edilen standart yöntemlerden birini tarif: (i) çini mürekkebi, konvansiyonel ışık mikroskobu ile birlikte ve (ii) ile birlikte boyama kullanılan negatif bir leke kapsül confocal mikroskobu tarafından takip ve hücre duvarı floresan boyalar. Son olarak, biz nasıl Hindistan mürekkep lekeli örneklerinden kapsül çap ölçümü-ebilmek var olmak göstermek sayısal görüntü analizi kullanarak otomatik.

Introduction

Çeyrek milyon insan her yıl etkileyen ve her yıl daha fazla 180.000 ölümle sonuçlanan, Cryptococcus neoformans patojen, hücre içi mantar ve Kriptokokkoz1,2, hastalığının olduğunu 3. zor hit antiretroviral tedavi, hazır erişim onları akut hastalık4,5,6duyarlı hale sahip olmayan HIV pozitif hastaların yoksul ülkelerde vardır. CDC verileri alt ve Sahra Afrika, C. neoformans tüberküloz daha fazla insan her yıl ve daha fazla her ay herhangi bir Ebola salgını kayıt1daha öldürdüğünü gösteriyor. Maruz kalma en yaygın yol çevre7olağan hale kabuktan sporlar teneffüs edilmesi oluşur. Akciğerlere girdikten sonra C. neoformans başarı enfekte bireylerin içinde katkıda birkaç virülans faktörleri vardır. Acapsular suşları öldürücü8değildir olarak polisakkarit kapsülü mikrop'ın birincil virülans faktörü olarak kabul edilir.

Cryptococcal kapsül üç ilke bileşenlerini yapılır: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) ve mannoproteins (MPs)9. MPs kapsül görece küçük bir hücre duvarı ilişkili bileşeni olmakla birlikte, bunlar immunojenik ve çoğunlukla pro-inflamatuar yanıt9,10yükseltebilirsiniz. Buna ek olarak, kapsül toplu GXM ve GalXM yapmak (> ağırlıkça % 90'ı) ve immünsupresif etkileri11var. İmmunomodulatory etkileri yanı sıra, kapsül vivo içinde hızlı genişleme ana bilgisayar Fagositik hücreleri (Yani, nötrofiller ve makrofajlar)12tarafından yenmesi için mekanik bir engel oluşturur. C. neoformans kapsül ve onun sentez karmaşık olmakla birlikte, genel olarak, artan kapsül çapı artan virülans6,13,14ile ilişkilidir. Bu göz önüne alındığında, hızlı ve doğru kapsül ölçümleri ölçmek muktedir C. neoformans araştırmacılar için önemlidir.

C. neoformans hücre ve onun polisakkarit kapsülü dinamik yapıları ve zaman15üzerinde değişiklikler göstermektedir. Kapsül yoğunluğu, boyutu ve derleme değişiklikler ana bilgisayar ortamı16,17,18değiştirebilirsiniz. Düşük demir veya besin düzeyleri, serum, insan fizyolojik pH ve artan CO2 kapsül büyüme16,18,19,20başlatmak için bilinir. Ayrıca, araştırmacılar21,22ana bilgisayar üzerinde bir avantaj- C. neoformans için kredi immunoreactivity önemli farklılıkların kaynaklanan enfeksiyon sırasında yapısal değişiklikler göstermiştir. C. neoformans kapsül mimarisini çeşitli şekillerde analiz etti çünkü bu bilinir. Elektron mikroskobu, örneğin, kapsül bir dış, daha geçirgen katman23altında iç bir elektron yoğun tabaka ile heterojen bir matris olduğunu ortaya koymuştur. Işık saçılma ve optik cımbız kullanımını daha da onun makromoleküllerin özellikleri24aydınlatmak araştırmacılar sağladı. Her iki statik ve dinamik ışık saçılma ölçüm sonuçlarını analiz, polisakkarit kapsülü karmaşık bir dallanma yapısı23olduğunu biliyoruz. Optik cımbız yapısına Sertlik test gibi onun antikor reaktivitesi24değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, şimdiye kadar en sık istihdam C. neoformans kapsül boyutu ölçüm analizidir.

Kapsül boyutu ölçmek için araştırmacılar ne-meli var olmak basit bir ölçüm kullanın: kapsül doğrusal çapını. Digital mikroskoplar birden fazla C. neoformans hücre (genellikle yüzlerce) çini mürekkebi veya floresan boyalar ile lekeli görüntülerini yakalamak için kullanılır. Her hücre vücut ve çevresindeki kapsül boyutu ölçülür. Veriler derlenmektedir ve kapsül ortalama çapı tüm cep telefonu çapı (hücre vücut + kapsül) üzerinden cep gövde çapı çıkarılarak hesaplanır. Şu ana kadar bu ölçümler el ile yapılmıştır. Genel olarak doğru olsa da, bu yöntem araştırmacılar için dezavantajları vardır. Büyük veri kümeleri gün almak ya da el ile çözümlemek için hafta. Ve bu ölçümler el ile yapılır çünkü, öznellik ve insan hatası sonucu etkileyebilir.

Otomatik hesaplama görüntü analizi biyolojik görüntüleri 25,26,27daha hızlı ve daha güvenilir analizini sağlayan moleküler hücre biyolojisi, birçok alanda araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kesin görüntü analizi teknikleri ne çoğu zaman karmaşık ve büyük veri kümeleri üzerinden nicel bilgi benim gereklidir. Ancak, bazı ölçümler, C. neoformans kapsül, özellikle ölçüm otomatikleştirmek zor olmuştur. Doğru bir şekilde hücre duvarı ve genellikle tarafından faz kontrast mikroskobu görüntüsü zaman karanlık bir halka olarak görünen, kapsül, arasındaki arabirimi tanımlayan basit bir eşik kullanarak çözmek zahmetli olabilir. Ayrıca, C. neoformans hücre kültüründe birlikte yığın eğilimindedir ve hücrelerinin doğru segmentasyon doğru ölçümler için gereklidir.

Bu projenin amacı (i) C. neoformans, (ii) karşılaştırın ve kontrast çini mürekkebi kapsül indüksiyon için standart iletişim kuralları göstermek için yapıldı ve floresan boyama çapı ölçümleri, kapsül ilgilidir (III) geliştirmek basit, Hindistan mürekkep lekeli bir görüntü analiz yazılımı ve (iv) kullanarak hücreleri görüntülerini kullanarak kapsül çapı ölçmek için hesaplama yöntemleri faydaları ve kısıtlamaları el ile kapsül Çap ölçüm ve yazılım Otomasyon kullanarak değerlendirmek. Biz bu iki boyama yöntemleri, hücre duvarı ve kapsül etiketleme floresan bulmak, daha uzun sürmesine iken, sağlanan deneyler arasında en tutarlı sonuçlar. Ancak, her iki yöntem başarılı bir şekilde ayırt etmek için bize etkin laboratuar ve klinik C. neoformans arasında farklı sergilenmesi suşları boyutları kapsül. Ayrıca, Hindistan mürekkep lekeli görüntüler üzerinden kapsül çap ölçümü otomatikleştirmek ve bu kapsül manuel ölçüm bir alternatif bulundu ki başardık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: C. neoformans seviye 2 (BSL-2) patojen ve bu modülle çalışmanın araştırmacılar gerekli önlemleri almalıdır. Ayrıntılı yordamlar nasıl için güvenli bir şekilde BSL-2 patojenler ile İş Merkezi hastalık kontrolü için (CDC) bulunabilir üzerinde web sitesi, ama tüm kişiler C. neoformans temas geliyor düzgün işlemede eğitimli unutmayın patojenik ajanlar ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE), genellikle lateks veya nitril eldiven giymek gerekir. Ayrıca, santrifüjler rotorları Kloroformu örnekleri ve hemen bir % 10 çamaşır suyu çözüm28kullanarak temizleyelim herhangi bir sızıntıları önlemek için kapalı olmalıdır.

1. kapsül indüksiyon

Not: Tüm adımları oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilmesi gerekiyor.

  1. C. neoformans Maya pepton dekstroz (YPD) suyu (pH 6,5 +/-0.2) içinde kültür ve 37 ° C'de log fazı (yaklaşık 18-36 h) onlar kadar sallayarak ile kuluçkaya.
  2. 870 x g 21 ° C'de 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.
  3. Hücreleri saymak ve 2 x 105 hücreleri/2 mL Dulbecco'nın en az temel medya (DMEM), resuspend için bir hemasitometre (veya bir otomatik hücre sayaç) kullanın.
  4. Kapsül ikna etmek için 37 ° C ve % 5 CO2 18 h için kuluçkaya.
    Not: Medya besin yokluğu ve CO2 varlığı ile birlikte C. neoformans kapsül büyüme uyarır.
  5. Sonrası kuluçka, hasat hücreleri (yukarıdaki gibi) centrifuging ve tüm ama 5-10 µL süpernatant kaldırma. Aynı zamanda, karşılık gelen bir un indüklenen hücre örneği ölçülecek her zorlanma için hasat. Bunlar negatif denetimleri kullanın.
    Not: Hücre topakları çok küçük olacaktır ve görmek zor olabilir. Süpernatant alıyorum dikkatli olun.
  6. Hindistan mürekkep (Kısım 2.1) veya floresan boyalar (Bölüm 2.2) ile leke.

2. boyama

  1. Sadece çini mürekkebi ile boyama
    1. Çini Mürekkebi ile Maya leke için Pelet kalan süpernatant içinde resuspend ve 4μL ekleyin (yaklaşık yarısı) hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam mikroskop slayt üzerine 4μL. Yavaşça karıştırın ve köpük önlemek.
    2. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.
  2. Sadece floresan boyalar ile boyama
    1. Maya ile floresan bir boya lekesi için 50 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile hücre Pelet resuspend.
    2. Kültür Calcofluor beyaz (CFW) eşit bir birimdeki kuluçkaya (1 µg/mL) ve kapsül mAb 18B7 AlexaFluor488 için Birleşik ( Tablo malzemelerigörmek) (AF488) (10 µg/mL) 37 ° C'de 30 dk
    3. 870 x g 21 ° C sonrası kuluçka, 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
    4. Hücre Pelet 10 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile resuspend.
    5. Hücre süspansiyon üzerine cam mikroskop kaymak 8 µL pipet.
    6. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.
  3. Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile boyama
    1. Daha doğrudan bu floresan boyalar boyama çini mürekkebi etkinliğini karşılaştırmak için her iki tür leke ile aynı hücre nüfus co leke. Bunu yapmak için önce hücreleri floresan kapsül ve hücre duvar boyası, adımları 2.2.1 - 2.2.3 göre kuluçkaya.
    2. Ardından, eşit miktarlarda (4 µL) fluorescently lekeli hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam slayt üzerine pipet. Hafifçe karıştırın.
    3. 13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) kenarları mühür.

3. görüntü edinme/mikroskobu

  1. Hücreleri Imaging çini mürekkebi ile lekeli.
    1. Standart bir ışık mikroskobu (100 X büyütme) kullanarak görüntüleri elde etmek.
    2. Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü.
      Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur. Bu deneyler için görüntüleri 16 bit bir derinlikte hücreleri küçük hareketlerle kaynaklanan bulanıklık en aza indirerek görüntü kontrastı en üst düzeye çıkarmak için optimize pozlama süreleri ile elde.
  2. Hücreleri Imaging ile floresan boyalar lekeli
    1. Hücreleri tarafından floresan mikroskopi olabilir görüntü için düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop açın ve kullanılan fluorophores için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında seçin (CFW ve AF488 heyecan 405nm ve 488 nm ışık, sırasıyla kullanarak). Floresan mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek.
    2. Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü.
      Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur.
    3. Bir z-yığın görüntü serisi hücrelerin belirli bir alan içindeki her hücre için maksimum kapsül çapı elde emin olmak için kazanmak.
      1. Mikroskop kontrol yazılımı "z-yığın" çubuğunda "z-yığın" Denetim Masası'nı açın ve sonra panelin sol üst köşesine "İlk/son" seçeneğini tıklatın.
      2. Mikroskop odak fine-odak denetimde bir tek Maya hücre ve kapsüller için tüm geçerli görüş alanı içinde en geniş amacı aşağıda ve "İlk ayarla"'ı tıklatın bir seviyede kullanın.
      3. Yukarıda aynı hücreyi ve kapsül hücre vücudun en geniş noktası odak fine-odak denetime tüm geçerli görüş alanı içindeki hücreleri ve "Son Set"'ı tıklatın.
      4. Sonra "Deney başlamak" z-yığın geçerli pozisyon için elde etmek için "Satın alma" sekmesinde tıklatın. Z-yığın görüntüleri en az 50 hücre elde kadar birden fazla pozisyonlarda işlemi yineleyin.
        Not: Bu deneyler için 1.0 için confocal iğne deliği kuruldu AU ve çakışan bir z-serisi 0.7 µM kapsayan 10-20 dilim seçili konumlarda elde. AU = havadar adet.
    4. Ardından, her z fiş serisi uygun görüntü analiz yazılımı kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) dönüştürün.
      Not: MIPs her uçak yığılmış resim29en büyük yoğunlukta proje. MIPS oluşturma bir en fazla hücre ve kapsül çapı yakalanan 3-b yığın içinde karşılık gelen resimleri bir 2-B temsil üretmek izin verir.
  3. Hücreleri Imaging çini mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli
    1. Widefield (40 X büyütme) veya confocal mikroskop kullanarak görüntüleri (63 X veya 100 X büyütme). Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli hücreler için bir bilgisayar kontrollü sahne ve yağı daldırma amacı ile donatılmış bir widefield mikroskop kullanarak çekim.
      Not: Mikroskop kullanımda bir görüntüleme yazılımı CFW kullanarak kontrol edilmelidir. 340-380 nm uyarma filtreden heyecanlı ve ışık yayılan Floresans 400 nm dikroik ayna dan yansıyan bir 435-485 nm bariyer filtresi ile tespit edilmelidir. AF488 floresan 465-495 nm uyarma filtreden heyecanlı ve verilmiş ışık 505-nm dikroik ayna dan yansıyan bir 515-555 nm bariyer filtresi ile tespit edilebilir.
    2. Resim Boyama her yöntem için koşul başına 50 hücreleri en az.

4. el ile ölçüm-in kapsül

  1. Çini Mürekkebi veya floresan lekeleri ile lekeli hücre için bir hücre ölçüm yazılımı el ile ölçü kapsül ve hücre çapı için kullanın (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" gidin > "Görüntü aç" > "Ölçü" ve tüm cep telefonu (Toplam çap) en geniş anlamı ile düz bir çizgi çizmek için kullanabilirsiniz imleç.
  2. Ardından, "Ölçü" yeniden tıklatın ve hücre vücut (hücre gövde çapı) düz bir çizgi çizin.
    Not: Ölçüler otomatik kaydedilen-hücreleri.
  3. Tüm hücreleri (en az 50/grup) için bu işlemi yineleyin.
  4. Bir kez onlar ölçülür görüntüleri kaydetmek için "Dosya"'ı tıklatın > "Farklı Kaydet" ve görüntüleri uygun şekilde adlandırın.
  5. Yeni ölçülen dosyaları seçin ve verileri bir elektronik tablo yazılımı için verin.
  6. Ortalama kapsül çap eşitliği kullanarak hesaplar: ([Toplam çapı] - [hücre gövde çapı]).

5. otomatik ölçüm kapsül

Not: başarılı otomatik ölçüm için 16-bit görüntüleri yüksek karşıtlık kullanın ve bir uygun görüntü analiz yazılımı ile birlikte düzgün odaklı ( Tablo malzemelerigörmek). C. neoformans kapsül ölçüm için Imaging zaman, hücre duvarı ve kapsül arasında sınır karanlık yüzüğe odaklanmak önemlidir. Bu doğru hücre ve kapsül betimlemek için yazılım sağlar.

  1. Ters çevir ve tüm çini mürekkebi hücre görüntüleri uygun bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak lekeli bir kopyasını oluşturun (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" tıklayın > Hindistan mürekkep lekeli görüntüleri açın ve sonra "kontrol" için "açık" + "I" görüntü ters çevirmek için. "Dosya" > "Ters görüntü kaydetmek için farklı kaydet".
  2. Hem özgün ve ters almak için "Dosya" görüntü içine belgili tanımlık bilgisayar yazılımı tıklatın > "Alma sırası" > "Yük görüntü" > "Tanımla sıra (el ile)" > "Boyutlar (kanal)" > "Al" > "Uygula".
    Not: C. neoformans hücre organları ve kapsül belirlenebilir ve özel algoritmalar 'yemek tarifleri' yazılımı dahil - olarak anılacaktır - kullanarak maskeli.
  3. Algılamak ve hücre vücut maske ters görüntü 'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi kullanın, sonra "Uygula"'ı tıklatın. Ters görüntü C. neoformans Hücre kenarlığını tanımlama karanlık halka çevreleyen kapsül parlak olur.
  4. 'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi ters görüntü onların kapsül C. neoformans hücre vücutlarından segmentlere ayırmak, o zaman tıkırtı "Uygula" için kullanın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Hücre beden" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak.
    Not: Tarifi birden fazla görüntü adımları işleme oluşur: arka plan kaldırma, nesne algılama, nesne ayırma ve alt filtreleme.
  5. Ardından, 'Hücre çoğalması' tarifi üzerinde orijinal görüntü tespit ve kapsül maske kullanmak ve "Uygula"'ı tıklatın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Kapsül" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak.
  6. Tarifi, 'Kapsülü Bölüm' kullanarak oluşturmak birbirinden bitişik kapsül bölümlemek için orijinal görüntü üzerine yeni bir maske. Bunu yapmak için tarifi açılan menüden "Kapsül bölümü"'yi tıklatın. Kapsül bölüm kutusunda kapsül bölge için şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Kapsül" (5.5) seçin. Şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Hücre beden" Kripto hücreleri (5,4) seçin. Giriş kanalı ve "Partitioned Kapsül oluşturma maskesi. için"Orijinal"seçin "Uygula'yı tıklatın
    Not: Tarifi hücre ve hücre ve kapsül ve alan ölçüleri Merkezi algılama maskeler geçerken en uzun ve en kısa eksen ortalama olarak tanımlanan kapsül çapı oluşturur. Bu yazılım elektronik tablo sekmesinde altında bulunan çıkış bulmak. Tüm resimler (en az 50 hücreler/grubu) için bu işlemi yineleyin. Tarifi'nın parametreleri algılama bireysel görüntülerin optimize etmek için ayarlanmış veya birden fazla görüntü toplu tespiti için en iyi duruma getirilmiş olabilir. Ek ölçümler hücre ve kapsül'ın Morfoloji kapsamlı karakterizasyonu için reçete tarafından hesaplanır.
  7. Verileri daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo yazılım için verin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kapsül: indüksiyon, hücre boyama, görüntü ve ölçüm teknikleri, biz üç soy-in çizgisiyle C. neoformans: ortak, iyi karakterize laboratuvar zorlanma, H99S30ve iki klinik olarak izole soyu daha önce Bilinmeyen kapsül çapı, B18 ve B5231.

İş akışı kapsül indüksiyon, boyama ve çini mürekkebi kullanarak resim alma şekil 1Aile gösterilir. Görüntüleri tüm üç suş alınan şekil 1B adımında öncesi ve sonrası indüksiyon gösterilir. Araştırmacı kapsül indüksiyon bir başarı değil-si olmak bu aynı kültürden kapsül indüksiyon uğramıştır hücreleri karşılaştırarak olup olmadığını bilecek. Her ne kadar bazı suşları bile indüksiyon sonra doğal olarak küçük kapsül sergileyecek bir net ölçü artış içinde çoğu suşları sonrası indüksiyon, genellikle açıkça görülür ( şekil1B B18 görüntüleri bkz). Bu kapsül indüksiyon kalan zengin medya indüksiyon öncesinde kaldırılmaz ise veya CO2 yoksa başarısız olması gerekmektedir. Bu gibi durumlarda, kapsül boyutu (varsa) sadece mütevazı artışlar gözlenir. Tüm üç suş çapı el ile ölçüldü ve sonuçları şekil 1 ciçinde gösterilir. Üç deneyler ikiye H99S B18 arasında fark yoktur boyutu vardı. Ancak, boyutu önemli bir fark sürekli olarak en büyük gerginlik, B52 ve H99S ve B18 arasında gözlendi (p < 0,001 ve p < 0,001, sırasıyla, standart en az kare sayısını test basit kontrastlı örnek boyutu 50 hücreler/zorlanma = ).

Şekil 2A kapsül indüksiyon, boyama ve resim alma kullanarak iki floresan boyalar, bir kapsül (18B7-AF488) ve bir hücre duvarı (Calcofluor beyaz) için iş akışı gösterilmektedir. Görüntüleri z-yığınları bütün üç suş sonrası indüksiyon, (şekil 2B) maksimum kapsül ve hücre gövde çapı ölçülecek her hücre için yakalandı sağlanması için olarak ele geçirildi. Her z-yığın maksimum yoğunluk projeksiyon, içine bir 2B görüntü analizi (şekil 2C) önce 3 boyutlu yığın sıkıştırma üretmek için işlendi. Bunlar daha sonra el ile ölçüldü (şekil 2B). Hindistan mürekkep lekeli hücreleri ölçülerini, bize üç onların kapsül çapı temelinde tüm üç suşları arasında ayırımcılık için etkin boyama floresan deneme yineler. Burada, en küçük kapsül çap ve B52 B18 en büyük olduğu bulundu (p < 0,001 tüm karşılaştırmalar, basit efektler ile standart en küçük kareler test için örnek boyutu 50 hücreler/zorlanma =).

C. neoformans kapsül boyama iki yöntem daha fazla değerlendirmek için üzerinden tüm üç suş ölçümleri karşılaştırıldı. (Şekil 3A) Boyama iki yöntemi kullanarak kararlı kapsül boyutları arasında anlamlı bir fark yoktu (basit efektler, birden fazla varyasyon ANOVA örnek boyutu 50 hücreler/zorlanma =). Bu sonuç nerede laboratuvar gerginliği, H99S, çini mürekkebi ve floresan boyalar (3B şekil-C) ile birlikte lekeli ayrı bir deney bulguları ile tutarlı. Her nasıl, orada was büyük değişkenlik çini mürekkebi, H99S ve gözlenen önemli fark karşılaştırıldığında B18 arasında önemli bir fark kapsül boyutunda tek bir üç deneyler gösterdi aslında kanıtladığı gibi kullanarak deneyler arasında tüm üç floresan deneylerde (şekil3D-E) bu suşlar arasında (basit efektler, birden fazla varyasyon ANOVA örnek boyutu 50 hücreler/zorlanma =).

Hindistan lekeli Protokolü (Bölüm 5) listelenen ölçütlere uyan görüntüleri mürekkep otomatik bir sistem kullanarak ölçülebilir. Şekil 4A kılavuzlarında adımlarda kullanıcı tarifleri kullanmak için gerekli gösterilen iş akışı C. neoformans kapsül ölçmek için tasarlanmış. İş akışı geliştirmek sonra el ile ve otomatik yöntemler kullanarak üç araştırmacı tarafından C. neoformans hücrelerin varolan görüntülerin bir önbellek ölçerek doğrulandı. Hiçbir zaman el ile yapılan araştırmacı ölçümleri arasında önemli farklılıklar vardı ve ölçümleri otomatik görüntü analiz yazılımı (şekil 4B) kullanarak yapıldığı zaman bu da gerçek oldu (ANOVA, örnek boyutu 50 hücreler/araştırmacı =). Ancak, küçük bir vardı ama kapsül boyutunda önemli fark bildirilen iki yöntem arasında (şekil 4 c) ANOVA, örnek boyutu = 150 hücreler/grup. Kapsül çapı el ile ölçümler daha otomasyon yoluyla ölçülen zaman sürekli olarak biraz daha küçük (0.3 µm, p < 0.001). Görüntü analiz yazılımı için el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler yerine miktar daha fazla müstehcen olduğu kullanıldığında ek olarak, aynı görüntü kümelerini ayrı araştırmacılar tarafından yapılan kapsül boyutu ölçümleri arasında karşılaştırırken, standart hata daha küçük Otomatik yöntemini kullanarak hassas, tekrarlanabilir ölçümler. Başarılı otomatik ölçmek için hücreleri odakta olmalı, bir orta büyük kapsül var ve aşırı olmamak (şekil 4 d) kümelenmiş. Biz küçük kapsül içeren kümelenmiş hücrelerin kötü odaklı görüntüleri otomatik olarak yazılım ölçülen değil bu bulunamadı. Ancak, bunlar da doğru bir şekilde el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler kullanarak ölçmek için zor olabilir iddia.

Figure 1
Resim 1 : Çini Mürekkebi ölçmek için boyama C. neoformans kapsül. (A) Hindistan mürekkep boyama tarafından kapsül ölçüm C. neoformans şematik gösterimi. Kısaca, kapsül ifade besin yoksunluğu ve CO2maruz kullanarak indüklenen, hücreleri içinde çini mürekkebi resuspended ve cam slaytlar üzerine monte edilmiş. Görüntüleri lekeli hücre ya da kullanıcı tarafından ya da tarayarak kiremit-bilgisayar kontrollü sahne kullanarak seçili alanlar ile ışık mikroskobu ile elde edilir. Görüntüleri analiz el ile veya otomatik görüntü segmentasyonu ve analiz için işlenmiş. Ortak laboratuvar zorlanma, H99S ve iki klinik suşları, B18 ve B52, öncesi ve sonrası kapsül indüksiyon (B) görüntüleri. Ölçek çubukları temsil eden bir temsilcisi (C) grafiği deneme gösteren tüm üç suşlarının çini mürekkebi ile lekeli ve el ile ölçülen kapsül çapı 10 µm (hata, standart hata (SE) temsil edilir). İstatistiksel anlamlılık aşağıdaki gibi belirtilir: *, p < 0,05; **, p < 0,01; ve ***, p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Floresan ölçmek için boyama C. neoformans kapsül. (A) C. neoformans kapsül ölçüm Calcofluor beyaz (CFW) ve 18B7-AF488 ortak boyama tarafından şematik gösterimi. Kapsül indüksiyon ve boyama sonra hücreleri monte edilmiş ve confocal mikroskobu tarama lazerle görüntüsü. Hücre içinde farklı odak uçaklar gibi z-yığınlar her konumda elde edilir. Bunlar doğru her hücre için maksimum kapsül çapı ölçmek için kullanılan en fazla yoğunluk tahminler üretmek için işlenir. (B) Ortak laboratuvar zorlanma, H99S ve iki klinik suşları, B18 ve B52, görüntüleri indüksiyon sonrası kapsül. Not: Tüm görüntüler için 10 µm ölçek çubukları temsil ediyor. (C) maksimum yoğunluk projeksiyonları fluorescently C. neoformans hücreleri etiketli. (D) Grafiği el ile gösterilen bir temsilcisi deney ölçülen tüm üç suşlarının CFW ve 18B7-AF488 ile lekeli kapsül çapı (hata, standart hata (SE) temsil edilir). İstatistiksel anlamlılık aşağıdaki gibi belirtilir: *, p < 0,05; **, p < 0,01; ve ***, p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Sonuçları çini mürekkebi ve floresan boyama arasında karşılaştırılması. (A)analiz üç C. neoformans suşlarının lekeli çini mürekkebi veya floresan boyalar, n = 3 (hata, standart hata (SE) temsil edilir). (B) görüntüleri tek bir C. neoformans hücre lekeli çini mürekkebi ve her iki floresan boyalar (ölçek çubuğu temsil eden 13 µm) ile. Kapsül kenarlarını yatay çizgiler ayıran ve hücre vücut kenarlarını dikey çizgiler ayırma. (C) miktar H99S temsilcisi bir deney çini mürekkebi ve floresan boyalar (hata standart hata (SE) temsil edilir) ile birlikte lekeli. (D, E) Kapsül çapı değişkenlik çini mürekkebi deneyler (D) ve floresan deneyler (E) arasında tasviri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Sayısal analiz C. neoformans Hindistan mürekkep görüntülerden kapsül çapı lekeli hücreleri. (A)görüntü segmentasyonu ve C. neoformans kapsül ölçüm bir otomatik ölçüm tekniği kullanarak şematik gösterimi ( Tablo malzemelerigörmek). (B) karşılaştırma Kılavuzu (Manuel 1-3) ve otomatik yöntemleri (otomatik 1-3) kullanarak 3 ayrı müfettişler tarafından gerçekleştirilen kapsül ölçümlerin. Her araştırmacı C. neoformans görüntülerin özdeş bir önbellek (hata STDSAPMA gösterilir) her iki yöntem tarafından kullanılan. (C) kombine ortalama el ile yapılan ölçümler ve otomatik ölçümler (hata, standart hata (SE) temsil edilir). Her iki (D) ideal örnekleri ve (E) ideal olmayan görüntüleri C. neoformans. Sigara-ideal görüntüleri başarıyla yazılımda ölçülemez. İstatistiksel anlamlılık aşağıdaki gibi belirtilir: *, p < 0,05; **, p < 0,01; ve ***, p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

On yıl için kapsül mycologists ve klinisyenler C. neoformans ve Kriptokokkoz patojen büyük virülans faktörü olarak rolü nedeniyle ilgi için araştırma önemli bir odak noktası olmuştur. Mikroskopi için kullanılması kapsül boyutu suşları arasında farklılıklar ölçmek ve farklı gelişim altında koşullar patojen ve yanıtları (örneğin, farklı çevre koşulları, çeşitli uyaranlara hakkında önemli bilgiler sağlar potansiyel ilaç tedavileri, vb) burada, biz C. neoformanskapsüle büyümesini teşvik için bir yöntem belirttiğimiz ve karşılaştırılan iki farklı kapsül boyama protokolleri. Son olarak, görüntü analiz yazılımı Hindistan hücreleri, lekeli manuel ölçüm yöntemleri için karşılaştırılabilir sonuçlar üreten mürekkep görüntülerden kapsül çap ölçümü otomatikleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterdi.

Bizim denemelerinde iki klinik suşları, B18 ve B52, H99S, bilinen kapsül boyutu18standart laboratuvar suşu ile karşılaştırıldığında. Her iki boyama yöntemleri gösterdi ki klinik gerginliği, B52, en büyük kapsül çapı üç suşlarının test vardı. Ancak, floresan ölçüm sonuçlarından nerede çini mürekkebi ölçümleri değildi küçük kapsül boyutu ile iki suşlar arasında farkı ayırt başardık. Boyama her iki yöntem sonuçları tutarlı, her ikisi de geçerli ama fluorescently görüntülerini kullanarak C. neoformans lekeli suşları küçük kapsül ile ölçüm artan duyarlılık için izin verebilir ima edildi. Maksimum projeksiyonlar z-yığın görüntülerden fluorescently oluşturulan kullanarak lekeli hücreleri araştırmacılar doğru kapsül çapı ölçümleri bile görüntülü hücreler farklı odak içinde uçaklar hale getirilmesini sağlamak sağlar. Bu ölçümler çini mürekkebi ve standart ışık mikroskobu kullanarak yansıma C. neoformans için daha zordur. Verilen herhangi bir görüntüde, bitişik hücreleri doğru bir şekilde çözmek için tüm hücreleri hücre vücut-kapsül sınır zorlaştırır biraz farklı odak uçaklarda oturabilirsin. Bu muhtemelen müfettişler kapsül boyutu veya suşları arasında küçük farklar küçük değişiklikler algılama yeteneğini yıkmak.

Her yöntemin kendine özgü doğal avantajları vardır. Hindistan mürekkep en sık araştırmacılar tarafından uygun fiyat, kullanım kolaylığı ve istikrar (floresan bazı lekeleri gibi zamanla FAT'te) nedeniyle kullanılır. Çini Mürekkebi floresan mikroskoplar kullanıma hazır standart ışık mikroskoplar ile birlikte kullanılabilmesi için bir basit, negatif leke olduğundan. Ancak, doğru oranları (Hindistan mürekkep: arabellek) kullanılmaz, leke otomatik görüntü analizi karmaşık hale getirebilir ne zaman görüntüsü, bir "tüylü" arka plan oluşturabilirsiniz. Kullanmak daha fazla zaman alıcı ve pahalı iken, floresan boyalar onların esneklik için avantajlı olabilir ve biz gösterdiği gibi onların duyarlılık. Bunlar özellikle bağışıklık hücreleri tarafından fagosite ve C. neoformans kapsüle histolojik muayene için gerekli olan C. neoformans ilgili deneylerde kapsül boyutu ve hücre yük ölçümü için yararlıdır doku örnekleri (bir tekniği bu makalede özetlenen değil)32. Calcofluor beyaz veya fluorescently tagged anti-GXM antikorlar, gibi floresan boyalar ile boyama sorunlu ise (örneğin, yetersiz boyama), bu genellikle boyama Protokolü optimize ederek üstesinden gelebilir (artan/azalan konsantrasyon ve/veya KULUÇKA zamanla boya).

Metodoloji boyama ne olursa olsun, bulduğumuz kapsül indüksiyon ve doğru görüntü yakalama Protokolü önemli adımlardır. Bu yazıda belirtilen iletişim kuralı kapsül indüksiyon C. neoformans için birkaç standart yöntemlerden birini ve birçok yıl23için Maya Labs'de tanımladınız. C. neoformans kapsül indüksiyon is CO2-bağımlı ve stresli koşullar23,33altında yalnızca oluşur. Bu nedenle, bir uygun besin eksik büyüme ortamı kullanarak bir % 5 CO2 kuluçka makinesine oluşur önemlidir. Bu kapsül kuluçka (genellikle 18-24 h) standart bir süre sonra indüklenen değil şüphesi varsa, hücreleri için stresli koşullar ortaya çıkmıştır değil bir uninduced denetim kültür karşılaştırılmalıdır. İki karşılaştırarak indüksiyon etkili olup olmadığını belirler. Başarılı bir indüksiyon hücreleri çoğunluğu uninduced denetimine göre daha büyük bir kapsül yapmak biri. Bütün hücreleri neden çünkü ölçülecek hücreleri kullanılabilir hücre türdeş olmayan bir temsil olmalıdır.

Özellikle otomatik ölçüm hedefi ise tutarlı resim alma önemini ardı edilemez. Odak, kontrast, arka plan Floresans gibi dosyaların bit derinliği ve görüntü sıkıştırma tüm önemli konulardır. Her ne kadar bazı filizlenen ve hücreleri dokunmadan kabul edilebilir ve kaçınılmaz olabilir mümkün olduğunda, bir tek odak düzlemi içinde oturmak yok hücrelerinin büyük kümeler, kaçınılmalıdır (Bu kuralı el ile ve otomatik ölçmek için takip edilmelidir). Bu sorun belirli bir ölçüde atlatılabilirdi, confocal, fluorescently Imaging kullanarak hücreleri lekeli. Maksimum yoğunluk tahminler üretmek için z-yığınlarının kullanımını bir tek görüntü29farklı odak uçaklarda hücrelerinin doğru ölçüm etkinleştirebilirsiniz. Buna ek olarak, görüntüleri hızlı bir şekilde örnek hazırladıktan sonra elde edilebilir. Bu Hindistan gibi kurumaya başlarlar, arka plan ve ön plan öğeler (hücreler) arasındaki kontrast düşürebilir ve istenmeyen arka plan özellikleri gelişmiş, hangi yol açar azaltılmıştır örnekleri otomatik lekeli mürekkep için özellikle önemli olabilir Segmentasyon doğruluk.

Kapsül çapı ölçümleri olağan C. neoformans toplumda olmakla birlikte, bu noktaya kadar onlar genellikle el ile önemli ölçüde zaman ve insan gücü gerektiren gerçekleştirilmiş. Ancak, el ile yapılan ölçümler alanında kabul edilir ve sonuçları küçük pahasına elde edilebilir. Görüntü analiz yazılımı gelişmeler bu ölçümler otomatikleştirme doğru ilk adımlar atması mümkün kılmıştır. C. neoformans hücre vücut ve kapsül - basit doğası bir daire bir daire - 2D görüntülerde içinde olarak görünen boyutlarının ölçülmesi roman geliştirmek için gerek kalmadan otomatik görüntü segmentasyonu yazılım paketleri için nispeten basit yapar algoritmalar. Bunun yerine, varolan algoritmaları bağlayarak, C. neoformans hücreleri ve kapsül tespit, parçalara, ölçülen ve. Hücreleri ile en sık kullanılan kapsül boya, çini mürekkebi, lekeli ve bunlar için aynı veri kümesi için el ile ölçümleri karşılaştırıldığında var bu yaklaşımı kullanarak, biz C. neoformans kapsül çapı ölçümleri otomatik. Bu yöntem ve tekrarlanabilirlik yararı çok insan hata kaldırma iken araştırmacı zaman tasarrufu manuel ölçüm ile ilişkili. Ayrıca, ek ölçümler en az çaba ile otomatik analizi iş akışı içine dahil edilebilir. Otomatik görüntü analizi C. neoformans kapsül doğruluk ve verimliliği yüksek düzeyde çok sayıda ölçmek araştırmacılar sağlar umut verici bir yaklaşım olduğunu hissediyorum.

Genel olarak, biz nasıl başarılı bir şekilde C. neoformanskapsül büyümesini teşvik, çini mürekkebi veya floresan boyalar örnekleriyle leke ve el ile ve otomatik ölçümler bir görüntü analizi kullanarak kapsül çapı ölçmek göstermiştir yazılım. Sonuçlarımız boyama her iki yöntem uygulanabilir ve (çini mürekkebi ölçümleri ile daha fazla değişkenlik olsa) genellikle tutarlı sonuçlar üretmek öneririz. Ayrıca, el ile ve otomatik ölçüm yöntemleri kapsül boyutları değişen ayırt yeteneği var.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar, Hoyin Lai, otomatik görüntü analiz yazılımı, Aivia yayımladığı DRVision, ürün yöneticisidir.

Acknowledgments

Biz moleküler Biosciences (MOBI) doktora programı ve Biyoloji bölümü Middle Tennessee Devlet Üniversitesi (MTSU) adlı bu çalışma için finansman sağlamak için teşekkür ederiz. Proje aynı zamanda kısmen D.E.N. için MTSU Vakfı tarafından verilen bir özel projeler hibe tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Tags

İmmünoloji sayı 132 Cryptococcus Neoformans kapsül virülans örüntü tanıma görüntü analizi otomatik analizi Maya
Size Matters: <em>Cryptococcus neoformans</em> kapsül çap ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guess, T., Lai, H., Smith, S. E.,… More

Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter