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Biochemistry

Formación de covalente ADN aductos carcinógenos activados enzimáticamente y fármacos In Vitro y su determinación por 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57177
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry, Charles University

Summary

Evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales y las drogas, ser enzimáticamente bioactivación intermedios generando covalente DNA aducciones, es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. Se describen los métodos para la activación de compuestos para formar que aductos de ADN, así como técnicas para su detección y cuantificación.

Abstract

Aductores de ADN covalente formado por sustancias químicas o fármacos con potencia carcinógena se juzgan como uno de los factores más importantes en la fase de iniciación de los procesos cancerígenos. Esta unión covalente, que se considera la causa de la tumorigénesis, ahora se evalúa como un dogma central de la carcinogénesis química. Aquí se describen los métodos que emplean las reacciones catalizadas por el citocromo P450 y las enzimas de biotransformación adicionales para investigar la potencia de productos químicos o drogas para su activación a metabolitos formando estos ADN aductos. Se presentan los procedimientos que describe el aislamiento de fracciones celulares que poseen enzimas de biotransformación (microsomales y citosólicas muestras con citocromos P450 u otras enzimas de biotransformación, es decir, peroxidasas, NADPH: citocromo P450 oxidorreductasa H:quinone oxidorreductasa de NAD (P) y xantina oxidasa). Además, se describen métodos que puede utilizar para la activación metabólica de las sustancias químicas analizadas por estas enzimas, así como aquellos para el aislamiento de ADN. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar ADN químicos/drogas-derivados de aductores, es decir, diferentes modificaciones de la técnica de P-postlabeling de 32y empleo de marcado radiactivo analizado productos químicos, son muestra en detalle.

Introduction

El metabolismo de xenobióticos (ambientales productos químicos o drogas) se produce en dos fases1. Fases I y II pretenden representar los compuestos originalmente hidrófobos (no soluble en agua) más hidrofílico (soluble en agua), por lo tanto haciéndolos fácilmente excretable por la orina, heces o sudor. Fase I (funcionalización) reacciones incluyen la oxidación, reducción, y la hidroxilación catalizada por enzimas como la citocromo P450s (P450s, APP), peroxidasas (es decir., ciclooxigenasa, COX), aldo-ceto reductasas (AKRs) y microsomal monooxigenasas que contienen flavina (consistente). Fase I también incluye reacciones de reducción, mediadas por una variedad de reductasas , microsomal NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citosólica oxidorreductasa H:quinone de NAD (P) (NQO1), xantina oxidasa (XO) y aldehído oxidasa (AO)1 . En la segunda fase (verbal), los grupos funcionales que se adjunta en fase se solía conjugar las moléculas polares pequeñas para aumentar más la polaridad. Ejemplos de enzimas consideradas para participar en la reacción de fase II incluyen Sulfotransferasas (resultados), N, O- acetiltransferasas (NATs), metiltransferasas como catecol -O- metiltransferasa (COMT), glutatión S- Transferasas (GSTs) y uridina difosfato glucuronosyltransferases (UGTs)1. La clasificación de las enzimas de fase I o II es, sin embargo, no rígidos, y algunas enzimas pueden agruparse sin duda en cualquier categoría.

Las enzimas P450 (EC 1.14.14.1) son la hemo que contiene las proteínas presentes en distintos organismos, que participan en la biotransformación de muchos productos químicos, catalizando su conversión3,4. Las enzimas P450 catalizan la hidroxilación de muchos sustratos, con una reacción donde un átomo de dioxígeno se introduce en la molécula de xenobióticos, mientras que el segundo átomo de oxígeno se reduce para formar agua por la reacción que requiere dos electrones [la ecuación (1 de3,)]4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Las enzimas P450 localizadas en la membrana del retículo endoplásmico de células de mamífero (sistemas de P450 microsomales) son miembros del sistema monooxigenasa multienzimáticos, que contiene más NADPH: citocromo P450 reductasa (POR) y citocromo b5 , el sustrato de la enzima denominada como NADH: citocromo b5 reductasa. Una teoría generalmente aceptada presume que el donante de los dos electrones necesarios para P450 es el sistema de la NADPH/POR. Sin embargo, citocromo b5 puede también actuar como donante de electrones de P450, es decir, como un donante del electrón reducción P450 durante la segunda reducción de su ciclo de reacción, donde actúa junto con NADH: citocromo b5 reductasa2,3,4.

Mamíferos utilizan varias enzimas P450 (por ejemplo, las enzimas de las familias 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 y 27) para la síntesis de valiosos compuestos endógenos, tales como esteroides y usarlos para el catabolismo de los productos naturales2,3 . Las otras enzimas de la mamíferas CYP, como humano CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 y 3A4, metabolizan sustancias químicas exógenas que se utilizan como drogas. 5 , 6 las más importantes enzimas catalizan el metabolismo de fármacos son App de la subfamilia 3A, especialmente CYP3A4. Las conversiones de los xenobióticos, como pro-carcinógenos y pro-sustancias tóxicas, son mediadas por humanos CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 y 3A42,5. La mayoría de estas App está presente en el hígado (excepto CYP1A1 y 1B1). Sin embargo, la APP se expresa también en varios órganos extrahepáticos. Tal P450s podría ser de gran importancia, principalmente cuando ellos participar en el metabolismo de la bioactivación de sustancias químicas (fármacos) intermedios reactivos en estos órganos7. Varios P450s son inducidas por varios compuestos que son sus sustratos, aunque esto no es necesariamente el caso.

Muchas enzimas P450 desempeñan un papel en la toxicidad de productos químicos (drogas). Pueden convertir los xenobióticos no sólo en sus metabolitos de desintoxicación, pero también activarlas a especies reactivas, que modificar macromoléculas endógenas que además exhiben diferentes propiedades biológicas, generalmente causando su toxicidad. ADN, lípidos y proteínas pueden ser los objetivos para su modificación por reactivos electrophiles y radicales generados a partir de productos químicos activados. En el caso de ADN, resolver varios genes importantes respuestas y sus mecanismos ya conocen a2,3,4,5.

Los cambios en el ADN pueden resultar en una disminución en el control del crecimiento celular, y este fenómeno es considerado como el factor predominante que lleva al desarrollo de procesos cancerígenos. La generación de covalente DNA aducciones con productos químicos que potencia carcinógena es juzgado como uno de los pasos más importantes en la fase de iniciación de cancerígenos procesos8,9,10,11. Se demostró que las relaciones entre la formación de ADN aductos y tumorogénesis ocurre, mientras que una disminución en la cantidad de ADN aductos es responsable de quimioprevención8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formación de carcinógeno/drogas-derivados de aductos de DNA depende de las bases individuales del ADN y es afectado por las secuencias de estas bases en el ADN. Aductores de las reparaciones de ADN depende de su ubicación (en el filamento de la DNA transcrito o no transcrito) y tipos de nucleótido modificado secuencias8,11,12,15, 16.

En este artículo, describen los procedimientos utilizando la conversión catalizada por la enzima de sustancias químicas (fármacos) para investigar su potencia para ser activado en metabolitos que modificado ADN (generar ADN aductos). Unión covalente del ADN, la sustancia de ensayo debe ser generalmente activado por reacciones oxidantes o reductoras, dependiendo de los fármacos individuales. Activación oxidativa o reductiva de químicos probados es mediado por un sistema enzimático dependiente de P450 presente en la fracción microsomal subcelular o por reducción con reductasas presentes tanto en microsomas (POR, NADH: citocromo b5 reductasa, enzimas P450) y en fracciones celulares citosólicas subcelulares (NQO1 XO, AO, peroxidasa). Metabolitos reactivos después de eso se unen al ADN formando ADN aductos. Porque las reacciones oxidativas y reductivas son importantes para activar varias drogas para estas especies reactivas, se describen los procedimientos experimentales empleando el sistema enzimático de oxidación/reducción. Además, los correspondientes métodos capaces de detectar y cuantificar estos ADN aductos se describen en detalle.

Dos procedimientos independientes para determinar si la sustancia activa sistemas enzimáticos, se enlaza al ADN se recomiendan: la técnica de P-postlabeling de 32y utilizando compuestos radiactivos marcados (por ej., 3H o 14 C). Para el primer piloto, investigación el ensayo P-postlabeling de 32se recomienda. La determinación del contenido de ADN en soluciones, evaluadas con precisión, debe preceder a ambos métodos.

32postlabeling P técnica utiliza la hidrólisis enzimática del ADN modificado por productos químicos no radiactivo (cancerígeno drogas) para 3´-phosphodeoxynucleosides, fosforilación adicional con fósforo radioactivo (32P) en el 5´- OH posición y la separación de Deoxinucleótidos químicos aductos de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal por cromatografía17 (figura 1). Modificados por el compuesto químico del ADN es hidrolizado por una mezcla de endonucleasa, nucleasa micrococcal y exonucleasa, conocida como la fosfodiesterasa del bazo. La mezcla de ADN hidrolizado que contiene ambos normal (sin modificar) y modificado desoxinucleósidos 3´-Unión es reaccionado con ATP [γ -32P] en presencia del portador (no radiactivo) ATP y T4 Polinucleótido cinasa de la a pH 9,5 a forma 5´- 323´ marcado con P, 5´-bifosfonatos (procedimiento "estándar" en la figura 1). El pH alcalino utilizado es capaz de reducir al mínimo la actividad enzimática de la cinasa T4 Polinucleótido al dephosphorylate desoxinucleósidos 3´-Unión en posición 3´. Separación y resolución de 32P etiquetados aductos de Deoxynucleótidos etiquetados por que no es modificado por los productos químicos se lleva a cabo por cromatografía en capa fina (TLC) intercambio multidireccional polietilamina (PEI) celulosa (figura 2 ). En los pasos de la primera y segunda elución (en dirección a D1 y D2), se eluyen Deoxynucleótidos por (no modificados) normal etiquetados como fosfato [32P] desde el inicio de la placa de TLC-PEI-celulosa utilizando soluciones de electrólitos en un pedazo corto de papel cromatográfico aplicado en la parte superior de la placa del TLC, mientras que el Deoxynucleótidos por que contienen químicos enlazados exhibiendo propiedades hidrofóbicas (carcinógeno/drogas-aductores) se mantienen en el inicio de la placa de celulosa PEI resolverse además con varios diversos sistemas solventes en D3 y D4 (figura 2). Localización de aductos se realiza mediante autorradiografía de pantalla mejorado; aductores de los separados son detectados como manchas oscuras reconocibles en las radiografías. Las áreas de puntos son suprimidas de la placa y utilizadas para cuantificar la radioactividad por centelleo líquido o conteo Cerenkov. Un fósforo de almacenamiento de información de método que se ha adaptado y cuantificar ADN aductos en cromatogramas detectados por 32ensayo P-postlabeling ahora también se utiliza. 18 máquina el Imager instantánea se utiliza con frecuencia para tal detección y cuantificación de ADN aductos. Este método proporciona más de 10 - veces mayor sensibilidad para detectar 32P que la técnica de pantalla había mejorado autorradiografía19.

Cantidades de ADN aductos son determinadas como valores de relativa aducción etiquetado (RAL), calculado utilizando la ecuación (2) como sigue:

CPM. en aducción Deoxynucleótidos por
RAL =---(2)
actividad específica de 32P-ATP (en cpm / pmol) Deoxynucleótidos por x pmol

Los valores de RALs son el cociente de tasas de conteo de Deoxynucleótidos aducidos por sobre las tasas de recuento del total [aducidos y normal (no modificados) Deoxynucleótidos por] Deoxynucleótidos por20,21. Sin embargo, este cálculo se basa en igual etiquetado eficiencias de aductos y normal Deoxynucleótidos por22. El procedimiento clásico ("estándar") de los 32P-postlabeling técnica es apropiado para varios ADN aductos (voluminosos y no voluminosos aductos), sin embargo, su sensibilidad no es satisfactoria detectar aductos encontradas bajas cantidades en el ADN. Mediante este procedimiento, la cantidad de un aducto en 10 Deoxynucleótidos por7 sin modificaciones en el ADN (0,3 fmol aducto/μg de DNA) es detectable.

Una variedad de modificaciones de este clásico 32procedimiento P-postlabeling se han utilizado para elevar la sensibilidad de la técnica. Hasta 10 a 100 veces mayor sensibilidad de la determinación de aductos por 32P de etiquetado se ha logrado utilizando limitando los niveles de ATP [γ -32P] (el procedimiento de intensificación). 23 , 24 otro procedimiento proporcionando que un aumento en la sensibilidad del método de P-postlabeling de 32utiliza una incubación de digeridos ADN conteniendo aductos con nucleasa P1 (de Penicillium citrinum)21 (figura 1). Esta enzima prefiere al dephosphorylate desoxinucleósidos sin modificar 3´-Unión, mientras que el Deoxynucleótidos por químicos enlazados (aducidos nucleótidos) son esencialmente no los sustratos de esta enzima. Por lo tanto, desfosforilatado desoxinucleósidos 3´-Unión (es decir, Desoxirribonucleosidos) no es fosforiladas por la cinasa T4 Polinucleótido de fosfato [32P] de γ -32P] ATP. Sin embargo, algunos de los nucleótidos que son productos químicos límite (Deoxynucleótidos aducidos por), como aductos arilamina sustituido en C8 de desoxiguanosina, puede bedephosphorylated por esta enzima. En contraste, la mayoría otros aductos (p. ej., aductos sustituido en N2 de desoxiguanosina) no son defosforilaciones por nucleasa P1. Esta modificación de 32postlabeling P hace este método mucho más sensible, aumentando su sensibilidad por más de tres órdenes de magnitud. Además, esta versión de 32P-postlabeling ofrece un método donde mayores cantidades de ADN (5-10 μg) y un exceso de portador-libre [γ - 32P] ATP puede utilizarse.

Otro método para enriquecer los aductos, descrito por Gupta25, utiliza el fisicoquímicas propiedades de Deoxinucleótidos voluminosos aductores, que pueden extraerse en n-butanol en presencia de un Tetrabutilamonio de agente de transferencia de fase cloruro (TBA) (figura 1) antes de [32P] etiquetado de fosfato, mientras que sin modificar Deoxynucleótidos por mal son extraídos por este solvente orgánico. Sin embargo, aductos menos hidrofóbicos, que consiste en por ejemplo de Deoxynucleótidos por modificado con grupos voluminosos no aromáticos o alkyl pequeños residuos, no son efectivamente extraído con n-butanol. Por lo tanto, son esencialmente indetectables cuando son analizadas por esta modificación de 32método P-postlabeling.

Las anteriores versiones de 32postlabeling P aumento de la sensibilidad y la cuantificación de ADN aductos enormemente (hasta tres órdenes de magnitud), siendo capaz de detectar una aducción por9,1010 normal nucleótidos (0.3 - 3 amol/μg de DNA). Estos dos métodos se recomiendan para las pruebas de los productos químicos para su eficacia que se unen covalentemente al ADN y, por lo tanto, se describen en este trabajo en los detalles.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las normas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (311/1997, Ministerio de agricultura, República Checa), que está en conformidad con la declaración de Helsinki.

1. aislamiento de fracciones Microsomal y citosólicas hepáticas

  1. Preparar el hígado fracciones subcelulares (microsomas ricos en enzimas P450 o cytosols ricos en reductasas o peroxidasas solubles) de ratas por simple centrifugación diferencial (105.000 x g).
    Nota: El pellet y sobrenadante se toman como microsomas y cytosols, respectivamente.
    1. Lavar las muestras de hígado (1-10 g) dos veces con tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, que contiene 150 mM buffer KCl (buffer 1) (volúmenes mayores de 10 veces que el peso del tejido, es decir, 10-100 mL) y cortar el tejido en trozos pequeños (de tamaño 2 x 2 mm).
    2. Homogeneizar los tejidos en presencia de este buffer (> 3 mL/g de peso/volumen) en homogeneizador a 4 ° C por 5 min y descarte las piezas no homogeneizada residual del tejido por filtración utilizando papel de filtro. Centrifugar el homogeneizado a 600 x g por 10 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a otro tubo de centrifugación.
    3. Volver a homogeneizar el pellet en buffer 1 (1 mL por cada 1 g de tejido), repita el paso 1.1.3. y descartar el precipitado. Centrifugue los sobrenadantes a 15.000 x g por 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a otro tubo de centrifugación.
    4. Centrifugar el sobrenadante a 105.000 x g durante 60 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante (citosol) y almacenar en alícuotas (1-10 mL) a-80 ° C. Caracterizar el citosol por la cantidad de proteína utilizando el método descrito por Bradford26.
    5. Resuspenda el precipitado en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.4 (> 2 mL/g de peso/volumen), centrifugar a 105.000 x g durante 60 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Volver a homogeneizar el sedimento (microsomas) en tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, que contiene 150 mM KCl y 20% de glicerol (< 5 peso volumen mL/g) en homogeneizador a 4 ° C. Almacenar los microsomas en alícuotas de 1 mL 0,5 - a-80 ° C. Se caracteriza por los microsomas del contenido de proteínas utilizando el método descrito por Bradford26.
    6. Determinar la concentración de citocromo P450 en los microsomas.
      Nota: La concentración de enzimas P450 en los microsomas se mide según lo descrito por Omura y Sato27, determinación de la absorción del complejo P450 reducción con monóxido de carbono (CO). Monóxido de carbono es un compuesto tóxico y debe ser manejado con cuidado y en una campana.

2. incubaciones de Test químicos (cancerígenos, drogas) con ADN en presencia de sistemas enzimáticos

  1. Incubación de la prueba de productos químicos (cancerígenos, drogas) con el ADN en presencia de sistemas enzimáticos oxidativos que contiene citocromos P450
    1. Preparar mezclas de incubación que contenga, en un volumen final de 0,75 mL a 4 ° C, los siguientes compuestos y sistemas enzimáticos.
      1. Mezcla de 100 mM de tampón fosfato, pH 7,4, (0,375 mL) con sistema de generación de NADPH (10 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa 6-fosfato, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glucosa 6-fosfato deshidrogenasa) o 10 mM NADPH (75 μL).
      2. Agregar en los microsomas de esta mezcla o puro recombinante P450 en Supersomes, que son los microsomas aislados de células de los insectos transfected con una construcción de baculovirus que contiene el cDNA de recombinante P450 enzimas, 50 pmol P450 enzimas en 50 μl microsomal o supersomal preparaciones - fracciones microsomales hepáticas aisladas en el laboratorio o de una fuente comercial.
      3. Añadir DNA de timo de becerro 1 mg (0,3 mL de solución stock - 3,3 mg/mL en agua destilada) y agitar en un agitador vortex durante 5 s.
      4. Por último, agregar 7.5 drogas de ellipticine de prueba μl 0,1 mM disuelto en DMSO y 42,5 μL agua destilación para alcanzar un volumen de la mezcla de incubación de 0,75 mL. Utiliza los productos químicos marcados con 3H o 14C o químicos sin etiquetar, dependiendo del procedimiento para la detección de ADN aductos.
      5. Agitar en un agitador vortex durante 5 s. Incubar en abierto tubos a 37 ° C durante 30-60 minutos.
      6. También prepara dos incubaciones de control similar, pero (i) sin un sistema de activación (microsomales muestras) o (ii) con él, pero sin la sustancia de ensayo.
  2. Incubaciones de prueba de productos químicos (cancerígenos, drogas) con el ADN en presencia reductoras sistemas enzimáticos
    1. Preparar mezclas de incubación que contenga, en un volumen final de 0,75 mL a 4 ° C, los siguientes compuestos y sistemas enzimáticos.
      1. De la mezcla a 4 ° C, 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, que contiene 0.2% Tween 20, (0,375 mL), solución 10 mM de cofactor de la enzima reductora NQO1 (NADPH) (75 μL), fracción citosólica (fracciones citosólicas hepáticas - aislados en el laboratorio o en caso de utilizar las citosólicas fracciones aisladas de donantes humanos individuales que se obtuvieron de la fuente comercial que contenga 1 mg de proteína (50 μL)).
      2. Añadir DNA de timo de becerro 1 mg (0,2 mL de solución stock - 3,3 mg/mL de agua destilada) y agitar en un agitador durante 5 s.
      3. Por último, añadir 7,5 μl 0,1 mM de sustancia (disuelto en agua destilada y metanol, etanol, DMSO, dependiendo de la solubilidad del compuesto) y 42.5 μL agua destilada agua para alcanzar un volumen de 0,75 mL de la mezcla de incubación. Etiquetado de productos químicos de uso con 3H o 14C o químicos sin etiquetar, dependiendo del procedimiento para la detección de ADN aductos (véase abajo).
      4. Purgar la mezcla de reacción con argón durante 1 minuto agitar en un agitador durante 5 s. Incubar en tubos cerrados a 37 ° C durante 30-60 minutos.
      5. También prepara dos incubaciones de control similar, pero (i) sin un sistema de activación (fracciones citosólicas) o (ii) con él, pero sin productos químicos de la prueba.
  3. Extracción de mezclas de incubación con disolventes orgánicos para eliminar el exceso de sustancias de ensayo
    1. Mezclar la mezcla de incubación en un tubo de ensayo con una tapa con el mismo volumen de acetato de etilo (éter dietílico o hexano) mediante la adición de estos solventes. Agite el contenido del tubo en una coctelera hasta la forma de una emulsión.
    2. Spin (3 min) 1.600 x g en una centrífuga a temperatura ambiente. Si las fases orgánicas y acuosas no son separados adecuadamente, una vez más por un largo período o a una centrifugación mayor velocidad de centrifugado.
    3. Eliminar la fase orgánica superior, recoger con una pipeta. Si pequeños volúmenes (< 400 μL) son utilizados, utilizar una pipeta automática equipada con una punta adecuada. Dejado de lado esta fase orgánica.
    4. Repita los pasos 2.3.1., 2.3.2. y 2.3.3. Eliminar solventes orgánicos residuales por una corriente de gas nitrógeno (se necesitan al menos 5-10 min de extracción).
  4. Aislamiento de ADN de incubaciones
    1. Extracción de ADN de soluciones con fenol/cloroformo y su precipitación con etanol
      1. Eliminar proteínas para aislar ADN de mezclas de incubación mediante la extracción de proteínas de soluciones de ADN con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y cloroformo, por el procedimiento que se muestra a continuación.
      2. Combinar la mezcla de incubación con la misma cantidad de fenol o fenol/cloroformo (1:1) en un Falcon o tubo Eppendorf con tapa. Revolver la mezcla hasta la forma de una emulsión.
      3. Spin (3 min) 1.600 x g en una centrífuga a temperatura ambiente. Si no se separan correctamente las fases orgánicas y acuosas, girar una vez más durante un período prolongado o a mayor velocidad de centrifugación.
      4. Transferir la fase superior de agua con una pipeta a un nuevo tubo de polipropileno. Si pequeños volúmenes (< 400 μL) son utilizados, utilizar una pipeta automática equipada con una punta adecuada. Eliminar la interfaz de proteína junto con la fase orgánica.
      5. Combinar la fase de agua superior con la misma cantidad de una mezcla de fenol y cloroformo (1:1). Reproducir pasos 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Combinar la fase de agua superior con la misma cantidad de cloroformo y repita los pasos 2.4.1.2. -2.4.1.4. El ADN se recuperan por precipitación con 2 volúmenes de etanol frío (-20 ° C). Determinar el volumen de la solución de ADN.
      7. Adaptar la concentración de cationes monovalentes por adición de cloruro de sodio de 5 M para el final las concentraciones de 0,1 M. agitar vigorosamente. Combinar con 2 volúmenes de etanol frío (-20 ° C) y mezclar bien. Frío a-20° C.
      8. Almacenar a-20 ° C hasta que se precipita el ADN. Cuando el ADN está fragmentado durante las incubaciones (e.g., por la formación de radicales de oxígeno durante la reacción de activación enzimática) o durante el procedimiento de aislamiento para el tamaño del ADN que es pequeño (< 1 kb) o cuando el ADN está presente en pequeñas cantidades (< 0.1 mg / mL), el tiempo de enfriamiento tiene que ser aumentada y disminución de la temperatura a-70 ° C.
      9. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Si el ADN está presente en concentraciones bajas o en forma de pequeños fragmentos, girar una vez más durante un período prolongado (30 min). Deseche el sobrenadante.
      10. Para quitar cualquier solutos (o residuos de la sustancia de ensayo) que podría estar presente en el ADN precipitado, lavar el ADN con etanol al 70% y éter dietílico. Lavado de precipitados ADN con frío (-20 ° C) etanol al 70%. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      11. Repita el paso 2.4.1.10. Lavado de precipitados ADN con frío (-20 ° C) etanol al 70%. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      12. Repita el paso 2.4.1.10. Poner el tubo en forma vertical sobre un papel absorbente para eliminar el sobrenadante residual. Lavar el pellet de DNA mediante la adición de 1 mL de éter dietílico para desechar los residuos potenciales de la prueba química del ADN aislado. Spin (10 min) a 1.600 x g a 0 ° C en una centrifugadora. Deseche el sobrenadante.
      13. Disolver el precipitado de DNA en el volumen adecuado (generalmente en 100-400 μL para alcanzar una concentración de ADN de 0.5 - 1 μg/μl) de agua destilada (o en cloruro de sodio citrato de sodio y 1,5 mM 0,15 mM). La solución de ADN puede colocar a 4 ° C durante la noche, o puede ser calentada a 37 ° C durante 10-30 minutos aumentar la disolución de ADN.
      14. Antes de almacenaje, separar el DNA en pequeñas alícuotas (10-20 μl), porque la repetida congelación y descongelación de soluciones de ADN podría resultado en una disminución de la aducción las concentraciones. Conservar a-80 ° C o más frío.
        Nota: Determinación espectrofotométrica de ADN: el método simple y exacto, que es ampliamente utilizado para medir la cantidad de ADN en una preparación si la muestra es pura (es decir, sin cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol u otros los ácidos nucleicos), es la medición espectrofotométrica de la cantidad de ADN de UV irradiación absorbida por las bases (consulte los procedimientos descritos previamente)28.
  5. Procedimientos para la detección de ADN aducción formación
    1. 32 Análisis P-postlabeling
      Nota: Utiliza la hidrólisis del ADN hidrolizado preparado en esta etapa para el análisis de aductos (2.5.1.), así como de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal (2.5.7)..
      1. Nucleasa micrococcal (MN) se disuelven en agua a una concentración de ~ 450 unidades (U) / mL. Dializan contra agua destilada y ajustar a 300 U/mL. Solución de fosfodiesterasa (SPD) de bazo de dializarse y ajuste a 4 U/mL.
      2. Mezcla de MN y SPD a concentraciones finales 150 mU/μl MN y 2,5 mU/μl SPD (solución de MN/SPD). Tomar la solución de ADN que contiene 12.5 μg y evaporar a sequedad en un evaporador. Disuelve en 6,5 μl de agua destilada.
      3. Añadir solución de MN/SPD de 5,0 μL (concentración final de MN es 60 mU/μl, concentración final de SPD es 1 mU/μL) y 1,0 μL de tampón de digestión (concentración final de succinato de sodio es de 20 mM, concentración final de CaCl2 es 8 m m). El volumen final de la mezcla es 12.5 μl. mezcla y permiten reacciones por 3 h a 37 ° C.
      4. Eliminar 2.5 μl (transferencia a otro tubo) para mayor dilución y análisis de Deoxynucleótidos por sin modificar (2.5.7).
    2. Procedimiento de enriquecimiento nucleasa P1
      1. A la restante 10.0 μL de hidrolizado, añadir tampón de acetato de sodio de 0.65 μl (concentración final, 40 mM), solución de2 de vivencias de 0.65 μl (concentración final 0,1 mM), 1.25 μl NP1 solución (concentración final, 0.385 μg/μl) y 0.45 μL agua destilación. El volumen final de la mezcla es 13 μl.
      2. Deje que la mezcla reaccione durante 30 min a 37 ° C y poner fin a la reacción con la adición de 3 μl de solución de Tris.
    3. n-procedimiento de enriquecimiento de Butanol
      1. Añadir a la restante 10.0 μL de hidrolizado de ADN, 215 μl de solución de formiato de amonio 11,6 mM, pH 3.5 y 25 μl 10 mM TBA cloruro en solución. Extraer con 250 μl n-butanol (saturada con agua) mediante la mezcla vigorosa. Spin (3 minutos) a 1.600 x g para separar las capas y sacar el superior n-capa de butanol. Extraer una vez más con 250 μl n-butanol (saturada con agua), hacer girar, despegar el superior n-capa de butanol y se combinan con el extracto anterior.
      2. Añadir 400 μL de agua (saturadas con n-butanol) a este extracto y mezclar vigorosamente. Girar para separar las capas y eliminar la capa acuosa inferior. Repita este procedimiento de lavado con 400 μL de agua (saturadas con n-butanol). Agregar 3 μl de solución de Tris-HCl, pH 9.5, de 250 mM al n-capa de butanol. Se evaporan n-butanol a sequedad en un evaporador a la temperatura ambiente.
      3. Disolver el residuo en 100 μl n-butanol, evaporar a sequedad otra vez y disolver el residuo en 16.0 μL de agua.
    4. Etiquetado de los aductos
      1. Añadir 1 μl de tampón de bicina (etiquetado buffer) y 4.5 μl de una mezcla que contiene 100 μCi [γ -32P] ATP, 45 pmol de frío ATP y 10.0 U de T4-PNK (T4-phosphonucleotide quinasa) 16.0 solución μl de mezcla de enriquecimiento NP1 o butanol. Las concentraciones finales de los reactivos será el siguiente: bicina de 20 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, espermidina de 0,5 mM y 0.5 U/μl T4-PNK, ATP de 3 μm. El volumen total de la mezcla es de 20 μl.
      2. Deje que la mezcla reaccione durante 30 min a temperatura ambiente. Aplicar toda la muestra (es decir. 20 μl) sobre la placa de TLC celulosa PEI (2.5.6.).
    5. Evaluación de la eficacia de NP1 o n -butanol mejorar procedimientos
      1. Lave la parte inferior del tubo con 50 μl de agua. Mezcla vigorosamente durante 30 s y vuelta (1 minuto) a 1.600 x g en una centrífuga para establecer allí no es ninguna contaminación en la tapa. Punto 5 μL en una placa de TLC celulosa PEI (20 x 20 cm). Cromatógrafo en una solución de 280 mM (NH4)2hasta4 y 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Separación de TLC de Deoxynucleótidos aducidos por
      1. Lavado preliminar a las placas de TLC con agua destilada. Se recomienda especialmente para las placas hechas en casa.
        Nota: Este lavado debe llevarse a cabo para eliminar el color amarillo de placas, de un color que puede elevar el fondo, particularmente en el frente del solvente.
      2. Ver toda la muestra sobre la placa de TLC celulosa PEI y empezar a cromatografía (2.5.4.); limpiar de aductos se realiza mediante el desarrollo de la placa en las direcciones D1 y D2 (figura 2).
      3. Desarrollar la placa en una dirección D1 (figura 2). Tampón de fosfato de sodio de uso de 1,7 M, pH 6.8, para asegurar que el ADN aductos son restantes en el inicio de la placa de TLC. Desarrollar de manera análoga, la placa en una dirección D2 utilizando este이 buffer. Para obtener información sobre posibles reservas para los procedimientos, consulte soluciones descritas para la resolución de varios tipos de aductos20,28.
        Nota: El desarrollo de la placa en una dirección D2 puede omitirse.
      4. Lave la placa en agua desionizada después de cromatografía por unos 5 min en dos baños consecutivos. Después de esto, seque las placas.
      5. Desarrollar las placas en dirección a D3 y D4 con 3,5 M litio formiato de tampón, pH 3.5, que contiene 0.5 a 8.5 M urea para D3 Dirección M Tris-HCl buffer, pH 8.0, que contiene urea LiCl y 8,5 M de 0.8 M para D4 dirección (figura 2). Los solventes deben ajustarse para desarrollar los puntos de la aducción sobre la placa de TLC. Para obtener información sobre posibles reservas para los procedimientos desarrollo D3 y D4, vea las soluciones descritas para la resolución de varios tipos de aducciones23,24,25,28.
      6. Para evitar cualquier problema en D4, después desarrollo en una dirección de D4 y un lavado con agua, se desarrollan las placas (a lo largo de D4) en 1,7 M fosfato sódico, pH 6.0 (usualmente asignado como desarrollo en dirección a D5), a la parte superior de una mecha de papel (12 x 11,5 cm).
        Nota: La dirección D5 puede también omitirse. En este caso, es necesario abrir el tanque del TLC cuando el solvente ha llegado a la cima del TLC y permite un funcionamiento de hasta 60 minutos. Este método es incluso mejor que agregar una mecha (el método utilizado con frecuencia en muchos laboratorios para eliminar cualquier problema en D4).
    7. Cuantificación de Deoxynucleótidos por (no modificados) normal después de la hidrólisis
      1. Diluir una alícuota de hidrolizado (de 2.5.1. describiendo la hidrólisis del ADN) con agua destilada, (es decir., 2,5 μl de la mezcla de digestión de 2.5.1. ajustado a 250 μl y 10 μl de esta solución se ajustó a 150 μL).
      2. Tomar alícuota de esta recopilación un 5 μl (10 pmol normal Deoxynucleótidos por), añadir 2,5 μl de tampón 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 y la etiqueta como en 2.5.4. (el volumen final de la mezcla es de 10 μl). Dejar para reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente.
      3. Tomar un μl 4 alícuotas de la mezcla y diluir hasta 750 μl con 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Mezcla y vuelta para establecer que no hay contaminación de la tapa. Se aplican 5 μL en una placa de TLC celulosa PEI. Desarrollar la placa de TLC en una solución de 280 mM (NH4)2entonces4 y 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Deje que se seque después de TLC.
      4. Uso de autorradiografía que se realiza en aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente para localizar los Deoxinucleótidos sin modificar cuatro bis-fosfatos. Corte para cuantificación por centelleo líquido o conteo Cerenkov.
    8. Cálculo del pariente aducción etiquetado (RAL)
      1. Determinar los valores de las cuentas en los puntos de la aducción y las cuentas en la alícuota de Deoxynucleótidos por (normal) etiquetados.
        Nota: Este último debe determinarse en 180.000 cuentas menos material que el anterior, una figura que es el factor de conversión para aplicar a la cuenta de Deoxynucleótidos por (normal) sin modificar para la evaluación de los valores RAL de aducto de niveles. RAL de ADN aductos se calcula según la ecuación (2) se muestra más arriba.
    9. Detección de atascamiento de la prueba de carcinógenos o drogas a ADN mediante fármacos radiactivos marcados
      1. Evaluar las 3H o 14C radiactividad de ADN modificado con productos químicos por recuento de centelleo líquido.
      2. Añadir 10-50 μl de solución de ADN a 3 mL de una solución de centelleo en el vial de centelleo. Mezclar bien. Medida de la radiactividad mediante el contador de centelleo.

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Representative Results

Utilizando los protocolos descritos aquí para la utilización de la activación de enzima-catalizado (es decir, P450, peroxidasa, reductasa) para investigar la potencia de los productos químicos (cancerígenos, drogas) para ser metabolizado a productos intermedios dando por resultado su covalente Unión a DNA (generación de ADN aductos), hemos sido capaces de resolver (i) un nuevo mecanismo de la acción farmacológica de la ellipticine agente contra el cáncer (para una revisión véase,29,30,31), (ii) la etiología de dos nefropatías asociadas con cáncer del tracto urotelial superior causado por planta alcaloide ácido aristolóquico (nefropatía por ácido aristolóquico y nefropatía endémica de los Balcanes) (para una revisión véase,32,33,34, 35,36,37,38,39) y (iii) la genotóxico mecanismos de la carcinogenicidad de diversos agentes carcinógenos como un agente contaminador del aire 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 y su contraparte reductiva, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 planta alcaloide aristolóquico ácido,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 y una amina aromática o- anisidina. 49 , 50 , 51 , 52 además, las enzimas determinación de efectos biológicos de estos productos químicos se determinaron empleando los métodos descritos.

Aquí el representante resulta en la activación oxidativa de ellipticine por P450s y peroxidasas dando por resultado la generación de covalente aductos con el ADN y en la reducción de 3-NBA a metabolitos que covalente modificado ADN, aparecen.

La planta alcaloide ellipticine (5,11-dimetil-6H- pirido [4, 3 -b] Carbazol) y sus derivados son agentes antitumorales, que actúan como medicamentos dañan el ADN a través de varios mecanismos, incluidos en la detención del ciclo celular y la inducción de apoptosis (para tener una visión general, véase29,30,31). Utilizando los protocolos descritos en este trabajo, hemos demostrado que el medicamento contra el cáncer genera covalente DNA aducciones después de bioactivación metabólica catalizada por P450s microsomal (figura 3) y peroxidasas (figura 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61y esto explican la fuerte eficacia de este agente contra el cáncer las células30. [3H]-ellipticine radiactiva y la versión de nucleasa P1 de 32postlabeling P técnica fueron utilizados predominante en los estudios,29,30,31,53 ,61. Utilizando el estudio complejo sistemas enzimáticos subcelular, inhibidores de la enzima y las enzimas puras en los experimentos utilizando los protocolos descritos, la predominante P450 enzimas oxidante ellipticine a especies reactivas formando ADN aductos y estructuras de estas especies reactivas fueron caracterizadas29,30,31,55. De la P450s examinados, la enzima CYP3A4 humana es más eficaz en la oxidación de ellipticine a hydroxyellipticine 12 y 13-hydroxyellipticine, los metabolitos de la ellipticine, que se descomponen espontáneamente a ellipticine-12-ylium y ellipticine-13-ylium Unión al ADN (figura 5). 55 , 61 las enzimas del CYP también generan metabolitos más como 9-hydroxyellipticine, que se considera una desintoxicación metabolito 7-hydroxyellipticine y ellipticine N2-óxido, que forman como el menor metabolitos ellipticine. 9-hydroxyellipticine, así como 7-hydroxyellipticine y ellipticine N2-óxido está formado principalmente por CYP1A1 y CYP2D6, respectivamente. 55 , 57 , 58

Peroxidasas (es decir, peroxidasa de rábano (HRP), lactoperoxidasa (LPO), mieloperoxidasa (MPO) y ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2)) metabolizan ellipticine para generar el mismo aductores de ADN derivado de ellipticine (figura 4)61 por los mecanismos que se muestra en la figura 5.

Nitroaromáticos 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-uno) es un componente de la combustión del diesel y se encuentra en partículas aerotransportadas62,63,64. El principal metabolito de este contaminante, 3-ABA,64,65 fue detectado en la orina de los trabajadores de las minas de sal que fueron expuestos a las emisiones de diesel para un tiempo largo63. Este hallazgo demuestra que estos trabajadores estaban expuestos a 3-NBA. Este nitroaromáticos causa tumores de pulmón en ratas después de la instilación intratraqueal67. 3-NBA también actúa como un mutágeno en la prueba de Ames Salmonella typhimurium (en tensión YG1024 overexpressing nitroreductase y O- acetiltransferasa), generando revertidas observado presencia de más de 6 millones por Nanomol en esta cepa62. Su potencia genotóxica fue demostrada también por generación de aductos covalentes con DNA in vitro, después de la activación de varias enzimas, utilizando los protocolos descritos en este trabajo y en vivo en varios órganos de animales roedores (figura 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,de67,de64,68.

Aducciones de la DNA derivados de NBA 3 formado después de la activación 3-NBA con reductasas citosólicas (es decir, NQO1) fueron medidos por la nucleasa P1 y n-métodos de enriquecimiento de butanol de 32postlabeling P método descrito en los protocolos presenta en este estudio. Los resultados indicaron la formación de ADN hasta cinco aductores (aducción puntos 1-5 en la figura 7), y tres de ellos se caracteriza por ser 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; aducción del punto 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; aducción punto 3) y N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; aducción puntos 4. y 5) (figura 7 y figura 8). Utilizando la versión de nucleasa P1 32método P-postlabeling, la dirección general de-C8 -N-ABA (aducción puntos 4 y 5) fue indetectable (figura 7 y figura 8). Este subraya resultado que algunas limitaciones de esta versión de 32P-postlabeling, es decir, la detección baja (si procede) de Deoxynucleótidos aducidos por que son defosforilaciones por nucleasa P1 (es decir, aductos formados durante oxidación de arilaminas o por reducción de aromáticos nitroderivatives a N- hydroxyarylamine-derivados sustituidos en C8 de desoxiguanosina). Similar al estudio con ellipticine, utilizando el complejo estudio con sistemas subcelular de la enzima, los inhibidores de la enzima, puras enzimas y ADN aducción estándares en los experimentos que emplean los protocolos descritos en este trabajo, la predominante citosólica enzimas de reducción 3-NBA a metabolitos que metaboliza generando aductores de ADN, es decir, el metabolito reactivo formado por reducción de 3-(N-OH-ABA), de la NBA y las estructuras de tres ADN aductos generan por 3 NBA fueron caracterizadas (figura 7 y Figura 8). En el hígado, bioactivación de 3 NBA en vitro fue encontrado para ser atribuible al ser humano y rata NQO1 (figura 7), mientras que el humano N,O- acetiltransferasas (NATs), NAT2, NAT1, sulfotransferasa (SULT), SULT1A1 y a un menor medida, SULT1A2 son las predominantes enzimas de fase II activación de NBA 342. POR microsomal hepática también es eficaz en la activación de los 3 NBA41, pero en los ratones, 3-NBA es principalmente bioactivación NQO1 en lugar de este microsomal POR42. En pulmón, que es el tejido diana para la carcinogenicidad de la NBA 367, NQO1 y XO reducen 3-NBA a metabolitos que ADN generando aductos. Sin embargo, XO parece actuar como una enzima activadora de menor 3-NBA en este órgano69.

Figure 1
Figura 1: Esquema del ensayo de P-postlabeling de 32. Se muestran los pasos individuales del 32P postlabeling método y sus procedimientos mejorados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: patrón de ADN aducción elución de las placas de TLC celulosa PEI. La cromatografía multidireccional de ADN aductos en PEI-celulosa se muestran placas. ORIGEN es una posición en la placa de TLC celulosa PEI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: 32postlabeling P análisis del ADN aductos formados en DNA de timo de becerro incubado con ellipticine, NADPH y rata (A) y (B) humanos microsomas hepáticos, (C) un control de la muestra sin los microsomas. Aductores 1 y 2 por flechas son generados en desoxiguanosina en ADN por ellipticine activada con microsomas. 32 P-postlabeling fue realizado utilizando la versión de nucleasa P1 del método (paso 2.5.2.) Orígenes se encuentran en las esquinas izquierda inferior (D3 de abajo hacia arriba y D4 de izquierda a derecha). D2 fue omitido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: 32postlabeling P análisis del ADN mediada por ellipticine aductores. Aducciones en timo de becerro ADN reaccionó con ellipticine (100 μm) y peroxidasa (A), lactoperoxidasa bovino (B), la mieloperoxidasa humana (C), ovina cyclooxygenase-1 (D), humano (ciclooxigenasa-2 E) (5 μg peroxidasas estaban presentes en las incubaciones), ADN de ratas tratadas con ellipticine de 40 mg por kilogramo de peso corporal (bw) (F), de timo de becerro ADN reaccionó con ellipticine y CYP3A4 humano de hígado (G), con 13 - hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-óxido () y 12-hydroxyelipticine (J). Se realizaron experimentos utilizando la versión de nucleasa P1 del análisis (paso 2.5.2.) Orígenes están en las esquinas izquierda inferior (D3 de abajo hacia arriba y D4 de izquierda a derecha). D2 fue omitido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: la oxidación de ellipticine por peroxidasas y app que muestra los metabolitos ellipticine y los sugirió generar ADN aductos. Los compuestos en los soportes no han sido aún detectados bajo las condiciones experimentales utilizadas en los experimentos, y son los metabolitos electrófila postulados como Unión última especie al ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: activación metabólica de y ADN aducción formación por 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, oxidorreductasa H:quinone de NAD (P); NAT, N,O- acetiltransferasas; SULT, sulfotransferasa; CYP, citocromo P450; POR, NADPH: citocromo P450 oxidorreductasa; HRP, con peroxidasa de rábano; LPO, lactoperoxidasa; MPO, mieloperoxidasa; COX-1, ciclooxigenasa-1. R = - COCH3 o -SO3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: 32postlabeling P análisis del ADN derivado de NBA 3 aductores. La nucleasa P1-(paneles a la izquierda) y n-versiones de extracción butanol (paneles de la derecha) del método se utilizaron. Aa y Ab, aductos formados en becerro timo ADN reaccionó con 3-NBA (300 μm) tras la activación con cytosols hepático de rata. Ba y Bb, aductos formados en el timo de becerro ADN, reaccionada con el 3-NBA (300 μm) tras la activación con citosol hepático humano (fracción combinada). Ca y Cb, aductos formados en el timo de becerro ADN, reaccionada con el 3-NBA (300 μm) tras la activación con hepática de puro rata NQO1 (0,09 unidades). Duna y Db, aductos formados en el timo de becerro ADN, reaccionada con el 3-NBA (30 μm) tras la activación con NQO1 recombinante humano (0,06 unidades). Ea y Eb, aductos formados en salmón testículo ADN tratado con N-OH-ABA. Fa y Fb, aductos formados en hígado DNA de tipo salvaje hermanos de camada en un fondo de C57BL/6 expuestos a 2 mg de 3-NBA por kg p.v. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: 32P-postlabeling análisis de ADN derivado de NBA 3 aducción normas [dG -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) y dG-C8 -N-ABA (C)] (paneles una) y estructuras de NBA 3 y estas 3-NBA-ADN aductos () paneles b). N-versión de extracción butanol del método fue utilizado (paneles en una). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo, se demuestra una metodología ampliamente accesible para el estudio de la potencia de los productos químicos que bioactivación a intermediarios metabólicos, resultando en generación de covalente DNA aducciones. Este es un tema crucial, porque la evaluación de la potencia de los productos químicos ambientales o medicamentos de su activación enzimática a metabolitos generando covalente ADN aductos es un campo importante en el desarrollo de cáncer y su tratamiento. La modificación del ADN por agentes carcinógenos que se considera la causa del desarrollo del tumor se considera ahora como un dogma central de la carcinogénesis causada por agentes carcinógenos. Esta sugerencia es confirmada por una variedad de resultados, tales como los fenómenos que: (i) los cancerígenos propiedades de diversos agentes carcinógenos dependen de bioactivación de estos compuestos a metabolitos reaccionando con centros nucleofílico en el ADN; (ii) los niveles de ADN aductos con frecuencia corresponden a muchas respuestas carcinogénicas; (iii) y la mutación en ciertos genes supresores de tumor y la activación de varios proto-oncogenes puede ser causada por su modificación con productos químicos cancerígenos potencias. Por otra parte, la modificación covalente del ADN por medicamentos contra el cáncer ha sido demostrada como uno de los efectos de estos medicamentos, más eficientes a dañar DNA que resulta de su uso en el tratamiento del cáncer.

Hay dos puntos críticos que determinan la evaluación acertada de productos químicos para sus propiedades genotóxicas, es decir, sus potencias para formar covalente DNA aducciones, específicamente: (i) encontrar, resolver y caracterizar la eficiencia de enzimática sistemas capaces de activar agentes carcinógenos, drogas enlace especie electrófila los centros nucleófila del ADN y (ii) desarrollar y utilizar las técnicas más adecuadas, por que aductos carcinógeno drogas – ADN encontrados y caracterizados estructuralmente. En este estudio se describen los métodos apropiados para ambas funciones.

Procedimientos de aislamiento de fracciones celulares que contienen enzimas de biotransformación (muestras microsomales o citosólicas poseer P450s y peroxidasas es decir, de bioactivating adicional enzimas o reductasas POR, NQO1, XO y AO), los protocolos de bioactivación de prueba carcinógenos/drogas por parte de los sistemas enzimáticos (incubaciones con ADN) y su uso que se muestra en este trabajo indica, como lo demuestran los resultados representativos, su idoneidad para la evaluación de propiedades genotóxicas de productos químicos.

Además, los métodos apropiados para la detección y cuantificación de aductos con el ADN como dos versiones de enriquecimiento de la técnica de P-postlabeling de 32(las nucleasa P1 - y n -butanol procedimientos de extracción) y el uso de marcado radiactivamente con compuestos probados mostraron ser apropiado para estudios de evaluación de la genotoxicidad de los xenobióticos de cancerígeno y las drogas.

Con respecto a la determinación del ADN covalente aductos, no sólo estos dos métodos, sino también otros métodos para la detección y medición de ADN aductos se han establecido8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. hasta 1981, la cuantificación de ADN aductos utilizados radiactivos químicos (carcinógenos, drogas), por 3H o 14C, que se han preparado sintéticamente. Tales métodos han sido utilizados provechosamente para los estudios ellipticine como se describe en este trabajo (véase53,54). Sin embargo, es generalmente difícil preparar los derivados con alta radioactividad para su uso exitoso73,80,81. Por lo tanto, aunque todavía se utiliza este procedimiento, es por desgracia limitada a en vitro experimentos similares a los descritos aquí. De otras técnicas de espectrometría de masas, electrón aerosol ionización (ESI), ionización de la desorción del laser asistida por matriz (MALDI), spectrometry total del acelerador (AMS), de la fluorescencia, métodos biológicos como inmunoensayo, 32 P-postlabeling se describe en este estudio en detalle, fueron desarrollados (para revisión, véase8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

Se muestra el ensayo P-postlabeling de 32se describe en el protocolo de este trabajo, que no sólo tiene aplicabilidad en los experimentos en vitro (ver representante resultados), es decir, pruebas de nuevos compuestos para genotoxicidad o mecanicista las investigaciones de la activación de carcinógenos y las drogas, pero también tiene otros usos como la evaluación de exposición humana a los carcinógenos ambientales, estudios sobre los mecanismos de desarrollo del tumor, seguimiento de reparación de ADN, examen de ADN dañan por endógeno compuestos y reacciones oxidativas e investigar la respuesta de pacientes a citotóxicos contra el cáncer medicamentos72,83.

Esta técnica es, sin embargo, no sin algunas limitaciones73. Las lesiones en el ADN, que no son estables como monodeoxynucleotides, no pueden determinarse confiablemente. 32P postlabeling método no es capaz de identificar las estructuras de ADN aducción. Por lo tanto, la caracterización estructural de ADN aductos con frecuencia confía en demostrar su cocromatografía sintético normas de estructuras conocidas. De hecho, este método fue utilizado en ambos ejemplos de los resultados representativos que se muestran en este trabajo (ellipticine, 3-NBA).

En conclusión, los protocolos se muestra en este trabajo pueden considerarse como métodos adecuados para evaluar la potencia de los productos químicos ambientales o medicamentos que enzimáticamente bioactivación a metabolitos generando covalente DNA aducciones, un proceso muy importante para la desarrollo de cáncer y su tratamiento.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Fundación para la ciencia Checa (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

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References

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Bioquímica número 133 drogas carcinógeno bioactivación,citocromo P450 reductasas aductores de ADN 32postlabeling P
Formación de covalente ADN aductos carcinógenos activados enzimáticamente y fármacos <em>In Vitro</em> y su determinación por <sup>32</sup>P-postlabeling
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Stiborova, M. Formation of Covalent… More

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

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