Summary
Monocyt-derived DC (MoDC) kan känna mindre mängder fara-associerade molekyler och är därför enkelt primas. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för isolering av MoDC från blod och tumörer och deras aktivering med immunkomplex samtidigt belysa viktiga försiktighetsåtgärder som bör övervägas för att undvika deras tidig aktivering.
Abstract
Dendritiska celler (DC) är heterogena cellpopulationer som skiljer sig i deras cellmembranet markörer, migrationsmönster och distribution, och i sin antigen-presentation och T-cells aktivering kapacitet. Eftersom de flesta vaccinationer av experimentella tumör modeller kräver miljontals DC, är de ofta isolerade från benmärgen eller mjälte. Dock dessa DC avsevärt skiljer sig från blod och tumör DC i sina svar att immunkomplex (IC) och förmodligen andra Syk-kopplade lektin-receptorer. Ännu viktigare, med tanke på känsligheten hos DC fara-associerade molekyler, närvaro av endotoxiner eller antikroppar som crosslink aktiveringen receptorer i en av de isolera kliver kunde resultera i grundningen av DC och därmed påverka parametrarna, eller åtminstone de dosering, krävs för att aktivera dem. Därför, här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera MoDC från blod och tumörer samtidigt undvika deras tidig aktivering. Dessutom finns ett protokoll för MoDC aktiveringen med tumör IC och deras efterföljande analyser.
Introduction
Dendritiska celler (DC) har sedan upptäckten, fokus omfattande forskning på grund av sin unika förmåga att förvränga T cell differentiering1. Under de senaste decennierna, har en omfattande forskningsinsats försökt att definiera de olika DC-underdelar och deras funktion under tumör progression och immunitet 2. DCs består av heterogena cellpopulationer som skiljer sig från varandra i deras mönsterigenkänning receptorer, vävnadsdistribution, och flyttande och antigen-presentation kapacitet3,4,5. Jämfört med andra DC delmängder, monocyt-derived DC (MoDC) är långt mer rikligt i tumörer och enkelt kan genereras från cirkulerande eller tumör-infiltrera monocyter6,7. Därför baseras många kliniska prövningar som försöker dra nytta av deras relativa förekomst på in-vivo och ex vivo manipulation av autologa MoDC för att framkalla T cell immunitet 8,9.
Likaså, DC-baserade vaccination av experimentella tumör modeller kräver 2-3 seriella injektioner, 5-7 dagars mellanrum, 1-2 x 106 aktiverade DC pulsade med tumör antigener. Därför, för att uppnå detta stora antal DC, de flesta mus-studier har främst använt MoDC odlade från benmärgen (BM) prekursorer i GM-CSF för 7-9 dagar (IL-4 behövs ej i inställningen för mus)10,11. Dock har hänsyn till att GM-CSF knockout möss har övergripande normala DC fack 12,13, och de blandade populationer som erhållits från det kulturen,14 fysiologiska relevansen av dessa DC ifrågasatts.
Alternativt, DC kan isoleras rutinmässigt från mjältceller. Men DC bestå endast ca 0,3-0,8% av totala mjältceller (resulterar i cirka 7 x 105 DC/mjälte), och av dessa celler, endast CD103+ DC och MoDC kan migrera tillbaka till lymfoida organ. Eftersom MoDCs består av ca 10-15% av mjälten DC populationer15,16, ge de flesta isolering protokoll ca 1 x 105 MoDC per mjälte. Expansion av MoDC kan uppnås genom att injicera transfekterade B16-celler som utsöndrar GM-CSF, vilket resulterar i en 100-faldig ökning av mjälten MoDC17. Användning av MoDC för att utveckla DC vacciner är dock begränsad, eftersom detta förfarande inte kan göras hos människor och det erhållna MoDC aktiveras redan mycket.
Utöver att få ett tillräckligt antal DC, innebär en annan utmaning för att utveckla effektiva DC vacciner mot autolog cancerceller bristen på tillräcklig varningssignaler i inställningen tumör fullt Aktivera DC. Induktion av co-stimulatory signaler uppnås vanligen genom aktivering av mönsterigenkänning receptorer (PRR), eller c-typen lektin signalering vägar18,19,20,21. En ytterligare metod för att aktivera DC utnyttjar sin förmåga att ta upp antigener genom interaktioner med surface Fcγ-receptorer (FcγR). Faktiskt, ett antal viktiga manuskript har visat att injektion av MoDC från BM prekursorer aktiveras med tumör-IgG IC kan förhindra tumörtillväxt i profylaktisk inställningar, och kan leda till utrotning av etablerade tumörer22,23 .
I två nyligen papper upptäckte Carmi et al. att MoDC från blod och tumörer i motsats till BMDC och mjälte DC, inte kan svara på IgG IC utan ytterligare stimuli. Detta befanns vara på grund av höga intracellulära nivåer av tyrosinfosfataser som reglerar FcγR signalering24,25. Genom att definiera en kritisk kontrollpunkt i DC, som detta arbete en viktig inblick i kraven för framgångsrik DC-baserade vaccination. Kravet för ytterligare stimuli för att aktivera FcγR signalering, och förmodligen signalering från andra lektin receptorer utnyttja en liknande fosforylering cascade, understryker därför behovet av att undvika grundningen av DC under deras isolering.
Därför protokolls beskriver isolering av MoDC från blod och tumörer, som skiljer sig markant från BM och mjälte DC, och handlar om förebyggande säkerhetsföreskrifter värt att överväga under processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedan hänvisar till isolering av mus MoDC, men de övergripande principerna kan gälla andra DC delmängder celler, samt. 12 - 16-vecka-gammal C57Bl/6j möss bibehölls i en American Association för ackreditering av laboratorium djur vård – ackrediterade djuranläggningen. Alla protokoll godkändes av Stanford University och Tel Aviv universitet institutionella djur vård och användning kommittén.
1. isolering av tumör associerade monocyt-Derived DC
- I en LAF, ta bort tumörer från CO2 euthanized möss och placera tumörer i RPMI medium utan fetalt bovint serum (FBS).
Obs: Det rekommenderas starkt att raka möss och spraya dem med 70% etanol innan du tar bort tumörer, för att minimera potentiella föroreningar från pälsen. Vara säker på att tumören inte överstiger 25-40 mm2 eftersom större tumörer har färre DC som tenderar att vara sköra och benägna att genomgå celldöd. Om du behöver större antal DC kan varje mus injiceras med tumörer celler på flera platser. - Under sterila laminar huva, hacka tumörer med kirurgi sax i små bitar (ca 1 x 1 mm2).
- Lägg till alla tumör fragment från en mus i en 30 mL steril platt-botten röret med magnetiska rör barer, som innehåller 5 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS), 2 mg/mL kollagenas IV och 0,01 mg/mL DNAS jag.
Försiktighet: Myeloida celler producera energi genom glycosylation, även under steady-state. Därför kommer att bara använder medier som innehåller glukos (e.g. HBSS RPMI och DMEM), som glukos svält för så lite som 10-15 min leda till celldöd och apoptos inom 24 h. användning endast en låg endotoxin kollagenas IV, som kollagenas är producerad av grampositiva bakterier (Clostridium histolyticum).
- Lägg till alla tumör fragment från en mus i en 30 mL steril platt-botten röret med magnetiska rör barer, som innehåller 5 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS), 2 mg/mL kollagenas IV och 0,01 mg/mL DNAS jag.
- Rör på ca 200-400 varv i en 37 oC inkubator med en magnetisk omrörare för 20-30 min.
- Tillsätt 5 mL av komplett media och slamma kraftigt.
- Filtrera celler genom en sil med 70 µm i cellen. Centrifugera vid 4 oC 400 rcf för 5-10 min till pellet cellerna.
Varning: Försök inte att isolera cellerna direkt efter enzymatisk nedbrytning, som vissa tumörer är nekrotisk och innehåller relativt stora mängder cellfragment eller extracellulära matrix. Applicera celler på 15% täthet lutning medium att få endast celler. - Avbryta 9 mL täthet lutning medium med 1 mL 10 x PBS att justera osmolalitet och få 100% Percoll stamlösning. Blanda 1,5 mL täthet lutning medium stamlösning med 8,5 mL HBSS och blanda det kraftigt med tumör-derived cellpelleten. Försiktigt layer 2 mL DMEM på toppen av 15% täthet lutning medium och centrifugera vid 400 rcf under 20 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanterna, eftersom cellerna bildar en pellet på botten av röret.
- Tvätta pelleterat cellerna två gånger genom åter att avbryta dem i 10 mL HBSS innehållande 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin, och 10 mM EDTA (isolering buffert) och centrifugera vid 4 oC 400 rcf för 5-10 min för att pressa samman cellerna.
- Räkna celler på en hemocytometer med trypan blå under ett ljusmikroskop.
- Återsuspendering 1 x 108 celler i 1 mL isolering buffert och odla dem i 4 oC med 30 μL av CD11b+ konjugerat magnetiska pärlor i 15 min.
Undvik användning av CD11c-konjugerad pärlor, eftersom detta kommer att aktivera DC och inducera celldöd. Försök inte att blockera FcγRII och FcγRIII med anti-CD16/32 antikroppar. Blockerar antikroppar ligera FcγR och framkalla starka fosforylering av karta kinaser och prime DC.- Ta bort överflödigt obundna pärlorna genom att lägga till 9 mL av isolering buffert och centrifugera celler vid 400 rcf för 5-10 min på 4oC.
- Aspirera supernatanten och slamma cellerna i 1 mL isolering buffert. Applicera cellerna på en förtvättad magnetiska kolumn. Tvätta kolonnen två gånger med 3 mL isolering buffert.
- Ta bort kolumnen från magneten. Pipettera 6 mL isolering buffert på kolumnen och spola ut magnetiskt-märkt cellerna i en steril samling röret genom att trycka på kolven. Centrifugera celler vid 400 rcf för 5-10 min på 4 oC.
- Resuspendera cellerna på 100 μL per 1 x 107 celler och fläcken med följande fluorophore-konjugerade antikroppar: Linage negativa (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI och Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
- Sortera celler efter gating små celler, använder side scatter (SSC) och vidarebefordra scatter (FSC) och kultur i komplett medium kompletteras med 5 ng/mL GM-CSF. Inkubera cellerna i 1 timme vid 3 7 oC för att möjliggöra makrofager att följa plattan. Överför sedan den löst och icke-anhängare celler till en ny kultur maträtt.
Obs: Mus MoDC definieras som CD11b+/CD11c+/MHCIIHej/Ly6Clo/int 7,26,27. Uttryck för Ly6C kan variera dramatiskt mellan tumör modeller, och i vissa modeller (t.ex. LMP) MoDCs helt saknar Ly6C uttryck. Sammantaget en 100 mm3 B16F10 tumör innehåller vanligtvis 5 x 104 i DC, vilket resulterar i cirka 4-5 x 106 totala celler. Dessa celler, 10-15% är immunceller och 8-10% är MoDC. Ökande DC siffrorna kan uppnås genom att injicera möss med tumörer på flera platser. Sortera endast små SSC/FCS celler, som andra myeloida celler kan uttrycka markörer såsom CD11c och Ly6C.
Valfritt: Sortera den tumör-infiltrera monocyt som liten SSC/FSC-celler som uttrycker Ly6CHej och är negativ för MHCII. Efteråt, kultur monocyter i vitro med 50 ng/mL GM-CSF att erhålla DC.
2. isolering av monocyt-derived DC från perifert blod
Obs: Eftersom mogna MoDCs är relativt sällsynta i mus blod, protokollet nedan avser deras härledning i vitro från sorterade monocyter.
- För att öka nivåerna av monocyter i blodet, söva möss med 4% isofluran och injicera dem subkutant (s.c.) med 1 μg av GM-CSF i 50 μL PBS.
- Efter 1-2 h, offra möss använder CO2.
Varning: Inte offra möss av cervikal dislokation, eftersom detta kommer att orsaka inre blödningar. - Omedelbart efter dödshjälp, spraya musen med 70% etanol och ta bort huden som täcker hjärtat med kirurgisk sax, under en steril LAF. Rengöra saxen med etanol och skär höger förmak i hjärtat. Långsamt, spola hjärtat genom höger kammare med 20 mM EDTA HBSS med en 10 mL spruta och 25-G nål.
- Samla in blod med en steril spruta från pleural hålighet i ett sterilt rör innehållande heparansulfat sulfat och EDTA. Fortsätt att spola hjärtat tills levern och lungorna blir rosa eller vit.
- Applicera blodet på en täthet lutning mediumand Centrifugera vid 400 rcf i rumstemperatur i 15 min med låg broms.
Försiktighet: Använd endotoxinfria täthet lutning medium (vanligtvis mindre än 0,12 EU per mL).- Samla in mononukleära celler i en ny tub. Tvätta cellerna av nytt uppehåll i 10 mL HBSS innehållande 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 10 mM EDTA (isolering buffert) och sedan centrifugering på 4 oC 400 rcf för 5-10 min till pellet cellerna.
Varning: Använd endast media som innehåller minst 1 g/L av glukos.
- Samla in mononukleära celler i en ny tub. Tvätta cellerna av nytt uppehåll i 10 mL HBSS innehållande 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 10 mM EDTA (isolering buffert) och sedan centrifugering på 4 oC 400 rcf för 5-10 min till pellet cellerna.
- För CD11b positivt urval, återsuspendering 1 x 108 celler i 1 mL isolering buffert och inkubera dem i 15 min med 50 μl av CD11b-konjugerad magnetiska pärlor på 4 oC.
- Tvätta överskott pärlor genom att lägga till 9 mL isolering buffert och centrifugering vid 400 rcf för 5-10 min på 4 oC. Aspirera supernatanterna och Slamma upp cellerna i 1 mL isolering buffert. Applicera cellerna på en förtvättad magnetiska kolumn enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort kolumnen från magneten, Pipettera 6 mL isolering buffert på kolumnen och spola ut magnetiskt-märkt cellerna i en steril samling röret genom att trycka på kolven. Centrifugera celler vid 400 rcf för 5-10 min på 4 oC. Wash kolumnen två gånger med 3 mL isolering buffert.
- Resuspendera cellerna på 1 x 107 celler/100 μL isolering buffert och fläcken med följande fluorophore-konjugerade antikroppar: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII och 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 celler.
- Sortera celler genom gating på små sida scatter (SSC) och små framåt scatter (FSC) celler.
Obs: Mus inflammatoriska monocyter definieras allmänt som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHejoch patrullerar monocyter definieras som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5. I fall där ingen åtskillnad mellan två delmängder behövs totalt SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo celler kan sorteras. Både naiv och tumör-bärande möss innehåller ungefär 5-8 x 104 MoDC per 1 mL blod och upp till 4-5 x 105 MoDC följande injektion av GM-CSF. Av dem var cirka 70% är inflammatoriska monocyter och 30% patrullerar monocyter. - Platta celler vid en koncentration på 1 x 106 celler/mL i en komplett media kompletteras med 20 ng/mL GM-CSF. Efter 1 dag, överföra icke-anhängare och löst vidhäftande cellerna till en ny platta och kultur för ytterligare 4-5 dagar.
Försiktighet: DC media bör inte kompletteras med pyruvat.
3. beredning av tumör-IgG immunkomplex
- Kultur tumörceller i 75 cm2 kultur kolv till 70% sammanflödet i komplett DMEM media.
- Tillsätt 2 mL av 0,25% trypsin/EDTA att lossa cellerna från kultur kolv och övervaka cellmorfologi i ljus Mikroskop för att undvika alltför trypsinization.
- Tillsätt 8 mL komplett kultur media (per 2 mL av trypsin) för att hämma trypsin matsmältningen och centrifugera vid 4 oC, 400 rcf för 5-10 min till pellet cellerna.
Obs: Se till att kolla tumörceller för Mycoplasma med en kommersiell PCR kit. Test för förekomst av gramnegativa bakterier och svamp endotoxiner använder Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). Serum skall filtreras genom 0,22 μM och testade för 9 virusen i Code of Federal Regulations. Dessutom testa kultur media och serum genom att släppa 100-200 μL på LB agar eller buljong och kultur under 2 dagar på 37 oC. - Tvätta cellerna igen från trypsin och serum resterna av åter avbryta dem i 10 mL PBS och centrifugera vid 400 rcf i 5-10 min. Aspirera supernatanten och upprepa tvätten 2 gånger.
- Fixa celler i 1,8% buffrad PARAFORMALDEHYD under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna genom att åter avbryta dem i 10 mL PBS och centrifugera vid 4 oC 400 rcf under 5-10 minuter.
- Aspirera supernatanterna och upprepa tvätta två gånger.
Valfritt: För tumör upptag analyser, celler kan märkas av inkubering under 5 minuter vid 37 oC i PBS med 1 μM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). CFSE är sedan härdas med komplett media i 10 min i is. Cellerna tvättas i stor utsträckning i PBS som innehåller 2% serum för att ta bort kvarvarande färgämne.
- Resuspendera cellerna i FACS buffert (PBS kompletteras med 2% FCS + 5 mM EDTA) och 0,5 μg/mL anti-CD16/32 för att kunna blockera potentiella icke-specifika protein-protein interaktioner. Plattan i en U-form 96 brunnar/tallrik med en koncentration på 1 x 105 celler per 100 μL.
- Lägga till olika spädningar av tumör-bindande antikroppar alltifrån 5 μg - 5 ng/1 x 105 celler. Inkubera plattan på is för 15-20 min.
Obs: IgG antikroppar var isolerade från serum hos naiva 20-24 veckor gamla honmöss på protein A kolumner, som beskrev24.
- Lägga till olika spädningar av tumör-bindande antikroppar alltifrån 5 μg - 5 ng/1 x 105 celler. Inkubera plattan på is för 15-20 min.
- Tvätta cellerna genom att lägga 150 μL av PBS och centrifugering plattan på 4 oC 400 rcf för 5-10 min.
- Kassera supernatanterna och upprepa tvätta två gånger. Resuspendera cellerna i 100 μL FACS buffert innehållande fluorophore-konjugerad sekundär antikropp. Inkubera plattan på is i 20 min.
- Tvätta cellerna genom att lägga till 200 μL av FACS buffert och centrifugering plattan vid 400 rcf för 5-10 min. kasta supernatanterna och upprepa tvätta.
- Analysera tumör bindande genom flödescytometri och bestämma minimal koncentration krävs att bestryka cellerna.
Obs: Antikroppar som inte ökar genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) färgade tumörceller av minst femfaldigt isotypen kontroll över bör inte användas i efterföljande funktionella analyser.
4. aktivering av MoDC med tumör-IgG IC
- Coat tumörceller med minimal IgG-koncentration, som beskrivs i avsnitt 3.1 genom 3.4.3
- En dag innan du aktiverar MoDC med tumör IC, ersätta MoDC kulturmassmedia, som innehåller GM-CSF. Till gör så, försiktigt aspirera media och tvätta cellerna en gång med pre värmde komplett kultur media.
Obs: Isolerade mogen tumör-associerad MoDC bör vara odlade för minst 2-3 h (eller även övernattning) efter sortering i komplett media utan GM-CSF, och innan du aktiverar dem med IC. - För tumör upptag analyser, lägga till CFSE-märkt tumören IC i MoDC i förhållandet 1:5 (IC:MoDC) och inkubera över natten i 12-16 h i 1 mL av komplett media per 1 x 106 DC.
- För FACS analyser av MoDC aktivering experiment, Lägg till tumör-IC på 1:1 (IC:MoDC) förhållande och inkubera över natten för 12-16 h.
Obs: Det rekommenderas starkt att inkludera en positiv kontroll, i vilka MoDC stimuleras med LPS eller andra TLR-receptoragonister 1 μg/mL. - Efter övernattning aktivering, aspirera supernatanterna och tvätta celler försiktigt tre gånger med isolering buffert eller 10 mM EDTA HBSS.
- För att lossa DC från plattan, inkubera cellerna för 2-3 min i 1 mL HBSS innehållande 10 mM EDTA och lossa cellerna genom kraftig pipettering.
- Centrifugera celler vid 400 rcf och resuspendera 1 x 106 DC i 90 μl PBS kompletteras med 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS buffert) och 0,5 μg blockera antikroppar. Inkubera i ice för 5-10 min.
- Tillsätt 10 μL av färgning antikroppar blandning till cellerna och inkubera på is i 15 min.
- Tillsätt 2 mL FACS buffert till celler och centrifugera vid 4 oC 400 rcf under 5-10 minuter.
- En dag innan du aktiverar MoDC med tumör IC, ersätta MoDC kulturmassmedia, som innehåller GM-CSF. Till gör så, försiktigt aspirera media och tvätta cellerna en gång med pre värmde komplett kultur media.
- Resuspendera cellerna i 200 μL FACS buffert.
- Lägga till 0,5 - 1 μg/mL DAPI 1-2 min innan du kör proverna, för att utesluta döda celler från analyser. Inte alltför Inkubera DAPI, som MoDC kommer att ta upp inom 10-15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi jämförde initialt antikroppar från naiva syngena och allogen möss förmåga att binda till tumörceller. Därför var B16F10 och LMP tumör cellinjer fast i PARAFORMALDEHYD och tvättas i stor utsträckning. B16F10 är en melanom cell fodrar, som isolerades ursprungligen från lungmetastaser i C57Bl/6 möss. LMP är en bukspottskörteln tumör cell som var isolerad från KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + och Pdx-1-Cre möss, och växer stadigt i 129F1 möss. För att erhålla IC, inkuberades tumörceller i 20 min på is med 2 μg av syngena eller allogena IgG per 1 x 105 tumörceller. IgG och IgM antikroppar var isolerade från cirkulationen av naiv 20-24-vecka-gammal möss på protein A, följt av storlek-utslagning kromatografi som beskrivs24. Cellerna var sedan tvättas och färgade med PE-konjugerad råtta antimus IgG sekundär antikropp och genomsnittlig fluorescerande intensiteten analyserades i en flödescytometer. Som framgår av figur 1A, bunden IgG-antikroppar från allogena C57Bl/6 möss långt mer effektivt än antikroppar LMP tumör celler ex vivo från 129S1 syngena möss. Likaså var färgning av fasta B16F10 med 129S1 allogen IgG mer än tio gånger högre, jämfört med färgning med syngena IgG från naiva C57Bl/6 möss. Intressant, misslyckades möss med B16 tumörer med att producera antikroppar med liknande bindande kapacitet som allogen möss, även under tumör progression (figur 1B).
Vi försökte nästa jämför IC svaret av MoDC från blod och tumörer som DC från mjälte och BM. För att isolera tumör-associerad MoDC, var B16F10 tumörer enzymatiskt separerade för att erhålla enda cellsuspensioner. Immunceller berikades med CD45-magnetiska pärlor, och MoDC var ytterligare sorteras som SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo av FACS (figur 2A). Det är anmärkningsvärt att olika tumör DC kan ha olika markörer som definierar dem. För att isolera MoDC från blodet, cirkulerande monocyter var berikas av CD11b-konjugerad magnetiska pärlor och ytterligare sorterade som SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. Celler odlades sedan 1 dag i GM-CSF och icke-anhängare och löst vidhäftande cellerna överfördes till en ny platta och odlade ytterligare 4-5 dagar att få MoDC (figur 2B). Som en referenspunkt som vi använde BMDC, tjänstgör som ”guldmyntfoten” DC för många funktionella analyser, samt mjälten MoDC, som återspeglar en mer fysiologisk DC delmängd. BMDC erhölls genom att sortera de BM pro-monocyter (CD11b+/Ly6CHej/CD115Hej/MHCIIneg), följt av deras odling i 7 dagar med GM-CSF, som beskrev24. Mjälten MoDC isolerades från den enda cellsuspension, erhålls genom mosa mjälte genom en cell sil (före inkubering med kollagenas krävs inte för mjälten MoDC), följt av berikning med CD11b-konjugerad magnetiska pärlor. Cellerna var sedan sorteras som SSClo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIHej/CD11cHej och odlade i 1 timme i komplett RPMI på 37oC till återställa baslinjen aktivitet.
För att undersöka effekten av IgG IC på MoDC aktivitet, inkuberas vi isolerade DC delmängder över natten med fasta tumörceller eller med fast tumörceller pre belagd med allogen IgG. Aktivering av BMDC eller mjälten DC med IC resulterade i ökad CD86 och MHCII uttrycket, till skillnad från MoDC, eller tumör-associerad MoDC (figur 3A). Förmågan att upptag CFSE-färgade tumör-derived proteiner, med eller utan allogen IgG, jämfördes också. Som påpekat konfokalmikroskopi, mjälten DC visade överlägsen förmåga att internalisera de tumör-derived proteinerna (figur 3B).
Sammantaget tyder dessa resultat på att tumören DC och MoDC svara annorlunda än mjälten DC och BMDC till aktiveringen med alloIgG-IC. Därför vaccination strategier som vill aktivera tumör DC inte kan baseras enbart på den aktivering mönstren av BMDC.
Figur 1: allogen möss har naturligt tumör-bindande IgG-antikroppar i deras omlopp: A. menar fluorescensintensiteten (MFI) av LMP tumörceller färgas med IgG-antikroppar som isolerats från blod syngena (129S1) och allogena (C57Bl/6) naiva möss. B. menar fluorescensintensiteten (MFI) B16F10 tumörceller inkuberas med IgG-antikroppar isolerade från cirkulationen av syngena tumör-bärande möss (C57Bl/6), eller allogena (129S1) naiva möss. Denna siffra har ändrats från utökade data 2A och 2B Carmi Y et al. Naturen 521 7550:99-104, 201524.
Figur 2: sortering av musen MoDC från blod och B16 tumörer. A. isolering och sorterings system för MoDC odlade från mus monocyter. Konfokalmikroskopi DIC bild av inflammatoriska och patrullerande monocyter efter 4 dagar i kultur (x400). B. isolering och sorterings system för tumör-associerad MoDC från B16 tumörer. Representativa konfokalmikroskopi DIC bilden av MoDC som isolerats från B16 tumörer efter övernattning kultur (x400). Denna siffra har ändrats från kompletterande figur 1 Carmi Y et al. JCI insikt 1:18:e89020, 201625. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MoDC från mjälten och BM visar olika mönster av aktivering än tumör och blod MoDC efter inkubation med IC. A. flöde flödescytometrisk analys av MHCII och CD86 uttryck av DC inkuberas över natten med tumör-IgG IC. B. Confocal immunohistokemi tumör upptag (grön) och MHCII uttrycket (röd) av DC inkuberas över natten med CFSE-märkt tumör IC. Denna siffra har ändrats från siffror 3A och 3DCarmi Y et al. Akt och SHP-1 är DC-inneboende kontrollpunkter för tumör immunitet. JCI insikt 1:18:e89020, 201625. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på det stora antalet DC krävs för vaccinering möss (cirka 2-4 x 106 DC per en mus), de flesta av vaccinationen strategier hos möss är baserade på isolering av DC från BM och mjälte följt av deras ex vivo -aktivering. Dock försöker aktivera tumör DC in-vivo, med samma villkor för att aktivera mjälte och BM DC, har ofta misslyckats i att producera effektiva immunitet. I två publikationer, Carmi et al. har hittat att blod och tumör MoDC skiljer sig markant från mjälte och BM DC, med tanke på att de bära naturligt höga inneboende nivåer av tyrosin fosfatas och kräver priming före aktivering med IC24,25. Dessutom återspeglar dessa resultat ytterligare stress behovet att vidta extra försiktighetsåtgärder för att upprätthålla DC i ett aktiveringstillstånd som bättre deras fysiologiska status. Därför syftar detta protokoll till att ge en detaljerad beskrivning av processen isolering av MoDC från tumörer och cirkulationen, och markera de steg som kan resultera i deras tidig aktivering.
Först, för att få tillräckligt antal DC från blod och tumörer, finns det ett behov av ett mycket större antal möss jämföras med protokoll för att isolera BMDC. För att öka avkastningen av DC vi använder 16-vecka-gammal möss, som har större blod volymer och övergripande blodkroppar. Vi rutinmässigt få 5-8 x 104 MoDC per 1 mL blod utan injektion av GM-CSF och 4-5 x 105 MoDC efter injektion. För tumör DC, vi får ca 6-8 x 104 MoDC från en 100 mm3 tumör, men antalet kan variera mellan enskilda möss och tumör modeller. Ökande tumör storlek resulterar i en lägre DC avkastning, eftersom en mm 1.0003 tumör kommer att ha endast ca 5000 DC. Istället injicera vi möss med tumörceller på flera platser (vanligen 4-6), därigenom få upp till 4 x 105 MoDC per mus.
Dessutom rekommenderar vi att före deras experimentell användning, antikroppar, cellinjer, rör och allmänna lab reagenser ska testas för endotoxiner genom LAL assay och plätering media på AC bakteriell agar. Tumör cellinjer är ofta infekterade med Mycoplasma och bör därför testas med PCR före deras inkubation med DC. Användning av rå kollagenas preparat, såsom typer 1 och 4 är en primär källa av endotoxiner på grund av isolering av kollagenaserna från Clostridium histolyticum. Standardberedningar av kollagenas kan innehålla så mycket som 10 EU/mg av endotoxiner, vilket är ungefär 1-2 ng av endotoxin per mL av matsmältningen blandning. Jahr o.a. har hittat att kollagenas preparat innehållande 2,7-6,7 ng/mL av endotoxiner kommer att framkalla 1 415-3,967 ng/mL av IL-1β efter kultur med PBMC29. Faktiskt, priming av DC görs rutinmässigt med 1 ng av LPS per mL media, men så lite som 100 pikogram/mL räcker till prime dem30,31,32. En annan potentiell källa av endotoxiner är FBS, som kan innehålla 25 EU/mL eller mer av endotoxiner, eller mindre än 10 EU/mL. Antar att kultur media innehåller 10% kunde FBS, endotoxin lasten nå 0,5 ng/mL, vilket är tillräckligt för att prime DC.
Dessutom använder många protokoll anti-CD16/32 antikroppar för att blockera Fc receptorer som ett sätt att öka specificiteten av sin antikropp panel före sortering. Dock leder cross-linking av FcγRIII (CD16) till fosforylering av Syk/ZAP-70 och PLC-γ, frisläppandet av intracellulära Ca2 + 33och fosforylering av P38 och ERK1/2 in både mänskliga34 och mus monocyter35. I våra händer inducerar tillägg av anti-CD16/32 MoDC kulturer konsekvent en stark fosforylering av P38 och ERK1/2 kinaser i DC inom en minut efter exponering. Vi föreslår därför starkt att undvika användning av anti-CD16/32 när isolerande MoDC för in vitro- funktionella analyser.
Ett annat vanligt protokoll använder anrikning av DC av CD11c magnetiska pärlor innan deras sortering av FACS. CD11c är en typ jag transmembrana glykoprotein som erkänner en mängd ligander, inklusive fibrinogen, LPS, typ I kollagen och den inaktiverade C3b-subenheten. Rezzonico et al. har visat att ligering av CD11c med antikroppar inducerar potenta NFκB aktivering och utsöndringen av kemokinerna36. Vår erfarenhet framkalla immobiliserade anti-CD11c antikroppar cellaktivering och apoptos, medan användningen av deras löslig form i FACS sortering inte inducerar fosforylering av antingen P38 eller ERK1/2.
Sammantaget är detta protokoll för att uppnå isolering av MoDC med så lite aktivering som möjligt, så att deras efterföljande aktivering in vitro återspeglar villkoren för deras aktivering i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar de har någon intressekonflikt och att de har något att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
