Summary
Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.
Abstract
Dendritische Zellen (DC) sind heterogene Zell-Populationen, die sich in ihrer Zellmembran Marker, Migrationsmuster und Verteilung, und in ihrer Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung-Kapazitäten zu unterscheiden. Da die meisten Impfungen der experimentellen Tumormodellen Millionen von DC benötigen, sind sie weitgehend isoliert aus dem Knochenmark oder Milz. Diese DC deutlich unterscheiden sich jedoch von Blut und Tumor DC in ihren Antworten zu Immunkomplexe (IC) und vermutlich andere Lektin Syk-gekoppelten Rezeptoren. Wichtig ist, angesichts der Sensibilität der DC in Gefahr-assoziierter Moleküle, das Vorhandensein von Endotoxinen oder Antikörper, die Crosslink-Aktivierung-Rezeptoren in der Isolierung eines Schritte könnte führen die Grundierung von DC und beeinträchtigen somit die Parameter oder zumindest die Dosierung, erforderlich, um sie zu aktivieren. Daher beschreiben wir hier ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren unter Vermeidung der vorzeitigen Aktivierungs. Darüber hinaus ist ein Protokoll für MoDC Aktivierung mit Tumor IC und ihre späteren Analysen bereitgestellt.
Introduction
Seit ihrer Entdeckung wurden die Dendritische Zellen (DC) ein Schwerpunkt der umfangreichen Forschung aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, T-Zell-Differenzierung1verzerren. In den letzten Jahrzehnten hat eine umfangreiche Forschungsarbeit versucht, die verschiedenen DC-Subsets und ihre Funktion während der Tumorprogression und Immunität 2definieren. DCs bestehen aus heterogenen Zell-Populationen, die in ihre Mustererkennung Rezeptoren, Gewebeverteilung, voneinander unterscheiden und wandernden und Antigen Präsentation Fähigkeiten3,4,5. Im Vergleich zu anderen DC-Teilmengen, Monocyte abgeleitet DC (MoDC) sind weit häufiger in Tumoren und können leicht von zirkulierenden erzeugt werden oder Tumor infiltrieren Monozyten6,7. Viele klinische Studien, die versuchen, ihre relative Prävalenz nutzen basieren daher auf in Vivo und ex Vivo Manipulation von autologen MoDC um T-Zell Immunität 8,9zu entlocken.
In ähnlicher Weise, DC-basierte Impfung von experimentellen Tumormodellen erfordert 2-3 serielle Injektionen, 5-7 Tage auseinander, von 1-2 x 106 aktivierte DC mit Tumorantigenen gepulst. Daher, um diese große Anzahl von DC zu erreichen, die meisten Studien an Mäusen haben in erster Linie verwendet MoDC kultiviert aus dem Knochenmark (BM) Vorstufen in GM-CSF für 7-9 Tage (IL-4 ist nicht erforderlich, in die Maus Einstellung)10,11. Dennoch hat angesichts dieser GM-CSF-Knockout Mäuse haben insgesamt normale DC Abteil 12,13, und die gemischte Bevölkerung aus dieser Kultur gewonnen14 die physiologische Relevanz dieser DC infrage gestellt worden.
Alternativ kann DC von milzzellen routinemäßig isoliert sein. DC umfassen jedoch nur etwa 0,3-0,8 % der gesamten milzzellen (was ca. 7 x 105 DC/Milz), und dieser Zellen, nur CD103+ DC und MoDC können zurück zu den lymphatischen Organen migrieren. Da MoDCs etwa 10-15 % der Milz DC Bevölkerung15,16 umfassen, liefern die meisten Isolierung Protokolle ca. 1 x 105 MoDC pro Milz. Ausbau der MoDC kann erreicht werden, durch die Injektion von transfizierten B16 Zellen, die GM-CSF, was zu einem 100-fold Anstieg in Milz MoDC17absondern. Die Verwendung von MoDC für die Entwicklung von DC Impfstoffe ist jedoch begrenzt, da dieses Verfahren bei Menschen und den erzielten erfolgen kann nicht MoDC sind bereits in hohem Maße aktiviert.
Eine weitere Herausforderung für die Entwicklung von effektiven DC Impfstoffe gegen autologe Krebszellen umfasst neben Erlangung ausreichender Anzahl der DC, den Mangel an ausreichend Gefahrensignale in der Tumor-Einstellung DC voll zu aktivieren. Induktion von co-stimulatory Signalen erfolgt in der Regel durch Aktivierung von Mustererkennung Rezeptoren (PRR), oder c-Art Lectin Signalisierung Wege18,19,20,21. Ein weiterer Ansatz zur Aktivierung DC nutzt ihre Fähigkeit zu nehmen Antigene durch Interaktionen mit Oberfläche Fcγ Rezeptoren (FcγR). In der Tat eine Reihe von wichtigen Handschriften haben gezeigt, dass die Injektion von MoDC aus BM Vorstufen aktiviert mit Tumor-IgG IC Tumorwachstum bei prophylaktischen Einstellungen verhindern können, und führt zur Beseitigung der etablierten Tumoren22,23 .
In zwei Publikationen entdeckt Carmi Et Al. , dass im Gegensatz zu BMDC und Milz DC, MoDC aus dem Blut und Tumoren auf IgG IC ohne zusätzliche Reize reagieren kann. Dies erwies sich durch die Anwesenheit der hohen intrazellulären Tyrosin-Phosphatasen Regulierung Signal24,25FcγR. Definieren Sie einen kritischen Kontrollpunkt in DC, versehen diese Arbeit einen wichtigen Einblick in die Anforderungen an erfolgreiche DC-basierte Impfung. Die Voraussetzung für zusätzliche Reize ermöglichen FcγR Signal- und vermutlich Signalisierung von anderen Lektin-Rezeptoren, die unter Verwendung einer ähnlichen Phosphorylierung Kaskade, unterstreicht damit die Notwendigkeit für die Grundierung von DC während ihrer Isolation zu vermeiden.
Daher dieses Protokoll beschreibt die Isolierung des MoDC von Blut und Tumoren, die sich deutlich von BM und Milz DC unterscheiden, und vorsorgenormen während des Prozesses eine Überlegung.
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Protocol
Die folgenden Protokolle beziehen sich auf die Isolierung der Maus MoDC, noch für andere DC Teilmengen Zellen, sowie gelten die allgemeinen Grundsätze. 12 - 16 Wochen alten C57Bl/6j Mäuse wurden in ein American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care – akkreditiert Tierhaus beibehalten. Alle Protokolle wurden von der Stanford University und Tel-Aviv Universität institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Isolierung von Tumor verbundenen Monocyte abgeleitet DC
- Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube Tumore von CO2 eingeschläfert Mäuse und Tumoren in RPMI Medium ohne fetalen bovine Serum (FBS).
Hinweis: Es wird empfohlen, um die Mäuse zu rasieren und sprühen sie mit 70 % Ethanol vor dem Entfernen der Tumoren, um mögliche Verunreinigungen aus dem Fell zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Tumor 25-40 mm2 nicht überschreitet, da größere Tumoren weniger DC, die tendenziell zerbrechlich und anfällig haben für Zelltod unterziehen. Wenn größere Anzahlen von DC benötigt werden, kann jede Maus mit Tumoren Zellen an mehreren Standorten injiziert werden. - Hacken Sie unter einer sterilen laminar Haube die Tumoren mit Operation Schere in kleine Stücke (ca. 1 x 1 mm2).
- Fügen Sie alle Tumor-Fragmente aus einem einzigen Mausklick in ein 30 mL sterile flach-Boden Rohr mit magnetischen rühren Bars, enthält 5 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS), 2 mg/mL Kollagenase IV und 0,01 mg/mL DNase ich.
Achtung: Myeloische Zellen produzieren Energie durch Glykosylierung, auch unter Steady-State. Daher führt nur Verwendung-Medien, die Glukose (zum Beispiel HBSS RPMI und DMEM), als Glukose Hunger für weniger als 10-15 min enthält im Zelltod und Apoptose innerhalb 24 Std. Nutzung nur eine geringe Endotoxin Kollagenase IV, als Kollagenase von gram-positiven produziert wird Bakterien (Clostridium Histolyticum).
- Fügen Sie alle Tumor-Fragmente aus einem einzigen Mausklick in ein 30 mL sterile flach-Boden Rohr mit magnetischen rühren Bars, enthält 5 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS), 2 mg/mL Kollagenase IV und 0,01 mg/mL DNase ich.
- Bei ca. 200-400 u/min in einem Inkubator 37 oC mit einem Magnetrührer für 20-30 min. umrühren.
- 5 mL komplette Medien hinzufügen und kräftig wieder auszusetzen.
- Filtern Sie Zellen durch ein 70 µm Zelle Sieb. Zentrifugieren Sie bei 4 oC 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen zu Pellets.
Achtung: Versuchen Sie nicht, die Zellen direkt nach enzymatische Verdauung, da manche Tumoren nekrotische sind und relativ große Mengen an zellenrückstand oder extrazelluläre Matrix enthalten zu isolieren. Tragen Sie Zellen auf 15 % Dichte Gradienten Medium, nur die Zellen zu erhalten. - Aussetzen Sie, 9 mL Dichte Gradienten Medium mit 1 mL 10 X PBS, Osmolalität anzupassen und zu 100 % Percoll-Stammlösung zu erhalten. Mix 1,5 mL Dichte Gradienten Medium Lösung mit 8,5 mL HBSS auf Lager und mischen Sie es kräftig mit Pellet-Zelle Tumor abgeleitet. Sanft Schicht 2 mL DMEM auf der Oberseite 15 % Dichte Gradienten Medium und Zentrifuge bei 400 Rcf für 20 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie die Überstände, wie die Zellen einen Pellet am Boden des Röhrchens bilden werden.
- Waschen Sie die gebeizte Zellen zweimal durch Aussetzung sie erneut in 10 mL HBSS, enthält 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, und 10 mM EDTA (Isolation Puffer) und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min um die Zellen zu Pellets.
- Anzahl Zellen auf einem Hemocytometer verwenden Trypan blau unter einem Lichtmikroskop.
- Wieder auszusetzen, 1 x 108 Zellen in 1 mL Isolierung Puffern und inkubieren sie bei 4 oC mit 30 μl CD11b+ konjugiert magnetische Beads für 15 Minuten.
Achtung: Vermeiden Sie die Verwendung CD11c konjugiert Perlen, wie dies die DC aktiviert und Zelltod zu induzieren. Versuchen Sie nicht, FcγRII und FcγRIII mit Anti-CD16/32 Antikörper zu blockieren. Blockieren Antikörper verbinden FcγR und verursachen starke Phosphorylierung von MAP-Kinasen und prime der DC.- Entfernen Sie die überschüssige ungebundenen Perlen, indem 9 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge Zellen auf 400 Rcf für 5-10 min bei 4oC.
- Aspirieren Sie überstand und auszusetzen Sie Zellen in 1 mL Isolierung Puffer wieder. Die Zellen auf einer vorgewaschen magnetische Spalte anwenden. Waschen Sie die Spalte zweimal mit 3 mL Isolierung Puffer.
- Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet. Pipette 6 mL Isolierung Puffer auf die Säule und die magnetisch-markierten Zellen in einem sterilen sammelröhrchen durch Drücken des Kolbens durchspülen. Zentrifuge Zellen bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC.
- Wieder aussetzen Zellen bei 100 μL pro 1 x 107 Zellen und Flecken mit den folgenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern: aus negativen (TCRb, Siglec-F, B220, CD19, FceRI und Ly6G), ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG, Ly - 6 C.
- Zellen nach Anspritzung die kleinen Zellen, mit Side Scatter (SSC) Sortieren und forward Scatter (FSC) und Kultur im kompletten Medium mit 5 ng/mL GM-CSF ergänzt. 1 Stunde bei 3 7 Zellen inkubieren oC um Makrophagen halten die Platte zu ermöglichen. Übertragen Sie anschließend die lose und nicht anhaftende Zellen in eine neue Kulturschale.
Hinweis: Maus MoDC gelten als CD11b+/CD11c+/MHCIIHallo/Ly6Clo/Int 7,26,27. Ausdruck der Ly6C variieren erheblich zwischen Tumormodellen und bei einigen Modellen (z.B. amp) MoDCs fehlt ganz Ly6C Ausdruck. Alles in allem, eine 100 mm3 B16F10 Tumor in der Regel 5 x 104 DC, was in etwa 4-5 x 106 total Zellen enthält. Dieser Zellen 10-15 % sind Immunzellen und 8-10 % sind MoDC. Die DC-Zahl erhöhen kann erreicht werden, durch die Injektion von Mäusen mit Tumoren an mehreren Standorten. Art nur kleine SSC/FCS-Zellen, können als andere myeloischen Zellen Marker wie CD11c und Ly6C Ausdrücken.
Optional: Art der Tumor infiltrieren Monocyte als kleine SSC/FSC-Zellen, die express Ly6CHallo und sind negativ für ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG. Danach Kultur Monozyten in Vitro mit 50 ng/mL GM-CSF, DC zu erhalten.
2. Isolierung der Monocyte abgeleitet DC aus dem peripheren Blut
Hinweis: Da Reife MoDCs Maus im Blut relativ selten sind, bezieht sich das Protokoll unten auf ihre Ableitung in Vitro aus sortierten Monozyten.
- Um die Höhe der Monozyten im Blut erhöhen, Mäuse mit 4 % Isofluran zu betäuben und injizieren sie subkutan (s.c.) mit 1 μg von GM-CSF in 50 μl PBS.
- Nach 1-2 h Opfern Sie Mäuse mit CO2.
Achtung: Opfere Mäuse nicht durch zervikale Dislokation, als innere Blutungen dadurch. - Sofort nach Euthanization Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und entfernen Sie die Haut, die das Herz mit Chirurgische Schere unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube bedeckt. Reinigen Sie die Schere mit Ethanol und schneiden Sie den rechten Vorhof des Herzens. Spülen Sie langsam, das Herz durch den rechten Ventrikel mit 20 mM EDTA HBSS mit einem 10-mL-Spritze und Nadel 25 G.
- Sammeln Sie das Blut mit einer sterilen Spritze aus der Pleurahöhle in ein steriles Röhrchen mit Heparan Sulfat und EDTA. Weiterhin das Herz bis zur Leber und Lunge werden rosa oder weiß zu spülen.
- Blut auf eine Dichte Gradienten Fragenkomplexen Zentrifuge bei 400 Rcf bei Raumtemperatur für 15 min mit niedrigen Bremse auftragen.
Achtung: Verwendung Endotoxin-freie Dichte Gradienten Medium (in der Regel weniger als 0,12 EU pro mL).- Sammeln Sie MONONUKLEÄRE Zellen in einen neuen Schlauch. Waschen Sie die Zellen wieder aussetzen in 10 mL HBSS, enthält 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 mM EDTA (Isolierung Puffer) und anschließend Zentrifugieren bei 4 oC 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen zu Pellets.
Achtung: Verwenden Sie nur Medien, die mindestens 1 g/L Glukose enthält.
- Sammeln Sie MONONUKLEÄRE Zellen in einen neuen Schlauch. Waschen Sie die Zellen wieder aussetzen in 10 mL HBSS, enthält 2 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 mM EDTA (Isolierung Puffer) und anschließend Zentrifugieren bei 4 oC 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen zu Pellets.
- Auszusetzen Sie für CD11b positive Selektion 1 x 10-8 -Zellen in 1 mL Isolierung Puffer wieder und inkubieren sie 15 min mit 50 μL von CD11b konjugiert magnetischen Perlen an 4 oC.
- Waschen Sie überschüssige Perlen durch Hinzufügen von 9 mL Isolierung Puffer und Zentrifugieren bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC. Aspirat die Überstände und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1 mL Isolierung Puffer. Die Zellen auf einer vorgewaschen magnetische Spalte nach Herstellerangaben auftragen.
- Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet, pipette 6 mL Isolierung Puffer auf die Säule und spülen Sie die magnetisch-markierten Zellen in einem sterilen sammelröhrchen durch den Kolben drücken. Zentrifugieren Sie Zellen bei 400 Rcf für 5-10 min bei 4 oC. Wash der Spalte zweimal mit 3 mL Isolierung Puffer.
- Re Zellen auf 1 x 107 Zellen/100 μL Isolierung Puffer und Fleck mit den folgenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern auszusetzen: 0,1 μg CD115 0,25 µg ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG und 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 Zellen.
- Sortieren Sie Zellen nach Anspritzung auf klein Scatter (SSC) und small forward Scatter (FSC) Zellen.
Hinweis: Maus entzündliche Monozyten sind in der Regel definiert als CD115+/ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGlo/Neg/Ly6CHallound patrouillieren Monozyten werden definiert als CD115+/MHCIIlo/Neg/Ly6CNeg 4,5. In Fällen, wo keine Trennung zwischen den zwei Teilmengen erforderlich, insgesamt SSClo/FCSlo/CD115+/ARBEITSPLATZAUSSTATTUNGlo Zellen sortiert werden können. Naiv und Tumor-tragenden Mäusen enthalten ca. 5-8 x 104 MoDC pro 1 mL Blut und bis zu 4-5 x 105 MoDC folgende Injektion von GM-CSF. Von ihnen etwa 70 % sind entzündliche Monozyten und 30 % Monozyten patrouillieren. - Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL in eine komplette Media ergänzt mit 20 ng/mL GM-CSF-Platte. Nach 1 Tag der nicht-Anhänger und lose adhärenten Zellen zum Übertragen einer neuen Platte und Kultur für weitere 4-5 Tage
Achtung: DC Medien sollten nicht mit Pyruvat ergänzt werden.
3. Vorbereitung des Tumor-IgG Immunkomplexe
- Kultur-Tumorzellen in 75 cm2 Kultur Kolben bis 70 % Zusammenfluss in kompletten DMEM Medien.
- Fügen Sie 2 mL 0,25 % Trypsin/EDTA, Zellen aus Kultur-Kolben und Monitor Zellmorphologie unter einem Lichtmikroskop zu vermeiden übermäßige Trypsinization zu lösen.
- Hinzugeben Sie 8 mL komplette Nährmedien (pro 2 mL Trypsin) hemmen Trypsin-Verdauung und Zentrifugieren bei 4 oC, 400 Rcf für ca. 5-10 min zu die Zellen Pellets.
Hinweis: Stellen Sie sicher, Tumorzellen für Mycoplasma mithilfe eines kommerziellen PCR-Kits zu überprüfen. Test auf das Vorhandensein von Gram-negativen Bakterien und Pilze Endotoxine Verwendung von Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). Serum muss durch 0,22 μM gefiltert und für die 9 Code of Federal Regulations-Viren getestet werden. Darüber hinaus testen Sie, Kultur, Medien und Seren durch Ablegen von 100-200 μL auf LB-Agar oder Bouillon und Kultur 2 Tage bei 37 oC. - Wash Zellen wieder von Trypsin und Serum bleibt dadurch, dass sie wieder in 10 mL PBS und Zentrifuge bei 400 Rcf für 5-10 min. Überstands abzusaugen und die Wäsche 2 weitere Male zu wiederholen.
- Zellen in 1,8 % gepuffert Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur zu beheben.
- Waschen Sie die Zellen dadurch, dass sie wieder in 10 mL PBS und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min.
- Zwei weitere Male waschen aspirat Überstände und wiederholen.
Optional: Für Tumor-Aufnahme-Assays, können Zellen beschriftet werden durch Inkubation sie für 5 min bei 37 oC in PBS mit 1 μM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-). CFSE wird dann mit kompletten Medien für 10 min in Eis abgeschreckt. Die Zellen sollten ausgiebig mit PBS-Puffer mit 2 % Serum, restliche Farbstoff zu entfernen gewaschen werden.
- Wieder auszusetzen Sie, Zellen in FACS Puffer (PBS ergänzt mit 2 % FCS + 5 mM EDTA) und 0,5 μg/mL Anti-CD16/32 um potentielle unspezifische Protein-Protein-Interaktionen zu blockieren. Platte in einer U-Form 96 Wells/Platte in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 100 μL.
- Fügen Sie verschiedene Verdünnungen des Tumor-bindenden Antikörpern von 5 μg - 5 ng/1 x 105 Zellen. Inkubieren Sie die Platte für 15-20 min auf Eis.
Hinweis: IgG Antikörper aus dem Serum von naiven 20-24 Wochen alten weiblichen Mäusen auf Protein A-Säulen, wie beschrieben24isoliert wurden.
- Fügen Sie verschiedene Verdünnungen des Tumor-bindenden Antikörpern von 5 μg - 5 ng/1 x 105 Zellen. Inkubieren Sie die Platte für 15-20 min auf Eis.
- Waschen Sie Zellen durch Hinzufügen von 150 μL der PBS und die Platte bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min zentrifugieren.
- Die Überstände zu verwerfen und die Wäsche zweimal wiederholen. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 μl-FACS-Puffer mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper. Inkubieren Sie Platte auf dem Eis für 20 min.
- Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 200 μl des FACS-Puffers zu und Zentrifugieren der Plattenrandes bei 400 Rcf für 5-10 min. die Überstände zu verwerfen und wiederholen Sie waschen.
- Analysieren Sie Tumor-Bindung durch Durchflusszytometrie und bestimmen Sie die minimale Konzentration erforderlich, um die Zellen zu beschichten.
Hinweis: Antikörper, die nicht meine Fluoreszenzintensität (MFI) von gefärbten Tumorzellen durch mindestens das Fünffache Isotype Kontrolle erhöhen sollte nicht in nachfolgenden funktionellen Assays verwendet werden.
(4) Aktivierung von MoDC mit Tumor-IgG IC
- Tumorzellen mit minimalen IgG-Konzentration zu beschichten, wie in den Abschnitten 3.1 durch 3.4.3 beschrieben
- Ersetzen Sie eines Tages vor der Aktivierung MoDC mit Tumor IC, MoDC Kulturmedien, die GM-CSF enthält. Dazu sanft Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten komplette Nährmedien zu.
Hinweis: Isolierte Reife Tumor-assoziierten MoDC sollten mindestens 2-3 h (oder sogar über Nacht) nach dem Sortieren in komplette Medien ohne GM-CSF und vor dem Aktivieren sie mit IC kultiviert werden. - Für Tumor-Aufnahme-Analysen MoDC in einem Verhältnis von 1:5 (IC:MoDC) CFSE--markierten Tumors IC hinzu und 12-16 h in 1 mL der komplette Media pro 1 x 106 DC über Nacht inkubieren.
- Fügen Sie für FACS Analysen MoDC Aktivierung Experimente Tumor-IC im Verhältnis 1:1 (IC:MoDC hinzu) und inkubieren Sie über Nacht für 12-16 Uhr.
Hinweis: Es wird dringend empfohlen eine Positivkontrolle gehören, in denen MoDC sind mit 1 μg/mL LPS oder anderen TLR-Agonisten stimuliert. - Nach Übernachtung Aktivierung Aspirieren Sie die Überstände und waschen Zellen sanft dreimal mit Isolierung Puffer oder 10 mM EDTA HBSS.
- Um DC von der Platte lösen, brüten Sie Zellen für 2-3 min in 1 mL HBSS mit 10 mM EDTA, und lösen Sie Zellen durch kräftig pipettieren.
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 400 Rcf und wieder auszusetzen Sie, 1 x 106 DC in 90 μl PBS ergänzt mit 2 % FCS, 5 mM EDTA (FACS-Puffer) und 0,5 μg Antikörper zu blockieren. Inkubieren Sie für 5-10 min auf Eis.
- Hinzufügen von 10 μL der Färbung Antikörper-Mischung zu den Zellen und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
- Zellen und Zentrifuge bei 4 oC 400 Rcf für 5-10 min 2 mL FACS Puffer hinzufügen.
- Ersetzen Sie eines Tages vor der Aktivierung MoDC mit Tumor IC, MoDC Kulturmedien, die GM-CSF enthält. Dazu sanft Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten komplette Nährmedien zu.
- Wieder aussetzen Sie-Zellen in 200 μl FACS Puffer.
- Hinzufügen von 0,5 - 1 μg/mL DAPI 1 – 2 min. vor dem Ausführen der Proben, um tote Zellen von Analysen auszuschließen. Inkubieren Sie nicht übermäßig DAPI, da MoDC es innerhalb von 10-15 min dauern wird.
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Representative Results
Zunächst verglichen wir die Kapazität von Antikörpern aus naiven Phänomen und allogene Mäuse an Tumorzellen binden. Zu diesem Zweck wurden B16F10 und LMP Tumorzelllinien an Paraformaldehyd fixiert und ausgiebig gewaschen. B16F10 ist ein Melanom-Zelllinie, die ursprünglich von Lungenmetastasen bei C57Bl/6 Mäusen isoliert war. LMP ist ein Pankreas-Tumor-Zelle, die aus KrasG12D isoliert wurde / + LSL-Trp53R172H / + und Pdx-1-Cre Mäuse und wächst stetig in 129F1 Mäuse. Um IC zu erhalten, wurden die Tumorzellen für 20 min auf Eis mit 2 μg Phänomen oder allogene IgG pro 1 x 10-5 -Tumor-Zellen inkubiert. IgG und IgM-Antikörper wurden isoliert aus dem Kreislauf der naiven 20-24 Wochen alten Mäusen auf Protein A, gefolgt von Größe-Ausschluss-Chromatographie als24beschrieben. Zellen wurden dann gewaschen und gefärbt mit Ratte PE-konjugierten Anti-Maus IgG Sekundärantikörper, und die mittlere fluoreszente Intensität wurde in einem Durchflusszytometer analysiert. Wie in Abbildung 1A, gebunden IgG-Antikörper von allogenen C57Bl/6 Mäusen LMP Tumor Zellen ex Vivo wesentlich wirksamer als Antikörper aus 129S1 Phänomen Mäuse. Ebenso war Färbung des festen B16F10 mit allogenen IgG 129S1 um mehr als das Zehnfache höher, im Vergleich zu Färbung mit Phänomen IgG aus naiven C57Bl/6 Mäusen. Interessanterweise konnte nicht Mäuse mit B16 Tumoren produzieren Antikörper mit ähnlichen Bindungskapazität der allogenen Mäuse, auch während der Tumorprogression (Abbildung 1 b).
Als nächstes wollten wir die IC Reaktion MoDC aus Blut und Tumoren auf der DC aus der Milz und BM zu vergleichen. Zur Isolierung von Tumor-assoziierten MoDC wurden B16F10 Tumoren enzymatisch getrennt, um einzelne Zellsuspensionen zu erhalten. Immunzellen wurden angereichert mit CD45-magnetische Beads und MoDC wurden weiter geordnet als SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo durch FACS (Abbildung 2A). Es ist bemerkenswert, dass verschiedene Tumor DC möglicherweise verschiedene Markierungen, die sie definieren. Um MoDC aus dem Blut zu isolieren, zirkulierende Monozyten angereichert mit magnetischen Beads CD11b konjugiert und weiter als SSClo/FSClosortiert / CD115+/MHCIINeg/lo. Zellen wurden dann für 1 Tag in GM-CSF kultiviert, und die nicht-Anhänger und lose adhärenten Zellen übertragen wurden, in eine neue Platte und kultivierten weitere 4-5 Tage lang, MoDC (Abb. 2 b) zu erhalten. Als Bezugspunkt verwendeten wir BMDC, als der "Goldstandard" DC für viele funktionelle Assays sowie Milz MoDC nachzudenken, die eine mehr physiologische DC Teilmenge. BMDC erhielt man durch das Sortieren der BM Pro-Monozyten (CD11b+/Ly6CHallo/CD115Hallo/MHCIINeg), gefolgt von ihrer Kultivierung für 7 Tage mit GM-CSF, wie beschrieben24. Milz MoDC wurden isoliert von der einzigen Zellsuspension durch Maischen die Milz durch ein Sieb Zelle erhalten (Vorinkubation mit Kollagenase ist nicht erforderlich für Milz MoDC), gefolgt von Anreicherung mit magnetischen Beads CD11b konjugiert. Zellen wurden dann als SSClo/B220Neg/NKp46Neg/CD3Neg/Gr1Neg/F4/80Neg/MHCIIHallo/CD11cHallo sortiert und für 1 Stunde in komplette RPMI bei 37oC, kultiviert Wiederherstellen Sie Grundlinie Aktivität.
Um die Wirkung von IgG IC auf MoDC Aktivität zu untersuchen, inkubiert wir die isolierte DC Teilmengen über Nacht mit festen Tumorzellen oder mit festen Tumorzellen vorbeschichtet mit allogenen IgG. Aktivierung von BMDC oder Milz DC mit IC führte zu erhöhten CD86 und ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG Ausdruck, im Gegensatz zu MoDC oder Tumor-assoziierte MoDC (Abb. 3A). Die Fähigkeit zur Aufnahme CFSE--gefärbten Tumor gewonnenen Proteinen, mit oder ohne allogene IgG wurde auch verglichen. Wie konfokale Mikroskopie beobachtet, Milz DC zeigte überlegene Fähigkeit, die Tumor-abgeleitete Proteine (Abb. 3 b) zu verinnerlichen.
Zusammen genommen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Tumor DC und MoDC anders als Milz DC und BMDC auf Aktivierung mit AlloIgG-IC zu reagieren. Daher Impfstrategien, dass Tumor aktivieren möchten, die DC kann nicht allein auf die Aktivierungsmuster des BMDC beruhen.
Abbildung 1: allogene Mäuse haben natürlich vorkommende Tumor-Bindung-IgG-Antikörper in ihrem Umlauf: A. meine Fluoreszenzintensität (MFI) der LMP-Tumor-Zellen befleckt mit IgG-Antikörper aus dem Blut von Phänomen (129S1) und allogene (C57Bl/6) naiv Mäusen isoliert. Bedeuten Sie B. Fluoreszenzintensität (MFI) von B16F10 Tumorzellen mit isoliert aus dem Kreislauf von Phänomen Tumor-tragenden Mäusen (C57Bl/6) oder allogene (129S1) naive Mäuse-IgG-Antikörper inkubiert. Diese Zahl wurde vom erweiterten Daten 2A und 2 b Carmi Y Et al.modifiziert. Natur -521-7550:99-104, 201524.
Abbildung 2: Schema der Maus MoDC aus Blut und B16 Tumoren sortieren. A. Isolation und Sortierung Schema der MoDC aus Maus Monozyten kultiviert. Konfokale Mikroskopie DIC Bild von entzündlichen und patrouillierenden Monozyten nach 4 Tagen in der Kultur (x400). B. Isolation und Sortierung Schema des Tumor-assoziierten MoDC aus B16 Tumoren. Repräsentative konfokalen Mikroskopie DIC Bild MoDC isoliert von B16 Tumoren nach Übernachtung Kultur (x400). Diese Zahl wurde von ergänzenden Abbildung 1 Carmi Y Et Al. JCI Einsicht 1:18:e89020, 201625geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: MoDC aus der Milz und BM zeigen verschiedene Muster der Aktivierung als Tumor und Blut MoDC nach Inkubation mit IC. A. durchflusszytometrischen Analyse der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG und CD86 Expression von DC über Nacht inkubiert mit Tumor-IgG IC. B. konfokale Immunohistochemistry Tumor Aufnahme (grün) und ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG Ausdruck (rot) von DC über Nacht mit CFSE-beschriftet Tumor IC inkubiert. Diese Zahl wurde von Abbildungen 3A und 3DCarmi Y Et Al. modifiziert Akt und SHP-1 sind DC-intrinsische Prüfpunkte für Tumor Immunität. JCI Einsicht 1:18:e89020, 201625. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Angesichts der großen Zahl von DC erforderlich für die Impfung Mäuse (ca. 2-4 x 106 DC pro Mausklick), die meisten von der Impfung Strategien bei Mäusen auf Isolierung der DC vom BM und Milz basieren, gefolgt von ihrer ex-Vivo -Aktivierung. Allerdings versucht, Tumor DC in Vivo, mit den gleichen Bedingungen zur Aktivierung der Milz und BM DC aktivieren, oft in der Herstellung von wirksamen Immunität unterlegen. In zwei weiteren Publikationen Carmi Et Al. habe festgestellt, dass Blut und Tumor MoDC deutlich von Milz und BM DC unterscheiden, angesichts der Tatsache, dass sie natürlich hohe intrinsische von Tyrosin Phosphatase tragen und erfordern Grundierung vor der Aktivierung mit IC24,25. Darüber hinaus spiegelt diese Ergebnisse weiter betonen die Notwendigkeit für zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen um DC in einem Aktivierungszustand, die besser zu halten ihren physiologischen Status. Daher soll dieses Protokolls eine detaillierte Beschreibung des Prozesses Isolierung der MoDC von Tumoren und die Durchblutung, und die Schritte hervorheben, die zu ihrer vorzeitigen Aktivierung führen kann.
Zuerst, um ausreichende Zahl von DC aus Blut und Tumoren zu erhalten, gibt es eine Notwendigkeit für eine viel größere Zahl von Mäusen im Vergleich zu der Protokolle für die Isolierung von BMDC. Um den Ertrag des DC erhöhen verwenden wir 16 Wochen alten Mäusen, die größere Mengen Blut haben und insgesamt Zelle zählt. Wir bekommen regelmäßig 5-8 x 104 MoDC pro 1 mL Blut ohne Injektion von GM-CSF und 4-5 x 105 MoDC folgende Injektion. Für Tumor DC, erhalten wir ca. 6-8 x 104 MoDC aus einem 100 mm3 Tumor, obwohl die Anzahl zwischen einzelnen Mäusen und Tumormodellen variieren. Erhöhung der Tumor ergibt sich eine geringere Ausbeute der DC wie ein 1.000 mm3 Tumor nur etwa 5.000 haben DC. Stattdessen, injizieren wir Mäuse mit Tumorzellen an mehreren Standorten (in der Regel 4-6), erhalten bis zu 4 x 105 MoDC per Mausklick.
Darüber hinaus wird empfohlen, vor ihrer experimentellen Gebrauch, Antikörper, Zelllinien, Röhren und allgemeine Labor Reagenzien für Endotoxine von LAL-Test, und durch die Medien auf AC bakterielle Agar Ausplattieren getestet werden sollte. Tumor-Zell-Linien sind oft mit Mykoplasmen infiziert und sollte daher vor der Inkubation mit DC durch PCR getestet werden. Verwendung von rohen Kollagenase Zubereitungen, wie z. B. die Typen 1 und 4, ist eine primäre Quelle von Endotoxinen durch Isolierung der Collagenases von Clostridium Histolyticum. Standard die Vorbereitungen der Kollagenbildung enthalten so viel wie 10 EU/mg von Endotoxinen, die etwa 1-2 ng von Endotoxin pro mL der Verdauung Mischung. Jahr Et al. habe festgestellt, dass Kollagenase Zubereitungen, die 2,7-6,7 ng/mL von Endotoxinen 1.415 3.967 ng/mL IL-1β induziert werden folgende Kultur mit PBMC29. In der Tat, Grundieren der DC erfolgt routinemäßig mit 1 ng LPs pro mL Medien noch weniger als 100 Pikogramm/mL ist ausreichend, um ihnen30,31,32prime. Eine weitere mögliche Quelle von Endotoxinen ist FBS, die 25 EU/mL oder mehr Endotoxine enthalten kann, oder weniger als 10 EU/mL. Davon aus, dass die Nährmedien enthält 10 % konnte die FBS, die Endotoxin-Last 0,5 ng/mL, erreichen, die ausreicht, DC Prime.
Darüber hinaus verwenden viele Protokolle Antikörper Anti-CD16/32, um Fc-Rezeptoren als ein Mittel zur Erhöhung der Spezifität der ihre Antikörper-Panel vor der Sortierung zu blockieren. Dennoch führt Vernetzung der FcγRIII (CD16) zu Phosphorylierung von Syk/ZAP-70 und PLC-γ, Freisetzung von intrazellulären Ca2 + 33und Phosphorylierung des P38 und ERK1/2 In beiden menschlichen34 und Maus Monozyten-35. In unseren Händen induziert Zusatz von Anti-CD16/32 MoDC Kulturen konsequent eine starke Phosphorylierung des P38 und ERK1/2 Kinasen in DC innerhalb einer Minute der Exposition. Wir empfehlen daher die Verwendung von Anti-CD16/32 zu vermeiden, wenn Sie MoDC für in-vitro- funktionelle Assays zu isolieren.
Ein weiteres gemeinsames Protokoll verwendet Anreicherung von DC mit magnetischen Beads CD11c vor ihrer Sortierung durch FACS. CD11c ist eine Art ich transmembranen Glykoprotein, das eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Fibrinogen, LPS, erkennt Typ I Kollagen und inaktivierten C3b-Untereinheit. Rezzonico Et Al. haben gezeigt, dass Ligatur der CD11c mit Antikörpern induziert potente NFκB-Aktivierung und Sekretion von Chemokinen36. Nach unserer Erfahrung induzieren immobilisierte Anti-CD11c Antikörper Zellaktivierung und Apoptose, während die Verwendung von ihrer lösliche Form bei der Sortierung von FACS nicht dazu, Phosphorylierung des P38 oder ERK1/2 veranlassen.
Insgesamt dieses Protokoll zielt auf Isolierung der MoDC mit möglichst wenig Aktivierung wie möglich, so dass die anschließende Aktivierung in Vitro die Voraussetzungen für ihre Aktivierung in Vivowiderspiegelt.
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Disclosures
Alle Autoren erklären sie kein Interessenkonflikt haben und, dass sie nichts preisgeben.
Acknowledgments
Keine
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
