Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات في المختبر وتصميمها من 32فبوستلابيلينج

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57177
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry, Charles University

Summary

تقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية، والمخدرات، وأن يكون انزيماتيكالي بيواكتيفاتيد إلى وسيطة توليد التساهمية الحمض النووي adducts، ميدان هام في تطوير السرطان ومعالجته. ويرد وصف أساليب للتنشيط المجمع لشكل الحمض النووي adducts، فضلا عن تقنيات للكشف والتحديد الكمي.

Abstract

التساهمية الحمض النووي adducts يتكون من المواد الكيميائية أو العقاقير بفاعلية مسرطنة يحاكمون كواحد من أهم العوامل في مرحلة بدء العمليات المسببة للسرطان. يتم الآن تقييم هذا الربط التساهمي، الذي ينظر في قضية توموريجينيسيس، كعقيدة مركزية التسرطن الكيميائية. هنا، يتم وصف الأساليب استخدام ردود الفعل التي تحفزها السيتوكروم P450، والأنزيمات أحيائي إضافية للتحقيق في فاعلية المواد الكيميائية أو العقاقير لمن التفعيل لنواتج الأيض تشكيل هذه الحمض النووي adducts. وترد الإجراءات تصف عزلة كسور الخلوية تملك الإنزيمات أحيائي (عينات ميكروسومال وسيتوسوليك مع cytochromes P450 أو غيرها أحيائي الإنزيمات، أي، بيروكسيداسيس، نادف: السيتوكروم P450 أوكسيدوريدوكتاز، أوكسيدوريدوكتاز H:quinone NAD (P)، أو زانتيني أوكسيديز). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الأساليب التي يمكن استخدامها لتنشيط التمثيل الغذائي لتحليل المواد الكيميائية هذه الإنزيمات، فضلا عن تلك المتعلقة بعزل الحمض النووي. علاوة على ذلك، الأساليب المناسبة قادرة على اكتشاف وتحديد كمية الحمض النووي الكيميائية/المخدرات-مشتقة adducts، أيتعديلات مختلفة لتقنية بوستلابيلينج ف 32، وتوظيف المشعة المسماة بتحليل المواد الكيميائية، وهي تبين بالتفصيل.

Introduction

يحدث استقلاب xenobiotics (المواد الكيميائية البيئية أو المخدرات) في هاتين المرحلتين1. المرحلتين الأولى والثانية تهدف إلى تقديم المركبات (لا للذوبان في الماء) مسعور أصلاً أكثر ماء (للذوبان في الماء)، مما يجعلها سهولة اكسكريتابل عن طريق البول أو البراز أو العرق. المرحلة الأولى تشمل (الروغان) ردود فعل الأكسدة، الحد، وهيدروكسيليشن التي تحفزها الإنزيمات مثل الفسفرة P450s (P450s، سيبس)، بيروكسيداسيس (أي.، السيكلواوكسيجيناز، كوكس)، keto الدو ريدوكتاسيس (أكرس)، وميكروسومال مونوكسيجيناسيس المحتوية على فلافين (فموس). تشمل المرحلة الأولى أيضا الحد من ردود الفعل، بوساطة مجموعة متنوعة من ريدوكتاسيس أي ميكروسومال نادف: السيتوكروم P450 ريدكتيز (البرتغال) وند (ف) سيتوسوليك H:quinone أوكسيدوريدوكتاز (NQO1)، زانتيني أوكسيديز (XO) والدهيد أوكسيديز (AO)1 . وفي المرحلة الثانية (التصريف)، المجموعات الوظيفية التي تم إرفاقها في المرحلة هي كنت متزاوجة الجزيئات القطبية الصغيرة لزيادة الأقطاب. أمثلة للإنزيمات التي تعتبر المشاركة في رد فعل للمرحلة الثانية تشمل سولفوترانسفيراسيس (سولتس)، ن، س-أسيتيلترانسفيراسيس (Nat)، ميثيلترانسفيراسيس مثل الكاتيتشول-س-ميثيلترانسفيراسي (ضميرياً)، الجلوتاثيون S- ترانسفيراسيس (جستس)، واردين ديفوسفاتي جلوكورونوسيلترانسفيراسيس (أوجتس)1. تصنيف الإنزيمات في المرحلة الأولى أو الثانية، مع ذلك، ليست جامدة، ويمكن القول أن يمكن تجميعها بعض الإنزيمات في أي من الفئتين.

هي إنزيمات P450 (المفوضية الأوروبية 1.14.14.1) الهيم المحتوية على البروتينات الموجودة في الكائنات الحية المختلفة، التي تشارك في التحول الأحيائي للعديد من المواد الكيميائية، وتحفيز على تحويل3،4. تحفيز إنزيمات P450 هيدروكسيلاتيون ركائز عديدة، مع رد فعل حيث يتم إدخال ذرة واحدة من ديوكسيجين في جزيء xenobiotics، بينما يتم تقليل الذرة الثانية من الأكسجين لتكوين الماء برد الفعل الذي يتطلب اثنين من الإلكترونات [المعادلة (1 3،) [4:

RH + O2 + نادف + روه ← ح+ + ح2س + NADP+ (1)

إنزيمات P450 المترجمة في غشاء هيولى خلايا الثدييات (نظم P450 microsomal) هم أعضاء في النظام مونوكسيجيناسي multienzyme، الذي يتضمن كذلك ريدكتيز نادف: السيتوكروم P450 (البرتغال) والسيتوكروم ب5 ، وصفته الركيزة إنزيم NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز. نظرية مقبولة عموما يفترض أن الجهة المانحة للإلكترونات هما الحاجة P450 هو نظام نادف/البرتغال. على الرغم من ذلك، الفسفرة ب5 قد تعمل أيضا كجهة مانحة للإلكترونات ل P450، هي كمانح الإلكترون الحد P450 خلال الحد الثاني من دورة رد فعل، حيث يعمل جنبا إلى جنب مع NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز2،،من34.

استغلال الثدييات إنزيمات P450 مختلف (مثلاً إنزيمات الأسر 5، 8، 11، 17، 19، 21، 24، 26 و 27) تخليق المركبات الذاتية قيمة، مثل المنشطات، واستخدامها لتقويض للمنتجات الطبيعية2،3 . أخرى CYP الثدييات الإنزيمات، مثل CYP1A2 البشرية, 9 2, 19 2، 6 2، و 3A4، استقلاب الخارجية من المواد الكيميائية المستخدمة كالمخدرات. 5 , 6 الإنزيمات أهم تحفيز عملية التمثيل الغذائي للأدوية هي سيبس الفصيلية 3A، لا سيما CYP3A4. تحويلات xenobiotics، مثل المواد المسرطنة للمحترفين والمحترفين-سميات، وساطة من CYP1A1 البشرية و 1A2، 1B1، 2A6، 2E1 و 3A42،5. معظم هذه سيبس موجودة في الكبد (باستثناء CYP1A1 و 1B1). ومع ذلك، سيبس أيضا يعبر عن عدة أجهزة اكستراهيباتيك. هذه P450s قد تكون ذات أهمية كبيرة، يغلب فيه المشاركة أنهم في الأيض بيواكتيفيشن من المواد الكيميائية (الأدوية) لرد الفعل وسيطة في هذه الأجهزة7. يتم P450s المختلفة الناجمة عن العديد من المركبات التي هي ركائز بهم، على الرغم من أن هذا ليس هو الحال بالضرورة.

إنزيمات P450 كثيرة تلعب دوراً في السمية الكيميائية (المخدرات). يمكن تحويل xenobiotics ليس فقط على إزالة السموم من الأيض، ولكنها أيضا تفعيلها للأنواع المتفاعلة التي تعديل الجزيئات الذاتية بالإضافة إلى ذلك يحمل الخصائص البيولوجية المختلفة، وعادة ما تسبب سميتها. الحمض النووي والدهون والبروتينات قد يكون هدفا للتعديل عليها برد الفعل اليكتروفيليس والجذور الناتجة عن المواد الكيميائية تم تنشيطه. في حالة الحمض النووي، وحل العديد من الردود الجينات الهامة وآلياتها الفعل معروفة2،3،،من45.

التغييرات في الحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في مكافحة نمو الخلايا، ويعتبر هذه الظاهرة هو العامل المهيمن مما أدى إلى تطور العمليات المسببة للسرطان. توليد التساهمية الحمض النووي adducts مع المواد الكيميائية لها فاعلية مسببة للسرطان هو الحكم كواحدة من أهم الخطوات في مرحلة بدء مسرطنة العمليات8،9،،من1011. قد أثبتت أن العلاقات بين تشكيل الحمض النووي adducts وتحدث توموريجينيسيس، بينما انخفاضا في كمية الحمض النووي adducts مسؤولة عن9،تشيموبريفينشن،من810، 11 , 12 , 13 , 14-تشكيل مادة مسرطنة/المخدرات-مشتقة الحمض النووي adducts يعتمد على الأسس الفردية للحمض النووي، وتتأثر في تسلسل هذه القواعد في الحمض النووي. عمليات إصلاح الحمض النووي adducts تعتمد على الموقع (على يدون أو نسخها من غير حبلا الحمض النووي) وأنواع من النوكليوتيدات تعديل تسلسل8،11،،من1215، 16.

في هذه المقالة، نحن تصف الإجراءات من خلال استخدام التحويل حفز إنزيم من المواد الكيميائية (الأدوية) للتحقيق في قوتها لتفعيلها في نواتج الأيض التي تعديل الحمض النووي (توليد الحمض النووي adducts). التساهمية الحمض النووي ملزم، ينبغي أن يكون المجمع الاختبار عادة المنشط أما عن طريق تفاعلات الأكسدة أو التخفيض، اعتماداً على العقاقير فردية. تنشيط الأكسدة أو التخفيض من اختبار المواد الكيميائية هو توسط P450-تعتمد على نظام الانزيمية موجودة في جزء سوبسيلولار ميكروسومال أو بتخفيض مع ريدوكتاسيس الحالية سواء في microsomes (البرتغال، NADH: السيتوكروم ب5 ريدكتيز، إنزيمات P450) وفي الكسور سوبسيلولار سيتوسوليك الخلوية (NQO1، XO، AO، البيروكسيديز). والايضات رد الفعل بعد ذلك ربط الحمض النووي تشكل الحمض النووي adducts. نظراً للتفاعلات الأكسدة والتخفيض على حد سواء مهم لتنشيط العديد من العقاقير لهذه الأنواع المتفاعلة، يتم وصف الإجراءات التجريبية تستخدم النظام الأنزيمي/الحد من أكسدة. وعلاوة على ذلك، أساليب مناسبة قادرة على اكتشاف وقياس هذه الحمض النووي adducts موصوفة بالتفصيل.

اثنين إجراءات مستقلة لتحديد ما إذا كانت المادة الكيميائية اختبار، تفعيلها من خلال النظم الانزيمية، منضماً إلى الحمض النووي ينصح: 32بوستلابيلينج ف التقنية واستخدام مجمع المشعة المسمى (مثلاً.، 3ح أو 14 ج). للمرة الأولى ينصح الطيار، فحص الإنزيم بوستلابيلينج ف 32. تحديد محتوى الحمض النووي في الحلول، وتقييم الذات، يجب أن يسبق كلا الأسلوبين.

32بوستلابيلينج ف تقنية تستخدم التحلل المائي الأنزيمي للحمض النووي تعديل بواسطة المواد الكيميائية غير مشعة (مسرطن مدمني المخدرات) إلى 3´-فوسفوديوكسينوكليوسيديس، الفسفرة إضافية مع الفوسفور المشعة (32ف) في 5´- يا الموقف، وفصل المواد الكيميائية-ديوكسينوكليوتيدي أدوكتس من deoxynucleotides العادية (غير معدلة) اللوني17 (الشكل 1). هو تحلل الحمض النووي تعديل بواسطة مركب كيميائي من خلال مزيج من اندونوكليسي ونوكلاس ميكروكوككال [ااكسونوكلس]، المعروف باسم فوسفوديستريس الطحال. الخليط من تحلل الحمض النووي التي تحتوي على كلا عادي (غير معدلة) وتعديل ديوكسيريبونوكليوسيدي 3´-مونوفوسفاتيس هو رد فعل مع ATP [γ-32ف] حضور الناقل كيناز ATP و T4-بولينوكليوتيدي (غير مشعة) في pH 9.5 إلى نموذج 5´- 32ف المسمى 3´، 5´-بيسفوسفاتيس (الإجراء "ستاندارد" في الشكل 1). درجة الحموضة القلوية المستخدمة قادرة على التقليل من نشاط إنزيم كيناز T4-بولينوكليوتيدي ديفوسفوريلاتي ديوكسيريبونوكليوسيدي 3´-مونوفوسفاتيس في 3´ الموقف. الفصل والقرار من 32ف المسمى أدوكتس من deoxynucleotides المسماة التي لم يتم تعديلها بواسطة المواد الكيميائية يقوم بتبادل شاردة متعدد الاتجاهات طبقة رقيقة اللوني (TLC) على السليلوز بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) (رقم 2 ). في الخطوات الأولى والثانية شطف (في اتجاه D1 و D2)، التيد من البداية لصفيحة TLC-بي-السليلوز باستخدام حلول المياه من الكهرباء على قطعة قصيرة من المسمى deoxynucleotides (معدلة) العادي وكذلك الفوسفات [32ف] ورقة الكروماتوغرافي المطبقة على رأس لوحة TLC، بينما يتم الاحتفاظ deoxynucleotides المحتوية على المواد الكيميائية المقيدة نستعرض خصائص عمود المصباح (مادة مسرطنة/المخدرات-أدوكتس) في بداية لوحة بي-السليلوز يتعين حلها بالإضافة إلى ذلك مع عدة أنظمة مختلفة المذيبات في اتجاهات D3 و D4 (الشكل 2). تعريب أدوكتس تتم باستخدام الشاشة المحسن autoradiography؛ أدوكتس ال يفصل يتم الكشف عنها كبقع داكنة يمكن التعرف على أفلام الأشعة السينية. مجالات البقع اقتطعت من اللوحة وتستخدم لقياس النشاط الإشعاعي التﻷلؤ السائل أو سيرينكوف العد. تخزين فوسفور التصوير الأسلوب الذي قد تم تكييفه التعيين والتحديد الكمي للحمض النووي adducts في تشروماتوجرامس الكشف عن بال 32الإنزيم بوستلابيلينج ف الآن يستخدم أيضا. 18 آلة "تصوير فورية" كثيرا ما يستخدم لمثل هذا الكشف والتحديد الكمي للحمض النووي adducts. يوفر هذا الأسلوب أكثر من 10-إضعاف حساسية للكشف عن 32ف من تقنية الشاشة المحسن autoradiography19.

كميات من الحمض النووي adducts تتحدد حسب القيم النسبية adduct وسم (راؤول)، محسوبة باستخدام المعادلة (2) على النحو التالي:

الاجتماع التحضيري للمؤتمر. في adduct deoxynucleotides
راؤول =---(2)
نشاط معين من 32ف-ATP (cpm./بمول) x pmol deoxynucleotides

قيم رالس هي نسبة معدلات العد من deoxynucleotides أدوكتيد على معدلات العد الإجمالي [deoxynucleotides أدوكتيد وعادي (غير معدلة)]20،deoxynucleotides21. ومع ذلك، يستند هذا الحساب على تكافؤ وسم كفاءات adducts و deoxynucleotides العادية22. الإجراء الكلاسيكي ("قياسي") 32تقنية بوستلابيلينج ف مناسبة لمختلف الحمض النووي adducts (ضخمة و/أو غير ضخمة adducts)، بيد أن حساسية ليست مرضية للكشف عن أدوكتس وجدت بكميات قليلة في الحمض النووي. باستخدام هذا الإجراء، مقدار adduct في 107 غير معدلة deoxynucleotides في الحمض النووي (0.3 فمول أدوكت/ميكروغرام الحمض النووي) قابلة للاكتشاف.

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من التعديلات لهذه الكلاسيكية 32الداخلي بوستلابيلينج ف رفع حساسية هذه التقنية. ما يصل إلى 10 إلى 100 ضعف حساسية أعلى لتحديد أدوكتس من 32ف العلامات قد تحقق باستخدام مستويات الحد من [γ-32ف] ATP (تكثيف الإجراءات). 23 , 24 إجراء مزيد توفير زيادة في حساسية الأسلوب بوستلابيلينج ف 32يستخدم حضانة الهضم المحتوية على الحمض النووي adducts مع نوكلاس P1 (من سيترينوم Penicillium)21 (الشكل 1). يفضل هذا الإنزيم ديفوسفوريلاتي ديوكسيريبونوكليوسيدي غير معدلة 3´-مونوفوسفاتيس، بينما deoxynucleotides مع المواد الكيميائية المقيدة (النيوكليوتيدات أدوكتيد) هي أساسا لا ركائز لهذا الإنزيم. ولذلك، لا هي فوسفوريلاتيد ديوكسيريبونوكليوسيدي ديفوسفوريلاتيد 3´-مونوفوسفاتيس (أي، ديوكسيريبونيوكليوسيدز) من T4-بولينوكليوتيدي كيناز بالفوسفات [32ف] من γ-32ف] ATP. ومع ذلك، بعض النيوكليوتيدات التي تكون فيها المواد الكيميائية ملزمة (أدوكتيد deoxynucleotides)، مثل أدوكتس arylamine استبداله في C8 ديوكسيجوانوسيني، يمكن أن بيديفوسفوريلاتيد بهذا الإنزيم. على النقيض من ذلك، معظم الأخرى أدوكتس (مثلاً، أدوكتس استبداله في ن2 من ديوكسيجوانوسيني) لم يتم ديفوسفوريلاتيد نوكلاس P1. هذا التعديل من 32ف بوستلابيلينج يجعل هذا الأسلوب إلى حد كبير أكثر حساسية، زيادة حساسيتها بأكثر من ثلاثة أوامر من حجم. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا الإصدار من 32بوستلابيلينج ف أسلوب حيث أعلى كميات من الحمض النووي (5-10 مكغ) ووجود فائض من خالية من الناقل ATP [γ- 32ف] يمكن أن تستخدم.

أسلوب آخر لإثراء أدوكتس، وصف غوبتا25، يستخدم في الفيزيائية adducts خصائص ديوكسينوكليوتيدي الضخمة، التي يمكن استخراجها في ن-وبيوتانول حضور تيترابوتيلامونيوم وكيل نقل مرحلة كلوريد (TBA) (الشكل 1) قبل [32ف] وسم الفوسفات، بينما يتم استخراج deoxynucleotides غير معدلة ضعيف بهذه المذيبات العضوية. بيد أن أدوكتس أقل مسعور، المكونة لتعديل المثال ل deoxynucleotides مع غير العطرية مويتيس ضخمة أو صغيرة مشبعة المخلفات، لا فعالية استخراج مع ن-butanol. ومن ثم، فأساسا لا يمكن الكشف عنها عندما يتم تحليلها بواسطة هذا التعديل من ال 32الأسلوب بوستلابيلينج ف.

كلا الإصدارات المذكورة سابقا من 32بوستلابيلينج ف زيادة الحساسية والتحديد الكمي للحمض النووي adducts هائلة (ما يصل إلى ثلاثة أوامر من حجم)، تكون قادرة على الكشف عن أحد adduct كل 109،10 عادي النيوكليوتيدات (0.3-3 أمول/ميكروغرام الحمض النووي). ينصح بهاتين الطريقتين لاختبار المواد الكيميائية لكفاءتها لربط تساهمي للحمض النووي، وذلك، ويرد في هذا العمل في التفاصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للنظام الأساسي للرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية (311/1997، وزارة الزراعة، الجمهورية التشيكية)، التي وفقا "إعلان هلسنكي".

1-عزل كسور ميكروسومال وسيتوسوليك كبدي

  1. إعداد الكسور سوبسيلولار الكبد (ميكروسوميس الغنية بالأنزيمات P450 أو سيتوسولس غنية في ريدوكتاسيس أو بيروكسيداسيس للذوبان) من الفئران بالطرد المركزي التفاضلية البسيطة (105,000 س ز).
    ملاحظة: بيليه والمادة طافية تؤخذ على أنها ميكروسوميس وسيتوسولس، على التوالي.
    1. أغسل عينات الكبد (1-10 غ) مرتين مع 50 ملم تريس-HCl المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.4 يحتوي على 150 مم بوكل المخزن المؤقت (المخزن المؤقت 1) (وحدات التخزين أعلى 10 مرات من وزن النسيج، أي 10-100 مل) وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (من حول حجم 2 × 2 مم).
    2. مجانسة الأنسجة حضور هذا المخزن المؤقت (> الحجم والوزن 3 مل/g) في الخالطون عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتجاهل تصفية القطع المتبقية غير تجانس النسيج باستخدام الترشيح ورقة. الطرد المركزي في هوموجيناتي في 600 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل المادة طافية إلى آخر أنبوب الطرد المركزي.
    3. إعادة تجانسه بيليه في المخزن المؤقت 1 (1 مل كل 1 غرام أنسجة)، كرر الخطوة 1.1.3.، وتجاهل بيليه. الطرد المركزي supernatants المجمعة في س 15,000 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية إلى آخر أنبوب الطرد المركزي.
    4. الطرد المركزي المادة طافية في 105,000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية (cytosol) وتخزينها في مختبرين (1-10 مل) في-80 درجة مئوية. تميز سيتوسول مقدار البروتين باستخدام الطريقة الموضحة من برادفورد26.
    5. إعادة تعليق بيليه في 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7.4 (> الحجم والوزن 2 مل/g)، أجهزة الطرد المركزي في 105,000 س ز لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. إعادة تجانسه بيليه (ميكروسوميس) في المخزن المؤقت 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4 يحتوي على 150 مم والغليسيرول بوكل و 20 في المائة (< الحجم والوزن 5 مل/g) في الخالطون في 4 درجات مئوية. تخزين microsomes في 0.5-1 مل مختبرين في-80 درجة مئوية. وصف ميكروسوميس لمحتوى البروتينات باستخدام الطريقة الموضحة من برادفورد26.
    6. تحديد تركيز السيتوكروم P450 في ميكروسوميس.
      ملاحظة: يتم قياس تركيز إنزيمات P450 في microsomes كما وصفها اومورا وساتو27، تحديد امتصاص مجمع P450 مخفضة مع أول أكسيد الكربون (CO). أول أكسيد الكربون هو مركب سامة، وأن يكون التعامل معها بعناية، وفي غطاء محرك السيارة.

2-إينكوبيشنز لاختبار المواد الكيميائية (المواد المسرطنة/المخدرات) مع الحمض النووي حضور النظم الانزيمية

  1. الحضانة لاختبار الكيماويات (المواد المسرطنة/المخدرات) مع الحمض النووي حضور النظم الانزيمية الأكسدة المحتوية على cytochromes P450
    1. إعداد حضانة المزائج المحتوية على، في وحدة تخزين نهائي 0.75 مل عند 4 درجة مئوية، والمركبات التالية والنظم الانزيمية.
      1. مزيج العازلة فوسفات 100 ملم، ودرجة الحموضة 7.4، (0.375 مل) مع نظام توليد نادف (ملم 10 MgCl2، 10 ملم د-الجلوكوز 6-فوسفات، 10 مم NADP+، 1 يو/مليلتر د-الجلوكوز 6-فوسفات نازعة) أو 10 مم نادف (75 ميليلتر).
      2. إضافة إلى هذا الخليط ميكروسوميس أو P450 المؤتلف النقي في سوبيرسوميس، وهي معزولة عن خلايا الحشرات microsomes transfected مع بنية باكولوفيروس يحتوي على كدنا إنزيمات P450 المؤتلف، وانزيمات P450 pmol 50 في 50 ميليلتر ميكروسومال أو سوبيرسومال الأعمال التحضيرية-الكسور ميكروسومال كبدي معزولة في المختبر أو من مصدر تجاري.
      3. إضافة 1 ملغ العجل الغدة الصعترية الحمض النووي (0.3 مل من الأسهم الحل-3.3 ملغ/مل بالماء المقطر)، ويهز على شاكر دوامة 5 ق.
      4. وأخيراً، إضافة 7.5 ميليلتر مم 0.1 اختبار المخدرات الليبتيسيني حله في [دمس] وميليلتر 42.5 المقطر المياه للوصول إلى وحدة تخزين من خليط حضانة 0.75 مل. استخدام المواد الكيميائية المسماة مع 3ح أو 14ج أو المواد الكيميائية غير موسومة، اعتماداً على الإجراء الخاص بالكشف عن الحمض النووي adducts.
      5. يهز على شاكر دوامة إينكوباتي س. 5 في فتح أنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
      6. كما تعد اثنين التحكم إينكوبيشنز وعلى نحو مماثل، لكن (ط) دون نظام تفعيل (عينات microsomal) أو (ثانيا) معها، ولكن دون اختبار مجمع.
  2. إينكوباتيونس اختبار الكيماويات (المواد المسرطنة/المخدرات) مع الحمض النووي حضور النظم الانزيمية التخفيض
    1. إعداد حضانة المزائج المحتوية على، في وحدة تخزين نهائي 0.75 مل عند 4 درجة مئوية، والمركبات التالية والنظم الانزيمية.
      1. في 4 درجات مئوية، مزيج 100 ملم تريس-HCl العازلة، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.2% 20 توين، (0.375 مل)، حل 10 ملم من مساعد الإنزيم NQO1 التخفيض (NADPH) (75 ميليلتر)، كسر سيتوسوليك (الكسور سيتوسوليك كبدي-معزولة في المختبر أو في حالة استخدام في سيتوسوليك الكسور المعزولة من فرادى المانحين البشرية التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري يحتوي على بروتين 1 ملغ (50 ميليلتر)).
      2. إضافة 1 ملغ العجل الغدة الصعترية الحمض النووي (0.2 مل من الأسهم الحل-3.3 ملغ/مل ماء المقطر)، ويهز على شاكر 5 ق.
      3. وأخيراً، إضافة 7.5 مم 0.1 ميليلتر اختبار الكيميائية (المذابة في الماء المقطر، أو الميثانول أو الإيثانول أو [دمس]، اعتماداً على الذوبان في المجمع) والمياه ميليلتر 42.5 المقطر للوصول إلى وحدة تخزين 0.75 مل الخليط حضانة. استخدام المواد الكيميائية المسماة مع 3ح أو 14ج أو المواد الكيميائية غير موسومة، اعتماداً على الإجراء الخاص بالكشف عن الحمض النووي adducts (انظر أدناه).
      4. إزالة الخليط تفاعل مع الأرجون ل 1 كحد أدنى اهتزاز على شاكر إينكوباتي س. 5 في أنابيب مغلقة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
      5. كما تعد اثنين التحكم إينكوبيشنز وعلى نحو مماثل، لكن (ط) دون نظام تفعيل (الكسور سيتوسوليك) أو (ثانيا) معها، ولكن دون اختبار المواد الكيميائية.
  3. استخراج المخاليط الحضانة مع المذيبات العضوية لإزالة الفائض في اختبار المواد الكيميائية
    1. مزيج الخليط حضانة في أنبوب اختبار مع غطاء بنفس الحجم من خلات الإيثيل (أو إثيل الاثير أو الهكسين) عن طريق إضافة هذه المذيبات. هز محتويات الأنبوبة على شاكر حتى أشكال مستحلب.
    2. زيادة ونقصان (3 دقيقة) في س 1,600 ز في أجهزة الطرد مركزي في درجة حرارة الغرفة. إذا كانت مراحل العضوية والمائية ليست مفصولة بشكل صحيح، تدور مرة أخرى لفترة أطول فترة أو في أعلى سرعة الطرد المركزي.
    3. قم بإزالة في المرحلة العليا، والعضوية جمع مع ماصة. إذا كانت كميات صغيرة (< 400 ميليلتر) هي المستخدمة، الاستفادة ماصة تلقائي مزودة بمعلومات مناسبة. ويلقي جانبا هذه المرحلة العضوية.
    4. كرر الخطوات 2.3.1., 2.3.2., و 2.3.3. إزالة المذيبات العضوية المتبقية بتيار غاز النيتروجين (على الأقل 5-10 دقيقة لإزالة مطلوبة).
  4. عزل الحمض النووي من إينكوبيشنز
    1. استخراج الحمض النووي من الحلول مع الفينول/كلوروفورم وعن هطول الأمطار مع الإيثانول
      1. القضاء على البروتينات لعزل الحمض النووي من الخلائط الحضانة عن طريق استخراج البروتينات من الحلول للحمض النووي مع الفينول، الفينول/كلوروفورم (1:1)، وكلوروفورم حسب الإجراء الموضح أدناه.
      2. الجمع بين خليط الحضانة مع نفس المقدار من الفينول أو الفينول/كلوروفورم (1:1) في صقر أو أنابيب ايبندورف بحد أقصى. يحرك الخليط حتى أشكال مستحلب.
      3. زيادة ونقصان (3 دقيقة) في س 1,600 ز في أجهزة الطرد مركزي في درجة حرارة الغرفة. إذا كان لا يفصل بين مرحلتي العضوية والمائية بشكل صحيح، تدور مرة أخرى لفترة أطول، أو في أعلى سرعة الطرد المركزي.
      4. نقل المرحلة المائية العليا مع ماصة لأنبوب البولي بروبلين جديد. إذا كانت كميات صغيرة (< 400 ميليلتر) هي المستخدمة، استخدام بيبيت تلقائي مزودة بمعلومات مناسبة. إزالة الواجهة البروتين جنبا إلى جنب مع المرحلة العضوية.
      5. الجمع بين المرحلة المائية العليا مع نفس الكمية من مزيج من الفينول كلوروفورم (1:1). إعادة إنتاج الخطوات 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. الجمع بين المرحلة المائية العليا بنفس المقدار من كلوروفورم وكرر الخطوات 2.4.1.2. -2.4.1.4. استرداد الحمض النووي بهطول الأمطار مع وحدات التخزين 2 الإيثانول الباردة (-20 درجة مئوية). تحديد حجم الحل الحمض النووي.
      7. التكيف مع تركيز الكاتيونات الفموي الأحادي التكافؤ بإضافة كلوريد الصوديوم 5 م إلى النهائي تركيزات من 0.1 م. إثارة بشدة. دمج وحدات التخزين 2 الإيثانول الباردة (-20 درجة مئوية) وتخلط بشكل صحيح. كول إلى-20درجة مئوية.
      8. تخزين في-20 درجة مئوية حتى هو عجلت الحمض النووي. عندما تم تجزئة الحمض النووي خلال إينكوبيشنز (مثلاً.، بتشكيل الجذور الأكسجين أثناء عملية التفاعل الأنزيمي التنشيط) أو أثناء إجراء العزل بحجم الحمض النووي صغير (< 1 كيلو بايت) أو عندما يكون الحمض النووي موجودة بكميات صغيرة (< 0.1 مغ/ مل)، وقت التبريد قد يكون زيادة وانخفضت درجة الحرارة إلى-70 درجة مئوية.
      9. زيادة ونقصان (10 دقيقة) في س 1,600 ز في 0 درجة مئوية في أجهزة الطرد مركزي. في حالة وجود تركيزات منخفضة، أو في شكل شظايا صغيرة الحمض النووي، تدور مرة أخرى لفترة أطول (30 دقيقة). تجاهل المادة طافية.
      10. لإزالة أي الذوائب (أو آثار متبقية للاختبار الكيميائية) التي قد تكون موجودة في وادي الحمض النووي، والحمض النووي يغسل مع الإيثانول 70% والأثير ثنائي إثيل. أغسل عجلت الحمض النووي مع الباردة (-20 درجة مئوية) الإيثانول 70%. زيادة ونقصان (10 دقيقة) في س 1,600 ز في 0 درجة مئوية في أجهزة الطرد مركزي. تجاهل المادة طافية.
      11. كرر الخطوة 2.4.1.10. أغسل عجلت الحمض النووي مع الباردة (-20 درجة مئوية) الإيثانول 70%. زيادة ونقصان (10 دقيقة) في س 1,600 ز في 0 درجة مئوية في أجهزة الطرد مركزي. تجاهل المادة طافية.
      12. كرر الخطوة 2.4.1.10. وضع الأنبوب في حالة عمودية على ورقة ماصة لإزالة المادة طافية المتبقية. أغسل بيليه الحمض النووي عن طريق إضافة 1 مل أثير ثنائي إثيل للتخلص من المخلفات المحتملة للاختبار الكيميائية من عزل الحمض النووي. زيادة ونقصان (10 دقيقة) في س 1,600 ز في 0 درجة مئوية في أجهزة الطرد مركزي. تجاهل المادة طافية.
      13. حل بيليه الحمض النووي في حجم مناسب (عادة في 100-400 ميليلتر لتحقيق تركيز الحمض النووي من 0.5-1 ميكروغرام/ميليلتر) من الماء المقطر (أو في 0.15 مم 1.5 مم وسترات الصوديوم كلوريد الصوديوم). الحل الحمض النووي يمكن أن تقف عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو يمكن أن تكون ساخنة إلى 37 درجة مئوية لمدة 10-30 دقيقة لزيادة تذويب الحمض النووي.
      14. قبل التخزين، فصل الحمض النووي إلى مختبرين الصغيرة (10-20 ميليلتر)، نظراً لتكرار تجميد والغاء الحلول الحمض النووي قد adduct نتيجة انخفاض في تركيزات. مخزن في-80 درجة مئوية أو برودة.
        ملاحظة: تحديد سبيكتروفوتوميتريك من الحمض النووي: طريقة بسيطة ودقيقة، الذي يستخدم على نطاق واسع لقياس كمية الحمض النووي في إعداد إذا كانت العينة النقية (أيدون كميات كبيرة من الملوثات مثل البروتين، الفينول، أو غيرها الأحماض النووية،) سبيكتروفوتوميتريك قياس كمية الإشعاع "الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية" ويمتص بالقواعد (انظر الإجراءات المذكورة سابقا)28.
  5. إجراءات للكشف عن الحمض النووي adduct تكوين
    1. 32 بوستلابيلينج ف بالانزيم
      ملاحظة: يستخدم الحمض النووي التحلل المائي هيدروليساتي في هذه المرحلة على استعداد للتحليل أدوكتس (2.5.1). وكذلك من deoxynucleotides (معدلة) العادي (2.5.7.).
      1. حل نوكلاس ميكروكوككال (مينيسوتا) في الماء بتركيز ~ 450 وحدة (U)/مل. دياليزي ضد الماء المقطر وضبط إلى 300 يو/مليلتر. دياليزي الطحال فوسفوديستريس (الحزب الاشتراكي الديمقراطي) الحل وضبط إلى 4 يو/مليلتر.
      2. مزيج MN، والحزب الديمقراطي الاشتراكي على تركيزات النهائي 150 مو/ميليلتر مينيسوتا و 2.5 مو/ميليلتر (MN/الحزب الديمقراطي الاشتراكي الحل) والحزب الديمقراطي الاشتراكي. محلول الحمض النووي يحتوي على 12.5 ميكروغرام، وتتبخر بجفاف في مبخر. تذوب في الماء المقطر ميليلتر 6.5.
      3. إضافة حل MN/الحزب الديمقراطي الاشتراكي ميليلتر 5.0 (التركيز النهائي من مينيسوتا 60 مو/ميليلتر، يكون التركيز النهائي للحزب الديمقراطي الاشتراكي 1 مو/ميليلتر)، والعازلة الهضم ميليلتر 1.0 (تركيز الصوديوم succinate النهائي 20 ملم، التركيز النهائي كاكل2 8 ملم). حجم الخليط النهائي هو 12.5 ميليلتر. ميكس والسماح لردود الفعل على ح 3 في 37 درجة مئوية.
      4. إزالة 2.5 ميليلتر (نقل إلى أنبوب آخر) لمزيد من التخفيف وتحليل deoxynucleotides غير معدلة (2.5.7.)
    2. نوكلاس P1 التخصيب الداخلي
      1. ميليلتر 10.0 المتبقية من هيدروليساتي، أضف 0.65 ميليلتر صوديوم اسيتات المخزن المؤقت (التركيز النهائي، 40 ملم)، والحل2 زنكل ميليلتر 0.65 (التركيز النهائي 0.1 ملم)، 1.25 الحل NP1 ميليلتر (التركيز النهائي، 0.385 ميكروغرام/ميليلتر)، و 0.45 ميليلتر ماء مقطر. حجم الخليط النهائي هو 13 ميليلتر.
      2. السماح الخليط أن تستجيب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وفي نهاية رد فعل مع إضافة 3 ميليلتر الحل تريس.
    3. ن-Butanol التخصيب الداخلي
      1. ميليلتر 10.0 المتبقية من الحمض النووي هيدروليساتي، أضف ميليلتر 215 من الحل فورمات الأمونيوم 11.6 ملم والأس الهيدروجيني 3.5 ملم 10 ميليلتر 25 يضاف كلوريد الحل. استخراج مع 250 ميليلتر n-butanol (المشبعة بالمياه) بخلط نشطة. زيادة ونقصان (3 دقيقة) في س 1,600 ز طبقات منفصلة، وخلع الأعلى ن-طبقة butanol. استخراج مرة أخرى مع 250 ميليلتر ن-butanol (المشبعة بالماء)، تدور، وخلع الأعلى n-طبقة وبيوتانول، والجمع بين مع استخراج السابق.
      2. إضافة 400 ميليلتر المياه (المشبعة نون-وبيوتانول) هذا استخراج، وخلط بقوة. تدور إلى طبقات منفصلة وحذف الطبقة المائية السفلي. كرر هذا الإجراء الغسيل باستخدام 400 ميليلتر من الماء (المشبعة نون-وبيوتانول). إضافة 3 ميليلتر من 250 ملم الحل تريس-HCl، pH 9.5، n-طبقة butanol. تتبخر n-butanol إلى جفاف في مبخر درجة حرارة المحيط.
      3. حل هذه البقايا في 100 ميليلتر n-butanol، تتبخر إلى جفاف مرة أخرى، وحل هذه البقايا في 16.0 ميليلتر المياه.
    4. وضع العلامات أدوكتس
      1. إضافة 1 ميليلتر بيسين المخزن المؤقت الحل (وسم المخزن المؤقت) و 4.5 ميليلتر من مزيج يحتوي على 100 µCi [γ-32ف] ATP، بمول 45 من ATP الباردة، و 10.0 يو من T4-بنك (T4-فوسفونوكليوتيدي كيناز) إلى 16.0 ميليلتر الحل من مزيج تخصيب NP1 أو butanol. تركيزات الكواشف النهائي سوف يكون ما يلي: بيسين 20 مم 10 مم مجكل2، ديثيوتريتول 10 ملم، سبيرمدين 0.5 مم و T4 يو/ميليلتر 0.5-بنك، ATP 3 ميكرومتر. الحجم الإجمالي الخليط من 20 ميليلتر.
      2. السماح الخليط أن تستجيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تطبيق نموذج كامل (أي-20 ميليلتر) على لوح TLC بي-السليلوز (2.5.6.).
    5. تقييم فعالية NP1 أو n -butanol تعزيز الإجراءات
      1. أغسل الجزء السفلي من الأنبوب مع 50 ميليلتر المياه. مزيج بقوة عن 30 ثانية وزيادة ونقصان (1 دقيقة) في س 1,600 ز في أجهزة الطرد مركزي إنشاء هناك أي تلوث على الغطاء. بقعة 5 ميليلتر على صفيحة TLC بي-السليلوز (20 × 20 سم). اللوني باستخدام حل 280 ملم (NH4)2حتى4 و 50 مم نة2بو4، الأس الهيدروجيني 6.8.
    6. فصل TLC deoxynucleotides أدوكتيد
      1. قبل غسل الأطباق TLC مع الماء المقطر. من المستحسن خاصة للوحات المصنوعة محلياً.
        ملاحظة: ينبغي الاضطلاع هذا الغسيل لإزالة اللون الأصفر من اللوحات، ألوان التي يمكن أن ترفع الخلفية، ولا سيما في الجبهة المذيبات.
      2. بقعة العينة كلها على صفيحة TLC بي-السليولوز وبدء الفصل اللوني (2.5.4-)؛ تنظيف adducts تتم بوضع اللوحة في الاتجاهات D1 و D2 (الشكل 2).
      3. وضع اللوحة في اتجاه D1 (الشكل 2). استخدام 1.7 م فوسفات الصوديوم العازلة، هي الباقية الرقم الهيدروجيني 6.8، لضمان أن الحمض النووي adducts في بداية لصفيحة TLC. المثل، وضع اللوحة في اتجاه D2 استخدام هذا المخزن المؤقت. للحصول على مزيد من المعلومات حول المخازن المؤقتة المحتملة للإجراءات، أدوكتس الحلول انظر وصف للقرار من عدة أنواع من20،28.
        ملاحظة: يمكن إهماله التنمية اللوحة في اتجاه D2.
      4. أغسل اللوحة في المياه بعد الفصل اللوني لحوالي 5 دقائق في الحمامات متتالية اثنين. وبعد ذلك تجف اللوحات.
      5. وضع اللوحات في اتجاه D3 و D4 استخدام 3.5 M الليثيوم فورمات العازلة، pH 3.5، والتي تحتوي على اليوريا 8.5 متر لاتجاه D3 و 0.5 م تريس-HCl المخزن المؤقت، pH 8.0، التي تحتوي على اليوريا ليكل و 8.5 م 0.8 م لاتجاه D4 (الشكل 2). يجب أن تعدل المذيبات لتطوير المواقع أدوكت على صفيحة TLC. للحصول على مزيد من المعلومات حول المخازن المؤقتة المحتملة لوضع إجراءات D3 و D4، انظر الحلول التي وصفت للقرار من عدة أنواع من أدوكتس23،24،،من2528.
      6. لتجنب أي مشاكل في D4، بعد التنمية في اتجاه D4 ويغسل الماء، وضع اللوحات (على طول D4) في 1.7 م فوسفات الصوديوم، pH 6.0 (عادة تعيينها كتطور في اتجاه D5)، إلى أعلى الفتيل ورقة (12 × 11.5 سم).
        ملاحظة: اتجاه D5 يمكن أيضا أن يتم حذف. وفي هذه الحالة، من الضروري فتح خزان TLC عندما وصلت المذيب أعلى TLC، والسماح تشغيل لمدة تصل إلى 60 دقيقة. هذا الأسلوب أفضل حتى من إضافة الفتيل (أسلوب كثيرا ما تستخدم في العديد من المختبرات إلى حذف أية مشاكل في D4).
    7. التحديد الكمي ل deoxynucleotides (معدلة) العادي بعد التحلل المائي
      1. يضعف قاسمة هيدروليساتي (من 2.5.1. تصف التحلل الحمض النووي) مع الماء المقطر، (أي.، 2.5 ميليلتر خليط الهضم من 2.5.1. تعديلها إلى 250 ميليلتر، وضبط 10 ميليلتر لهذا الحل إلى 150 ميليلتر).
      2. تأخذ 5 ميليلتر (10 deoxynucleotides pmol العادي) الكوة من هذه النبذة، إضافة 2.5 العازلة 10 ملم HCl تريس ميليلتر، pH 9.0، والتسمية كما هو الحال في 2.5.4- (حجم الخليط النهائي هو 10 ميليلتر). السماح بالرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. ميليلتر 4 الكوة من الخليط وتمييع ميليلتر 750 مع 10 ملم تريس-HCl، pH 9.0. ميكس وتدور إقامة هناك أي تلوث من الغطاء. تطبيق 5 ميليلتر على صفيحة TLC بي-السليلوز. وضع صفيحة TLC في حل من 280 ملم (NH4)2حتى4 و 50 مم نة2بو4، الرقم الهيدروجيني 6.5. السماح لتجف بعد TLC.
      4. استخدام أوتوراديوجرافي الذي يتم تنفيذه لحوالي 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعريب ديوكسينوكليوتيدي غير معدلة أربعة مكررا-الفوسفات. قص بقعة للقياس الكمي التﻷلؤ السائل أو سيرينكوف العد.
    8. حساب النسبية adduct وسم (راؤول)
      1. تحديد قيم التهم في البقع أدوكت والتهم في قاسمة للمسمى deoxynucleotides (العادي) غير معدلة.
        ملاحظة: يكون هذا الأخير يحدد التهم 180,000 أقل المواد من السابق، شكل الذي هو عامل التحويل لتطبيق على عدد deoxynucleotides (العادي) غير معدلة لتقييم قيم مستويات adduct راؤول. راؤول من الحمض النووي adducts ويحسب وفقا للمعادلة (2) المبينة أعلاه.
    9. كشف ملزم لاختبار المواد المسرطنة أو المخدرات للحمض النووي باستخدام العقاقير المشعة المسماة
      1. تقييم 3ح أو النشاط الإشعاعي 14ج دنا عدلها مع المواد الكيميائية السائلة التﻷلؤ العد.
      2. إضافة 10-50 ميليلتر من الحمض النووي الحل إلى 3 مل حل التﻷلؤ في القنينة التﻷلؤ. مزيج جيد. قياس النشاط الإشعاعي استخدام عداد التﻷلؤ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام البروتوكولات المذكورة هنا للاستفادة تفعيل تحفيز إنزيم (أي، P450، البيروكسيديز، ريدكتيز) للتحقيق في فاعلية من المواد الكيميائية (المواد المسرطنة/المخدرات) أن تستقلب إلى وسيطة أدى بهم التساهمية ملزمة للحمض النووي (جيل من الحمض النووي adducts)، تمكنا من حل (ط) إليه رواية الدوائي عمل اليبتيسيني عامل السرطان (بالنسبة استعراض انظر،29،،من3031)، (ثانيا) مسببات اثنين نيفروباثيس المرتبطة بسرطان المسالك urothelial العلوي الناجمة عن مصنع قلويد اريستولوشيك حمض (حدوث حمض اريستولوشيك وحدوث المتوطنة البلقان) (لإحدى، راجع استعراض32،،من3334، 35،،من3637،،من3839)، والآليات (ثالثا) سمية جينية السرطنة للمواد المسرطنة عدة مثل الملوثات جوية 3- نيتروبينزانثروني،(3-الدوري الأميركي للمحترفين)4041،42،43،،من4445 ونظيرتها التخفيض، 3-أمينوبينزانثروني (3-أبا)،46 ،،من4748 مصنع قلويد اريستولوشيك الحمضية،32،33،34،35،،من3637 , 38 , 39 وأمين عطرية س-أنيسيديني. 49 , 50 , 51 , 52 كذلك، الإنزيمات تحديد الآثار البيولوجية لهذه المواد الكيميائية تم تحديد استخدام الأساليب المذكورة.

هنا، يؤدي الممثل على تفعيل عنصر مؤكسد من اليبتيسيني من P450s وأدوكتس بيروكسيداسيس أدى إلى توليد التساهمية مع الحمض النووي، والحد من 3-الدوري الأميركي للمحترفين لنواتج الأيض التي تساهمي تعديل الحمض النووي، وترد.

الليبتيسيني قلويد النباتية (5,11-ثنائي ميثيل-6ح-بيريدو [4,3-ب] كاربازولي) ومشتقاته هم وكلاء انتيتومور، التي تعمل كالمخدرات تضر بالحمض النووي من خلال عدة آليات، وشملت إلقاء القبض على دورة الخلية وتحريض المبرمج (لإلقاء نظرة عامة، انظر29،،من3031). استخدام البروتوكولات المذكورة في هذا العمل، أثبتنا أن المخدرات السرطان يولد التساهمية الحمض النووي adducts بعد بيواكتيفيشن الأيضية تحفزها P450s ميكروسومال (الشكل 3) و، بيروكسيداسيس (الشكل 4)29 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61، وهذا يفسر كفاءة قوية لهذا الوكيل ضد خلايا السرطان30. [3ح]-اليبتيسيني راديولابيليد وإصدار 32تقنية ف بوستلابيلينج nuclease P1 واستخدمت أساسا في الدراسات29،،من3031،53 ،61. استخدام الدراسة المعقدة مع نظم الإنزيم سوبسيلولار ومثبطات إنزيم الإنزيمات نقية في تجارب استخدام البروتوكولات وصف إنزيمات P450 اليبتيسيني المؤكسدة للأنواع المتفاعلة تشكيل الحمض النووي adducts وهياكل الغالبة كانت هذه الأنواع المتفاعلة30تتسم29،،،من3155. من P450s درست، الإنزيم CYP3A4 البشرية الأكثر كفاءة في أكسدة الليبتيسيني 12-هيدروكسييليبتيسيني و 13-هيدروكسييليبتيسيني، والايضات الليبتيسيني، التي تتحلل تلقائياً إلى الليبتيسيني-12-إيلام والليبتيسيني-13-إيلام ملزم للحمض النووي (الشكل 5). 55 , 61 إنزيمات CYP تولد أيضا والايضات أخرى مثل 9-هيدروكسييليبتيسيني، الذي يعتبر من السموم المستقلب، 7-هيدروكسييليبتيسيني والليبتيسيني ن2-أكسيد، التي يتم تشكيلها القاصر والايضات الليبتيسيني. 9-هيدروكسييليبتيسيني، فضلا عن 7-هيدروكسييليبتيسيني والليبتيسيني ن2-أكسيد تتشكل أساسا من CYP1A1 و CYP2D6، على التوالي. 55 , 57 , 58

بيروكسيداسيس (أي، الفجل البيروكسيديز (HRP)، لاكتوبيروكسيداسي (LPO)، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وسيكلوكسيجيناسيس (كوكس-1 و 2-كوكس)) استقلاب الليبتيسيني لتوليد نفس المستمدة من الليبتيسيني الحمض النووي adducts (الشكل 4)61 الآليات هو موضح في الشكل 5.

نيترواروماتيك 3-الدوري الأميركي للمحترفين (3-نيترو-7ح-بنزديأنثراسين-7-واحد) مكون عادم الديزل ووجدت في الجسيمات المحمولة جوا62،،من6364. تم الكشف عن المستقلب الرئيسي من هذه الملوثات، 3-أبا،64،65 في بول عمال مناجم الملح التي تعرضت إلى انبعاثات وقود الديزل ل وقت طويل63. هذه الحقائق أثبتت أن هؤلاء العمال قد تعرضت إلى 3-الدوري الأميركي للمحترفين. يسبب هذا نيترواروماتيك أورام الرئة في الفئران بعد إعطاء تقطير67. 3-الدوري الأميركي للمحترفين أيضا بمثابة مطفر في اختبار ايمز typhimurium السالمونيلا (في سلالة YG1024 أوفيريكسبريسينج نيتروريدوكتاسي و يا-أسيتيلترانسفيراسي)، توليد أكثر من 6 مليون ريفيرتانتس كل نانومولي في هذه السلالة62. كما تجلى لها فاعلية سمية جينية بجيل من adducts التساهمية مع الحمض النووي في المختبر، وبعد التنشيط بالأنزيمات عدة، باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذا العمل، و في فيفو في عدة أجهزة من القوارض الحيوانات (الرقم 6 )39،،من4041،42،،من4344،45،46،47 ،64،،من6768.

المستمدة من الدوري الأميركي للمحترفين 3 الحمض النووي adducts تشكلت بعد التنشيط 3-الدوري الأميركي للمحترفين مع ريدوكتاسيس سيتوسوليك (أي، NQO1) كانت تقاس نوكلاس P1 و n-أساليب الإثراء وبيوتانول 32بوستلابيلينج ف الأسلوب الموصوفة في البروتوكولات قدمت في هذه الدراسة. أشارت النتائج إلى adducts تشكيل الحمض النووي يصل إلى خمسة (adduct النقاط 1-5 في الشكل 7)، وثلاثة منهم قد اتسمت 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-أمينوبينزانثروني (دا-ن6-C2-أبا؛ adduct بقعة 1)، N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-أمينوبينزانثروني (dG-ن2-C2-أبا؛ adduct 3 بقعة) و N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8-N-أبا؛ adduct البقع 4. و 5) (رقم 7 و رقم 8). استخدام إصدار 32ف بوستلابيلينج الأسلوب، المدير العام نوكلاس P1-C8-N-أبا (adduct البقع 4 و 5) كانغير قابل للكشف (الشكل 7 و الشكل 8). هذه النتيجة تؤكد أن تحدث بعض القيود المفروضة على هذا الإصدار من 32ف بوستلابيلينج، وهما، وكشف deoxynucleotides أدوكتيد التي منخفضة (أن وجد) ديفوسفوريلاتيد نوكلاس P1 (أي adducts تشكلت خلال أكسدة أريلامينيس أو عن طريق الحد من نيتروديريفاتيفيس العطرية إلى N-هيدروكسياريلاميني-مشتقات استبداله في C8 ديوكسيجوانوسيني). مماثلة للدراسة مع الليبتيسيني، الاستفادة من الدراسة المعقدة مع نظم الإنزيم سوبسيلولار ومثبطات الإنزيم، نقية الإنزيمات والحمض النووي adduct المعايير في التجارب التي تستخدم بروتوكولات الموصوفة في هذا العمل، والغالب سيتوسوليك تخفيض الإنزيمات التاييض 3-الدوري الأميركي للمحترفين لنواتج الأيض توليد الحمض النووي adducts، إلا وهو المستقلب رد الفعل شكلتها تخفيض 3-الدوري الأميركي للمحترفين (N-يا أبا)، والهياكل الثلاثة الحمض النووي adducts المتولدة عن 3-الدوري الأميركي للمحترفين كانت تتميز (الشكل 7 و الشكل 8). في الكبد، وعثر على بيواكتيفيشن من 3-الدوري الأميركي للمحترفين في المختبر أن تعزى أساسا إلى الإنسان والفئران NQO1 (الشكل 7)، بينما الإنسان ن،س-أسيتيلترانسفيراسيس (Nat)، NAT2، NAT1، سولفوترانسفيراسي (سولت)، SULT1A1، وإلى وبقدر أقل، SULT1A2 هي الغالبة إنزيمات المرحلة الثانية تفعيل 3-الدوري الأميركي للمحترفين42. بور ميكروسومال الكبد أيضا فعالة في تفعيل 3-الدوري الأميركي للمحترفين41، لكن في الفئران، 3-الدوري الأميركي للمحترفين أساسا بيواكتيفاتيد NQO1 بدلاً من هذا بور ميكروسومال42. في الرئة، وهي الأنسجة المستهدفة للسرطنة 3-الدوري الأميركي للمحترفين67، تقليل NQO1 وإكس 3-الدوري الأميركي للمحترفين لنواتج الأيض توليد الحمض النووي adducts. ومع ذلك، يبدو إكس يعمل إنزيم تفعيل طفيفة 3-الدوري الأميركي للمحترفين في هذا الجهاز69.

Figure 1
الشكل 1: مخطط للانزيم بوستلابيلينج ف 32. تظهر الخطوات الفردية بطريقة بوستلابيلينج ف 32وإجراءات معززة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: نمط الحمض النووي adduct شطف على ألواح TLC بي-السليلوز. اللوني متعدد الاتجاهات للحمض النووي adducts في جزيرة الأمير إدوارد-السليلوز تظهر لوحات. الأصل موقف ابدأ على صفيحة TLC بي-السليلوز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3:32 بوستلابيلينج ف تحاليل الحمض النووي adducts شكلت في الحمض النووي الغدة الصعترية العجل المحتضنة مع الليبتيسيني وميكروسوميس الكبدي (ب) البشرية نادف والفئران (A)، (ج) عنصر تحكم نموذج دون ميكروسوميس. أدوكتس 1 و 2 تم تعيينها بالأسهم يتم إنشاؤها في ديوكسيجوانوسيني في الحمض النووي بواسطة الليبتيسيني المنشط مع ميكروسوميس. 32 بوستلابيلينج ف قد أنجز تستخدم الإصدار نوكلاس P1 للأسلوب (الخطوة 2.5.2.) أصول تقع في الزوايا السفلية اليسرى (D3 من أسفل إلى أعلى و D4 من اليسار إلى اليمين). وقد أغفل D2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4:32 بوستلابيلينج ف تحاليل الحمض النووي بوساطة الليبتيسيني أدوكتس. أدوكتس التي شكلت في الغدة الصعترية العجل كان رد فعل الحمض النووي مع اليبتيسيني (100 ميكرومتر) والفجل البيروكسيديز (A)، lactoperoxidase البقري (ب)، ميلوبيروكسيداسي البشرية (ج)، والأغنام السيكلواوكسيجيناز-1 (د)، الإنسان السيكلواوكسيجيناز-2 ( ﻫ) (5 ميكروغرام بيروكسيداسيس كانت موجودة في إينكوبيشنز)، من الكبد كان رد فعل الحمض النووي فئران تعامل مع الليبتيسيني 40 مغ كل كيلوغرام من وزن الجسم (الأسلحة البيولوجية) (و)، من العجل الغدة الصعترية الحمض النووي مع الليبتيسيني و CYP3A4 البشرية (ز)، 13- هيدروكسييليبتيسيني(ح)، اليبتيسيني ن2-أكسيد (أنا)، و 12-هيدروكسيليبتيسيني (ي). أجريت تجارب باستخدام إصدار نوكلاس P1 المقايسة (الخطوة 2.5.2.) أصول في الزوايا السفلية اليسرى (D3 من أسفل إلى أعلى و D4 من اليسار إلى اليمين). وقد أغفل D2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: أكسدة الليبتيسيني من بيروكسيداسيس وسيبس عرض الأيض الليبتيسيني وتلك المقترحة لتوليد الحمض النووي adducts. المركبات في أقواس، لم لا تزال تم الكشف عنها الظروف التجريبية المستخدمة في التجارب، وهي نواتج الأيض electrophilic افترض أنها ملزمة في نهاية المطاف الأنواع للحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تنشيط الأيض والحمض النووي adduct تكوين قبل 3-نيتروبينزانثروني- 3-الدوري الأميركي للمحترفين، 3-نيتروبينزانثروني؛ NQO1، أوكسيدوريدوكتاز H:quinone NAD (P)؛ نات، ن،س-أسيتيلترانسفيراسيس؛ سولت، سولفوترانسفيراسي؛ CYP، السيتوكروم P450؛ بور، نادف: السيتوكروم P450 أوكسيدوريدوكتاز؛ برنامج الصحة الإنجابية، الفجل البيروكسيديز؛ LPO، لاكتوبيروكسيداسي؛ الخطة الرئيسية للعمليات، ميلوبيروكسيداسي؛ كوكس-1, السيكلواوكسيجيناز-1. R =-المدرب3 أو-هكذا3ح؛ دا-ن6-أبا، 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-أمينوبينزانثروني؛ المديرية العامة-ن2-أبا، N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-أمينوبينزانثروني؛ المديرية العامة-C8-N-أبا، N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7:32 بوستلابيلينج ف تحاليل الحمض النووي المستمدة من الدوري الأميركي للمحترفين 3 أدوكتس. نوكلاس P1-(يسار لوحات) و نون-استخدمت وبيوتانول استخراج الإصدارات (حق الألواح) للأسلوب. أ و أب، أدوكتس العجل المشكلة في الغدة الصعترية الحمض النووي تجاوب مع 3-الدوري الأميركي للمحترفين (300 ميكرون) بعد التنشيط مع الجرذ الكبد سيتوسولس. أدوكتس ب و بب، شكلت العجل الغدة الصعترية الحمض النووي، كان رد فعل 3-الدوري الأميركي للمحترفين (300 ميكرون) بعد التنشيط مع سيتوسول الكبد البشري (الكسر المجمعة). أدوكتس ج و جب، شكلت العجل الغدة الصعترية الحمض النووي، وتجاوب مع 3-الدوري الأميركي للمحترفين (300 ميكرون) بعد التنشيط مع الفئران نقي الكبد NQO1 (وحدات 0.09). أدوكتس د و دب، شكلت العجل الغدة الصعترية الحمض النووي، كان رد فعل 3-الدوري الأميركي للمحترفين (30 ميكرومتر) بعد التنشيط مع NQO1 الماشوب البشري (0.06 الوحدات). أدوكتس ه و بمن ه، شكلت في سمك السلمون الخصية الحمض النووي تعامل مع N-أوه-أبا. و و وب، أدوكتس الكبد شكلت في الحمض النووي من البرية من نوع ليتيرماتيس على خلفية C57BL/6 يتعرض إلى 2 مغ من الدوري الأميركي للمحترفين-3 كل كيلوغرام يتعلق الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8:32 بوستلابيلينج ف تحاليل الحمض النووي المستمدة من الدوري الأميركي للمحترفين 3 adduct المعايير [dG-ن2-C2-أبا (A)،ندا-6-C2-أبا (ب) والمديرية العامة-C8-N-أبا (ج)] (لوحات) وهياكل 3-الدوري الأميركي للمحترفين وهذه 3-الدوري الأميركي للمحترفين--الحمض النووي adducts ( لوحات ب). ن-استخدمت وبيوتانول استخراج نسخة من الأسلوب (اللوحات في). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، ثبت منهجية متاحة على نطاق واسع لدراسة فاعلية المواد الكيميائية لتكون بيواكتيفاتيد لوسيطة الأيضية، أدى إلى توليد التساهمية الحمض النووي adducts. هذا هو مسألة بالغة الأهمية، نظراً لأن تقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية أو المخدرات من تفعيل الانزيمية لنواتج الأيض توليد التساهمية الحمض النووي adducts هو ميدان هام في تطوير السرطان وعلاجه. الآن هو الحكم بتعديل الحمض النووي بالمسرطنات التي نظرت في قضية التنمية الورم كعقيدة مركزية المسرطنة الناجمة عن المواد المسرطنة. ويتأكد هذا الاقتراح من مجموعة متنوعة من النتائج التي توصل إليها، مثل الظواهر التي: (ط) المسرطنة خصائص مختلف المواد المسببة للسرطان يعتمد على بيواكتيفيشن من هذه المركبات إلى نواتج الأيض التفاعل مع مراكز تفاعلات في الحمض النووي؛ (ثانيا) مستويات الحمض النووي adducts كثيرا ما تقابل بردود كثيرة مسببة للسرطان؛ (ثالثا) وقد يكون سبب الطفرة في بعض الجينات القامع الورم وتفعيل وبروتو عدة على تعديلها مع المواد الكيميائية مع مقايسات مسببة للسرطان. وعلاوة على ذلك، أثبتت التساهمية تعديل الحمض النووي بالمخدرات السرطان كواحدة من آثار تضر بالحمض النووي الأكثر كفاءة لهذه الأدوية، مما يؤدي إلى استخدامها في علاج السرطان.

هناك اثنين من النقاط الحرجة التي تحدد نجاح تقييم المواد الكيميائية لخصائص سمية جينية، أي مقايسات بهم لتشكيل التساهمية الحمض النووي adducts، على وجه التحديد: (ط) أن تجد، حل، وتميز كفاءة الانزيمية نظم قادرة على تفعيل المواد المسرطنة/المخدرات إلى ربط الأنواع electrophilic العثور على مراكز تفاعلات الحمض النووي، و (الثاني) لتطوير واستخدام التقنيات الأكثر ملاءمة، بموجبه مادة مسرطنة/المخدرات – الحمض النووي adducts وتتميز هيكلياً. ويرد في هذه الدراسة الأساليب المناسبة لكلتا الميزتين.

إجراءات العزل لكسور الخلوية التي تحتوي على إنزيمات أحيائي (عينات ميكروسومال أو سيتوسوليك حيازة P450s و أي بيواكتيفاتينج إضافية الإنزيمات بيروكسيداسيس أو ريدوكتاسيس بور، NQO1، XO و AO)، البروتوكولات من أجل بيواكتيفيشن لاختبار المواد المسرطنة/المخدرات عن طريق النظم الانزيمية (إينكوبيشنز مع الحمض النووي)، واستخدامها هو مبين في هذا العمل المشار إليه، كما يتضح من النتائج التمثيلية، وملاءمتها لتقييم خصائص جينية سمية المواد الكيميائية.

علاوة على ذلك، الأساليب الملائمة للكشف والتحديد الكمي ل adducts مع الحمض النووي مثل نسختين تخصيب تقنية بوستلابيلينج ف 32(نوكلاس P1-و نون-butanol استخراج إجراءات)، واستخدام وعرضت المركبات المختبرة المسمى بالاشعاع مناسباً لدراسات تقييم السمية الجينية لمدمني المخدرات مسرطن xenobiotics.

بشأن تحديد التساهمية الحمض النووي adducts، وهذان الأسلوبان، ليس فقط، بل أيضا أساليب أخرى مناسبة لكشف وقياس الحمض النووي adducts قد أنشئت8،،من7071،72 ،،من7374،75،،من7677،78،79،80،81 , 82-حتى عام 1981، التحديد الكمي للحمض النووي adducts استخداماً المشعة المواد الكيميائية (المواد المسرطنة/المخدرات)، المسمى من قبل 3ح أو 14ج، التي تم إعدادها صناعيا. مثل هذه الأساليب قد استخدمت مفيد للدراسات مع الليبتيسيني كما هو موضح في هذا العمل (انظر،من5354). ومع ذلك، من الصعب عادة لإعداد المشتقات مع ارتفاع النشاط الإشعاعي لعلى الاستخدام الناجح73،،من8081. ولذلك، على الرغم من أن هذا الإجراء يزال يستخدم، أنها للأسف تنحصر في المختبر تجارب مشابهة لتلك الموضحة هنا. تقنيات أخرى، الكتلي، رش إلكترون التأين (ESI)، الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين (استخدام)، مسرع الطيف الكتلي (هيئة علماء المسلمين)، الأسفار، والأساليب البيولوجية مثل المناعة، و 32 بوستلابيلينج ف الموصوفة في هذه الدراسة بالتفصيل، ووضعت (للاستعراض، راجع8،16،،من7071،،من7273، 74،76،75،،من7779،78،80،،من8182).

يظهر الإنزيم بوستلابيلينج ف 32الموصوفة في البروتوكول لهذا العمل، الذي ليس فقط لديه قابلية التطبيق في التجارب في المختبر (انظر نتائج الممثل)، إلا وهي، اختبار مركبات جديدة لسمية جينية أو الميكانيكية التحقيقات المتعلقة بتنشيط مادة مسرطنة/المخدرات، ولكن لديه أيضا استخدامات أخرى مثل تقييم التعرض البشري للمسرطنات البيئية، دراسات بشأن آليات التنمية الورم، رصد إصلاح الحمض النووي، فحص الحمض النووي من إلحاق الضرر بالذاتية المركبات والتفاعلات الأكسدة، والتحقيق استجابة المرضى للسآمة للخلايا السرطان المخدرات72،83.

هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يخلو بعض القيود73. لا يمكن تحديد الآفات في الحمض النووي، وهي ليست مستقرة كما مونوديوكسينوكليوتيديس، موثوق بها. 32بوستلابيلينج ف الأسلوب غير قادر على تحديد هياكل الحمض النووي adduct. ولذلك توصيف الهيكلية للحمض النووي adducts كثيرا ما تعتمد على مما يدل على اللوني المشارك مع المعايير التركيبية للهياكل المعروفة. في الواقع، استخدمت هذا أسلوب في كلا الأمثلة التمثيلية النتائج المعروضة في هذا العمل (الليبتيسيني، 3-الدوري الأميركي للمحترفين).

وفي الختام، البروتوكولات المبينة في هذا العمل يمكن اعتبار أساليب مناسبة لتقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية أو المخدرات أن يكون انزيماتيكالي بيواكتيفاتيد إلى نواتج الأيض توليد التساهمية الحمض النووي adducts، عملية بالغة أهمية بالنسبة التنمية من السرطان وعلاجه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة "مؤسسة العلوم التشيكية" (جاكر، منحة 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 133، المخدرات، مسرطن، بيواكتيفيشن،السيتوكروم P450، ريدوكتاسيس، الحمض النووي Adducts، 32ف بوستلابيلينج
تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات <em>في المختبر</em> وتصميمها من <sup>32</sup>فبوستلابيلينج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stiborova, M. Formation of Covalent… More

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter