Summary
Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
Abstract
수지상 세포 (DC)는 이종 세포 인구에 그들의 세포 막 마커, 마이그레이션 패턴 및 유통, 그리고 그들의 프레 젠 테이 션 항 원에 T 세포 활성화 능력을 다른. 실험적 종양 모델의 대부분 예방 접종 필요 DC의 수백만, 그들은 널리 골 수 나 비장 으로부터 격리 됩니다. 그러나, 이러한 DC 크게 다 혈액과 종양 DC에 그들의 응답에서 면역성이 있는 복합물 (IC), 그리고 아마도 다른 lectin Syk 결합 수용 체. 중요 한 것은, 위험 관련 분자에 DC의 감도 감안할 때, 독 또는 crosslink 활성화 수용 체는 격리 중 하나는 항 체의 존재 수 DC의 못쓰게 되며 따라서 매개 변수를 영향을 하거나 적어도 복용량, 그들을 활성화 하는 데 필요한 따라서, 여기 우리가 그들의 조기 활성화를 피하고 있는 동안 혈액과 종양에서 MoDC를 고립 시키기를 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 프로토콜 종양 IC와 함께 MoDC 활성화 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.
Introduction
그들의 발견부터 수지상 세포 (DC) T 세포 감 별 법1왜곡 그들의 독특한 능력으로 인해 광범위 한 연구의 초점을 했습니다. 지난 몇 년간 광범위 한 연구 노력 종양 진행과 면역 2동안 다양 한 DC 하위 집합 및 그들의 기능을 정의 하기 위해 노력해왔다. Dc는 그들의 패턴 인식 수용 체, 조직 배포에서에서 서로 다른 이기종 세포 인구 구성 및 철새와 항 원 프레 젠 테이 션 기능3,,45. 다른 DC 하위 집합에 비해 monocyte 파생 된 DC (MoDC) 종양에 훨씬 더 풍부 하 고 순환에서 쉽게 생성 될 수 또는 종양 침투 monocytes6,7. 따라서, 그들의 상대 보급을 활용 하고자 하는 많은 임상 실험은 T 세포 면역 8,9를 유도 하기 위해 헌 MoDC의 비보와 비보 전 조작 기반으로 합니다.
마찬가지로, DC 기반으로 예방 접종 실험 종양 모델의 2-3 직렬 주사, 떨어져, 1-2 10 x 5-7 일 필요6 활성화 된 DC 펄스와 종양 항 원. 따라서, DC의이 많은 수를 달성 하기 위해, 대부분 마우스 연구 주로 사용 MoDC 7-9 일 (IL-4 마우스 설정에 필요 하지 않습니다)에 대 한 GM-CSF에 골 수 (BM) 선구자에서 교양10,11. 그럼에도 불구 하 고, 주어진 그 GM-CSF 녹아웃 쥐가 전반적으로 정상적인 DC 구획 12,의13, 그리고 그 문화에서 얻은 혼합된 인구를 주어진14 이러한 DC의 생리 적인 관련성 질문으로 불려 왔다.
또는, DC 비장 세포에서 정기적으로 격리 된 수 있습니다. 그러나, DC 구성 약 0.3-0.8% (약 7 × 105 DC/비장 결과), 총 비장 세포의이 세포, CD103만의+ DC 및 MoDC 림프 기관에 다시 마이그레이션할 수 있습니다. MoDCs 비장 DC 인구15,16의 약 10-15%를 구성, 이후 대부분 격리 프로토콜 약 1 × 105 MoDC 비장 당 양보. MoDC의 확장 GM-CSF, 비장 MoDC17100 증가 결과 분 비 하는 transfected B16 셀을 삽입 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나, DC 백신 개발을 위한 MoDC의 사용은 제한 때문에 인간과 취득에이 절차를 수행할 수 없습니다 MoDC 이미 매우 활성화 됩니다.
DC의 적절 한 숫자를 얻는 이외에 헌 암 세포에 대 한 효과적인 DC 백신을 개발 하기 위한 또 다른 도전은 완전히 DC를 활성화 하는 종양에 충분 한 위험 신호의 부족을 포함 한다. Co-stimulatory 신호 유도 패턴 인식 수용 체 (PRR), 또는 c 형 lectin 신호 통로18,19,,2021의 활성화를 통해 일반적으로 달성 된다. DC를 활성화 하기 위한 더 접근 표면 Fcγ 수용 체 (FcγR)와 상호 작용을 통해 항 원까지 자신의 능력을 악용 합니다. 실제로, 중요 한 원고 수 나타났습니다 예방 설정에서 종양의 성장을 막을 수는 BM 선구자 활성화에서 MoDC의 주입 종양-IgG IC 및 설립된 종양22,23 의 박멸을 이어질 수 있습니다 .
2 최근 논문, Carmi 외 는 BMDC 및 비장 DC, 달리 고 혈액 종양에서 MoDC에 응답할 수 없습니다 IgG IC 추가 자극 없이 발견 했다. 이 티로신 인산 가수분해 효소 신호24,25FcγR 통제의 상부 세포내의 존재 때문에 발견 되었다. DC에서 중요 한 검사점을 정의 하 여이 작품 성공 DC 기반 예방 접종에 대 한 요구 사항에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다. FcγR 신호, 그리고 아마도 비슷한 인 산화 폭포를 활용 하 여 다른 lectin 수용 체에서 신호 수 있도록 추가 자극에 대 한 요구 따라서 그들의 고립 동안 DC의 애 벌 칠을 피하에 대 한 필요성을 밑줄.
따라서, 현재 프로토콜 혈액 및 종양, BM, 비장 DC에서 현저 하 게 다르다에서 MoDC의 격리를 설명 하 고 과정에서 고려 가치가 주의 강조.
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Protocol
프로토콜 아래 마우스 MoDC의 격리를 참조 하십시오 아직 전반적인 원리 다른 DC 하위 집합 셀에도 적용 될 수 있습니다. 12-16 주 된 C57Bl/6j 생쥐 실험 동물 관리 인증-공인 동물 시설에 대 한 미국 협회에서 유지 되었다. 모든 프로토콜은 스탠포드 대학 및-텔아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 종양의 절연 관련 Monocyte 파생 된 DC
- 층 류 두건에서 CO2 안락사 마우스에서 종양을 제거 하 고 소 태아 혈 청 (FBS) 없이 RPMI 매체에 종양을 배치 합니다.
참고: 그것은 좋습니다 쥐를 면도 하는 모피에서 잠재적인 오염을 최소화 하기 위해 종양을 제거 하기 전에 그들을 70% 에탄올 스프레이. 더 큰 종양 때문에 허약 하 고 세포 죽음을 받아야 하는 경향이 경향이 적은 DC 종양 25-40 m m2 를 초과 하지 않는 수 있습니다. DC의 큰 숫자는 필요한 경우 각 마우스는 여러 사이트에서 종양 세포 주입 수 있습니다. - 후드 무 균 층 류, 수술이 위를 사용 하 여 작은 조각 (대략 1 x 1 m m2)으로 종양을 잘라.
- 30 mL 메 마른 플랫 바닥 관으로 자기 저 어 바, 행 크의의 5 mL를 포함 하는 하나의 마우스에서 모든 종양 조각을 소금물 (HBSS), 2 mg/mL 콜라 4, 및 0.01 mg/mL DNase 균형 추가 나.
주의: 골수성 세포 정상 상태 에서도 glycosylation 통해 에너지를 생산. 따라서, 10-15 분 만큼 적은 위해 포도 당 부족으로 포도 당 (HBSS, RPMI, 및 DMEM)를 포함 하는 유일한 사용 미디어 귀 착될 것 이다 세포 죽음 및 apoptosis 24 h.만 낮은 내 콜라 4, 콜라로 그람 양성 하 여 생산 사용 내 박테리아 (Clostridium histolyticum).
- 30 mL 메 마른 플랫 바닥 관으로 자기 저 어 바, 행 크의의 5 mL를 포함 하는 하나의 마우스에서 모든 종양 조각을 소금물 (HBSS), 2 mg/mL 콜라 4, 및 0.01 mg/mL DNase 균형 추가 나.
- 37 oC 인큐베이터에 약 200-400 rpm에서 20-30 분 자력으로 저 어.
- 완전 한 미디어의 5 mL을 추가 하 고 다시 적극적으로 일시 중단.
- 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다. 작은 셀을 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심.
주의: 직접 다음 효소 소화, 일부 종양 괴 고 상대적으로 많은 양의 세포 파편 또는 세포 외 기질을 포함 하는 셀을 분리 하지 마십시오. 셀 셀만을 얻기 위해 15% 밀도 그라데이션 매체에 적용 됩니다. - 10 x PBS osmolality, 조정 하 고 100 %Percoll 재고 솔루션을 1 mL와 밀도 그라데이션 매체의 9 mL를 일시 중단 합니다. 믹스 1.5 mL 밀도 그라데이션 매체 8.5 mL HBSS 솔루션 재고와 종양에서 파생 된 셀 펠 릿으로 적극적으로 섞는다. 부드럽게 계층 15% 밀도 그라데이션 매체와 실 온에서 20 분 400 rcf에 원심 분리기의 정상 DMEM의 2 mL. 폐기 supernatants, 셀 튜브의 하단에 펠 릿을 형성 됩니다.
- 두 번 다시 10 ml HBSS 2 %FBS, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM EDTA (절연 버퍼), 그리고 원심 분리기 4 oC 400 rcf 5-10 분에 작은 셀을 그들을 일시 중단 하 여 수송과 세포를 씻어.
- Hemocytometer trypan 블루 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 다시 일시 중단 1 x 108 셀 1 mL 절연 버퍼 및 4 oC CD11b의 30 μ와에서 그들을 품 어+ 활용 자석 구슬 15 분.
주의:이 DC를 활성화 하 고 세포 죽음을 유도 것 이다 CD11c 활용 된 구슬, 사용을 하지 않습니다. 안티-CD16/32 항 체와 FcγRII 및 FcγRIII를 차단 하지 마십시오. 항 체를 차단 FcγR 선 지도 kinases의 강한 인 산화를 유도 하 고 DC 프라임.- 4oc.에 5-10 분 동안 400 rcf에 절연 버퍼 및 원심 분리기 세포의 9 mL를 추가 하 여 초과 언바운드 비즈를 제거
- 상쾌한 발음 하 고 다시 1 mL 절연 버퍼에 셀을 일시 중단. 셀 prewashed 자석 열에 적용 됩니다. 두 번의 열 절연 버퍼의 3 mL 씻으십시오.
- 자석에서 열을 제거 합니다. 플라스틱 절연 버퍼 열에 6 mL 그리고 플런저를 밀어 여 살 균 컬렉션 튜브로 자석으로 표시 된 셀 밖으로 플러시. 원심 분리기 셀 400 rcf 4 oc.에 5-10 분에서
- 다시 1 x 107 셀 당 100 μ에서 세포를 일시 중단 하 고 다음 fluorophore 활용 된 항 체와 얼룩: 비재귀 부정적인 (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI 및 Ly6G), MHCII, Ly-6 C.
- 게이팅 측면 살포 (SSC)를 사용 하 여 작은 셀으로 셀을 정렬 하 고 산포 (FSC) 및 5 ng/mL GM-CSF를 보완 하는 완전 한 매체에서 문화 전달. 3 7 1 시간 동안 세포를 품 어 대 접시를 준수 할 수 있도록 oC. 그런 다음 전송에 느슨하게 및 새로운 문화 접시에 비 부착 한 세포.
참고: 마우스 MoDC CD11b로 정의 된+/CD11c+/MHCII안녕하세요/Ly6Clo/int 7,,2627. Ly6C의 표현 다를 수 있습니다 극적으로 종양 모델 사이 및 일부 모델 (예: LMP)에 MoDCs 완전히 Ly6C 식 부족. 전반적으로, 100 m m3 B16F10 종양은 일반적으로 약 4-5 배 106 총 셀에에서 발생 하는 DC의 5 x 104 포함 한. 이러한 세포의 10-15%는 면역 세포 하 고 8-10%는 MoDC. DC 숫자를 증가 하는 것은 여러 사이트에서 종양 쥐를 주입 하 여 얻을 수 있습니다. 정렬만 작은 SSC/FCS 셀 다른 골수성 세포로 CD11c 및 Ly6C와 같은 마커 표현할 수 있습니다.
선택 사항: MHCII에 대 한 부정적 표현 Ly6C안녕하세요 작은 SSC/FSC 셀으로 종양 침투 monocyte 정렬. 그 후, monocytes에서 생체 외에서 DC를 50 ng/mL GM-CSF와 문화.
2. 말 초 혈액에서 DC Monocyte 파생의 격리
참고: 성숙 MoDCs 마우스 혈액에 비교적 드문 때문에, 아래의 프로토콜은 그들의 파생에서 체 외에서 정렬된 monocytes에서 합니다.
- 혈액에 monocytes의 수준을 증가, 4 %isoflurane 쥐를 anesthetize 하 고 그들을 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) 50 μ PBS에 GM-CSF의 1 μ g으로.
- 후 1-2 h, CO2를 사용 하 여 쥐를 희생.
주의: 자 궁 경부 전위에 의해 한 생쥐 희생 하지이 내부 출혈이 발생할 것입니다. - Euthanization, 직후 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 피부 심장 수술가 위, 살 균 층 흐름 후드를 사용 하 여 커버를 제거 합니다. 에탄올과가 위를 청소 하 고 심 혼의 오른쪽 아 트리 움 잘라. 천천히, 20 mm EDTA HBSS 10 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용 하 여 우 심 실을 통해 마음을 플러시.
- Heparan 황산 염, EDTA를 포함 하는 살 균 관으로 흉 막 캐비티에서 무 균 주사기 혈액을 수집 합니다. 간 및 폐 되 핑크 나 화이트까지 중심부를 계속 합니다.
- 15 분 동안 실 온에서 400 rcf에 밀도 그라데이션 mediumand 분리기에 혈액 낮은 브레이크 적용.
주의: 사용도 무료 밀도 그라데이션 매체 (보통 미만 0.12 mL 당 유럽 연합).- 새로운 관으로 단 세포를 수집 합니다. 다시 10 ml 2 %FBS, 1% 페니실린/스와 10 mM EDTA (절연 버퍼), 그리고 4 o에서 다음 centrifuging HBSS C 400 rcf 작은 셀을 5-10 분에 대 한 일시 중단 하 여 세포를 씻어.
주의: 적어도 1 g/L 포도 당을 포함 하는 미디어에만 사용 합니다.
- 새로운 관으로 단 세포를 수집 합니다. 다시 10 ml 2 %FBS, 1% 페니실린/스와 10 mM EDTA (절연 버퍼), 그리고 4 o에서 다음 centrifuging HBSS C 400 rcf 작은 셀을 5-10 분에 대 한 일시 중단 하 여 세포를 씻어.
- CD11b 긍정적인 선택, 다시 1 mL 절연 버퍼에 1 x 108 셀을 일시 중단 하 고 4 oc.에 CD11b 활용 자석 구슬의 50 μ와 15 분 동안 그들을 품 어
- 절연 버퍼의 9 mL을 추가 하 고 5-10 분 4 oC. Aspirate에서 400 rcf에는 supernatants centrifuging 여 초과 비즈를 세척 하 고 다시 1 mL 절연 버퍼에 셀을 일시 중단. 제조업체의 지침에 따라 prewashed 자기 열에 셀을 적용 합니다.
- 자석에서 열을 제거 하 고 플라스틱, 열에 절연 버퍼의 6 mL 플런저를 밀어 여 살 균 컬렉션 튜브로 자석으로 표시 된 셀 밖으로 플러시. 원심 4 oC. 세척에서 5-10 분 동안 400 rcf에 셀 절연 버퍼의 3 mL로 두 번 열.
- 1 x 107 셀/100 μ 절연 버퍼와 얼룩 다음 fluorophore 활용 된 항 체와 세포를 다시 중단: 0.1 μ g CD115, 0.25 μ g MHCII, 그리고 0.1 μ g Ly-6 C/1 x 106 셀.
- 게이팅 작은 측면 살포 (SSC)와 작은 앞으로 분산형 (FSC) 셀에 의해 셀을 정렬 합니다.
참고: 마우스 염증 monocytes는 일반적으로 정의 된 CD115로+MHCIIlo/neg/Ly6C안녕하세요및 monocytes 순찰 CD115로 정의 됩니다/+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4, 5. 두 하위 집합 사이 분리는 필요 하다는 경우, 총 SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo 셀을 정렬할 수 있습니다. 순진한 및 종양 방위 쥐 포함 약 5-8 10 ×4 MoDC 혈액 및 최대 1 mL 당 105 MoDC 다음 x 4-5 GM-CSF의 주입. 그들의 약 70%는 염증 monocytes 고 30%는 monocytes를 순찰 하 고 있다. - 완전 한 미디어 20 ng/mL GM-CSF와 보완에 1 x 106 셀/mL의 농도에서 세포 격판덮개 1 일 후 추가 4-5 일에 대 한 비 점착 및 느슨하게 부착 세포 새로운 플레이트와 문화를 전송.
주의: DC 미디어 pyruvate와 보완 해야 하지.
3. 종양 IgG 면역성이 있는 복합물의 준비
- 완전 한 DMEM 미디어에서 70% 합류 하 75 cm2 문화 플라스 크에 문화 종양 세포.
- 0.25 %trypsin / EDTA-trypsinization 피하기 위해 가벼운 현미경 문화 플라스 크 및 모니터 셀 형태학에서 세포를 분리 하의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 트립 신 소화를 억제 하 여 4 oC, 5-10 분 작은 셀 400 rcf에 원심 (trypsin의 2 개 mL) 당 완전 한 문화 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
참고: Mycoplasma 상업 PCR 키트를 사용 하 여 종양 세포를 확인 해야 합니다. 그램 음성 박테리아와 곰 팡이 독을 사용 하 여 Limulus Amebocyte Lysate (LAL)의 존재에 대 한 시험 분석 결과28). 혈 청 0.22 μ M 통과 하 고 9 연방 규정 코드 바이러스에 대 한 테스트 해야 합니다. 또한, 37 oc. 2 일에 대 한 파운드 agar 또는 국물, 그리고 문화에 100-200 μ를 놓아 문화 미디어와 세럼을 테스트 - 워시 세포 다시 다시 10 mL PBS와 5-10 분에 대 한 400 rcf에 원심 분리기에서 그들을 일시 중단 하 여 트립 신 및 혈 청 유적에서 상쾌한 발음 하 고 2 번 더 세척을 반복.
- 실 온에서 10 분 동안 버퍼링 1.8 %paraformaldehyde 셀을 수정 합니다.
- 다시 10 mL PBS와 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심 분리기에서 그들을 일시 중단 하 여 세포를 씻어.
- Aspirate supernatants, 반복 두 번 더 세척.
선택 사항: 종양 이해 분석 실험에 대 한 셀 수 표시 37 oC에서 1 μ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 포함 하는 PBS에서 5 분 동안 그들을 배양 하 여. CFSE는 얼음에 10 분에 대 한 완전 한 미디어 다음 침묵 이다. 셀 잔여 염료를 제거 하려면 2% 혈 청을 포함 하는 PBS에 광범위 하 게 세척 되어야 한다.
- 다시 잠재적인 비 특정 단백질-단백질 상호 작용을 차단 하기 위해 FACS 버퍼 (PBS 보충 fcs가 2% + 5 mM EDTA) 셀 안티-CD16/32의 0.5 μ g/mL를 일시 중단 합니다. 100 μ 당 1 x 105 셀의 농도에 U 자형 96 웰 스/접시 플레이트.
- 5 μ g-105 셀 x 5 ng/1에서에서 배열 하는 종양 바인딩 항 체의 다른 희석을 추가 합니다. 15-20 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어.
참고: IgG 항 체 기술된24로 단백질 A 열에 순진한 20-24 주 된 여성 쥐의 혈 청에서 고립 되었다.
- 5 μ g-105 셀 x 5 ng/1에서에서 배열 하는 종양 바인딩 항 체의 다른 희석을 추가 합니다. 15-20 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어.
- PBS의 150 μ를 추가 하 고 5-10 분 4 oC 400 rcf에 접시 centrifuging 여 세포를 씻어.
- supernatants 무시 하 고 두 번 세척을 반복 합니다. 다시 100 μ FACS 버퍼 fluorophore 활용 된 이차 항 체를 포함 하는 셀을 일시 중단 합니다. 20 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어.
- FACS 버퍼의 200 μ를 추가 하 여 셀을 세척 하 고 접시 centrifuging 5-10 분에 대 한 400 rcf에 취소는 supernatants 및 세척을 반복.
- Cytometry 종양 바인딩 분석 하 고 셀 코트 하는 데 필요한 최소 농도 결정 합니다.
참고: 항 체를 증가 하지 의미 형광 강도 (MFI)으로 얼룩진된 종양 세포의 이상 요소가 isotype 제어 후속 기능 분석에 사용할 수 없습니다.
4. 종양 IgG IC와 MoDC의 활성화
- 3.4.3 통해 3.1 섹션에 설명 된 대로 최소한의 IgG 농도와 종양 세포를 코트
- 종양 IC와 함께 MoDC를 활성화 하기 전에 1 일 GM-CSF를 포함 하는 MoDC 문화 미디어를 교체 합니다. 이렇게 하려면 부드럽게 미디어를 발음 하 고 미리 데워 진된 완전 한 문화 미디어와 한 번 세포를 씻어.
참고: 적어도 2-3 h (또는 심지어 하룻밤) 정렬 후 GM-CSF 없이 완전 한 미디어, 그리고 IC와 그들을 활성화 하기 전에 격리 된 성숙한 종양 관련 MoDC 교양 수 한다. - 종양 통풍 관 분석, CFSE 표시 된 종양 IC MoDC 1:5 (IC:MoDC)의 비율로 추가 및 1 x 106 DC 당 완전 한 미디어의 1 mL에 12-16 시간 밤새 품 어.
- FACS MoDC 활성화 실험의 분석, 1:1 (IC:MoDC) 비율에서 종양-IC를 추가 하 고 12-16 시간 밤새 품 어.
참고: 것이 좋습니다 잘, 긍정적인 통제를 포함 하는 MoDC는 LPS 또는 다른 TLR agonists의 1 μ g/mL로 자극. - supernatants 발음 다음 하룻밤 활성화, 그리고 세척 세포 부드럽게 세 번 절연 버퍼, 또는 10 m m EDTA HBSS.
- 접시에서 DC를 분리, 2-3 분 1 ml HBSS 10 mM EDTA를 포함 하는 셀을 품 어 하 고 활기찬 pipetting으로 세포를 분리 합니다.
- 400 rcf에 세포를 원심 하 고 다시 1 x 106 DC 90 μ PBS 2 %FCS, 5 mM EDTA (FACS 버퍼)와 0.5 μ g 항 체를 차단의 보충을 중단. 5-10 분 동안 얼음에 품 어.
- 얼룩이 지는 세포에 항 체 혼합물의 10 μ를 추가 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.
- 셀을 5-10 분 4 oC 400 rcf에 원심 분리기 2 mL FACS 버퍼를 추가 합니다.
- 종양 IC와 함께 MoDC를 활성화 하기 전에 1 일 GM-CSF를 포함 하는 MoDC 문화 미디어를 교체 합니다. 이렇게 하려면 부드럽게 미디어를 발음 하 고 미리 데워 진된 완전 한 문화 미디어와 한 번 세포를 씻어.
- 다시 200 μ FACS 버퍼에 셀을 일시 중단 합니다.
- 추가 0.5-1 μ g/mL DAPI의 분석에서 죽은 세포를 제외 하는 샘플을 실행 하기 전에 1-2 분. 마십시오 하지-품 어 DAPI로 MoDC 10-15 분 이내에 그것을 걸릴 것 이다.
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Representative Results
우리는 처음 종양 세포에 바인딩할 순 syngeneic 고 수용자 쥐에서 항 체의 용량 비교. 이 위해, B16F10 LMP 종양 세포 라인 paraformaldehyde에서 고정 되었고 광범위 하 게 씻어. B16F10 흑색 종 세포 선, C57Bl/6 마우스의 폐 전이에서 원래 고립 되었다 이다. LMP는 KrasG12D에서 고립 되었다 췌 장 종양 세포 / +, LSL-Trp53R172H / +, 그리고 Pdx-1-Cre 마우스 129F1 마우스에 꾸준히 성장 하 고. IC를, 종양 세포는 1 x 105 종양 세포 당 syngeneic 또는 수용자 IgG의 2 μ g으로 얼음에 20 분 동안 incubated 했다. IgG 및 IgM 항 체 순의 순환에서 고립 된 단백질 A, 크기 배제 크로마토그래피로 다음에 20-24 주 된 쥐 설명24. 셀에 씻어 했다 그리고 PE 활용 된 쥐 반대로 마우스 IgG 이차 항 체, 물 고 교류 cytometer에서 평균 형광 강도 분석 했다. 그림 1A에 표시 된 대로 C57Bl/6 수용자 쥐에서 항 체 IgG 바인딩된 LMP 종양 세포 ex vivo 항 체 보다 훨씬 더 효과적으로 129S1 syngeneic 쥐에서. 마찬가지로, 129S1 수용자 IgG와 고정된 B16F10의 얼룩은 10 배 이상, 순진한 C57Bl/6 쥐에서 syngeneic IgG와 얼룩에 비해. 흥미롭게도, B16 종양 방위 쥐 비슷한 바인딩 용량 수용자 생쥐의 항 체를 생산 하는 종양 진행 (그림 1B) 중에 하지 못했습니다.
우리는 다음 장과 BM에서 DC의 혈액과 종양에서 MoDC의 IC 응답을 비교 하고자 했다. 종양 관련 MoDC를 격리 하려면 B16F10 종양 효소 단일 셀 정지를 해리 했다 했다. 면역 세포 CD45 자석 구슬를 사용 하 여 농축 했다 그리고 SSClo/FSClo/CD11c MoDC 정렬 추가 했다+/MHCII+/Ly6Clo FACS (그림 2A)에 의해. 그것은 그 다른 종양 DC 그들을 정의 하는 다른 마커를 할 수 있습니다. MoDC는 혈액에서 순환 monocytes 했다 CD11b 활용 된 자성 구슬에 의해 농축 고 추가 정렬 SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. 셀 후 GM-CSF, 1 일에 대 한 교양 했다 그리고 비 점착 및 느슨하게 부착 셀 MoDC (그림 2B)를 추가 4-5 일에 대 한 교양 및 새로운 접시에 옮겨 졌다. 우리가 사용 하는 BMDC, "금 표준" DC 많은 기능 분석 뿐만 아니라 비장 MoDC로 봉사 하는 기준점으로는 더 생리 DC 하위 집합을 반영 합니다. BMDC BM 프로 monocytes를 정렬 하 여 얻은 했다 (CD11b+/Ly6C안녕하세요/CD115안녕하세요/MHCIIneg), GM-CSF, 설명된24로 7 일 동안 배양 하는 그들의 뒤. 비장 MoDC는 단일 세포 현 탁 액 셀 스 트레이너를 통해 비장을 mashing 여에서 고립 되었다 (콜라와 전 보육 필요 하지 않습니다 비장 MoDC), 뒤에 자석 구슬 CD11b 활용 된 농축. 셀에 정렬 SSClo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCII안녕하세요/CD11c안녕 했다 그리고 37oC에 완전 한 RPMI에 1 시간 동안 배양 초기 계획 활동을 복원 합니다.
MoDC 활동에 IgG IC의 효과 조사, 우리 incubated 절연된 DC 하위 집합 미리 수용자 IgG와 코팅 고정된 종양 세포 또는 고정된 종양 세포와 하룻밤. BMDC 또는 IC와 비장 DC의 활성화 증가 CD86 MHCII 식 MoDC, 또는 종양 관련 MoDC (그림 3A)와 달리 결과. 글귀 CFSE 스테인드 종양에서 파생 된 단백질, 또는 수용자 IgG 없이 능력 또한 비교 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰, 비장 DC internalize 종양에서 파생 된 단백질 (그림 3B) 우수한 능력을 보여주었다.
함께 찍은, 이러한 결과 종양 DC와 MoDC 다르게 응답 비장 DC와 BMDC 보다 alloIgG IC와 활성화에 것이 좋습니다. 따라서, 예방 접종 전략을 DC BMDC의 활성화 패턴에 전적으로 기반으로 수 없습니다 종양을 활성화 하고자 합니다.
그림 1: 수용자 마우스에 그들의 순환에 있는 자연 발생 종양 바인딩 IgG 항 체: A. syngeneic (129S1)와 수용자 (C57Bl/6) 순진한 쥐의 혈액에서 분리 된 IgG 항 체와 스테인드 LMP 종양 세포의 형광 강도 (MFI)을 의미 한다. B. B16F10 종양 세포 IgG 항 체 syngeneic 종양 베어링 마우스 (C57Bl/6), 또는 수용자 (129S1) 순진한 쥐의 순환에서 격리를 incubated의 형광 강도 (MFI)을 의미 한다. 이 그림은 확장된 데이터 2A 및 2B Carmi Y 외에서 수정 되었습니다. 자연 521 7550:99-104, 201524.
그림 2: 정렬 마우스 MoDC 혈액과 B16 종양에서의 계획. A. 절연 고 MoDC 마우스 monocytes에서 경작의 정렬 계획 합니다. Confocal 현미경 검사 법 문화 (x400)에서에서 4 일 후 염증 및 순찰 monocytes의 DIC 이미지. B. 고립과 B16 종양에서 종양 관련 MoDC의 분류 체계 MoDC 숙박 문화 (x400) 후 B16 종양에서 고립의 대표적인 confocal 현미경 검사 법 DIC 이미지. 이 그림은 보충 그림 1 Carmi Y 외. JCI 통찰력 1:18:e89020, 201625에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 비장에서 MoDC와 BM 종양 보다 활성화의 다른 패턴을 표시 및 혈액 MoDC IC 가진 외피 다음. A. MHCII 그리고 CD86 식 DC와 하룻밤 incubated의 흐름 cytometric 분석 종양-IgG IC. B. 종양 글귀 (녹색)과 MHCII 식 (레드) DC의 Confocal immunohistochemistry incubated CFSE 표시 된 종양 IC와 하룻밤. 이 그림 그림 3A와 3DCarmi Y 외 에서 수정 되었습니다. Akt와 SHP 1 종양 면역에 대 한 DC 내장 검문소 있습니다. JCI 통찰력 1:18:e89020, 201625 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
마우스에 우 두를 접종에 필요한 DC의 많은 수를 감안할 때 (약 2-4 x 106 DC 한 마우스 당), 예방 접종 BM과 비장 뒤에 그들의 비보 전 활성화에서 DC의 격리를 기반으로하는 생쥐에서 전략의 대부분. 그러나, 종양 DC에서 vivo에서, 비장 및 BM DC 활성화에 대 한 동일한 조건을 사용 하 여 활성화, 자주 하지 효과적인 면역 생산에 성공 하려고 합니다. 두 후속 출판물, Carmi 외. 그 혈액과 종양 MoDC 크게 차이가 비장 및 BM DC에서 그들은 자연스럽 게 내장의 상부 티로신 인산 가수분해 효소를 부담 하 고 IC24,25활성화 전에 못쓰게 해야 하는 것을 발견 했다. 또한, 이러한 결과 더 스트레스 더 활성화 상태에서 DC를 유지 하기 위해 추가 조치를 취하에 대 한 필요성 그들의 생리 적 상태를 반영 합니다. 따라서, 현재 프로토콜 종양과 순환에서 MoDC의 격리 프로세스에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 그들의 조기 활성화에 발생할 수 있는 단계를 강조 하기 위함입니다.
첫째, 혈액 및 종양에서 DC의 충분 한 숫자를 얻으려면 마우스 BMDC를 격리 하기 위한 프로토콜에 비해 훨씬 더 많은 수에 대 한 필요가 하다. DC의 수확량을 증가 시키기 위해 사용 하는 더 큰 혈액 볼륨 있는 16 주 된 쥐와 전반적인 셀 수 있습니다. 우리는 정기적으로 5-8 x 10 얻을4 MoDC GM-CSF, 및 4-5 배 105 MoDC 다음의 주입 없이 혈액 1 mL 당 주입. DC 종양에 대 한 우리는 약 6-8 x 10 얻을4 MoDC 100 m m3 종양에서 비록 종양 모델 및 개별 마우스 사이의 수 다를 수 있습니다. 1000 m m3 종양에만 약 5000 해야한다 낮은 DC 수율, 종양 크기 결과 증가 DC. 대신, 우리는 4 x 10까지5 MoDC 마우스 당 그로 인하여 취득 여러 사이트 (일반적으로 4-6), 종양 세포와 쥐 주사.
또한, 그 이전에 그들의 실험적인 사용, 항 체, 세포, 튜브 및 일반적인 실험실 시 약 위해 시험 되어야 한다 독 랄 분석 결과, 고 AC 세균성 agar에 미디어를 도금 하 여 하는 것이 좋습니다. 종양 세포 선을 종종 Mycoplasma 감염 그리고 그러므로 DC 가진 그들의 외피 이전 PCR에 의해 시험 되어야 한다. 종류 1, 4, 등 원유 콜라 준비의 사용 Clostridium histolyticum에서 collagenases의 격리로 인해 독의 기본 소스입니다. 콜라의 표준 준비로 EU/10mg의 독에 대 한 포함 될 수 있습니다 소화 혼합물의 mL 당도의 1-2 기. Jahr 외. 독의 2.7 6.7 ng/mL를 포함 하는 콜라 준비 IL 1β의 1,415 3,967 ng/mL을 유발 한다 발견 PBMC29와 문화에 따라. 실제로, DC의 못쓰게 정기적으로 이루어집니다 1 mL 미디어, 아직 조금 picograms/100ml 당 LPS의 ng는 그들30,,3132를 충분 한. 독의 또 다른 잠재적인 소스 FBS, 독의 25 EU/mL 이상 포함할 수 있습니다, 또는 10 EU/mL 이다. 문화 미디어 10% 포함 가정 FBS, 내 부하 도달할 수 0.5 ng/mL, DC를 충분히.
또한, 많은 프로토콜을 정렬 하기 전에 그들의 항 체 패널의 특이성을 증가 하는 수단으로 Fc 수용 체를 차단 안티-CD16/32 항 체를 사용 합니다. 그럼에도 불구 하 고, FcγRIII (CD16)의 cross-linking 리드 Syk/전기 충격 기-70 및 PLC-γ, 세포내 캘리포니아2 + 33, 릴리스 및 P38와 ERK1/2의 인 산화 인 산화 두 인간의34 와 마우스 monocytes35. 우리의 손에서 안티-CD16/32 MoDC 문화에의 추가 일관 되 게 노출의 1 분 이내 P38, ERK1/2 kinases DC에서의 강한 인 산화를 유도합니다. 우리는, 그러므로, 좋습니다 생체 외에서 기능적 분석을 위한 MoDC를 분리 하는 때 안티-CD16/32의 사용을 피하.
또 다른 일반적인 프로토콜 FACS에 의해 분류 하는 그들의 이전 CD11c 자성 구슬에 의해 DC의 농축을 사용 합니다. CD11c 형식이 나 다양 한 ligands, fibrinogen, LPS를 포함 하 여 인식 하는 막 횡단 당단백질 유형 I 교원 질, 그리고 사 C3b 소 단위. Rezzonico 외 항 체와 그 결 찰 CD11c 나타났습니다 강력한 NFκB 활성화 및 발산36의 분 비를 유도 한다. 우리의 경험에서는, 고정된 안티-CD11c 항 체에 유도 세포 활성화 apoptosis, FACS 정렬에서 그들의 녹는 모양 사용 P38 또는 ERK1/2의 인 산화를 유도 하지 않는 동안.
전반적으로,이 프로토콜은 위한 가능한 작은 활성화와 MoDC의 격리 되도록 그들의 활성화에서 비보에대 한 요구 조건을 반영 하는 그들의 후속 활성화 체 외 .
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Disclosures
모든 저자 그들은 충돌의 관심을가지고 그들은 공개 없다 선언 합니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
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