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Cancer Research

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

doi: 10.3791/57183 Published: April 12, 2018

Summary

In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB 血管新生における補完機構のみが示唆されました。

Abstract

・ フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 癌抑制遺伝子の不活化は、人間の中枢神経系 (CNS) 内血管芽腫 (HBs) の開発で重要な役割を果たしています。しかし、細胞の起源と HBs (新生血管を含む) の進化の過程の両方残る物議を醸す、VHL HBs、古典的な HB 新生に基づいての抗血管新生が臨床試験で残念な結果を生成しました。抗血管内治療の臨床成功の翻訳 1 つの主要な障害は、この血管豊富な腫瘍血管新生の徹底的な理解の欠如です。この記事では体外でHBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案する.この手順で研究者は正確に HB 血管新生の複雑さを理解し、HBs で血管新生のこの一般的な形式の関数を識別できます。これらのプロトコルは、腫瘍の治療のため、または HBs 抗血管新生治療の最適化で将来の翻訳を支援する並進可能性が高い腫瘍については、最も有望な抗血管治療の評価に使用できます。結果は、HB の血管新生の複雑さを強調表示し、この一般的なフォームの血管新生が HB 血管新生の補完機構のみであることを示唆します。

Introduction

血管芽腫 (HBs) は、人間の中枢神経系 (CNS) にのみ見られる血管腫です。フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 病や散発的な病変の患者で開発します。VHL HBs は頻繁に再発のため外科的治療によって治癒が困難とこれに起因する遺伝的多発障害1。VHL 癌抑制遺伝子の不活化は、VHL HBs の腫瘍の根本的な原因と考えられている、(新生血管を含む) 細胞の起源と HBs の進化プロセスのまま大きく物議を醸す2です。したがって、HB 新生血管生物学的メカニズムの理解は、VHL HBs の最も有望な抗血管戦略に有用な洞察を提供可能性があります。

最近の研究では、HB 新生血管が発生学的血管3,45と似ていることを示唆しています。古典的な血管内皮増殖因子 (VEGF)-を介した血管新生血管の内皮細胞に由来する、関数の VHL の損失によって牽引されて増殖し、新生血管形成されている6に挑戦します。1965 年 Cancilla とジマーマンは、HBs の由来内皮7電子顕微鏡を使用してください。その後、間質細胞由来 vasoformative エレメント8それが見つかりました。1982 年、Jurcoは間質細胞が内皮細胞起源9あることを発見しました。したがって、我々 の仮説ひと血管内皮細胞が HB 血管新生10の元の細胞であります。VHL 患者手術から派生した HB 細胞の初代培養を使用することをお勧め、HB からプライマリ カルチャが、安定しない、細胞株の確立された3できませんでした私たちの以前の研究が示されます。また、HB 血管成分10,11の前駆細胞が含まれているために、3 D 環境で初代培養は HB 新生血管の細胞起源を識別できませんでした。したがって、プリミティブと古典的な血管内皮細胞のモデルとしてひと血管内皮細胞 (株) は、HBs の細胞の代替モデルとして役立つことができます。

回転楕円体の発芽アッセイは、組織工学12,13の新しいモデルです。本稿で、3 D コラーゲン ベース共システムの in vitroアッセイを発芽回転楕円体を使用して、開発された HBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価するための全体的な目標を持つ。

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Protocol

このメソッドは、承認されたガイドラインや研究倫理委員会の華山病院、復旦大学の規則に従い行った。対応する標準的な安全対策は、各ステップで続いていた。図式、図 1を参照してください。

1. 細胞培養とプラスミド構築

  1. 定期的に管理ダルベッコでひと臍帯静脈内皮細胞 (株) のイーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン加湿の 5% の 100 μ g/mL と補われる、変更された CO2インキュベーター37 ° C で
  2. ShRNA フラグメントの合成の ApaI と EcoRI PLKO.1 プラスミドを消化します。VHL shRNA ベクターのオリゴヌクレオチドのシーケンスが CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14であることを確認します。
  3. オリゴ、逆オリゴの 5 μ L、NEB バッファー x 10 の 5 μ L、ddH2O 一緒に (総容積は 50 μ L) の 35 μ L の 5 μ L 前方で、20 の µΜ システムを混ぜます。数時間で 4 分、ゆっくりと室温まで冷却 98 ° C で混合物を加熱します。
  4. 一晩焼なまし oligos と一緒に 4 ° C で T4 リガーゼ PLKO.1 プラスミドを縛る。16 時間後、25 μ L の有能な DH5α セルに結紮ミックスの 5 μ L を追加します。正常に結紮プラスミドをスクリーンし、シーケンスによって挿入されたフラグメントを確認します。

2. レンチ ウイルス パッケージと感染症

  1. 合計では、PLKO.1 shVHL または PLKO.1 shScramble のベクトルの 10 μ g、プラスミド psPAX2 のパッキングの 7.5 μ g、500 μ L の 25 分のためのウシ胎児血清 (FBS) なし DMEM メディアで封筒プラスミド pMD2.G の 2.5 μ g を混ぜます。
  2. FBS なし 7 mLDMEM を上記準備ソリューションに追加します。
  3. 直径 10 cm のティッシュの培養皿で FBS なし DMEM 293 FT 細胞。293 FT 細胞数が 1 × 107セルのカウンターを使用してであることを確認します。
  4. 293 FT 細胞の培地に transfection のため上記準備溶液 1 mL を追加します。
    注:293 FT 細胞ラインは、293 f 細胞ラインから派生し、安定 SV40 大きい T の抗原を表現します。そのため、レンチ ウイルスの生産のための適したホストです。
  5. 10% を含む DMEM 培に置き換える 6 h 後 FBS。
  6. トランスフェクション後 48 h でピペットを使用してメディアを収集します。
    注:10% を含む DMEM にウイルスが存在する政府短期証券。死んだ細胞は、培地を浮遊します。0.45 μ m の無菌膜を使用すると、死んだ細胞や不純物をフィルター処理します。一般的に、感染症 (MOI) の多様性をチェックする必要はありません。これは、安定した細胞ラインを確立することです。最後のステップで成功の感染なしすべての生きている細胞は、ピューロマイシンによって死んでしまいます。ShScramble グループと血管内皮細胞は、コントロール グループです。すべての血管内皮細胞が 72 h で使用されるピューロマイシン濃度と死ぬことを確認します。同じ数のセルをすべてきちんと備えています。
  7. 72 h のレンチ ウイルスのメディアで血管内皮細胞を培養します。ピューロマイシンを対照群として治療なし 24 時間使用血管内皮細胞の 2 μ G/ml の濃度で血管内皮細胞のメディアに追加します。この時点でセルは死に、コントロールを確認します。
    注:生きている細胞は、VHL ノックダウン細胞と shSramble 細胞の安定したセルラインを表します。メッキ密度で 5,000/ウェルの 96 ウェル プレートであります。

3. 血管内皮細胞スフェロイドの世代

  1. Huvec 細胞を trypsinize し、10 %dmem 培地で再懸濁します FBS。10 cm 培養皿の細胞の中程度で、typsin EDTA の 1 mL を追加します。
  2. 1 × 103細胞/ウェルの細胞密度で、3 D の丸底 96 ウェル プレートで細胞を播きます。まあ回転楕円体を停止する 0.50 μ L の回転楕円体を収容することができますそれを使用します。製造元の指示に従って細胞カウンター システムを用いた細胞を数えます。
  3. 37 ° C で 5% CO2連続 72 時間のセルを孵化させなさい。これらの条件の下で浮遊細胞は自動的に細胞スフェロイドを形成することを確認します。36 時間後培地の半分を交換してください。

4.体外血管新生アッセイ

  1. 4 ° C でゲル溶液を解凍し、減らされた血清培地で希釈比が 1:5 で割りますと。
  2. マイクロ ピペットを DMEM 培地から回転楕円体を吸います。減少血清培地 5 mL の回転楕円体を洗浄した後希釈のゲルで、ゆっくりと慎重に、回転楕円体を中止すること。空気の泡がないことを確認します。
  3. 15 ウェル プレートに 300 μ L の混合液を埋め込みます。37 ° C と 1 h の 5% CO2で潜伏後 400 μ L 減少血清培地を各ウェルに追加します。滅菌水を蒸発を妨げる加湿環境を生成する井戸の周りをご記入ください。
  4. その後、文化で 37 ° C 1 時間の湿度 100% で 5% CO2プレート。
  5. 慎重に古い培地を吸引し、各ウェルで内皮細胞成長サプリメントで 1% 減少血清中の 600 μ L で置き換えます。
  6. 倒立顕微鏡下で撮影後 12 h、24 h (40 *)。

5. データの解析

  1. スプラウト長さデータ (資材表) を取得するオンライン画像解析プラットフォームに画像をアップロードします。
  2. Web ページ、メールでアカウントを作成します。
  3. [アップロード] ボタンをクリックして画像をアップロードします。
  4. ダウンロード ボタンをクリックして結果をダウンロードします。
    注:ソフトウェアは、処理後の画像とデータが生成されます。データに 5 つの部分が含まれている: 累積的な芽の長さ、平均スプラウト長さスプラウト長さ、スプラウト領域と回転楕円体領域の標準偏差。処理後の画像の識別を容易にする別の色では、処理後の画像の各パラメーターの輪郭が表示されたら: 赤い表すもやしスケルトン、芽数を黄色、青い芽構造、白芽エンドとオレンジ回転楕円体。

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Representative Results

元の画像は倒立顕微鏡で撮影しました。コントロール グループと VHL グループの典型的なイメージは、図 2に示す-A1および図 2-A2。コントロール グループの発芽の長さは VHL グループのより短いです。

画像をアップロードした後は、オンラインのプラットフォームは、分析結果を直接提供します。出力は、2 つの部分で構成されています: 処理された画像と対応する解析結果。コントロール グループと VHL 遺伝子の沈黙グループの加工画像が異なる色でマークされます (図 2-A3図 2-A4)。平均の芽の長さはそれぞれ、65 μ m とコントロール グループと VHL 沈黙グループで 125 μ m と平均の累積的な芽の長さは、芽の長さが増加を示すことが、それぞれ 680 μ m および制御グループと VHL 沈黙グループで 1250 μ mコントロール群 (図 2B) と比較して、VHL 沈黙グループで約 2 つのフォールド。VHL 欠乏がひと血管内皮細胞の血管形成能を促進することが示唆されました。

Figure 1
図 1.回転楕円体の発芽アッセイのスキーマします。手順 1 では、血管内皮細胞の培養皿を示しています。手順 2、血管内皮細胞は、手順 3 血管内皮細胞でフォームを示します内皮細胞スフェロイド自動的に 3 D プレート 72 h の 3 D の丸底 96 ウェル プレートに移動されます。手順 4 でスフェロイドを希薄化後のゲルに追加します。手順 5 で 15 ウェル プレートを覚悟の上の混合物を追加します。手順 6 は、回転楕円体萌芽 15 ウェル プレートを示しています。手順 7 では、倒立顕微鏡下で撮影された発芽の画像を表示します。手順 8 は、アップロードされた画像を示しています、手順 9 はプラットフォームから出力画像 (バー = 100 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.発芽アッセイ回転楕円体における血管内皮細胞の血管新生能力に VHL 遺伝子サイレンシングの効果。(A)口伸長制御 (A1) と血管内皮の VHL 沈黙回転楕円体 (A2) で 12 時間後の代表的なイメージ (バー = 100 μ m)。図 A3 および A4 の分析によるプラットフォーム数字 A1 と A2 にそれぞれの画像を表示します。赤を表すもやしスケルトン黄色の芽数、青い芽構造、白芽エンドとオレンジ回転楕円体。(B)もやしの長さ。統計分析は、独立スチューデントの t 検定を用いて行われた.P を表す < 0.05。コン制御;新生活、ひと臍帯静脈内皮細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

最近では、血管生物学の研究の複数のフィールドが血管内皮15の研究によって刺激されました。この記事での新規候補分子を識別するために操作の血管内皮細胞における機能の VHL 遺伝子の損失に起因する血管の形成を研究する実験モデルとして技術を発芽内皮細胞スフェロイドを開発した、血管新生のカスケード。我々 の知る限り、これは天体の変更された血管内皮細胞の血管新生効果を検討する最初の報告です。

組織 (腫瘍組織を含む) の血管新生は開発時にだけでなく、両方の生理学的および病理学的条件12,15 を介して血管新生と vasculogenic メカニズムで発生する複雑な過程,16. 発芽アッセイ回転楕円体、イベント17,18、発芽の結果 3 D 細胞マトリックス培養システムに埋め込まれている内皮細胞の自己凝集を含む複雑なカスケードによって特徴付けられる・毛細血管19の 3 D ネットワークの再生。この三次元ゲル包埋回転楕円体モデル血管形成およびその能力を適したマトリックスの真似より良い環境を提供するためのメカニズムを研究するための組織工学で広く使用されているシステムとなっています。ただし、この生物学的プロセスの最も重要なステップは、静止の内皮細胞17,20,21,22の活性化です。この手順では内皮細胞 neovessels23,24のレギュレータ成長遺伝子 VHL 遺伝子のサイレンシング天体によって作動し。古典的な内皮開始を介して対応する細胞外の環境 (含む外因性血管成長因子) と行列の外因性の誘導とは異なり、この修正法を拡張できるに多数天体の遺伝的メカニズムを解明するためのアプリケーション。次に、外因性のマトリックスの影響を軽減するためプロトコル実験で簡単なステップをしたゲルを希釈することによって最適化を行った。さらに、プラットフォームに画像をアップロードして解析結果を取得する分だけかかった。プラットフォームは、目的、発芽アッセイ イメージをオンラインの同等、および自動画像解析に実験者ができる画像解析サービスを提供します。したがって、プロトコルは、人為的要因による測定と計算のエラーを克服します。

血管新生カスケードの個々 のステップの機械的な理解は、腫瘍学の臨床応用を現在許可されている抗血管治療の発展のため合理的根拠を提供しました。本稿は血管内皮細胞の操作、新生血管の新規候補分子を識別するためにVHL遺伝子の機能の損失に起因する血管の形成を研究するシンプルで堅牢な回転楕円体を用いた測定モデルを確立カスケードは、多数の血管新生と血管関連アプリケーションに活用できます。作者は、この生体外モデルがいくつかの固体腫瘍 (例えば、腫瘍 vasculogenic 擬態) における血管新生の役割を評価し、他の可能な前駆細胞の潜在的な役割に役立つ追加情報を提供可能性があります推測生成する腫瘍 neovessels生体内で、グループとして、抗血管新生剤のみで治療に反応されている腫瘍患者で特に。

回転楕円体の発芽アッセイの血管新生と関連するメカニズムを研究する広く使用されている方法となっています。アッセイでは、古典的な 2 D の文化よりもより良い模擬環境を提供することによって重要な利点があります。近年、3次元共培養モデルを不均一性と腫瘍微小環境25内血管新生の複雑さを模倣した腫瘍血管新生の研究に開発されています。このモデルで 3 D 環境で管間質のコンポーネントと同様に、癌細胞を直接血管内皮細胞を培養しています。さらに、3 Dの in vitro培養系は、従来の細胞培養システムよりも治療薬に体内の応答をより正確に反映する示されています。さらに、このメソッドを使用して、胚性幹細胞、組織の成長、創傷治癒、虚血や炎症の差別化のため。従来の方法と比較して、我々 のアプローチは効果的で簡単に実装できます。体外血管新生の研究の役に立つツールだし、それはこのプロセスのより良い理解に新しい道を開くと考えています。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、上海科学委員会、技術 (15411951800、15410723200) からの助成金によって支えられました。著者教授 YuMei 温とその技術支援復旦の病原微生物部大学教授・ チャオ趙を感謝したいです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human umbilical vein endothelial cell Fudan IBS Cell Center FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium  Gibco 11995040
fetal bovine serum Gibco  26400044
PLKO.1-puro vector Addgene #8453
packing plasmid psPAX2  Addgene #12260
envelope plasmid pMD2.G Addgene #12259
3D round-bottom 96-well plates S-Bio MS-9096M
matrigel BD Biosciences 354234
Opti-MEM medium Gibco 31985-070 reduced serum medium 
15-well plate Ibidi 81501 Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight
endothelial cell growth supplements Sciencell #1052
10-cm culture dish Corning Scipu000813
Puromycin Gibco A1113802
typsin-EDTA Gibco 25200056
Automated Cell Counter System   BioTech
Image Analysis software  Winmasis http://mywim.wimasis.com 

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References

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発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生<em>体外</em>パフォーマンスを評価する包括的な手順
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Wang, Y., Chen, D., Chen, M., Ji, K., Ma, D., Zhou, L. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (134), e57183, doi:10.3791/57183 (2018).More

Wang, Y., Chen, D., Chen, M., Ji, K., Ma, D., Zhou, L. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (134), e57183, doi:10.3791/57183 (2018).

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