Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57177
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry, Charles University

Summary

הערכת עוצמת סביבתיים כימיקלים, תרופות, להיות enzymatically bioactivated כדי intermediates יצירת DNA קוולנטיות adducts, הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. שיטות מתוארים עבור הפעלת מתחם לטופס שה-DNA adducts, כמו גם טכניקות שלהם זיהוי, כימות.

Abstract

DNA קוולנטיות adducts שהוקמה על ידי כימיקלים או סמים עם העוצמה מסרטנים נשפטים כאחד הגורמים החשובים ביותר בשלב הייזום של תהליכים מסרטנים. איגוד קוולנטיות זה, הנחשב הגורם tumorigenesis, עכשיו מוערך של הדוגמה המרכזית של carcinogenesis כימי. כאן, שיטות מתוארים העסקת את התגובות על ידי ציטוכרום P450, אנזימים ביואמסה נוספים כדי לחקור את העוצמה של כימיקלים או סמים עבור ההפעלה שלהם כדי מטבוליטים ויוצרים את הדנ א הללו adducts. ההליכים מוצגים המתארים את ניתוקה של שברים הסלולר הפו אנזימים ביואמסה (microsomal cytosolic דגימות עם cytochromes P450 או אחרים ביואמסה אנזימים, קרי, peroxidases, nadph ל: ציטוכרום P450 oxidoreductase, oxidoreductase H:quinone NAD (P) או xanthine אוקסידאז). יתר על כן, מתוארות שיטות זה יכול לשמש עבור ההפעלה מטבולית של כימיקלים שנותחה על ידי אנזימים אלה, כמו גם עבור בידוד של דנ א. עוד יותר, השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות DNA כימית/סמים-נגזר adducts, דהיינו, שינויים שונים של הטכניקה P-postlabeling 32, העסקתם של רדיואקטיבי שכותרתו ניתח כימיקלים, הם מוצגים בפירוט.

Introduction

חילוף החומרים של ואינטראקציות (כימיקלים סביבתיים או תרופות) מתרחשת בשני שלבים1. שלבים I ו- II במטרה להבהיר את תרכובות הידרופוביות במקור (לא מסיסים במים) יותר הידרופילית (מסיסים במים), ובכך הופך אותם excretable בקלות באמצעות שתן, צואה או זיעה. שלב I (functionalization) תגובות כוללים חמצון, הפחתה, ו hydroxylation מזורז על ידי אנזימים כגון ציטוכרום P450s (P450s, CYPs), peroxidases (כלומר., cyclooxygenase, קוקס), אלדו-keto reductases (AKRs), ו microsomal פלווין המכילים monooxygenases (FMOs). שלב אני כולל גם הפחתת תגובות, מתווכת על ידי מגוון רחב של reductases דהיינו microsomal nadph ל: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ו- NAD (P) cytosolic H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthine אוקסידאז (XO) אלדהיד אוקסידאז (AO)1 . בשלב השני (נטיה), קבוצות פונקציונליות שצורפו בשלב אני משמשות נזווג מולקולות קוטביות קטנות כדי להגביר עוד יותר את הקוטביות. דוגמאות של אנזימים נחשב להשתתף התגובה של שלב II כוללים sulfotransferases (ים), N, O- acetyltransferases (Nat), methyltransferases כגון catechol -O- methyltransferase (COMT), גלוטתיון S- transferases (GSTs), uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. הסיווג של אנזימים בשלב I או II עם זאת, לא נוקשה, ולא ניתן לקבץ כמה אנזימים ניתן לטעון גם בקטגוריה.

אנזימי P450 (EC 1.14.14.1) הן heme המכיל חלבונים המצויים אורגניזמים שונים, אשר להשתתף ביואמסה של כימיקלים רבים, ותזרז את ההמרה3,4. אנזימי P450 לעודד hydroxylation של סובסטרטים רבים, עם תגובת איפה אטום אחד של dioxygen מוחדרים המולקולה של ואינטראקציות, בעוד האטום השנייה של חמצן הוא מופחת כדי ליצור מים על ידי התגובה כי דורש שני אלקטרונים [המשוואה (1 3,)]4:

RH + O2 + nadph ל + H+ ← ROH + H2O + NADP+ (1)

אנזימי P450 לוקליזציה. ממברנה רשתית תוך-פלזמית בתרבית של תאים (מערכות P450 microsomal) הם חברי המערכת multienzyme monooxygenase, אשר בהמשך מכיל ניקוטין: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ציטוכרום b5 , המצע של האנזים כינה NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז. תיאוריה מקובלים hypothesizes כי התורם האלקטרונים שני לצורך P450 היא מערכת ניקוטין/בבקשה. בכל זאת, ציטוכרום b5 עשוי לשמש גם כתורם אלקטרונים עבור P450, כלומר תורם של האלקטרון הפחתת P450 במהלך הפחתת השני של מחזור התגובה שלה, שבו היא פועלת יחד עם NADH: ציטוכרום b5 3,2,רדוקטאז4.

יונקים לנצל את אנזימי P450 שונים (למשל, האנזימים של משפחות 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, ו 27) לסינתזה של תרכובות אנדוגני יקרי ערך, כמו סטרואידים, להשתמש בהם עבור קטבוליזם של מוצרים טבעיים2,3 . אחרים CYP בתרבית של האנזימים, כגון CYP1A2 האנושי, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ו 3A4, לעכל אקסוגני כימיקלים המשמשים כמו סמים. 5 , 6 אנזימים החשובים ביותר ותזרז את חילוף החומרים של תרופות הם CYPs של תת משפחה 3A, במיוחד CYP3A4. ההמרות של ואינטראקציות, כגון פרו-מסרטנים ו- pro-חשיפה לרעלים, הן מתווכת על-ידי CYP1A1 האנושי 1A2, 1B1, 2A6, 2E1,2,3A45. רוב CYPs אלה נמצאים הכבד (למעט CYP1A1 ו- 1B1). ובכל זאת, CYPs גם מבוטאים במספר האיברים extrahepatic. P450s כזה יכול להיות משמעות רבה, בעיקר כאשר להשתתף הם בחילוף החומרים bioactivation של כימיקלים (תרופות) intermediates הממוגן ב איברים אלה7. P450s שונים הם המושרה על ידי מספר תרכובות מצעים שלהם, למרות שזה לא בהכרח המקרה.

אנזימי P450 רבים לשחק תפקיד רעילות כימית (סמים). הם יכולים להמיר את ואינטראקציות לא רק מטבוליטים דטוקסיפיקציה שלהם, אך גם להפעיל אותם למינים תגובתי, המשנים את מקרומולקולות אנדוגני, כי בנוסף התערוכה מאפיינים ביולוגיים שונים, בדרך כלל גורם הרעילות שלהם. ה-DNA, שומנים, חלבונים ייתכן המטרות ולשנותן שלהם על-ידי electrophiles תגובתי רדיקלים המופקים כימיקלים מופעל. במקרה של ה-DNA, פתרון מספר גנים חשובים תגובות ומנגנונים שלהם ידועים כבר2,3,4,5.

השינויים ב- DNA עלולה לגרום ירידה בשליטה צמיחת תאים, תופעה זו נחשבת הגורם השולט המובילים להתפתחות של תהליכים מסרטנים. הדור של DNA קוולנטיות adducts עם כימיקלים בעל העוצמה מסרטנים נאמד כמו אחד הצעדים החשובים ביותר בשלב הייזום של מסרטנים מעבד8,9,10,11. הוכח כי היחסים בין היווצרות של דנ א adducts, tumorigenesis להתרחש, ואילו ירידה בכמות הדנ א adducts אחראי chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. היווצרות של גורם מסרטן/סמים-derived DNA adducts תלוי בסיסים בודדים של דנ א, מושפע את רצפי הבסיסים האלה ב- DNA. התיקונים של ה-DNA adducts תלויות שלהם מיקום (על צירוף ד. נ משועתקים או שאינם עיבד) וסוגים של נוקלאוטיד ששונה רצפים8,11,12,15, 16.

במאמר זה נתאר תהליכי ניצול ההמרה מזורז-אנזים של כימיקלים (תרופות) לחקור מחוזקה תופעל לתוך מטבוליטים אשר שינוי ה-DNA (הפקת דנ א adducts). עבור איגוד ה-DNA קוולנטיות, המתחם בדיקה בדרך כלל צריך להיות מופעל גם על-ידי תגובות חמצון או מוטעה, בהתאם סמים בודדים. הפעלת חימצוני או מוטעה של כימיקלים שנבדקו מתווך על ידי מערכת אנזימטיות תלויות-P450 נוכח השבר subcellular microsomal או על ידי הפחתה reductases להציג את שניהם microsomes (POR, NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז, אנזימי P450) והן בחלקים הסלולר cytosolic subcellular (NQO1, הקמב ץ, AO, peroxidase). מטבוליטים תגובתי לאחר מכן לאגד דנ א ויוצרים דנ א adducts. בגלל תגובות חמצון והן חותכות חשוב להפעיל מספר תרופות אלו מינים תגובתי, מתוארים ההליכים ניסיוני העסקת מערכת אנזימטי חמצון/צמצום. יתר על כן, adducts השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות הדנ א הללו מתוארים בפירוט.

שני הליכים עצמאיים כדי לקבוע אם הכימיקל מבחן, מופעל על ידי מערכות אנזימטיות, מאוגד ל- DNA מומלצים: 32P-postlabeling טכניקה של המתחם רדיואקטיבי התווית על-ידי ניצול (למשל., 3H או 14 C). הראשון מומלץ טייס, הקרנת וזמינותו P-postlabeling 32. הקביעה של תוכן ה-DNA פתרונות, להעריך במדויק, חייב להופיע לפני שתי השיטות.

32P-postlabeling טכניקה מנצל את הידרוליזה אנזימטי של דנ א שונה על-ידי כימיקלים לא רדיואקטיבי (מסרטן/סמים) 3´-phosphodeoxynucleosides, זרחון נוספים עם זרחן רדיואקטיבי (32P)-5´- הו גם ההפרדה של כימיקלים-deoxynucleotide adducts מן deoxynucleotides (שלא שונתה) נורמלי מאת כרומטוגרפיה17 (איור 1). דנ א שונה על-ידי תרכובת כימית hydrolyzed לפי תערובת של endonuclease נוקלאז micrococcal, אקסונוקלאז, המכונה phosphodiesterase הטחול. התערובת של הידרוליזה DNA המכיל שני רגיל (יבוצעו בהם שינויים) ולשנות deoxyribonucleoside 3´-monophosphates הוא הגיב עם ATP [γ -32P] בנוכחות המוביל (שאינו רדיואקטיבי) ATP ו- T4-polynucleotide קינאז ב- pH 9.5 על טופס 5´- 32התווית על-ידי P 3´, 5´-bisphosphates ("רגילה" הליך באיור1). ה-pH בסיסי בשימוש הוא מסוגל מזעור פעילות אנזים של T4-polynucleotide קינאז כדי dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates-3´ עמדה. ההפרדה והרזולוציה של 32התווית על-ידי P adducts מן deoxynucleotides שכותרתו ששונו על ידי כימיקלים לא מבוצע על ידי אניון רב-כיווני-המרת שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) על polyethyleneimine (פיי) תאית (איור 2 ). בשלבים • תנאי הראשון והשני (בכיוון D1 ו- D2), שכותרתו deoxynucleotides (שלא שונתה) רגילה, כמו גם [32P] פוספט נמצאים eluted מן ההתחלה של צלחת TLC-פיי-תאית באמצעות פתרונות מים של אלקטרוליט על חתיכת קצר נייר כרומטוגרפי חלה על ראש הלוח TLC, ואילו deoxynucleotides המכיל כימיקלים מאוגד בתערוכה מאפיינים הידרופובי (מסרטן/סמים-adducts) נשמרים בתחילתו של פיי-תאית צלחת בנוסף לפתור עם מספר מערכות הממס שונות בכיוונים D3, D4 (איור 2). לוקליזציה של adducts מתבצעת באמצעות מסך משופרת autoradiography; adducts מופרדים מזוהים כמו כתמים כהים לזיהוי על סרטי צילום רנטגן. האזורים של כתמים טוחנות מהצלחת ומשמשת לכמת רדיואקטיביות על-ידי גזים או Cerenkov לספור. פוספור אחסון הדמיה שיטה כי כבר מותאם כדי למפות ולכמת את הדנ א adducts על chromatograms זוהה על ידי 32P-postlabeling assay גם משמש כיום. 18 Imager מיידית המכונה לעתים קרובות מנוצל לשם איתור כזה, כימות של דנ א adducts. שיטה זו מספקת יותר מ 10 פעמים רגישות גבוהה יותר לגילוי 32P מאשר בטכניקה של מסך משופרת autoradiography19.

כמויות של ה-DNA adducts נחושים כמו ערכים של קרוב משפחה adduct תיוג (RAL), מחושב באמצעות המשוואה (2) כדלקמן:

cpm. adduct deoxynucleotides
RAL =---(2)
פעילות ספציפית של 32P-ATP (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

הערכים של RALs הם היחס של הרוזן שערי adducted deoxynucleotides מעל ספירת המחירים של סכום [adducted ונורמלי (שלא שונתה) deoxynucleotides]20,deoxynucleotides21. עם זאת, חישוב זה מבוסס על שוויון תיוג היעילות של adducts ו- deoxynucleotides נורמלי22. ההליך ("רגילה") הקלאסית של 32P-postlabeling טכניקה מתאימה עבור דנ א שונים adducts (מגושם ו/או ללא עבים adducts), לעומת זאת, הרגישות אינה מספקת כדי לזהות adducts שנמצאו כמויות נמוכות ב- DNA. באמצעות הליך זה, הסכום של adduct ב- deoxynucleotides 107 יבוצעו בהם שינויים ב- DNA (0.3 fmol adduct/µg ה-DNA) הוא לזיהוי.

מגוון של שינויים של זו הקלאסית 32הליך P-postlabeling כבר נעזרו להעלות את רמת הרגישות של הטכניקה. עד 10-100 פעמים רגישות גבוהה יותר של נחישות של adducts על ידי 32P תיוג הושגה באמצעות הגבלת רמות של ATP [γ -32P] (ההליך התעצמות). 23 , 24 הליך נוסף במתן שעלייה הרגישות של שיטת P-postlabeling 32מנצל של דגירה של מתעכל DNA המכיל adducts עם נוקלאז P1 (מתוך Penicillium citrinum)21 (איור 1). אנזים זה מעדיף dephosphorylate שלא deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, ואילו deoxynucleotides עם כימיקלים מאוגדת (נוקלאוטידים adducted) הם בעצם לא מצעים של אנזים זה. לכן, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (כלומר, deoxyribonucleosides) הם לא phosphorylated על ידי T4-polynucleotide קינאז מאת [32P] פוספט וγ -32P] ATP. עם זאת, חלקם של נוקלאוטידים איפה כימיקלים מאוגדים (adducted deoxynucleotides), כגון arylamine adducts שהוחלפו-C8 של deoxyguanosine, יכול bedephosphorylated על ידי אנזים זה. לעומת זאת, רוב השני adducts (למשל, adducts שהוחלפו ב N2 של deoxyguanosine) הם לא dephosphorylated על ידי נוקלאז P1. שינוי זה של 32P-postlabeling הופך שיטה זו במידה ניכרת רגיש יותר, הגדלת הרגישות שלה על-ידי סדרי גודל יותר משלושה. יתר על כן, גירסה זו של 32P-postlabeling מספק שיטה שבו גבוה יותר כמויות של DNA (5-10 µg) ו עודף של הספק ללא ATP [γ - 32P] יכול להיות מנוצל.

שיטה נוספת להעשיר adducts, שתואר על ידי גופטה25, מנצל את physicochemical מאפייני מגושם deoxynucleotide adducts, אשר ניתן לחלץ לתוך n-butanol בנוכחות שלב העברת הסוכן tetrabutylammonium כלוריד (יפורסם בהמשך) (איור 1) לפני [32P] פוספט תיוג, ואילו deoxynucleotides שלא שונתה מופקים לקוי על ידי הממס האורגני הזה. עם זאת, פחות הידרופוביות adducts, המורכב על דוגמה של deoxynucleotides שונה עם moieties מגושם הלא-ארומטי או אלקיל קטן משקעים, לא ביעילות יחולצו עם n-butanol. לפיכך, הם בעיקרו של דבר בלתי מורגשת כאשר הם נותחו על ידי שינוי זה של 32שיטת P-postlabeling.

שתי הגרסאות כאמור של 32P-postlabeling להגביר הרגישות ואת כימות של ה-DNA adducts מאוד (עד שלושה סדרי גודל), להיות מסוגל לזהות את אחד adduct לכל 109,10 נורמלי נוקלאוטידים (0.3 - 3 (קרית אתא) / µg דנ א). שתי השיטות המומלצות עבור בדיקות הכימיקלים ליעילות שלהם לאגד covalently דנ א, ו, לכן, הם מתוארים בעבודה זו בפרטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (311/1997, משרד החקלאות, צ'כיה), אשר תואם הצהרת הלסינקי.

1. בידוד של הכבד שברים Microsomal ו- Cytosolic

  1. הכן שברים subcellular הכבד (microsomes עשיר אנזימי P450 או cytosols עשיר reductases או peroxidases מסיסים) של חולדות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית פשוטה (שהם 105,000 x g).
    הערה: צניפה ואת תגובת שיקוע נלקחים כמו microsomes ו- cytosols, בהתאמה.
    1. לשטוף את הדגימות הכבד (1-10 גרם) פעמיים עם מאגר 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 המכיל 150 מ מ מאגר אשלגן כלורי (מאגר 1) (10 פעמים גבוה יותר אמצעי אחסון מאשר משקל של הרקמה, דהיינו 10-100 מ ל) ואת הרקמות לחתיכות קטנות (של סביב בגודל 2 x 2 מ"מ).
    2. Homogenize הרקמה בנוכחות המאגר (> נפח ומשקל mL/דור 3) במהמגן ב 4 ° C 5 דקות, להשליך החלקים שאינם הומוגני שיורית של הרקמה באמצעות סינון לסנן נייר. Centrifuge את homogenate ב x 600 g 10 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע עוד צינור צנטריפוגה.
    3. מחדש homogenize בגדר במאגר 1 (1 מ"ל לכל 1 g של רקמה), חזור על שלב 1.1.3., ולמחוק את גלולה. צנטריפוגה במאגר supernatants ב x 15,000 g למשך 20 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע עוד צינור צנטריפוגה.
    4. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x שהם 105,000 g עבור 60 דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע (ציטוזול) ואחסן אותו aliquots (1-10 מ"ל) ב- 80 ° c לאפיין ציטוזול עבור כמות חלבון באמצעות השיטה המתוארת על ידי ברדפורד26.
    5. מחדש להשעות את צניפה במאגר סודיום פוספט 100 מ מ, pH 7.4 (> 2 נפח ומשקל mL/g), צנטריפוגה ב x שהם 105,000 g עבור 60 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. מחדש homogenize בגדר (microsomes) במאגר 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 המכיל 150 מ מ גליצרול אשלגן ו-20% (< מ"ל נפח ומשקל 5/g) ב מהמגן ב 4 º C. אחסן microsomes 0.5 - 1 מ ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. מאפיינים microsomes עבור התוכן של חלבונים באמצעות השיטה המתוארת על ידי ברדפורד26.
    6. לקבוע את הריכוז של ציטוכרום P450 ב- microsomes.
      הערה: הריכוז של אנזימי P450 ב microsomes נמדד כפי שתואר על ידי אומורה ו- Sato27, הקובע את הספיגה של המתחם של P450 מופחתת עם פחמן חד חמצני (CO). פחמן חד-חמצני הוא תרכובת רעילה, ויש לטפל בזהירות, בשכונה.

2. incubations של מבחן כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) עם ה-DNA בנוכחות מערכות אנזימטיות

  1. דגירה של מבחן כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) עם ה-DNA בנוכחות חמצוני מערכות אנזימטיות המכיל cytochromes P450
    1. הכנת תערובות הדגירה המכיל, נפח סופי של 0.75 מ ב 4 ° C, תרכובות הבאים, מערכות אנזימטיות.
      1. לערבב 100 מ מ פוספט מאגר, pH 7.4, (0.375 מ"ל) עם 10 מ מ nadph ל או מערכת ליצירת nadph ל (10 מ מ MgCl2, 10 מ מ D-גלוקוז 6-פוספט, 10 מ מ NADP+, 1 D U/mL-גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז) (75 µL).
      2. להוסיף לתוך זה microsomes תערובת או טהור P450 רקומביננטי ב- Supersomes, אשר microsomes מבודדים מתאי חרקים transfected עם מבנה baculovirus המכיל cDNA של אנזימי P450 רקומביננטי, אנזימי P450 pmol 50 50 µL microsomal או supersomal ההכנות - הכבד שברים microsomal בודדו במעבדה או ממקור מסחרי.
      3. להוסיף 1 מ ג עגל התימוס DNA (0.3 מ"ל של פתרון מניות - 3.3 מ"ג/מ"ל מים מזוקקים), וללחוץ על מטרף מערבולת עבור 5 s.
      4. לבסוף, להוסיף 7.5 µL 0.1 מ מ ellipticine בדיקת סמים מומס דימתיל סולפוקסיד ו 42.5 µL לגלידה להגיע אמצעי אחסון של דגירה תערובת של 0.75 מ ל. כימיקלים לשימוש עם 3H תוויות או 14C או כימיקלים unlabelled, בהתאם לנוהל לצורך זיהוי ה-DNA adducts.
      5. לנער על מטרף מערבולת Incubate ס' 5 צינורות שנפתח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
      6. גם להכין שני incubations שליטה באופן דומה, אבל (i) ללא מערכת הפעלת (דוגמאות microsomal) או (ii) עם זה, אבל בלי המבחן מורכבות.
  2. Incubations של מבחן כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) עם ה-DNA בנוכחות מערכות אנזימטיות חותכות
    1. הכנת תערובות הדגירה המכיל, נפח סופי של 0.75 מ ב 4 ° C, תרכובות הבאים, מערכות אנזימטיות.
      1. ב 4 ° C, לערבב 100 מ מ טריס-HCl מאגר, pH 7.4, המכיל 0.2% Tween 20, (0.375 מ"ל), 10 מ מ תמיסת קופקטור של NQO1 חותכות האנזים (nadph ל) (75 µL), cytosolic שבר (הכבד cytosolic שברים - שבודדו במעבדה או שימוש של cytosolic שברים מבודד תורמים יחידים אנושיים שהם התקבלו מן המקור מסחרי המכיל 1 מ ג חלבון (50 µL)).
      2. להוסיף 1 מ ג עגל התימוס DNA (0.2 מ"ל של פתרון מניות - 3.3 מ"ג/מ"ל של מים מזוקקים), וללחוץ על מטרף עבור 5 s.
      3. לבסוף, להוסיף 7.5 µL 0.1 מ מ בדיקה כימית (מומס מים מזוקקים, מתנול, אתנול או דימתיל סולפוקסיד, המסיסות של המתחם בהתאם) ומים µL 42.5 מזוקקים להגיע נפח של 0.75 מ עבור התערובת הדגירה. כימיקלים לשימוש עם 3H תוויות או 14C או כימיקלים unlabelled, בהתאם לנוהל לצורך זיהוי ה-DNA adducts (ראו להלן).
      4. נקה את תערובת התגובה עם ארגון עבור 1 מינימלית להתווכח על מטרף עבור 5 ס Incubate צינורות סגורה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
      5. גם להכין שני incubations שליטה באופן דומה, אבל (i) ללא מערכת הפעלת (שברים cytosolic) או (ii) עם זה, אבל בלי כימיקלים הבדיקה.
  3. מיצוי של דגירה תערובות עם ממיסים אורגניים כדי להסיר את עודף של מבחן כימיקלים
    1. מערבבים את התערובת הדגירה במבחנה עם כובע עם נפח זהה אתיל אצטט (או דיאתיל אתר או הקסאן) על-ידי הוספת ממיסים אלה. לנער את התוכן של הצינור על מטרף עד טפסים אמולסיה.
    2. ספין (3 דקות) ב x 1,600 גרם ומפרידה בטמפרטורת החדר. אם השלבים ולא מימית אורגניים אינם מופרדים כראוי, ספין פעם נוספת עבור עוד נקודה או מהירות צנטריפוגה גבוהה יותר.
    3. הסר את השלב העליון, אורגני איסוף עם פיפטה. אם אמצעי אחסון קטן (< 400 µL) נמצאים בשימוש, לנצל פיפטה אוטומטי מצויד טיפ מתאים. הצדה שלב זה אורגני.
    4. חזור על שלבים 2.3.1., 2.3.2., ו- 2.3.3. להסיר שאריות ממיסים אורגניים על ידי זרם של גז חנקן (לפחות 5-10 דקות של הסרת נדרשים).
  4. בידוד של דנ א מ- incubations
    1. הפקת דנ א של פתרונות עם פנול/כלורופורם והמשקעים שלה עם אתנול
      1. לחסל את החלבונים כדי לבודד את ה-DNA של תערובות דגירה על-ידי חילוץ חלבונים פתרונות ה-DNA עם פנול, פנול/כלורופורם (1:1), חומר הרדמה על-ידי הפרוצדורה המוצגת להלן.
      2. משלבים את התערובת הדגירה עם אותה כמות של פנול או פנול/כלורופורם (1:1) בבז גלאים צינור עם כובע. מערבבים את התערובת עד טפסים אמולסיה.
      3. ספין (3 דקות) ב x 1,600 גרם ומפרידה בטמפרטורת החדר. אם השלבים ולא מימית אורגניים אינם מופרדים כראוי, ספין פעם נוספת לתקופה ארוכה יותר או מהירות צנטריפוגה גבוהה יותר.
      4. להעביר את השלב העליון מים עם פיפטה צינור פוליפרופילן. אם אמצעי אחסון קטן (< 400 µL) נמצאים בשימוש, לנצל pipet אוטומטית עם טיפ מתאים. הסר את ממשק חלבון יחד עם השלב אורגני.
      5. משלבים את השלב העליון מים עם אותה כמות של תערובת של פנול כלורופורם (1:1). לשחזר שלבים 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. משלבים את השלב העליון מים עם אותה כמות של כלורופורם, חזור על שלבים 2.4.1.2. -2.4.1.4. לשחזר את ה-DNA על ידי משקעים עם 2 כרכים של אתנול קר (-20 ° C). קבע את עוצמת הקול של פתרון ה-DNA.
      7. להתאים את הריכוז של קטיונים monovalent על ידי תוספת של 5 מ' נתרן כלורי לגמר ריכוזים של 0.1 מ ומערבבים נמרצות. לשלב עם 2 כרכים של אתנול קר (-20 ° C) ומערבבים היטב. מגניב ל-20מעלות צלזיוס.
      8. לאחסן ב-20 ° C עד ה-DNA הוא חולל. כאשר הדנ א פיצול קבצים במהלך incubations (למשל., על ידי היווצרות של רדיקלים במהלך התגובה הפעלת אנזימטי) או במהלך ההליך בידוד לגודל של DNA קטן (< 1 kb) או כאשר ה-DNA נמצא בכמויות קטנות (< 0.1 mg / מל '), תקופת צינון צריך להיות מוגברת, החום ירד ל-70 מעלות צלזיוס.
      9. ספין (10 דקות) ב x 1,600 גרם ב-0 מעלות צלזיוס ומפרידה. אם ה-DNA קיים בריכוזים נמוכים או בצורה של רסיסים קטנים, ספין פעם נוספת לתקופה ארוכה יותר (30 דקות). למחוק את תגובת שיקוע.
      10. כדי להסיר כל מומסים בגבול (או שאריות עקבות של הבדיקה הכימית) אשר עשויים להופיע ב- DNA זירז, לשטוף DNA עם 70% אתנול וביו -דיאתיל אתר. שטיפת זירז את הדנ א קר (-20 ° C) 70% אתנול. ספין (10 דקות) ב x 1,600 גרם ב-0 מעלות צלזיוס ומפרידה. למחוק את תגובת שיקוע.
      11. חזור על השלב 2.4.1.10. שטיפת זירז את הדנ א קר (-20 ° C) 70% אתנול. ספין (10 דקות) ב x 1,600 גרם ב-0 מעלות צלזיוס ומפרידה. למחוק את תגובת שיקוע.
      12. חזור על השלב 2.4.1.10. להביא את הצינור למצב אנכי על נייר סופג כדי להסיר את תגובת שיקוע שיורית. רחץ בגדר ה-DNA על-ידי הוספת 1 מ"ל של דיאתיל אתר להשליך שאריות פוטנציאל כימי מ- DNA מבודדות הבדיקה. ספין (10 דקות) ב x 1,600 גרם ב-0 מעלות צלזיוס ומפרידה. למחוק את תגובת שיקוע.
      13. להמיס בגדר DNA באמצעי האחסון המתאים (בדרך כלל ב- 100-400 µL כדי להשיג את ריכוז הדנ א של 0.5 - 1 µg/µL) של מים מזוקקים (או כלוריד נתרן סודיום ציטרט ו- 1.5 מ מ 0.15 מ מ). הפתרון דנ א יכול לעמוד ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או יכול להיות מחומם עד 37 מעלות צלזיוס למשך 10-30 דקות להגדיל את המסת ה-DNA.
      14. לפני האחסון להפריד את ה-DNA לתוך aliquots קטנים (10-20 µL), כי חזר על הקפאה והפשרה של פתרונות ה-DNA עשוי לגרום לירידה adduct ריכוזים. לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס או כבדח.
        הערה: נחישות Spectrophotometric של ה-DNA: השיטה פשוטים ומדויקים, אשר נמצא בשימוש נפוץ כדי למדוד את כמות ה-DNA בהכנה אם המדגם הוא טהור (כלומר, בלי כמויות משמעותיות של מזהמים כגון חלבון, פנול או השני חומצות גרעין), spectrophotometric מדידה של כמות ה-DNA של UV הקרנה נספג על ידי בסיסי (ראה את ההליכים שתוארה לעיל)28.
  5. הליכים לצורך זיהוי ה-DNA adduct צורה
    1. 32 P-postlabeling assay
      הערה: ה-DNA הידרוליזה מנצל את hydrolysate מוכן בשלב זה עבור הניתוח של adducts (2.5.1.), כמו גם של deoxynucleotides (שלא שונתה) נורמלי (2.5.7.).
      1. להתמוסס נוקלאז micrococcal (MN) במים-ריכוז של ~ 450 יחידות (U) / mL. Dialyze נגד מים מזוקקים ולהתאים את 300 U/mL. Dialyze טחול phosphodiesterase (SPD) פתרון ולהתאים את 4 U/mL.
      2. מערבבים MN ו SPD הסופי ריכוזים 150 מו/µL MN ו 2.5 מו/µL SPD (MN/SPD פתרון). פתרון ה-DNA המכיל 12.5 µg, ואין להתאדות ליובש ב המאייד. מתמוססים במים מזוקקים µL 6.5.
      3. הוספת פתרון MN/SPD µL 5.0 (הריכוז הסופי של MN מו 60/µL, הריכוז הסופי של SPD מו 1/µL), ומאגר 1.0 µL עיכול (הריכוז הסופי של נתרן succinate הוא 20 מ מ, הריכוז הסופי של CaCl2 הוא 8 מ מ). הנפח הסופי של התערובת הוא µL 12.5. מיקס ולאפשר תגובות עבור 3 h-37 מעלות צלזיוס.
      4. להסיר µL 2.5 (העברת צינור אחר) דילול נוסף וניתוח של deoxynucleotides שלא שונתה (2.5.7.)
    2. נוקלאז P1 העשרת שגרת
      1. כדי µL 10.0 הנותרים של hydrolysate, להוסיף 0.65 µL סודיום אצטט מאגר (הריכוז הסופי, 40 מ מ), 0.65 µL ZnCl2 פתרון (הריכוז הסופי 0.1 מ מ), 1.25 פתרון NP1 µL (ריכוז סופי, µg 0.385/µL), ו- 0.45 µL מים מזוקקים. הנפח הסופי של התערובת הוא 13 µL.
      2. לאפשר את התערובת להגיב למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולסיים את התגובה עם תוספת של 3 µL של פתרון טריס.
    3. n-Butanol העשרת שגרת
      1. כדי µL 10.0 הנותרים של ה-DNA hydrolysate, להוסיף µL 215 11.6 מ מ אמוניום formate פתרון, pH 3.5 ו 10 מ מ 25 µL יפורסם פתרון כלוריד. לחלץ עם 250 µL n-butanol (רווי מים) על ידי ערבוב נמרץ. ספין (3 דקות)-x 1,600 גרם כדי להפריד בין השכבות, ותוריד את העליון n-butanol שכבה. לחלץ עוד פעם עם 250 µL n-butanol (רווי מים), ספין, תוריד את העליון n-butanol שכבה, לשלב עם תמצית לשעבר.
      2. להוסיף מים µL 400 (רווי n-butanol) זה לחלץ, מערבבים היטב. ספין כדי להפריד בין שכבות ולמחוק את השכבה המימית למטה. חזור על הליך זה כביסה באמצעות 400 µL של מים (רווי n-butanol). להוסיף 3 µL של 250 מ מ פתרון טריס-HCl, pH 9.5, n-butanol שכבה. להתאדות n-butanol ליובש ב המאייד בטמפרטורת החדר.
      3. להמיס את השאריות µL 100 n-butanol, להתאדות שוב ליובש, להמיס את השאריות במים µL 16.0.
    4. תיוג של adducts
      1. להוסיף 1 µL של bicine בופר (תיוג מאגר) ו 4.5 µL של תערובת המכילה 100 µCi [γ -32P] ATP, pmol 45 של ATP קר, 10.0 U של T4-PNK (T4-phosphonucleotide קינאז) לפתרון µL 16.0 מ NP1 או butanol מיקס העשרה. ריכוזי ריאגנטים הסופי יהיה הבאות: bicine 20 מ מ, 10 מ מ MgCl2, 10 מ מ dithiotreitol, spermidine 0.5 מ מ ו- T4 0.5 U/µL-PNK, ATP מיקרומטר 3. הנפח הכולל של התערובת הוא 20 µL.
      2. לאפשר את התערובת להגיב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. להחיל את הדגימה כולו (כלומר. 20 µL) על צלחת פיי-תאית TLC (2.5.6.).
    5. הערכת יעילות של NP1 או n -butanol שיפור תהליכי
      1. לשטוף את החלק התחתון של הצינור במים µL 50. לערבב נמרצות במשך 30 s וספין (1דקות.) ב 1,600 x g ומפרידה להקים שם הוא ללא זיהום על המכסה. במקום 5 µL על צלחת פיי-תאית TLC (20 x 20 ס מ). כרומטוגרפיה באמצעות פתרון 280 ממ (NH4)2אז4 ו- 50 מ מ NaH2PO4, pH 6.8.
    6. TLC הפרדת adducted deoxynucleotides
      1. מראש לשטוף צלחות TLC עם מים מזוקקים. מומלץ במיוחד עבור לוחות תוצרת בית.
        הערה: שטיפה זו צריכה להתבצע כדי להסיר את הצבע הצהוב צלחות, צבע אשר יכול לרומם את הרקע, בעיקר בחזית הממס.
      2. ספוט המדגם כולו על צלחת פיי-תאית TLC ולהתחיל כרומטוגרפיה (2.5.4.); ניקוי adducts מבוצעת על ידי פיתוח את הצלחת בכיוונים D1 ו- D2 (איור 2).
      3. לפתח את הצלחת בכיוון D1 (איור 2). שימוש 1.7 M סודיום פוספט מאגר, pH 6.8, כדי להבטיח כי ה-DNA adducts הם שנותרו בתחילתו של צלחת TLC. באנלוגיה, לפתח את הצלחת בכיוון D2 באמצעות מאגר זה. למידע על מאגרי אפשרי עבור שגרות, הצגת פתרונות המתוארות עבור רזולוציה של מספר סוגים של adducts20,28.
        הערה: פיתוח של הצלחת בכיוון D2 יכול להיות מושמט.
      4. לשטוף את הצלחת במים יונים לאחר כרומטוגרפים בערך 5 דקות בשתי אמבטיות רצופים. לאחר מכן, לייבש את הצלחות.
      5. פיתוח הלוחות בכיוון D3, D4 באמצעות 3.5 מ' ליתיום formate מאגר, pH 3.5, המכילה אוריאה 8.5 מ' לכיוון D3 ו 0.5 מ' טריס-HCl מאגר, pH 8.0, המכילה אוריאה LiCl ו- 8.5 מ' 0.8 מ' לכיוון D4 (איור 2). ממיסים התוקף שתישמר לפתח את הנקודות adduct יניף TLC. למידע על מאגרים אפשרי עבור שגרות המתפתח D3 ו- D4, ראה את הפתרונות המתוארים עבור רזולוציה של מספר סוגים של adducts23,24,25,28.
      6. כדי למנוע בעיות ב- D4, לאחר פיתוח כיוון D4, שטיפה במים, לפתח את הצלחות (לאורך D4) ב- 1.7 M סודיום פוספט, pH 6.0 (בדרך כלל מוקצית כמו התפתחות לכיוון D5), לחלק העליון של הפתיל נייר (12 x 11.5 ס מ).
        הערה: כיוון D5 יכול גם להיות מושמט. במקרה זה, יש צורך לפתוח את המיכל TLC כאשר הממס הגיע לראש TLC, ולאפשר לברוח עד 60 דקות. שיטה זו היא אפילו טוב יותר מאשר הוספת פתיל (שיטת הנפוצות בשימוש מעבדות רבות כדי למחוק את כל בעיות ב- D4).
    7. כימות של deoxynucleotides (שלא שונתה) נורמלי לאחר הידרוליזה
      1. לדלל את aliquot של hydrolysate (מ 2.5.1. המתארת את הדנ א הידרוליזה) עם מים מזוקקים, (כלומר., 2.5 µL של תערובת העיכול מן 2.5.1. להתאים ל- 250 µL, µL 10 של פתרון זה יש להתאים ל- 150 µL).
      2. קח µL 5 (10 pmol רגיל deoxynucleotides) aliquot של תקציר זה, להוסיף 2.5 µL 10 מ מ טריס-HCl מאגר pH 9.0, תווית כמו 2.5.4. (נפח התערובת הסופית היא 10 µL). אפשר להגיב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. קח את µL 4 aliquot של התערובת, לדלל כדי 750 µL עם 10 מ מ טריס-HCl, pH 9.0. מיקס ולהקים ספין שאין חשש לזיהום של המכסה. החל 5 µL על צלחת TLC פיי-תאית. לפתח את הצלחת TLC בפתרון של 280 מ מ (NH4)2אז4 ו- 50 מ מ NaH2PO4, pH 6.5. אפשר להתייבש אחרי TLC.
      4. השתמש autoradiography שמתבצע במשך כ 45 דקות בטמפרטורת הסביבה כדי להתאים לשפה deoxynucleotide שלא שונתה ארבע bis-פוספטים. חותכים ספוט על כימות נדיפים או Cerenkov לספור.
    8. חישוב היחסית adduct תיוג (RAL)
      1. לקבוע את הערכים של הסעיפים על המקומות adduct וספירות ב aliquot של שכותרתו יאומתו deoxynucleotides (רגילה).
        הערה: האחרון חייב להיקבע באשמות 180,000 פחות חומר מאשר לשעבר, דמות אשר הוא הגורם ההמרה להחיל על הרוזן deoxynucleotides (רגילה) שלא שונתה להערכת הערכים RAL של רמות adduct. RAL של DNA adducts מחושבים לפי המשוואה (2) המוצג לעיל.
    9. זיהוי של איגוד של בדיקת חומרים מסרטנים או סמים ל- DNA באמצעות סמים רדיואקטיבי שכותרתו
      1. להעריך את 3H או 14ג רדיואקטיביות של דנ א שונה עם כימיקלים על-ידי גזים לספור.
      2. להוסיף 10-50 µL של פתרון ה-DNA 3 מ"ל של פתרון נצנוץ בבקבוקון נצנוץ. מערבבים היטב. למדוד את הרדיואקטיביות באמצעות הדלפק נצנוץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקולים המתוארים כאן על הניצול של הפעלת מזורז-אנזים (קרי, P450, peroxidase, רדוקטאז) לחקור את העוצמה של כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) כדי להיות מטבוליזם כדי intermediates וכתוצאה מכך קוולנטיות שלהם איגוד ה-DNA (דור של דנ א adducts), היינו מסוגלים לפתור (i) מנגנון של פעילות פרמקולוגית ellipticine הסוכן נגד סרטן (עבור סקירה ראה,29,30,31), (ii) האטיולוגיה של שניים nephropathies הקשורים לסרטן בדרכי urothelial העליונה הנגרמת על ידי הצמח אלקלואיד aristolochic חומצה (כלייתית חומצה Aristolochic, הבלקן כלייתית אנדמיים) (עבור ראה סקירה,32,33,34, 35,36,37,38,39), ו- (iii) genotoxic מנגנונים של carcinogenicity של מספר חומרים מסרטנים כמו מזהמי אוויר 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 והקובץ המקביל חותכות, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 47, ,48 לשתול אלקלואיד aristolochic חומצה,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 ו- o- anisidine אמין ארומטי. 49 , 50 , 51 , 52 . נוסף, האנזימים לקביעת השפעות ביולוגיות של כימיקלים אלה היו נחושים העסקת השיטות המתואר.

כאן, נציג תוצאות על ההפעלה חמצוני של ellipticine מאת P450s, peroxidases וכתוצאה מכך דור של קשרי ערכיות adducts עם ה-DNA, ועל ירידה של 3-NBA כדי מטבוליטים covalently שינוי ה-DNA, מוצגים.

Ellipticine אלקלואיד הצמח (5,11-דימתיל-6H- pyrido [4,3 -b] carbazole) ונגזרותיו הם סוכנים antitumor, אשר לשמש תרופות מזיקות-DNA באמצעות כמה מנגנונים, כלול בתוך מעצרו של מחזור התא, אינדוקציה של אפופטוזיס (לקבלת סקירה, ראה29,30,31). באמצעות פרוטוקולים המתואר בעבודה זו, הפגנו כי התרופה נגד סרטן יוצר DNA קוולנטיות adducts לאחר מטבולית bioactivation על ידי microsomal P450s (איור 3), peroxidases (איור 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61, וזה הסביר את היעילות חזקה של סוכן זה נגד סרטן תאים30. [3H]-radiolabeled ellipticine וגירסת 32P-postlabeling טכניקה נוקלאז P1 נוצלו בעיקר ב מחקרים29,30,31,53 ,61. באמצעות המחקר מורכבים עם מערכות אנזימים subcellular, אנזימים טהור בניסויים ניצול הפרוטוקולים שתואר השולט אנזימי P450 ellipticine חמצון למינים תגובתי ויוצרים DNA adducts, מבנים של מעכבי אנזימים המינים תגובתי הללו היו מאופיין29,30,31,55. P450s בחן, האנזים CYP3A4 האנושי הוא היעיל ביותר מבחינה ellipticine 12-hydroxyellipticine של 13-hydroxyellipticine, מטבוליטים ellipticine, אשר באופן ספונטני לפרק ellipticine-12-ylium, ellipticine-13-ylium כריכת ל- DNA (איור 5). 55 , 61 CYP אנזימים גם ליצור מטבוליטים נוספות כגון 9-hydroxyellipticine, אשר נחשב דטוקסיפיקציה מטבוליט, 7-hydroxyellipticine ו- ellipticine N2-תחמוצת, אשר נוצרות כמו הקטין ellipticine מטבוליטים. 9-hydroxyellipticine וכן 7-hydroxyellipticine ו- ellipticine N2-תחמוצת נוצרות בעיקר על-ידי CYP1A1 CYP2D6, בהתאמה. 55 , 57 , 58

Peroxidases (כלומר, חזרת peroxidase (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) ו cyclooxygenases (קוקס-1 ו- COX-2)) לעכל ellipticine כדי להפיק את אותו הדבר נגזר ellipticine דנ א adducts (איור 4)61 על ידי המנגנון המוצג באיור5.

Nitroaromatic 3-באן (3-ניטרו-7H-בנץדהanthracen-7-אחד) הוא רכיב של דיזל הפליטה, מצוי חלקיקים באוויר-62,-63,-64. מטבוליט מרכזי של64,3-ABA,65 זה מזהם, זוהה בשתן של פועלי מכרות המלח שנחשפו כדי פליטת דיזל עבור זמן63. ממצא זה הוכיח כי עובדים אלו נחשפו 3-NBA. Nitroaromatic זה גורם גידולים ריאות אצל חולדות לאחר החדרה intratracheal67. 3-NBA גם משמש מוטגן במבחן איימס סלמונלה typhimurium (בזן YG1024 overexpressing nitroreductase ו- O- acetyltransferase), לייצר יותר מ-6 מיליון revertants לכל nanomole ב זה זן62. מחריפותו genotoxic הודגם גם על ידי דור של קשרי ערכיות adducts עם ה-DNA בתוך חוץ גופית, לאחר ההפעלה על-ידי מספר אנזימים, באמצעות פרוטוקולים המתוארת בעלון זה עבודה, אין ויוו באיברים מספר של חיות מכרסמים (איור 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68.

הדנ א 3 ב- NBA-נגזר adducts נוצר לאחר הפעלת 3-NBA עם cytosolic reductases (קרי NQO1) נמדדו על ידי נוקלאז P1 ו n-butanol שיטות העשרה של 32P-postlabeling בשיטה המתוארת ב הפרוטוקולים הציגה מחקר זה. התוצאות הצביעו על היווצרות של DNA עד חמישה adducts (adduct מקומות 1-5 איור7), שלושה מהם היו מאופיין ל-2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; adduct במקום 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; adduct מקום 3) ו- N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; adduct נקודות 4. ו- 5) (איור 7 , איור 8). ניצול נוקלאז P1 גירסת 32בשיטת P-postlabeling, די. ג'י-C8 -N-ABA (adduct נקודות 4 ו-5) היה לא לגילוי (איור 7 , איור 8). קווים תחתונים תוצאה זו להתרחש כמה מגבלות של גירסה זו של 32P-postlabeling, כלומר, זיהוי נמוכה (אם בכלל) deoxynucleotides adducted כי הם dephosphorylated על ידי נוקלאז P1 (קרי, adducts נוצר במהלך חמצון של arylamines או על ידי הפחתת ארומטי nitroderivatives ל N- hydroxyarylamine-נגזרים שהוחלפו-C8 של deoxyguanosine). בדומה ללימוד עם ellipticine, ניצול המחקר מורכבים עם מערכות אנזימים subcellular, מעכבי אנזימים, אנזימים טהור ו DNA adduct תקנים בניסויים העסקת הפרוטוקולים המתואר בעבודה זו, השולט cytosolic הפחתת אנזימים חילוף חומרים 3-NBA כדי מטבוליטים ביצירת DNA adducts, כלומר, את תגובתי מטבוליט הנוצרת על-ידי הפחתת 3-NBA (N-OH-ABA), של מבנה ה-DNA שלושה adducts שנוצר על ידי 3-NBA היה מאופיין (איור 7 ו איור 8). בכבד, bioactivation של 3-NBA במבחנה נמצא בעיקר המיוחס אנושי, עכברוש NQO1 (איור 7), ואילו האדם N,O- acetyltransferases (Nat), NAT2, NAT1, sulfotransferase (הים), SULT1A1 ו, ל פחותה, SULT1A2 הם אנזימים הדומיננטית של שלב II. מפעיל 3-NBA42. הכבד POR microsomal יעיל גם בהפעלת 3-NBA41, אבל בעכברים, 3-NBA בעיקר bioactivated על-ידי NQO1 במקום הזה POR microsomal42. בריאה, המהווה רקמת המטרה עבור 3-NBA carcinogenicity67, NQO1 והן הקמב ץ להפחית 3-NBA כדי מטבוליטים שביצירת DNA adducts. עם זאת, הקמב ץ נראה לשמש אנזים מינור של הפעלת 3-NBA זה איבר69.

Figure 1
איור 1: ערכה של 32P-postlabeling וזמינותו. מדרגות בודדות בשיטת P-postlabeling 32ונהלים משופרת שלו מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תבנית של דנ א adduct • תנאי על צלחות TLC פיי-תאית. רב-כיווני כרומטוגרפיה של ה-DNA adducts על פיי-תאית צלחות מוצגים. מקור הוא עמדה להתחיל בצלחת TLC פיי-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: adducts 32P-postlabeling ניתוחים של ה-DNA נוצר ב- DNA התימוס עגל מודגרות עם ellipticine, nadph ל ו (א) עכברים microsomes הכבד האנושי (ב), (ג) פקד לטעום ללא microsomes. Adducts 1 ו- 2 שהוקצה על ידי החצים נוצרים ב- deoxyguanosine ב- DNA על-ידי ellipticine מופעל עם microsomes. 32 P-postlabeling בוצע העסקת את הגירסה נוקלאז P1 של השיטה (שלב 2.5.2.) מקורותיה ממוקמים בפינות השמאלית התחתונה (D3 מלמטה ועד למעלה D4 משמאל לימין). D2 הושמט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: 32P-postlabeling ניתוחים של DNA בתיווך ellipticine adducts. Adducts שהוקמה ב התימוס עגל דנ א הגיבו עם ellipticine (100 מיקרומטר), חזרת peroxidase (A), שור lactoperoxidase (B) myeloperoxidase אנושי (C), ovine cyclooxygenase-1 (ד), אנושי (cyclooxygenase-2 E) (5 µg peroxidases היו קיימות ב- incubations), מן הכבד הדנ א של חולדות שטופלו ellipticine 40 מ"ג לכל קילוגרם משקל גוף (bw) (F), מעגל התימוס דנ א הגיבו ellipticine של CYP3A4 אנושי (G), עם 13 - hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-אוקסיד (אני), ו- 12-hydroxyelipticine (J). הניסויים בוצעו באמצעות גירסת נוקלאז P1 וזמינותו (שלב 2.5.2.) המקורות הם בפינות השמאלית התחתונה (D3 מלמטה ועד למעלה D4 משמאל לימין). D2 הושמט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: חמצון של ellipticine על ידי peroxidases ו- CYPs מציג מטבוליטים ellipticine ואלה הציע להפיק DNA adducts. תרכובות בסוגריים אין עדיין היה זוהה בתנאים ניסיוני המשמשים את הניסויים, והם מטבוליטים electrophilic שמהווה דבר מחייב מינים האולטימטיבית ל- DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הפעלת מטבולית ודנ א adduct צורה על-ידי 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, oxidoreductase H:quinone NAD (P); נאט, N,O- acetyltransferases; הים, sulfotransferase; CYP, ציטוכרום P450; בבקשה, oxidoreductase nadph ל: ציטוכרום P450; HRP, חזרת peroxidase; . הההנפקה, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; קוקס-1, cyclooxygenase-1. R = - COCH3 או -אז3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; די. ג'י -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; די. ג'י-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: 32P-postlabeling ניתוחים של הדנ א 3 ב- NBA-נגזר adducts. נוקלאז P1-(משמאל פאנלים) ו- n-butanol החילוץ גירסאות (לוחות הנכון) של השיטה נוצלו. א ו- Ab, adducts עגל שהוקמה ב DNA התימוס הגיבו 3-NBA (300 מיקרומטר) לאחר ההפעלה עם עכברוש cytosols הכבד. B ו- Bb, adducts שהוקמה ב עגל התימוס ה-DNA, הגיבו 3-NBA (300 מיקרומטר) לאחר ההפעלה עם ציטוזול הכבד האנושי (שבר במאגר). C ו- Cb, adducts שהוקמה ב עגל התימוס ה-DNA, הגיבו 3-NBA (300 מיקרומטר) לאחר ההפעלה עם עכברוש טהור ולשננו NQO1 (יחידות 0.09). יח ו- Db, adducts שהוקמה ב עגל התימוס ה-DNA, הגיבו 3-NBA (30 מיקרומטר) לאחר ההפעלה עם האדם NQO1 רקומביננטי (0.06 יחידות). E ו- Eb, adducts סלמון שהוקמה ב testis DNA שטופלו N-OH-ABA. F ו- Fb, adducts הכבד שהוקמה ב- DNA של הארנבונים מאותה פראי-סוג על רקע C57BL/6 חשופים 2 מ"ג 3-NBA לכל ק ג b.w. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: 32P-postlabeling ניתוחים של הדנ א 3 ב- NBA-נגזר adduct תקנים [dG -N2-C2-ABA (א), דה -N6-C2-ABA (B) ודי. ג'י-C8 -N-ABA (ג)] (לוחות) ואת מבנה 3-NBA אלה 3-NBA-DNA adducts ( לוחות b). N-butanol גירסה החילוץ של השיטה היה מנוצל (לוחות ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בנייר זה, הוכח מתודולוגיה נרחב נגיש ללמוד את העוצמה של כימיקלים להיות bioactivated כדי intermediates מטבולית, וכתוצאה מכך הדור ה-DNA קוולנטיות adducts. זה הוא נושא קריטי, כי הערכה של עוצמת כימיקלים סביבתיים או סמים של הפעלת אנזימטי שלהם כדי מטבוליטים יצירת DNA קוולנטיות adducts הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. השינוי של ה-DNA על ידי חומרים מסרטנים נחשב הגורם התפתחות גידולים עכשיו נשפטת כמו הדוגמה המרכזית של carcinogenesis הנגרמת על ידי חומרים מסרטנים. הצעה זו אושר על ידי מגוון רחב של ממצאים, כגון התופעה זה: (i) מסרטנים המאפיינים של חומרים מסרטנים שונים תלויים bioactivation של תרכובות אלו כדי מטבוליטים מגיבים נוקלאופילי מרכזי ב- DNA; (ii) רמות ה-DNA adducts לעתים קרובות שיתאימו תגובות מסרטנים רבים; (iii), המוטציה מסוימים גנים משתיק קול של גידול, הפעלת מספר proto-oncogenes עלול להיגרם על ידי שינוי שלהם עם כימיקלים עם הלוחמים מסרטנים. יתר על כן, השינוי קוולנטיות של ה-DNA על ידי תרופות נגד סרטן הוכח כאחת היעילה תאוצה של תרופות אלו, כשהתוצאה היא השימוש בטיפול בסרטן.

ישנן שתי נקודות קריטיות, הקובעים את ההערכה מוצלחת של כימיקלים למאפייני genotoxic שלהם, כלומר את הלוחמים שלהם כדי ליצור קשרי ערכיות DNA adducts, במיוחד: (i) כדי למצוא, לפתור, ולאפיין את היעילות של אנזימטי מערכות מסוגל להפעיל מסרטנים/סמים מינים electrophilic איגוד המרכזים נוקלאופילית של DNA, ו (ii) לפתח, להשתמש בטכניקות המתאימים ביותר, שבו adducts מסרטן/סמים – DNA שנמצאו, מאופיין מבנית. השיטות המתאימות עבור ששתי התכונות שתוארו במחקר זה.

נוהלי בידוד לשברים התאית המכילה אנזימים ביואמסה (microsomal או cytosolic דגימות הפו P450s ו bioactivating נוספים אנזימים קרי peroxidases או reductases POR, NQO1, הקמב ץ ו AO), הפרוטוקולים עבור bioactivation של מבחן מסרטנים/סמים על ידי מערכות אנזימטיות (incubations עם ה-DNA), השימוש בהם המוצגת בעבודה זו הצביעו, כפי שמגלה את התוצאות נציג, להתאמתם עבור הערכה של מאפייני genotoxic של כימיקלים.

עוד, השיטות המתאימות זיהוי, כימות של adducts עם ה-DNA כגון שתי גרסאות העשרה של 32P-postlabeling הטכניקה (נוקלאז P1 - ו n -butanol מיצוי ההליכים) ושימוש radioactively-ידי תרכובות שנבדקו הוצגו הולם ללימודי הערכת genotoxicity של גורם מסרטן/סמים ואינטראקציות.

לגבי הקביעה של ה-DNA קוולנטיות adducts, לא רק שתי שיטות אלו, אלא גם בשיטות אחרות מתאימות זיהוי ומדידה של ה-DNA adducts היה הוקמה8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. עד 1981, כימות של ה-DNA adducts שימוש רדיואקטיבי כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות), הנקרא על-ידי 3H או 14ג, שהוכנו לאכסון. שיטות כאלה כבר נעזרו מועיל מחקרים עם ellipticine כפי שתואר בעבודה זו (ראה53,54). עם זאת, לרוב קשה להכין את המעו ף עם רדיואקטיביות גבוהה שלהם שימוש מוצלח73,80,81. לכן, אף-על-פי נוהל זה משמש עדיין, זה למרבה הצער מוגבל במבחנה ניסויים דומים לאלה המתוארים כאן. של טכניקות אחרות, ספקטרומטר מסה, אלקטרון לרסס יינון (ESI), לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון (MALDI), מאיץ ספקטרומטר מסה (AMS), פלורסצנטיות, שיטות ביולוגיות כמו מתכלה, 32 P-postlabeling המתוארים במחקר זה בפירוט, פותחו (ראו סקירה,8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

32P-postlabeling וזמינותו תיאר בפרוטוקול של עבודה זו מוצג, אשר תחולתה יש לא רק בניסויים במבחנה (ראה תוצאות נציג), כלומר, בדיקות תרכובות חדשות עבור genotoxicity או מכניסטית חקירות של הפעלת גורם מסרטן/סמים, אך יש גם utilizations נוספים כגון הערכת חשיפה סביבתית מסרטנים, מחקרים על מנגנוני התפתחות הגידול, ניטור תיקון ה-DNA, בדיקת ה-DNA נזק על ידי אנדוגני תרכובות תגובות חמצון ואני חוקרת את תגובתה של חולים ציטוטוקסיות נגד סרטן סמים72,83.

טכניקה זו אינה, עם זאת, ללא מגבלות מסוימות73. נגעים ב- DNA, אשר אינם יציבים כמו monodeoxynucleotides, לא ניתן לקבוע באופן אמין. 32P-postlabeling שיטה אינה מסוגלת לזהות את מבנה ה-DNA adduct. לכן, אפיון מבניים של ה-DNA adducts לעתים קרובות מסתמך על הוכחת שלהם כרומטוגרפיה שיתוף עם סטנדרטים סינתטי של מבנים ידועים. אכן, השיטה היה בשימוש בשתי דוגמאות לתוצאות נציג המוצגת בעבודה זו (ellipticine, 3-NBA).

לסיכום, הפרוטוקולים המוצגת בעבודה זו עשויים להיחשב כפעולות מתאימים כדי להעריך את העוצמה של כימיקלים סביבתיים או סמים כדי להיות enzymatically bioactivated כדי מטבוליטים יצירת DNA קוולנטיות adducts, תהליך חשוב מאוד עבור התפתחות של סרטן ושל הטיפול בה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הצ'כית (GACR, גרנט 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

ביוכימיה גיליון 133 סמים מסרטן bioactivation,ציטוכרום P450 reductases אן Adducts 32P-postlabeling
היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים <em>במבחנה</em> ונחישות שלהם על ידי <sup>32</sup>P-postlabeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stiborova, M. Formation of Covalent… More

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter