أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

Summary

الإثراء البيئي (EE) هو بيئة إسكان الحيواني الذي يستخدم للكشف عن الآليات التي تقوم عليها العلاقة بين نمط الحياة والإجهاد والمرض. ويصف هذا البروتوكول إجراء يستخدم نموذج ماوس tumorigenesis القولون وهه لتحديد التعديلات على وجه التحديد في التنوع البيولوجي الحجمية التي قد تؤثر على وفيات الحيوان.

Abstract

وقد أبرزت عدة دراسات أجريت مؤخرا الآثار المفيدة للذين يعيشون في بيئة مخصب على تحسين الأمراض البشرية. في الفئران، الإثراء البيئي (EE) يقلل tumorigenesis بتنشيط ماوس الجهاز المناعي، أو يؤثر على الورم تأثير بقاء الحيوان عن طريق حفز الاستجابة إصلاح الجرح، بما في ذلك التنوع ميكروبيومي محسنة، وورم المكروية. شرط هنا إجراء مفصل لتقييم آثار الإثراء البيئي على التنوع البيولوجي ميكروبيومي في نموذج ورم القولون ماوس. موصوفة بالاحتياطات اللازمة فيما يتعلق بتربية الحيوان واعتبارات للحيوان التكامل مستعمرة الوراثي، والماوس، وكلها تؤثر في نهاية المطاف التنوع البيولوجي الميكروبي. الإصغاء هذه الاحتياطات قد تسمح بانتقال ميكروبيومي موحدة أكثر، ونتيجة لذلك سوف يخفف آثار تعتمد غير المعالجة التي يمكن الخلط بين نتائج الدراسة. علاوة على ذلك، تتسم التغيرات الحجمية في هذا الإجراء، استخدام 16S المتاشب تسلسل الحمض النووي المعزولة من البراز التي جمعت من القولون القاصي بعد تخصيب البيئية الطويلة الأجل. القناة الهضمية الحجمية الاختلال يرتبط بأمراض سرطان القولون ومرض التهاب الأمعاء، ولكن أيضا من السمنة ومرض السكري بين السكان الآخرين. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل هة وميكروبيومي دراسة دور ميكروبيومي المرضية عبر مجموعة متنوعة من الأمراض التي توجد فيها نماذج الماوس قوية التي يمكن إيجاز الأمراض البشرية.

Introduction

دراسات الإثراء البيئي ه (ه) استخدام معلمات السكن معقدة تؤثر على التحفيز الاجتماعي (أقفاص السكنية الكبيرة، ومجموعات أكبر من الحيوانات) والتحفيز الإدراكي (أكواخ والإنفاق، ومواد التعشيش ومنصات) والنشاط البدني (على التوالي عجلات). وقد استخدمت هة بالعديد من المعامل لفهم آثار زيادة النشاط وتحسين التفاعلات الاجتماعية والمعرفية في بدء المرض والتقدم باستخدام مجموعة واسعة من نماذج الماوس، بما في ذلك الحلاقة الحاصة المستحث، مرض الزهايمر، متلازمة ريت وأمراض الأورام والجهاز الهضمي عدة نماذج^1،2،،من^34،،من⁵⁶.

تم تطوير عدة نماذج الماوس لدراسة tumorigenesis القولون في الفئران. ربما هو النموذج الأكثر المعالم الماوس Apc^دقيقة . الماوس Apc^دقيقة وضعت في المختبر من حمامة ويليام في عام 1990⁷، وقد استخدمت كنموذج الفأر من الطفرات في الجين APC التي ترتبط عادة بسرطان القولون والمستقيم البشرية. على النقيض من البشر إيواء APC الطفرات، الفئران Apc^مين أساسا تطوير أورام الأمعاء الصغيرة، مع حدوث نادرة جداً لاورام القولون. ومع ذلك، يزيد اليل Tcf4^Het مع طفرة متخالف خروج المغلوب knockin واحدة في Tcf4، إلى حد كبير tumorigenesis القولون عندما جنبا إلى جنب مع اليل Apc^{دقيقة 8}. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الطراز الماوس من tumorigenesis القولون لتحديد آثار هة على القولون توموريجينيسيس⁶. في الكاثوليكي وآخرون. دراسة آثار فسيولوجية والمظهرية هة على الذكور والإناث من أربعة خطوط الماوس المختلفة (البرية من نوع (WT)، Tcf4^Het/+ Apc^{+ +}، Tcf4^{+ +} Apc^مين/+، و Tcf4 ^Het/+ آسيا والمحيط الهادئ^مين/+)) تم تعريفها. ربما كانت النتيجة الأكثر إثارة للاهتمام أن هة يزيد بشكل ملحوظ عمر الحيوانات الحاملة لورم القولون الذكور والإناث على حد سواء. وهذا يبرهن أنه قد يقلل هة على الأقل بعض الأعراض المرتبطة tumorigenesis القولون، وتحسين صحة الحيوان. بشكل ملحوظ، هذا عمر محسنة عند الذكور ليست نتيجة مباشرة لانخفاض توموريجينيسيس، وبدلاً من ذلك يرتبط بالشروع في ورم الجرح الشفاء الاستجابة، بما في ذلك تحسين ميكروبيومي التنوع البيولوجي⁶.

وقد نشرت عدة دراسات محددة هة مع نتائج مثيرة للاهتمام. ومع ذلك، من وجهة النظر تقنية، نتائج هامة لا غالباً ما قابل للترجمة إلى مختبرات أخرى. الحفاظ على منهجيات هة متطابقة بين المختبرات المختلفة هو مسألة معقدة بشكل لا يصدق، ليس فقط بسبب أجهزة تخصيب والمساكن المستخدمة، لكن أيضا الفراش، الغذاء، التهوية، تربية، علم الوراثة، والنشاط في الغرفة، وبروتوكول الحيوان الاحتياجات، من بينها^9،،من¹⁰¹¹. مثال واحد هو التكامل الحيواني، حيث الحيوانات يجب ستابلي إدماجها في مستعمرة الماوس، ثم تطبيع التركيب الجيني في الخلفية، والنظام الغذائي، لتجنب آثار غير المعالجة ذات الصلة. علاوة على ذلك، استكملت دراسات هة العديد من قبل أعمال أهمية ميكروبيومي في المرض، وطريقة أن ممارسات تربية الماوس مشتركة يمكن أن تؤثر على تكوين^10،ميكروبيومي القناة الهضمية¹².

تربية والتنسيب الاستراتيجية والحيوان في هة يمكن أن تزيد من التوتر لم يكن تنفيذها بشكل صحيح. منذ الدراسات هة استخدام إعداد كبيرة من الحيوانات الذكور والإناث والأنماط الجينية متعددة، الإعداد التجريبية يمكن أن يكون صعباً نظراً للحاجة إلى الحيوانات من ليتر عدة تكون جنبا إلى جنب. ولذلك، وضعت تربية والفطام استراتيجية للسماح للجمع بين الحيوانات الفطام للنمط الوراثي الصحيح من ليتر مختلفة. وكان الأساس المنطقي الأساسي لهذا لتطبيع الحجمية بين ليتر والحد من التوتر عندما تم نقل الحيوانات في البيئة التجريبية. وأحيلت ميكروبيومي من السد¹⁰. توفير التنوع الميكروبي للمستعمرة، التي تم شراؤها من "مختبرات جاكسون" الإناث وإدماجها في المستعمرة لمدة شهر واحد قبل بدء التجربة^9،،من¹⁰¹². وكانت الإناث نحو مزيد من تطبيع ميكروبيومي التنوع البيولوجي بين الحيوانات، مساكن المشترك قبل تربية. بعد تربية والإسكان البلدية أثناء تربية القدرة على الهروب التمريض الجراء تحسين مستويات الإجهاد لرعاية الأمهات^13،14، ربما تعزيز تطبيع ميكروبيومي. لمنع غير EE ذات الصلة بالآثار على ميكروبيومي، وهذا الإسكان البلدية من جميع الحيوانات التجريبية منع القتال وإضافية من الإجهاد الذي حدث عند الجمع بين العديد من الذكور من ليتر مختلفة في قفص تجريبية واحدة. وأخيراً، شملت أعدادا متساوية من الحيوانات من جميع الأنماط الجينية في الأقفاص. وهذا أتاح الفرصة للتنوع البيولوجي الحجمية محسنة عبر الأنماط الجينية، وإزالة مساهمة كوبروفاجيا (الميل للحيوان أن تستهلك البراز) أو الفوارق السلوكية الممكنة الخاصة بالنمط الوراثي للدراسة الشاملة.

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية توسع الدراسات هة السابقة تشمل الجوانب المعروفة للبحث ميكروبيومي، بما في ذلك التكامل مستعمرة الإرسال والحيوان الحجمية لتطبيع الحجمية، لتمكين السكان ميكروبيومي موحدة أكثر بين الحيوانات التجريبية. مراعاة هذه الاحتياطات أمر ضروري نظراً لقدرة الاختلافات غير المعالجة الحجمية ذات الصلة الخلط بين نتائج الدراسة. إزالة غير هة المتصلة بالتغيرات الحجمية سوف تمكن الباحثين من تحديد دور هة تحديداً في تكوين الحجمية أثناء المرض التنمية والتقدم.

Protocol

وأجريت جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة يوتا.

1-تصميم التجريبية وهه وإعداد قفص مراقبة

ملاحظة: للرجوع إليها، ويتضح مخطط تفصيلي لتصميم تجريبي (الشكل 1).

1. إعداد عنصر التحكم (شمال شرق) واقفاص هة (2 الرقم).
   1. لإعداد الأقفاص NE، استخدام الأقفاص التحكم التقليدية يعقم (الجدول 1) التي تفتقر إلى أجهزة تخصيب اليورانيوم.
   2. لاقفاص كبيرة، حفر ثقب واحد في قفص كبير بما يكفي لاستيعاب جروميت، ونفق (جدول المواد).
   3. لإعداد تربية ألجرو واقفاص هة، توصيل اثنين من أقفاص يعقم كبيرة مع نفق مضمون جروميت معقمة ومنصات معقمة 2 لزيادة مساحة الطابق (الجدول 1). لإجراء تجارب عليها هة، توفر تشغيل عجلات، أنفاق، كوخاً، والأكواخ، وكرات الزحف معقمة، وتداخل المواد داخل أقفاص هة.
   4. ضع أقفاص هة وني في رف التهوية لتوفير التهوية متساوية.
      ملاحظة: السماح لاثنين من أقفاص كبيرة مع منصات 2 (الجدول 1) لمدة أقصاها 12 من الإناث الحوامل الواحدة ألجرو تربية الإعداد¹⁵ (انظر الجدول للمواد، وخطوة 3.2 في الوثيقة، و الجدول 2).
   5. تغذية الفئران تشاو القياسية إعلانية libitum المشع والتناضح العكسي يعقم المياه.
   6. تزويد الفئران بمواد تعقيم الفراش.
      ملاحظة: ويجب أن يتم التلاعب جميع أقفاص فارغة واقفاص مع الحيوانات في غطاء محرك السيارة لمنع التلوث. للتلاعب في قفص من أقفاص كبيرة بتغطية الحفرة في القفص مع فيلم لاصق.
2. إعداد الحيوانات لتربية. مجموعة الإناث شهرا 2-15 منزل في قفص كبير واحد (الجدول 1) لمدة أسبوعين قبل التزاوج. بشكل منفصل البيت 2-شهر القديمة ليتيرماتي الذكور لمدة أسبوعين قبل التزاوج.
   ملاحظة: عدد الإناث لتربية تعتمد على التجربة وعدد الحيوانات المطلوب. في هذه الدراسة، استخدمت الإناث 15 الحصول على 12 من الإناث توصيله، وهو الحد الأقصى للعدد المسموح به في ألجرو تربية الإعداد الموصوفة في 1.1.2 (الجدول 2).
3. لتربية، الجمع بين الحيوانات، الأب والأم وذكر 1 كل الإناث 2. ينبغي أن يكون الاختيار الأول في الصباح المقابس المهبلية، التي قد تكون علامة مرئية وقد تزاوج الحيوانات أثناء الليل.
   ملاحظة: مجلس النواب الذكور والإناث معا حتى قد توصيل كل أنثى. يمكن تحديد المكونات مهبلية بصريا، إذا كان خارجي.
   1. للكشف عن المقابس المدخلة، ويتم إدراج تحقيق فتح المهبل وإذا كان التوصيل المهبلي غير موجود، لا يتم إدراج التحقيق بسهولة (¹⁶) (انظر القسم 4.3.6).
      ملاحظة: سجل صباح اليوم تم الكشف عن المكونات كيوم ½، نظراً للتزاوج حدث في الليل.
   2. وبمجرد الإناث المقابس المهبلية، نقلها إلى جرو كبيرة تربية الأقفاص للإسكان مجموعة مع الأخرى تفعيل الإناث (الإعداد في الخطوة 1.1.2 دون أجهزة التخصيب).
   3. استبدال تزاوج الإناث مع الإناث المجنحات مجموعة مساكن جديدة للتزاوج وتستمر في التزاوج للحصول على أكبر عدد ممكن من ليتر في فترة 7 أيام.
      ملاحظة: يجب أن يكون جميع الحيوانات تاريخ تسليم في غضون 7 أيام من بعضها البعض.
4. السماح للإناث الحوامل على الولادة في المجموعة السكنية حيث أنه يتم رفع كل ليتر داخل ألجرو كبيرة واحدة تربية كيج (الإعداد في الخطوة 1.1.2 دون أجهزة التخصيب).
   1. تتبع أرقام ألجرو وبيرثداتيس، وتبدأ الجراء التنميط في 7 أيام عمر.
      1. الوشم الجراء على أصابع قدميه في 7 أيام عمر مع كود رقمي التعرف عليها^13،17.
      2. تنظيف إصبع القدم مع الإيثانول 70% ولطف إدراج جهاز مايكرو--الوشم يحتوي على الحبر إلى سطح الجلد موازية ل إصبع القدم¹⁷ (انظر الجدول للمواد).
      3. جمع الأنسجة مع مقص للتنميط من نصائح ذيل إينسيسينج قطعة صغيرة من الأنسجة من حديثي الولادة 7-يوم القديمة.
   2. عزل الحمض النووي من الأنسجة وإجراء PCR باستخدام أسلوب العامل البارع تقليدية كما هو موضح في ¹⁸.
   3. منفصلة من الحيوانات حسب الجنس في أيام 14-21 في أقفاص كبيرة مع الأمهات.
      ملاحظة: ضمان أن الجراء كبار السن قادرين على إطعام الخاصة بهم، وأن تستمر الجراء الصغار لارضاع طفلها حتى يبلغ من العمر ما يكفي لإطعام الخاصة بهم.
   4. 21-28 يوما، توزيع الحيوانات الذكور والإناث على حدة بالنمط الوراثي في بيئات ني أو هة، مع التأكد من الاحتفاظ بنسب متساوية من كل الوراثي في قفص (الشكل 2أ).
      ملاحظة: تأكد من أن مجموع عدد الحيوانات المسموح بها في كل قفص ني أو هة يستند إلى العدد الأقصى المسموح به من قبل إياكوك (الجدول 2). وقد الأقفاص NE على الأكثر 5 الحيوانات (الجدول 2). في أقفاص هة، للتنشيط الاجتماعي، لا يقل عن 20، ومع القيود المفروضة على الفضاء، ينبغي أن يسمح الحيوانات لا يزيد عن 41 في القفص هة (الجدول 2).

2-البراز جمع في 16 أسبوعا عمر

1. يبدأ جمع البراز 1 إلى 2 يوما السابقة للتضحية، وجمع البراز كل على حدة اليوم من تضحيات خلال التشريح باستخدام أدوات معقمة.
   ملاحظة: جمع البراز في نفس الوقت 1-2 أيام قبل جمع قد تساعد على تجنب فقدان عينة بسبب احتمال وجود البراز ليس هذا وقت جمع.
   1. لجمع البراز من الحيوانات الحية، القفا بعناية الحيوان فوق قفص نظيف. جمع البراز باستخدام الملقط العقيمة في أنبوب عقيم [ميكروفوج].
      ملاحظة: ستؤدي إزالة الحيوانات عادة البراز عندما معطلة، مما يسمح لجمع البراز السريع مباشرة في أنبوب عقيم [ميكروفوج]. في حالة عدم التبرز حيوان فورا عند معطلة، وضعه في قفص نظيف والانتظار للحيوان التغوط (عادة ما يصل إلى 1 س).
   2. جمع البراز في اليوم للتضحية.
      1. يوثانيزينج الحيوان، وضع الحيوان في جرة الجرس الذي يحتوي على حاوية صغيرة مع كرة القطن غارقة في إيسوفلوراني. بمجرد توقف التنفس يلاحظ (عادة بعد 2 دقيقة)، وضع الحيوان على ظهرها للسماح بتشريح القولون.
      2. تطبيق الإيثانول 70% في البطن الماوس.
      3. رفع الجلد عرفت افتتاح الاحليل مع الملقط، واستخدام مقص لقص على طول خط الوسط البطني حتى وصلت إلى القفص الصدري قطع من قاعدة للشق الأول نحو كل الساق. إضعاف مرة أخرى من الجلد، واستخدام مقص لقطع طريق الجدار البريتوني في نفس النمط.
      4. استخدام الملقط لفهم القولون البعيدة عند فتحه الشرج تشريح وفصل القولون القاصي من المستقيم. حين سحب النقطتين عمودياً مع الملقط، استخدام مقص لقطع طريق مساريق للإفراج عن القولون.
      5. قطع القولون فقط دون الأعور ووضع على ورق الترشيح. استخدام الملقط برفع الجزء العلوي من أنبوب القولون، فتح التجويف للسماح لجانب واحد من مقص مفتوح لإدراجها. قطع طوليا، فتح القاصي الدانية، وسبلاي القولون طوليا.
      6. جمع البراز من القولون القاصي في أنبوب عقيم [ميكروفوج] استخدام الملقط العقيمة.
2. تخزين البراز في [ميكروفوج] أنابيب في-80 ˚C حتى الوقت لعزل الحمض النووي البكتيري.
   ملاحظة: في يوم التضحية، بالإضافة إلى البراز، جمع عينات مثل الدم كله، ومصل الدم، البلازما، العادية وورم الأنسجة الأخرى من الأنسجة الدهنية القولون والأمعاء، ميكروسوميس، و ما إلى ذلك. لمعالجة مسائل محددة في الدراسة.

3-الحمض النووي في معزل عن البراز

ملاحظة: الاستفادة من مجموعة تجارية لعزل الحمض النووي الميكروبي من البراز بعد بروتوكول اكتشاف ممرض براز. إزالة عينات مباشرة للثلاجة ˚C-80 ومخزن على الثلج الجاف بينما وزنها.

1. نقل يصل إلى 220 ملغ براز إلى نظيفة [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على 1.4 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) البراز تحلل المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد).
2. دوامة العينة لمدة 1 دقيقة دقة مجانسة المواد الصلبة (الشكل 2ب). الحرارة التعليق إلى ˚C 95 لمدة 5 دقائق أن جميع البكتيريا (بما في ذلك البكتيريا إيجابية).
3. عينات دوامة 15 ق وثم الطرد المركزي في العاشر 20,000 ز لمدة 1 دقيقة بيليه الصلبة البراز. نقل طافية على أنبوب 2 مل [ميكروفوج]. إضافة قرص واحد لكل عينة على استيعاب PCR مثبطات، دوامة حتى يذوب الكمبيوتر اللوحي، واحتضان العينة في RT 1 دقيقة.
4. الطرد المركزي العينة في 20,000 x ز لمدة 3 دقائق ونقل المادة طافية [ميكروفوج] أنابيب جديدة. الطرد المركزي في العاشر 20,000 ز 3 دقيقة 15 اليكووت ميكروليتر من البروتيناز ك (الأسهم 20 ملغ/مل) في أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل جديدة. "الماصة؛" 200 ميكروليتر من العينة في أنبوب يحتوي على بروتيناز ك.
5. إضافة 200 ميكروليتر جوانيدينيوم كلوريد تحلل المخزن المؤقت للأنبوب، ودوامه جيدا لمدة 15 ثانية (انظر الجدول للمواد) واحتضان العينة في ˚C 70 للحد الأدنى 10 إضافة 200 ميكروليتر من الإيثانول (96-100 ٪) للأنابيب ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج.
6. مكان السليكا القائمة على عمود الدوران في أنبوب جمع 2 مل وتطبيق النماذج للعمود. إغلاق الغطاء وجهاز الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 20,000 x ز.
7. نقل العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة وإضافة 500 ميكروليتر يغسل المخزن المؤقت 1 إلى العمود وكاب بالعمود والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 20,000 خ زاي نقل العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة وإضافة 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 للعمود ، قم بإغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 3 دقائق.
8. مع غطاء مغلق، نقل العمود إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة، والطرد المركزي 1 دقيقة إضافية في 20,000 ز x لإزالة المخزن المؤقت لغسيل المتبقية. نقل العمود إلى 1.5 مل المسمى [ميكروفوج] أنابيب والوت العينة بإضافة 200 ميكروليتر من شطف مخزن يحتوي على يدتا للغشاء (انظر الجدول للمواد).
9. قم بإغلاق الغطاء واحتضان في RT لدقيقة 1 أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة في 20,000 خ زاي تجاهل العمود.

4-الحمض النووي تركيز تصميم وإعداد نموذج لبكر

ملاحظة: الاستفادة من فلوروميتير ومقايسة فلورسنت دسدنا متاحة تجارياً لتحديد تركيز الحمض النووي الجينومي في كل عينة (انظر الجدول للمواد). يجب ربط صبغة الفلورسنت مزدوجة من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل على وجه التحديد.

1. إعداد إضعاف 1: 200 لكل عينة (1 ميليلتر من كل عينة في مزيج الرئيسي دسدنا ميليلتر 199) و 01:50 تمييع المعايير. تحليل فلوروميتير استخدام الإعداد دسدنا.
   ملاحظة: يمكن أن تكون وحدة تخزين عالية من الحمض النووي في PCR المثبطة، ولذلك حجم الحمض النووي المستخدمة يجب أن لا أكثر من 10% الحجم النهائي لل [بكر]. Fluorometer يمكن القياس الدقيق للحمض النووي في العينة، كما سوف فلوريس فقط الحمض النووي ملتزمة بصبغة الفلورسنت، القضاء على المساهمة الممكنة للملوثات إلى تركيز الحمض النووي النهائي محسوب. هذا المستوى من كوانتيتيشن دقيقة أمر ضروري لتطبيق تسلسل المتلقين للمعلومات.
2. إعداد قوالب PCR المخفف إلى 5 نانوغرام/ميكروليتر مع حجم المناسبة 10 ملم تريس، الأس الهيدروجيني 8.5 لجعل عمل قالب الأرصدة لكل عينة.
3. تخزين العينات في-20 درجة مئوية.

5-تصميم كبسولة تفجير 16S المطلوب المناطق الخامس

1. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم المناطق الرنا الريباسي 16S الخامس المطلوب بشكل انتقائي.
2. تحليل الإشعال مع "مباراة التحقيق"، من "مشروع قاعدة البيانات ريبوسومال"¹⁹، لتحديد معدل ضرب التقريبي يعج المختلفة.
   ملاحظة: لمناطق V1-V3، نشرت الدراسة الحالية تستخدم كبسولة تفجير Bosshard إلى الأمام²⁰الذي ربط في موقف 8 داخل المنطقة V1 و 533 عكس²¹، الذي يربط في موضع 533 داخل منطقة V3. يجب أن تشمل الإشعال تسلسل محول المتراكمة للفهرسة.
3. عند تصميم كبسولة تفجير، وتشمل تسلسل محول في نهايات 5 ' كل التمهيدي، كما أوصت metagenomics 16S تسلسل مكتبة إعداد²² (الجدول 3).
4. توليف هذه كبسولة تفجير كبير مع تنقية خرطوشة. إعادة تشكيل يهتمان كبسولة تفجير، وتمييع بكر العامل المخزون إلى 1 ميكرومتر 10 مم تريس، pH 8.5.

6-تولي بكر Amplicon تضخيم Region(s) الخامس مع تسلسل محول عبء ²²

1. قم بإعداد أمبليكون مزيج تفاعل PCR كما هو موضح في الجدول 4.
2. ضع ختم لوحة بكر واضح لاصقة على اللوحة وتشغيل amplicon PCR باستخدام المعلمات في الجدول 5.
3. (اختياري) تشغيل amplicon منتجات PCR [اغروس] هلام أو فحص الحمض النووي حساسية عالية التي تمكن من قياس كمي لحجم أمبليكون (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: حجم أمبليكون من هذه الدراسة هو 550 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 3أ).

7-بكر تنظيف استخدام المغناطيسي الخرز ²²

1. الطرد المركزي لوحة بكر أمبليكون بسرعة في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة لجمع التكثيف.
   ملاحظة: يمكن استخدام شرائط أنبوب بكر بدلاً من لوحات PCR للتقليل من التلوث. تجاهل أغطية الأنابيب وإعادة استخدامها ابدأ.
2. دوامة الخرز الخرز المغناطيسي بالتساوي تفريق المتظاهرين، وإضافة 20 ميكروليتر من المغناطيسية لكل أمبليكون بكر جيدا، ثم "الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً ببطء 10 مرات.
3. احتضان على RT لأدنى 5 مكان لوحة بكر على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة حتى يتم جمع الخرز المغناطيسية والمادة طافية الواضح. إزالة وتجاهل المادة طافية.
4. أغسل حبات مع 200 ميكروليتر الطازج 80 ٪ الإيثانول بينما لوحة بكر على المغناطيسي الوقوف واحتضان لمدة 30 s في RT على الوقوف المغناطيسية. بعناية إزالة المادة طافية.
5. تكرار الغسيل لمرة ثانية. والآن، استخدام تلميح ماصة غرامة لإزالة أي الإيثانول المتبقي من الآبار، وتسمح للهواء التجفيف لمدة 10 دقائق.
6. إزالة لوحة بكر من موقف المغناطيسية وإضافة 52.5 ميكروليتر من 10 ملم تريس pH 8.5 لكل بئر. "الماصة؛" أعلى وأسفل 10 مرات على تعليق الخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
7. نقل لوحة بكر بالحامل المغناطيسي جمع الخرز المغناطيسية ونقل 50 ميكروليتر من المادة طافية على صفيحة بكر نظيفة. ضع ختم لوحة بكر واضح لاصقة على اللوحة وتخزينها في ˚C-20 لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

8-إعداد مخطط لوحة لفهرس PCR

ملاحظة: لإنشاء مكتبة V1-V3، أنجز بكر ثاني مع فهرس كيت (انظر الجدول للمواد). استخدم مخطط افتراضي فهرسة لترسم تركيبات الرقم القياسي المزدوج فريدة من نوعها لكل عينة (الشكل 3ب و ²³).

1. التأكد من أن كل عينة مزيجاً فريداً من 2 فهرس الإشعال (أيفهرسة المزدوج).

9-تنفيذ فهرس PCR لإرفاق الباركود إلى تسلسل محول ك وصف ²² .

1. نقل ميكروليتر 2.5 من بكر أمبليكونس (أمبليكونس النظيفة) إلى لوحات جيدا 96 الجديدة ومكان في المباراة لوحة فهرس للمعونة في الفهرسة.
2. ترتيب الفهرس 1 والفهرس التمهيدي 2 كما هو الحال على سبيل المثال إعداد لوحة الرسم (الشكل 3ب).
   ملاحظة: وترد إشارات مرئية لتجنب ميكسوبس التمهيدي: يجب أن يكون الفهرس 2 التمهيدي أنابيب قبعات بيضاء والحل واضح، بينما يجب أن يكون الفهرس 1 التمهيدي أنابيب قبعات برتقالية وصفراء الحل.
3. تجميع الفهرس رد فعل مزيج PCR كما هو موضح في الجدول 6. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تغطية مع ختم لوحة بكر واضح لاصقة والطرد المركزي لجمع في س 1,000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
4. تشغيل الفهرس PCR باستخدام المعلمات في الجدول 7.

10-تنقية المكتبة بكر النهائي

ملاحظة: هذا بكر تنظيف مطابق للخطوة 7 أعلاه، ويستخدم الخرز المغناطيسي لإجراء تنظيف PCR فهرس PCR²².

1. الطرد المركزي لوحة بكر من الخطوة 10 بسرعة في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة لجمع التكثيف.
2. ثم "دوامة الخرز الخرز المغناطيسي بالتساوي تفريقهم، ثم إضافة 20 ميكروليتر من المغناطيسية لكل أمبليكون بكر حسنا، الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً ببطء 10 مرات لخلط.
3. تبني على RT لمدة 5 دقائق.
4. لوحة "بكر مكان" على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة حتى الخرز المغناطيسي يتم جمعها وطاف واضح. إزالة وتجاهل المادة طافية.
5. أغسل حبات مع 200 ميكروليتر الطازج 80 ٪ الإيثانول بينما لوحة بكر على المغناطيسي الوقوف واحتضان لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة على الوقوف المغناطيسية. بعناية إزالة المادة طافية.
6. تكرار الغسيل لمرة ثانية.
7. وعقب أغسل الثانية، استخدام تلميح ماصة غرامة لإزالة أي الإيثانول المتبقي من الآبار، وتسمح للهواء التجفيف لمدة 10 دقائق.
8. إزالة لوحة بكر من موقف المغناطيسية وإضافة 52.5 ميكروليتر من 10 ملم تريس pH 8.5 لكل بئر. "الماصة؛" أعلى وأسفل 10 مرات على تعليق الخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
9. نقل لوحة بكر بالحامل المغناطيسي جمع الخرز المغناطيسية ونقل 50 ميكروليتر من المادة طافية على صفيحة بكر نظيفة. ضع ختم لوحة بكر واضح لاصقة على اللوحة وتخزينها في ˚C-20 لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
10. (اختياري) تشغيل منتجات PCR مؤشر [اغروس] هلام أو فحص الحمض النووي حساسية عالية التي تمكن من قياس كمي لحجم أمبليكون (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: حجم المكتبة المفهرسة النهائي من هذه الدراسة هو 668 bp (الشكل 3ج-د).

11-كمياً، تطبيع، وتجمع المكتبات المفهرسة للتسلسل

1. تحديد تركيز الحمض النووي لكل عينة مع فلوروميتير ومجموعة أدوات فحص فلورسنت دسدنا (انظر الجدول للمواد).
   1. إعداد إضعاف العينة (1 ميليلتر من كل عينة في 199 ميليلتر دسدنا الرئيسية ميكس، الذي يتضمن المخزن المؤقت وكاشف) 1: 200 لكل العينات مفهرسة والمعايير (190 ميليلتر دسدنا ميكس الرئيسي و 10 ميليلتر من معيار). تحليل فلوروميتير استخدام الإعداد دسدنا.
2. وبعد حساب تركيز الحمض النووي، تطبيع المكتبات عن طريق حساب حجم متوسط مكتبة. القيام بذلك بجمع أطوال المحول وأطوال الفهرس الخامس amplicon الحجم من الإشعال، وعرض المنتجات بواسطة [اغروس] هلام أن تكون على يقين من أن الحجم الفعلي مماثل لحجم المحسوبة (انظرالشكل 3جيم، ²²).
   1. وبدلاً من ذلك، الاستفادة من فحص الحمض النووي حساسية عالية التي تمكن من قياس كمية الحمض النووي النزاهة وحجم أمبليكون، وتركيز (الجدول للمواد، الشكل 3د).
      ملاحظة: في هذه الدراسة، حجم مكتبة متوسط تم حسابه على أساس مجموع أطوال محول وأطوال مؤشر حجم amplicon V1-V3 من الإشعال. وكان متوسط حجم 668 bp.
   2. يتم تطبيع تركيزات عينات باستخدام الصيغة في الجدول 8.
3. تمييع عينات 4 نانومتر وتجمع 5 ميكروليتر من كل عينة 4-شمال البحر الأبيض المتوسط في أنبوب واحد للتسلسل.

12-تسلسل المكتبة باستخدام "نظام تسلسل الجيل القادم" وتحليل البيانات

1. تسلسل المكتبة.
   ملاحظة: لهذه الدراسة، تقوم جامعة يوتا عالية الإنتاجية الأساسية علم الجينوم تمسخ مكتبة وعينه التسلسل (كما هو موضح في ^6،22).
2. تحليل البيانات.
   ملاحظة: لفصل البيانات من العينات المجمعة، وحددت ما يلي: فهرس ومفصولة (كما هو موضح في ²²).
3. إنشاء ملفات فستق والاستفادة من هذه لتحليل البيانات اللاحقة.

13-تحليل البيانات المتتابعة من مكتبة Amplicon 16S

ملاحظة: يتم إجراء هذه الخطوة كما هو موضح في الكاثوليكي et al., 2017⁶.

1. تثبيت أدوات تحليل البيانات المتاحة بحرية (انظر الجدول للمواد؛ ²⁴).
2. تجميع ملفات فستق ديمولتيبليكسيد من بيانات متسلسلة (كما هو موضح في^،من²⁵²⁶). تجاهل كافة تسلسل مفككة.
3. إجراء تحليلات عقب حيثياته مفتوحة تصنيفية وحدة (أسامة) انتقاء بروتوكول (كما هو موضح في ²⁷).
   1. بن التسلسلات في ملف واحد فاستق بواسطة سامبليد وتسلسل المجموعة مع 97% أو أكبر من التشابه في OTUs، كما هو موضح في ²⁸. قم بمحاذاة تسلسلات الممثل لمجموعة مع طول التسلسل الحد الأدنى من 150 و 75% في المئة هوية^29،30أساسية. تعيين التصنيف ك وصف²⁸.
      ملاحظة: يمكن إهمال عينات وتحليلها³¹، تليها التعيين التصنيفي وأسامة الجدول بناء³².
   2. إنشاء ملف رسم خرائط التي تحدد أسماء وصفية وخصائص العينات إلى الارتباط بتحديد نموذج التحقق من صحة ملف تعيين^33،34.
   3. جعل شبكة أسامة الذي يربط OTUs بوصف العينة باستخدام ملف تعيين³⁵.
   4. حساب ملخصات التصنيف من حيث الوفرة النسبية بتلخيص الأصناف عن طريق قطع³⁶.
   5. استكشاف التنوع ألفا من عينات على عمق التسلسل موحدة مناسبة للعينات. لتحديد العمق المناسب للتنوع ألفا، تلخيص مجموع التهم التي لوحظت في كل عينة باستخدام الأمر جدول تلخيص كل منطقة أحيائية، كما هو موضح في ³⁷.

Representative Results

أظهرت العديد من الدراسات أن ممارسة الطب العقل والجسم بتحسين النتائج الصحية. وبالمثل، يحسن الإثراء البيئي في الفئران، النتائج بما في ذلك تحسين عمر وورم الجرح إصلاح⁶. ولذلك، وضعت إجراء هة بهدف تحديد دور الحجمية في هذا النمط الظاهري أثناء أول تطبيع ميكروبيومي قبل البدء بالتجربة (الشكل 1). الأهم من ذلك، إدماج جميع تربية الحيوانات في مستعمرة الماوس لمدة شهر واحد على الأقل قبل البدء في تربية، والوليد الجراء مساكن يشترك مع الأمهات في قفص كبير واحد لتطبيع انتقال الحجمية قبل التجربة. عند الحيوانات ما بين 21 و 28 يوما القديمة، هي الفطام أعدادا متساوية من كل الوراثي في السكن بهم كل منهما، EE أو بيئات NE (الشكل 2أ). في 16 أسبوعا، البراز من جميع الحيوانات التي يتم جمعها والمتجانس (الشكل 2ب)، متبوعاً بعزل الحمض النووي البكتيري. وأخيراً، 16S تتضخم أمبليكونس من البراز ميكروبيومي الحمض النووي والرمز الشريطي مفهرسة للسماح للتسلسل من جميع ميكروبيومي المكتبات في وقت واحد (الشكل 3). ويبين الشكل 4تسلسل فريدة من نوعها التي حددت في وزن والورم إذ تضع الحيوانات في ظروف ني وهه. من المثير للاهتمام، هة لا تحسين التنوع البيولوجي في وزن الحيوانات، ولكن يزيد إلى حد كبير التنوع البيولوجي في الورم تأثير الحيوانات (الشكل 4)، مما يدل على أن هذا الأسلوب يتيح تحسين التنوع البيولوجي. وهذه الزيادة في التنوع البيولوجي يمكن أن يعزى إلى الوجود المتزايد للأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا، مع كبير يزيد في أصناف الفابروتيوباكتيريا، وبيتابروتيوباكتيريا، والنقصان في جامابروتيوباكتيريا المسببة للأمراض (الرقم 5 ; تكميلية الجدول 1). أكبر زيادة في بيتابروتيوباكتيريا فئة هو جنس ستريلا، commensal المحتمل المتورطين في تدهور إيغا يفرز (الشكل 6، أيضا انظر³⁸).

الشكل 1 : عبارة عن تمثيل للمخطط الزمني التجريبي. وتمثل نطاقات قصيرة ويندوز 7 أيام، كما يتم إنجاز معظم البروتوكول بتزايدات من 7 أيام. يساعد هذا أيضا في تصور طائفة الإعمار ألجرو عبر التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : ه ه وني الإسكان الظروف والبراز هوموجيناتيس (كما هو موضح في البروتوكول)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : إعداد مكتبة ميكروبيومي 16S- (أ) "بكر أونبوريفيد" أمبليكون المنتجات المستمدة من البراز المجينية الحمض النووي. (ب) الفهرسة لوحة الرسم تصميمها وفقا للبرمجيات المستخدمة (الجدول للمواد، ²³). تركيبات الرقم القياسي المزدوج، I7 (فهرس 1؛ الصف) و I5 (فهرس 2؛ العمود)، وترد لكل عينة. كل فهرس هو 8 bp في الطول. إعداد عينة تشير إلى أرقام الماوس الخاصة بكل منها من دراسات هة. (ج) المنتجات أونبوريفيد فهرس PCR. (د) نوعية التحليل النهائي لتنقية وتجميع المكتبات 16S. (أ، ج، د) السهام السوداء تدل على 550 شركة بريتيش بتروليوم أمبليكون ومكتبة مفهرسة bp 668. الأسهم الحمراء تشير إلى المنتجات غير المحددة التي يتم التخلص من بعد تنقية كما هو موضح في d العليا وعلامات انخفاض حجم علامات تضاف إلى العينة للرجوع إليها في الحجم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : التغيرات في التنوع ألفا بعد هة من Tcf4^Het/+ الجيش الشعبي الكونغولي^مين/+ الحيوانات. ألفا تنوع WT و Tcf4^Het/+ الجيش الشعبي الكونغولي^مين/+ الورم مع الحيوانات. في 20,000 ما يلي: ني وهه WT، ف= 0.64 وني وهه من Tcf4^Het/+ Apc^دقيقة/+، p= 0.03 استخدام الاختبار t عينة اثنين مع تصحيح ولش. مقتبس من الكاثوليكي et al., 2017⁶. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : هة بوساطة التغييرات بعد هة من Tcf4^Het/+ الجيش الشعبي الكونغولي^مين/+ الحيوانات. R-ggplot2 التي تم إنشاؤها بقطع الخط الطولي مربع تدل التغيرات في وفرة للأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا وفئات الفابروتيوباكتيريا وبيتابروتيوباكتيريا وجامابروتيوباكتيريا. تتم الإشارة إلى القيم المتطرفة كدوائر. p= 0.005 استخدام اثنين--نموذج تي-الاختبارات مع التصحيح ولش. أشرطة الخطأ محسوبة باستخدام الخطأ المعياري للوسط (SEM). مقتبس من الكاثوليكي et al., 2017⁶. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : التغيرات في الوفرة النسبية ستريلا عقب هة من Tcf4^Het/+ الجيش الشعبي الكونغولي^مين/+ الحيوانات. تتم الإشارة إلى القيم المتطرفة كدوائر. p= 0.005 استخدام الاختبار t عينة اثنين مع تصحيح ولش. أشرطة الخطأ محسوبة باستخدام sem. مواءمة من المكتب وآخرون.، 2017⁶. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تكميلية الجدول 1: "التصنيف من البكتيريا المعزولة" من "البراز التي جمعت" من الفئران ني وهه. تصنيف عبر الأنماط الجينية على مستوى الأسرة في اللغات (A) والفئة (ب) وأمر (ج)، (د) الأسرة وجنس (ه). مقارنات ني وهه من نفس النمط الوراثي أو WT إلى Tcf4^Het/+ الجيش الشعبي الكونغولي^مين/+. تحسب قيم P-استخدام اختبار t عينة اثنين مع تصحيح ولش. مقتبس من الكاثوليكي et al., 2017⁶. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

البند	المساحة الإجمالية (بوصة2)	المساحة الإجمالية (سم2)	حجم القفص (بوصة) L x العرض x العمق x الارتفاع	قفص الحجم (سم) L x العرض x العمق x الارتفاع
عنصر تحكم واحد كيج (شمال شرق)	68.25	440.32	10.5 × 6.5 × 5.5	26.67 × 16.51 x 13.97
قفص كبير واحد (هة)	264.36	1706.32	13.87 x 19.06 x 7.75	35.24 × 48.42 × 19.69
أقفاص كبيرة اثنين (هة)	528.72	3412.64	2 @ 13.87 x 19.06 x 7.75	2 @ 35.24 × 48.42 × 19.69
منصات اثنين (هة)	93	600	2 @ 11.8 x 3.94 × 2.95	2 @ 30 × 10 × 7.5
اثنين من أقفاص كبيرة مع منصات اثنين (هة)	621.72	4013	2 @ 13.87 x 19.06 x 7.75 + 2 @ 11.8 x 3.94 × 2.95	2 @ 35.24 × 48.42 × 19.69 + 2 @ 30 × 10 × 7.5

الجدول 1: أحجام هة والقفص ني و "مساحة الأرضية".

الحيوانات المسموح بها في قفص	المطلوب البوصة المربعة للحيوان الواحد	مجال هة كيج (بوصة2)	مجموع الحيوانات المسموح به
يصل إلى 25	12	622 في2 (4013 سم2)	يصل إلى 25
25 +	15	622 في2 (4013 سم2)	يصل إلى 41
الإناث مع القمامة	51	622 في2 (4013 سم2)	يصل إلى 12

الجدول 2: يسمح عدد حيوانات في أقفاص استناداً إلى مساحة الطابق ¹⁵ .

أمبليكون [بكر] كبسولة تفجير
إلى الأمام	5-تكجتكجكاجكجتكاجاتجتجتاتاجاجاكاجأجاجتتجاتكمتجكتكاج-3 '
عكس	5-جتكتكجتججكتكجاجاتجتجتاتاجاجاكاجتاككجكجكتجكتجكاك -3 '
موضع تسلسل معين تظهر بخط غامق وغير غامق هو تسلسل محول المتراكمة.

الجدول 3: الإشعال PCR أمبليكون.

تفاعل Amplicon PCR إعداد
	وحدة التخزين
الحمض النووي الميكروبي (5ng/ميكروليتر)	ميكروليتر 2.5
إلى الأمام التمهيدي (1 ميكرومتر؛ من الخطوة 5.1.2)	ميكروليتر 5.0
عكس التمهيدي (1 ميكرومتر؛ من الخطوة 5.1.2)	ميكروليتر 5.0
2 X ميكس HotStart جاهزة	ميكروليتر 12.5
المجموع	ميكروليتر 25.0

الجدول 4: مزيج PCR أمبليكون.

إعداد بكر أمبليكون
95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
25 دورات:
	95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
	55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
	72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية
72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
اضغط على 4 درجة مئوية

الجدول 5: إعداد البرنامج بكر أمبليكون.

فهرس PCR الباركود الجمعية
الحمض النووي	ميكروليتر 2.5
الفهرس التمهيدي 1 (N7XX)	ميكروليتر 2.5
الفهرس التمهيدي 2 (S5XX)	ميكروليتر 2.5
2 X ميكس HotStart جاهزة	ميكروليتر 12.5
بكر الصف المياه	5 ميكروليتر
المجموع	25 ميكروليتر

الجدول 6: مؤشر مزيج PCR.

فهرس PCR الإعداد
95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
8 دورات من:
	95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
	55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
	72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
اضغط على 4 درجة مئوية
مخزن في-20 درجة مئوية

الجدول 7: تعيين فهرس PCR برنامج المكياج.

نموذج تركيز الصيغة لتجميع

(تركيز الحمض النووي في نانوغرام/ميكروليتر) x 106 = تركيز في شمال البحر الأبيض المتوسط (660 غ/مول × مكتبة متوسط الحجم)

مثال من هذه الدراسة:

(85.2 نانوغرام/ميكروليتر) x 10 ^ 6 = 193.3 شمال البحر الأبيض المتوسط (660 g/mol x 668 bp)

الجدول 8: صيغة لتطبيع قبل تجميع عينات

Discussion

يسمح هذا الإجراء لتحليل الحجمية المعزولة من البراز بعد الإثراء البيئي عادي أو ورم مع الحيوانات. لأن هذه التجارب الكبيرة التي تنطوي على تربية للحصول على العديد من الحيوانات من جنسين مختلفين والأنماط الجينية، تطبيع ميكروبيومي بين الحيوانات قبل بدء التجربة أمر ضروري لتجنب هة غير المتصلة بآثار على ميكروبيومي التنوع البيولوجي.

للاتساق بين ظروف ني وهه، تجري عملية تربية لضمان أن جميع الفئران في البداية التعرض للميكروبات نفسها و، ولذلك، من المتوقع أن يكون مماثلة ميكروبيومي محتويات. فمن الممكن، ومن المحتمل أن النمط الوراثي الماوس يؤثر على تكوين ميكروبيومي. ولهذا السبب، تمسك الماوس أرقام كل الوراثي بين ني وهة الظروف أن تكون على يقين من أن أي الحيوان الذي يستهلك البراز ستواجه تنوع مماثل ميكروبيومي.

عدة صعوبات جلية عند تصميم هة التجارب. أولاً، العدد الإجمالي للحيوانات اللازمة للتجارب مرهون بتفاصيل التجريبية، ولكن العدد الإجمالي هو أيضا محدود بالعدد الحيوانات المسموح بها في القفص. على سبيل المثال، استخدمت البيانات التاريخية المحيطة بها الماوس البقاء على قيد الحياة في تجربة هة أولية لحساب عدد الحيوانات لتحديد الآلية الكامنة وراء بقاء تحسن لوحظ في التجارب السابقة. من هذه البيانات، ما مجموعة 17 الحيوانات في مجموعة المقارنة كانت مطلوبة من أجل قوة 80% للكشف عن اختلاف في البقاء على قيد الحياة في الوجهين اختبار t حيث ألفا = 0.05. بذلك، يجب أن تراعي الحيوانات 4-5 في المجموعة عنصر التحكم مقابل 20-24 (أو ما يصل إلى 41) الحيوانات في قفص في المجموعة التجريبية حساب سلطة. ولذلك، هناك حاجة إلى عدة أقفاص مجموعة مراقبة جنبا إلى جنب مع القفص التجريبية. علاوة على ذلك، مع الأنماط الجينية معقدة، من الصعب الحصول على أرقام الحيوان كافية لكل الوراثي، مما يتطلب أعدادا كبيرة من الإناث تربية المطلوبة. ومع ذلك، مع النماذج الأخرى التي تتواجد فيها الاختلافات المعدلة وراثيا أقل، يمكن تحليلها أكثر الحيوانات من نفس النمط الوراثي في هذا النظام ومربي أقل ضرورية. في الولايات المتحدة، يمكن أن يضم 12 من الإناث الحوامل في 633² من الفضاء (الجدول 2). مع هذه المسألة أن الجراء الحصول على كبار السن، أنها تأخذ مساحة أكبر. ونظرا لأن فصل الجراء الذكور عن الإناث الجراء في أيام 14-21، استثناء معتمدة إلى القاعدة الفضائية في بعض البلدان قد يكون ممكناً. وبخلاف ذلك، يمكن أن تكون الجراء الذكور والإناث جينوتيبيد وتحديدها، وثم فصل في سن أصغر مع الأمهات البقاء أدناه إعداد الماوس كحد أقصى. من الضروري للحصول على الموافقة لهذه الدراسات، والتقيد بالقواعد المحلية بشأن القيود الفضاء. وأخيراً، مع الحجمية، عدد الحيوانات اللازمة للكشف عن الاختلافات الصغيرة حتى في تكوين الحجمية صعبة لحساب مسبق. بينما في هذه الدراسة، تم العثور على اختلافات كبيرة في الحجمية مع الحيوانات 4 كل مجموعة، فمن الممكن أن زيادة ذلك العدد من الحيوانات من شأنه أن يكشف الحجمية التي هي أكثر تنوعاً بين الفئران EE أو تتغير إلا قليلاً من هة.

توضح هذه المقالة طريقة خاصة المعدات والفراش، التي تستخدم، الذي على السطح قد لا تظهر الأساسية. ومع ذلك، العديد من القضايا غير الواضحة التي تؤثر على الاتساق يمكن أن تصادف وتحتاج إلى معالجة قبل الشروع في هذه كبيرة جداً، باهظة الثمن، ودراسات تستغرق وقتاً طويلاً. مسألة رئيسية واحدة هي التهوية القفص. مع إعداد كبيرة من الحيوانات في قفص، يصبح مسألة التهوية، ومسألة أن معظم الباحثين لا تأخذ في الاعتبار عند محاولة توفير البيئات اتساقا بين المراقبة واقفاص التجريبية. وتوضع جميع الأقفاص في إعداد وصف في خزانة التهوية مساواة التهوية عبر التجريبية والتحكم في أقفاص. لا يمكن أن يتحقق هذا عند استخدام الأقفاص تفعل ذلك لا يصلح في خزانة التهوية. وسيلة أخرى لتطبيع التهوية بين التجريبية ومراقبة الحيوانات يمكن اختبارها ويطبق باستمرار، ولكن لا يتم استكشاف هذه الأساليب في هذه الدراسة. وتنشأ مسائل الاتساق مماثلة مع الأسرة. في النظام النموذجي سرطان القولون المستخدمة في هذه الدراسة، سوف يبتلع الحيوانات التي لديها أمراض الجهاز الهضمي أنواع معينة من الأسرة، لا سيما الذرة الكوز الفراش، مما يؤدي إلى انسداد الجهاز الهضمي ومرض. من المهم أن تضع ذلك في اعتبارها إذا كانت الحيوانات معروفة لاستيعاب الأسرة عندما احتلت ليس خلاف ذلك، كما هو الحال في بيئة المراقبة. هذه الظاهرة والآثار الصحية غير متناسقة اللاحقة سيؤثر تأثيراً عميقا على جميع البيانات.

المورثة 16S ريبوسومال قد استخدمت كوسيلة لدراسة السكان البكتيرية. وهو يتضمن المناطق التسع التي تعبر عن التنوع الجيني و V1-V9 اينتيرسبيرسيد المناطق المصانة التي تبقى بدون تغيير نسبيا بين الأنواع البكتيرية³⁹. ويوفر منطقة V1-V3، على وجه الخصوص، احتمال أعلى لتحديد مستوى الأنواع³⁹. V3 V1 مماثلة دراسات حول سرطان القولون والمستقيم (CRC) و "الورم الحميد القولون المتقدم" الاطلاع على التغييرات في يعج ثلاث تهم: Bacteroidetes، فيرميكوتيس، وبروتيوباكتيريا^21،،من⁴⁰⁴¹. وقد أفيد أيضا أن ممارسة يمكن أن تحول السكان الميكروبية ويؤدي إلى زيادة في فيرميكوتيس⁴². ولهذا السبب، حددت هذه الدراسة السكان ميكروبيومي باستخدام كبسولة تفجير V1-V3 عقب 16S الجينومية مكتبة بروتوكول الإعدادية²² يحتمل أن تحديد آثار الإثراء البيئي في يعج هذه معروفة لتغيير في الورم الحميد واتفاقية حقوق الطفل. يمكن تعديل هذا الإجراء تضخيم وتسلسل المناطق الأخرى متغير من الجينات الرنا الريباسي 16S. إحدى الطرق هي باستخدام "مسبار مطابقة" لفهم التصنيف النشوء والتطور من الحجمية الموجودة في العينة التي سيتم تحديد بالتحقيق. وبهذه الطريقة، يمكن استهداف المسابير تحديداً تعريف وتصنيف فيلوجينيتيكالي الميكروبات للفائدة. هذا يسمح لوصف مختلف الحجمية الموجودة في عينات البراز، وقد تكشف إضافية EE-تعتمد على التعديلات في ميكروبيومي ورم تحمل الفئران التي قد تؤثر على تطور المرض.

باستخدام هذا الإجراء، جنس ستريلا اعتبرت جنس آخر تغيير بعد هة للورم مع الحيوانات. هذا الإجراء يمكن تكييفها لاستيعاب الدراسات التي تستخدم أي أسلوب يعني لتحليل الآثار المترتبة اضطراب في تكوين ميكروبيومي في نماذج معدلة وراثيا من الأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، بدلاً من هة, يمكن تلقيح الفئران مع ستريلا لتحديد ما إذا كان التطعيم ستريلا كافية لزيادة التنوع البيولوجي الميكروبي والجرح إصلاح في ورم الذكور الأسبوع 16 عاماً مع الحيوانات.

مما لا شك فيه، هو الجانب الأكثر فريدة من نوعها لهذا البروتوكول القلق إزاء تطبيع الحجمية قبل هة والحفاظ على التنوع ميكروبيومي في جميع أنحاء الدراسات هة. حيث يتم باستمرار تحسين الدراسات ميكروبيومي، فمن المحتمل أن تنشأ أساليب أكثر قوة لتميز في ميكروبيومي، وتوصيف ميكروبيومي في هذا البروتوكول سوف تصبح عتيقة. على سبيل المثال، قد المسابر المستخدمة لتضخيم الرنا الريباسي 16S مع الدراسة الحالية، والتحيز، واستنادا إلى التحقيقات التي يتم اختيارها، ولا تميز جميع البكتيريا الموجودة في ميكروبيومي. بينما بلا شك سوف تحسين الأساليب المستخدمة في المسح وتميز في ميكروبيومي، الركيزة الأساسية لتصميم وتشغيل هة التجارب بينما نصب تطبيع ميكروبيومي تبقى جانبا أساسيا من جوانب التجارب هة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teklad Diets/Harlan Labs Chow	Harlan Labs	3980X	Standard irradiated chow formulated by Dr. Mario Capecchi in collaboration with Harlan Labs.
Cell-Sorb Plus bedding	Fangman Specialties	82010	Autoclave prior to use.
AIMS Tattooing System For Neonates	AIMS	NEO-9	https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Other animal grade tattoo systems and inks can be used with similar results including the Aramis Micro Tattoo Kit.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Complete with cage, AllerZone filter top and modular diet delivery system	Lab Products	82120ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment Device	Lab Products	82109ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Length X 19-1/16" Width X 7-3/4" Depth	Lab Products	82100ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top	Lab Products	82101ZF	Each EE cage requires one of each catalog # 82120ZF, 82100ZF, and 82101ZF, as well as two of 82109ZF. Food is only in one side.
Tunnel	Bio-Serv	K3323 or K3332	Connect cages together and use for enrichment
Grommet to connect Tunnel to cages	Fabricated by the University of Utah Machine Shop	n/a	Be certain the material is resistant to chewing and autoclavable
Fast-track wheel	Bio-Serv	K3250 or K3251	Use with mouse igloo and floor
Mouse Igloo	Bio-Serv	K3328, K3570 or K3327	Use with Fast-track wheel and floor
Mouse Igloo floor	Bio-Serv	K3244	Use with mouse Igloo and Fast-Track
Mouse Hut	Bio-Serv	K3272, K3102 or K3271
Crawl Ball	Bio-Serv	K3330 or K3329
Bio-hut	Bio-Serv	K3352	Wood pulp hut used for sheltering and nesting
Adhesive film	VWR	60941-072	Use to temporarily cover drilled hole in large cage to prevent mice from escaping
Laminar Flow Ventilated Rack	Techniplast	Bio-C36	The cabinet we used in this study is not currently supplied. The Bio-C36 is very similar.
1.5 mL Microfuge Tube- RNAse and DNAse free	Any supplier
QIAamp DNA Stool MiniKit	Qiagen	51504	This kit supplies reagents for 50 DNA preparations. Stool Lysis Buffer=ASL; Guanidinium Chloride Lysis Buffer= AL; Wash Buffer 1 with Guanidinium Chloride= AW1; Wash Buffer 2= AW2; Elution Buffer with EDTA=AE
Waterbath (capable of heating to 95)	Any supplier		For 94 degree incubation of stool samples to lyse cells.
Waterbath (capable of heating to 70 degrees)	Any supplier		For 70 degree incubation of stool samples
Ethanol (200 proof)	Sigma Aldrich	E7023
Fluorometer: Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA broad Range Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32850
EB Buffer or 10 mM Tris pH 8.5	Qiagen	19086
Experiment specific primers	Any Supplier
PCR grade water	Any supplier
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Kapa Biosystems	KK2601	For Amplicon Amplification (1.25 mL allows 100 rxns).
Agarose for running diagnostic gels	Any supplier
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace	Agilent	5067-5583	TapeStation or Bioanalyzer instruments are common in Institutional Genomics Cores to analyze library quality . Alternatively a Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) can be used.
Agencourt AMPure XP Magnetic Beads	Beckman Coulter	A63880	Magentic beads For PCR cleanup- 5 mL will clean 250 PCR reactions
Magnetic stand	Life Technologies	AM10027
Library Preparation Guide	Illumina		Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
Unique Dual Indexing	Illumina	Illumina Experiment Manager Software	Freely available at: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index Kit	Illumina	FC-131-1002	Used to add barcodes to amplicons
MicroAmp Optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems/ThermoFisher	N8010560
TruSeq Index Plate Fixture	Illumina	FC-130-1005
Adhesive clear plate seal	Applied Biosystems /ThermoFisher	4360954	Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp adhesive film
Sequencing by MiSeq with v3 reagents and dual 300 bp reads	Illumina	MS-102-3003
PhiX Control Kit	Illumina	FC-110-3001
Proteinase K (600 mAU/ml)	Qiagen	19131	Equivalent to 20 mg/ml of proteinase K. Supplied with QiaAmp kit
Data Analysis Tools	Qiime	QIIME software Tools	Installation may differ based on your system and the QIIME website describes several options (http://qiime.org/install/install.html). For this study, MacQIIME software package 1.9.1 was utilized (compiled by Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Step 13.2.	Qiime	FastQ Join method	(http://code.google.com/p/ea-utils  ).  For this study Multiple join paired ends was used http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis, Durham, NC. (2011).
Step 13.3.	Qiime	De-Novo OTU picking protocol	http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Step 13.3.1.		Open Taxonomic Units (OTUs) using Uclust	Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Step 13.3.1.	Pynast	Pynast	Caporaso, J.G. et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).
Step 13.3.1.	Pynast	Pynast_Greengenes	DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). Greengenes version 13_8 was used in this study
13.3.1. Note:	Qiime	Multiple Split Libraries	http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Note:	Qiime	Pick de novo OTUs script	http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html
Step 13.2.2.	Qiime	Create a mapping file	http://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Step 13.2.2.	Qiime	Validate a mapping file	http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Step 13.3.3.	Qiime	Link the OTU to sample description to mapping file	http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Step 13.3.4.	Qiime	Summarize Taxa through plots	http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Step 13.3.5.	Qiime	Biome Summarize table	http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  In this study, all samples were rarified to 20,000 OTUs followed by analysis using alpha rarefaction script in QIIME.