Summary
Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.
Abstract
Células dendríticas (DC) são populações de células heterogêneas que diferem em seus marcadores de membrana celular, padrões de migração e distribuição e em sua apresentação de antigénios e capacidades de ativação de células T. Desde que a maioria das vacinas de modelos experimentais de tumor exigem milhões de DC, são amplamente isolados da medula óssea ou baço. No entanto, estes DC significativamente diferem sangue e tumor DC nas suas respostas aos complexos imunes (IC) e presumivelmente a outros receptores de lectina Syk-acoplado. Importante, dada a sensibilidade da DC para moléculas associadas a perigo, a presença de endotoxinas ou anticorpos que crosslink receptores de ativação em um do isolando passos poderia resultar de escorva DC e, assim, afetar os parâmetros, ou pelo menos a dosagem, necessária para ativá-los. Portanto, aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar MoDC de sangue e tumores, evitando sua ativação prematura. Além disso, um protocolo é fornecido para ativação MoDC com tumor IC e suas análises subsequentes.
Introduction
Desde a sua descoberta, as células dendríticas (DC) têm sido um foco de pesquisa extensa devido à sua capacidade única de inclinar a diferenciação de células T1. Ao longo das últimas décadas, buscou-se um esforço de pesquisa extensiva definir os vários subconjuntos de DC e sua função durante a progressão do tumor e imunidade 2. DCs são compostas de populações de células heterogêneas que diferem entre si em seus receptores de reconhecimento de padrões, distribuição tecidual, e migratórias e antígeno apresentação recursos3,4,5. Comparado a outros subconjuntos de DC, DC derivados de monócitos (MoDC) são muito mais abundante em tumores e podem ser facilmente gerados a partir de circulação ou tumor infiltrando monócitos6,7. Portanto, muitos ensaios clínicos procuram se aproveitar de sua prevalência relativa baseiam-se na manipulação in vivo e ex vivo de MoDC autólogo para eliciar a célula T imunidade 8,9.
Da mesma forma, a vacinação baseada em DC de modelos experimentais de tumor requer injeções seriais de 2-3, 5-7 dias de diferença, de 1-2 x 106 registrado DC pulsado com antígenos do tumor. Portanto, para alcançar este grande número de DC, a maioria dos estudos de rato ter usado principalmente MoDC cultivada de precursores da medula óssea (BM) em GM-CSF para dias 7-9 (IL-4 não é necessário na configuração do mouse)10,11. No entanto, dado que nocaute de GM-CSF, os ratos têm total normal DC compartimento 12,13e dado as populações mistas obtidas essa cultura,14 a relevância fisiológica destes DC tem sido posta em causa.
Alternativamente, a DC pode ser rotineiramente isolado de células de baço. No entanto, DC compreendem apenas cerca de 0,3-0,8% de células de baço total (resultando em cerca de 7 x 105 DC/baço) e destas células, apenas CD103+ DC e MoDC podem migrar para órgãos linfoides. Desde que MoDCs representam cerca de 10-15% de esplênica DC populações15,16, a maioria dos protocolos de isolamento rendem aproximadamente 1 x 105 MoDC por baço. Expansão de MoDC pode ser alcançado através da injeção de células transfectadas do B16 que secretam GM-CSF, resultando em um aumento de 100 vezes no esplênica MoDC17. No entanto, o uso de MoDC para o desenvolvimento de vacinas de DC é limitado, desde que este procedimento não pode ser feito em seres humanos e os obtidos MoDC já altamente são ativados.
Além de obter números adequados de DC, outro desafio para o desenvolvimento de vacinas DC eficazes contra células cancerígenas autólogas envolve a falta de sinais de perigo suficiente no cenário de tumor para ativar completamente DC. Indução de sinais co-estimulatória geralmente é conseguida através da ativação de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), ou lectina tipo c sinalização percursos18,19,20,21. Uma abordagem mais para ativar DC explora sua capacidade para assumir a antígenos através de interações com receptores de superfície Fcγ (FcγR). Com efeito, um número de manuscritos importantes têm demonstrado que a injeção de MoDC de precursores BM ativado com tumor-IgG IC pode impedir o crescimento do tumor em configurações profiláticas e pode levar à erradicação dos tumores estabelecido22,23 .
Em dois trabalhos recentes, Carmi et al descobriram que em contraste com BMDC e baço DC, MoDC pelo sangue e tumores não pode responder a IgG IC sem estímulos adicionais. Isto foi encontrado para ser devido à presença de altos níveis intracelulares de fosfatases de tirosina regulação FcγR sinalização24,25. Definindo um ponto de controle crítico no DC, este trabalho forneceu uma visão importante sobre os requisitos de vacinação bem sucedida baseada em DC. A exigência de estímulos adicionais habilitar FcγR, sinalização e presumivelmente sinalização de outros receptores de lectina utilizando uma cascata de fosforilação semelhante, assim ressalta a necessidade de evitar a escorva da DC durante seu isolamento.
Portanto, o presente protocolo descreve o isolamento de MoDC do sangue e tumores, que diferem marcadamente de BM e baço DC, e destaca as precauções vale a pena considerar durante o processo.
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Protocol
Os protocolos abaixo referem-se ao isolamento do mouse MoDC, no entanto, os princípios globais podem se aplicar a outras células de subconjuntos de DC, também. 12 - camundongos C57Bl/6j de 16 semanas de idade foram mantidos em uma associação americana para a facilidade de animais credenciados – acreditação do cuidado de Animal de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade de Stanford e Tel-Aviv University institucional Cuidado Animal e Comitê de uso.
1. isolamento de Tumor associado DC derivados de monócitos
- Em uma capa de fluxo laminar, remover tumores de CO2 eutanásia de ratos e coloque tumores em meio RPMI sem soro fetal bovino (FBS).
Nota: É altamente recomendável para raspar os ratos e pulverizá-los com etanol a 70% antes de retirar os tumores, para minimizar possíveis contaminações partir da pele. Certifique-se de que o tumor não exceda 25-40 mm2 , desde que os tumores maiores têm menos DC que tendem a ser frágil e propenso a sofrer a morte celular. Se um número maior de DC é necessários, cada rato pode ser injetado com células de tumores em vários locais. - Sob uma capa laminar estéril, pique os tumores usando tesouras de cirurgia em pedaços pequenos (aproximadamente 1 x 1 mm2).
- Adicionar todos os fragmentos de tumor de um rato em um 30 mL tubo estéril de fundo plano com barras de agitação magnética, que contém 5 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS), 2 mg/mL IV de colagenase e 0,01 mg/mL DNase eu.
Cuidado: Pilhas Myeloid produzem energia através de glicosilação, mesmo em estado estacionário. Portanto, a única mídia de uso que contém glicose (por exemplo, HBSS, RPMI e DMEM), como fome de glicose para tão pouco como 10-15 min resultará em morte celular e apoptose dentro de 24 h. uso somente uma colagenase endotoxina baixa IV, como colagenase é produzido por Gram-positivas bactérias (Clostridium histolyticum).
- Adicionar todos os fragmentos de tumor de um rato em um 30 mL tubo estéril de fundo plano com barras de agitação magnética, que contém 5 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS), 2 mg/mL IV de colagenase e 0,01 mg/mL DNase eu.
- Agita-se a cerca de 200-400 rpm numa incubadora 37 oC com um agitador magnético para 20-30 min.
- Adicionar 5 mL de mídia completa e ressuspender vigorosamente.
- Filtre as células através de um filtro de célula de 70 µm. Centrifugar a 4 oC 400 rcf, por 5-10 min para as células de Pelotas.
Cuidado: Não tente isolar as células diretamente após digestão enzimática, como alguns tumores são necróticos e contêm quantidades relativamente grandes de restos celulares ou matriz extracelular. Aplicam-se as células em 15% médio gradiente de densidade para obter apenas as células. - Suspenda o 9 mL do meio de gradiente de densidade com 1 mL de PBS de x 10 para ajustar a pressão osmótica e para obter a solução-mãe de Percoll 100%. Mistura 1,5 mL densidade gradiente médio estoque solução com 8,5 mL HBSS e misture vigorosamente com tumor derivado centrifugado. Suavemente da camada 2 mL de DMEM na parte superior 15% densidade gradiente médio e centrifugar rcf 400 por 20 min em temperatura ambiente. Descarte os sobrenadantes, como as células formarão um sedimento no fundo do tubo.
- Lave as células peletizadas duas vezes por re-suspensão-los em 10 mL HBSS contendo 2% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 10 mM EDTA (Buffer de isolamento) e centrifugar 4 óC 400 rcf por 5-10 min para as células de Pelotas.
- Contar as células em um hemocytometer usando trypan azul sob um microscópio de luz.
- Ressuspender as células de 1 x 108 isoladamente 1 mL buffer e incube-os a 4 oC com 30 μL de CD11b+ conjugado magnéticos grânulos por 15 min.
Atenção: Evite o uso de grânulos CD11c-conjugados, pois isso irá ativar o DC e induzir a morte celular. Não tente bloquear FcγRII e FcγRIII com anticorpos anti-CD16/32. Bloqueando os anticorpos ligate FcγR e induzir forte fosforilação de quinases mapa e prime o DC.- Remover os excesso grânulos desvinculados pela adição de 9 mL de tampão de isolamento e centrífuga células no rcf 400 durante 5-10 minutos a 4oC.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de isolamento. Aplicam-se as células em uma coluna magnética pré-lavadas. Lave a coluna duas vezes com 3 mL de tampão de isolamento.
- Remova a coluna do ímã. Pipete 6 mL de tampão de isolamento para a coluna e expulsar as células magneticamente-etiquetadas em um tubo de coleta estéril, empurrando o êmbolo. Centrífuga de células no rcf 400 durante 5-10 minutos a 4 oC.
- Ressuspender as células em 100 μL por 1 x 107 células e manchar com os seguintes anticorpos conjugados fluoróforo: Linage negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI e Ly6G), MHCII, Ly - 6C.
- Classificar as células por retenção de pequenas células, usando dispersão lateral (SSC) e encaminhar a dispersão (FSC) e cultura em completo suplementado com 5 ng/mL, GM-CSF. Incubar as células durante 1 hora a 3 7 oC para permitir que os macrófagos aderir a placa. Em seguida, transferir o frouxamente e células não-aderentes para um novo prato de cultura.
Nota: O Mouse MoDC são definidos como CD11b+/CD11c+/MHCIIOi/Ly6Clo/int 7,26,27. Expressão de Ly6C pode variar drasticamente entre modelos de tumor e em alguns modelos (por exemplo, LMP) MoDCs falta completamente a expressão de Ly6C. Em geral, um tumor de3 B16F10 100 mm normalmente contém 5 x 104 de DC, resultando em aproximadamente 4-5 x 106 células total. Destas células, 10-15% são células do sistema imunológico e 8-10% são MoDC. Aumentar os números de DC pode ser alcançado através da injeção de ratos com tumores em vários locais. Apenas pequenas células SSC/FCS de espécie, como outras células mieloides podem expressar marcadores como CD11c e Ly6C.
Opcional: Classificar o tumor infiltrando monócitos como pequenas células SSC/FSC que expressam Ly6COi e são negativos para MHCII. Depois disso, cultura de monócitos em vitro com 50 ng/mL GM-CSF para obter DC.
2. isolamento de DC derivados de monócitos do sangue periférico
Nota: Desde que MoDCs maduros são relativamente raros em sangue de rato, o protocolo abaixo refere-se a sua derivação em vitro de monócitos classificados.
- Para aumentar os níveis de monócitos no sangue, anestesiar os ratos com 4% de isoflurano e injetá-las por via subcutânea (s.c.) com 1 μg de GM-CSF em 50 µ l de PBS.
- Após 1-2 h, sacrifica os ratos usando CO2.
Cuidado: Não sacrifica os ratos por deslocamento cervical, porque isso poderá provocar hemorragia interna. - Imediatamente após a eutanásia, pulverize o mouse com 70% de etanol e remover a pele que cobre o coração com uma tesoura cirúrgica, sob uma capa de estéril de fluxo laminar. Limpe a tesoura com etanol e corte aurícula direita do coração. Lentamente, irrigue o coração através do ventrículo direito com 20 mM de EDTA HBSS, usando uma seringa de 10 mL e agulha 25-G.
- Colete o sangue com uma seringa estéril da cavidade pleural, em um tubo estéril contendo sulfato de heparan e EDTA. Continue a lavar o coração até o fígado e o pulmões tornam-se rosa ou o branco.
- Aplica o sangue para uma densidade gradiente: médio e centrifugar rcf 400 em temperatura ambiente por 15 min com freio baixo.
Atenção: Uso livre de endotoxinas densidade gradiente médio (normalmente menos de 0,12 EU / mL).- Colete células mononucleares em um tubo de novo. Lave as células pela re-suspensão em 10 mL HBSS contendo 2% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 10mm EDTA (tampão de isolamento) e em seguida de centrifugação em 4 órcf 400 C por 5-10 min para as células de Pelotas.
Atenção: Utilize apenas a mídia que contém pelo menos 1 g/L de glicose.
- Colete células mononucleares em um tubo de novo. Lave as células pela re-suspensão em 10 mL HBSS contendo 2% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 10mm EDTA (tampão de isolamento) e em seguida de centrifugação em 4 órcf 400 C por 5-10 min para as células de Pelotas.
- Para a selecção positiva CD11b, re-suspender 1 x 108 células em 1 mL de tampão de isolamento e incube-os por 15 min com 50 μL de grânulos magnéticos CD11b-conjugado no 4 oC.
- Lave o excesso grânulos adicionando 9 mL de tampão de isolamento e centrifugação no rcf 400 para 5-10 min a 4 oC. Aspire os sobrenadantes e ressuspender as células em 1 mL de tampão de isolamento. Aplicam-se as células em uma coluna magnética pré-lavadas de acordo com as instruções do fabricante.
- Retirar a coluna do ímã, pipete 6 mL de tampão de isolamento para a coluna e expulsar as células magneticamente-etiquetadas em um tubo de coleta estéril, empurrando o êmbolo. Centrifugar as células no rcf 400 durante 5-10 min à 4 óC. Wash a coluna duas vezes com 3 mL de tampão de isolamento.
- Ressuspender as células em 1 x 107 células/100 μL isolamento buffer e mancha com os seguintes anticorpos conjugados fluoróforo: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII e 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 células.
- Classificar as células por retenção na dispersão lateral pequena (SSC) e células pequenas frente dispersão (FSC).
Nota: Inflamatórios monócitos Mouse são geralmente definidos como CD115+/MHCIIEis/neg/Ly6COie patrulhando os monócitos são definidos como CD115+/MHCII de /Ly6C deEis/negneg 4,5. Em casos onde não há separação entre os dois subconjuntos é necessária, total SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIEis as células podem ser classificadas. Tanto o ingênuo e o tumor-rolamento ratos contêm aproximadamente 5-8 x 104 MoDC por 1 mL de sangue e até 4-5 x 105 MoDC seguinte injeção de GM-CSF. Deles, cerca de 70% são inflamatórios monócitos e 30% estão a patrulhar os monócitos. - As células em uma concentração de 1 x 106 células/mL em uma mídia completa suplementada com 20 ng/mL, GM-CSF da placa. Depois de 1 dia, transferi as células não-aderentes e frouxamente aderentes a uma placa nova e cultura por mais 4-5 dias.
Cuidado: Mídia DC não deve ser complementadas com piruvato.
3. preparação de Tumor-IgG complexos imunes
- Células de tumor de cultura no frasco de cultura 75 cm2 a confluência de 70% nos meios de comunicação DMEM completas.
- Adicione 2 mL de 0,25% tripsina/EDTA para separar células de cultura balão e monitor celular morfologia sob um microscópio de luz para evitar excesso de tripsinização.
- Adicione 8 mL de meios de cultura completo (por 2 mL de tripsina) para inibir a digestão do trypsin e centrifugar a 4 oC, rcf 400 por 5-10 min para as células de Pelotas.
Nota: Certifique-se de verificar as pilhas do tumor para o micoplasma usando um kit comercial de PCR. Teste para a presença de bactérias Gram-negativas e fungosas endotoxinas usando Métodos de Limulus Lysate (LAL) ensaio28). Soro deve ser filtrado através de 0,22 μM e testado para os 9 vírus do código de regulamentos federais. Além disso, teste a meios de cultura e soros pela queda de 100-200 μL em LB ágar ou caldo e cultura durante 2 dias a 37 oC. - Lavagem de células novamente de restos de tripsina e soro suspendendo-os novamente em 10 mL de PBS e centrifugar rcf 400 por 5-10 min. Aspire o sobrenadante e repetir a lavagem 2 vezes mais.
- Células de reparo em 1,8% tamponada paraformaldeído por 10 min à temperatura ambiente.
- Lave as células suspendendo-os novamente em 10 mL de PBS e centrifugar a 4 oC 400 rcf por 5-10 min.
- Sobrenadantes de aspirado e repetir lavagem duas vezes mais.
Opcional: Para os ensaios de absorção de tumor, as células podem ser etiquetadas por incubando-os por 5 min em 37 oC em PBS contendo 1 éster de grufo de carboxyfluorescein μM (CFSE). CFSE então é saciada com mídia completa para 10 min no gelo. As células devem ser lavadas extensivamente em PBS contendo 2% de soro para remover o corante residual.
- Re-suspenda as células em buffer FACS (PBS suplementado com FCS 2% + 5 mM EDTA) e 0.5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear potenciais interacções não-específicas da proteína-proteína. Placa em uma U-forma 96 poços/placa em uma concentração de 1 x 105 células por 100 μL.
- Adicione diferentes diluições de anticorpos de ligação de tumor variando de 5 μg - 5 ng/1 x 105 células. Incube a placa no gelo por 15-20 min.
Nota: IgG anticorpos foram isolados do soro de ratos fêmeas de ingênuo 20-24 semanas de idade em colunas de proteína A, como descrito,24.
- Adicione diferentes diluições de anticorpos de ligação de tumor variando de 5 μg - 5 ng/1 x 105 células. Incube a placa no gelo por 15-20 min.
- Lave as células adicionando 150 µ l de PBS e centrifugação a placa em 4 óC 400 rcf, por 5-10 min.
- Descartar os sobrenadantes e repita a lavagem duas vezes. Ressuspender as células em buffer de FACS 100 μL contendo anticorpo secundário conjugado fluoróforo. Incube a placa no gelo por 20 min.
- Lavagem de células, adicionando 200 μL de tampão, FACS e centrifugação a placa no rcf 400 de 5-10 min. descartar os sobrenadantes e repita a lavagem.
- Analisar a vinculação de tumor por citometria de fluxo e determinar a concentração mínima necessária para revestir as células.
Nota: Os anticorpos que não aumentem fluorescência de média intensidade (IFM) de células de tumor manchada pelo menos cinco vezes ao longo do isotipo controle não devem ser usados em ensaios funcionais subsequentes.
4. activação das MoDC com IC Tumor-IgG
- Casaco de células tumorais com concentração mínima de IgG, conforme descrito nas seções 3.1 através de 3.4.3
- Um dia antes de ativar o MoDC com tumor IC, substitua MoDC meios de cultura, que contém o GM-CSF. Para fazer isso, delicadamente aspirar a mídia e lavar as células uma vez com meios de cultura completa previamente aquecido.
Nota: Isolado MoDC maduro tumor-associado deve ser cultivada pelo menos 2-3 h (ou até mesmo durante a noite) depois da classificação nos meios de comunicação completos sem GM-CSF e antes de ativá-los com IC. - Para análises de captação do tumor, adicionar o tumor CFSE-rotulado IC para MoDC em uma proporção de 1:5 (IC:MoDC) e incubar durante uma noite para 12-16 h em 1 mL de mídia completa por 1 x 106 DC.
- Para análises de FACS de experimentos de ativação MoDC, adicionar o tumor-IC na proporção de 1:1 (IC:MoDC) e incubar durante uma noite para 12-16 h.
Nota: É altamente recomendável para incluir um controle positivo, no qual MoDC são estimulados com 1 μg/mL de LPS ou outras agonistas TLR. - Ativação durante a noite, a seguir, Aspire os sobrenadantes e lavagem de células suavemente três vezes com tampão de isolamento, ou 10 mM, EDTA HBSS.
- Para desanexar DC da placa, incubar as células por 2-3 min em 1 mL HBSS contendo 10 mM EDTA e separe as células pipetando vigorosa.
- Centrifugar as células no rcf 400 e ressuspender 1 x 106 DC em 90 µ l PBS suplementado com FCS 2%, 5 mM EDTA (tampão de FACS) e 0.5 μg de bloqueio de anticorpos. Incube no gelo por 5-10 min.
- Adicionar 10 μL de mistura de anticorpos para as células de coloração e incubar no gelo por 15 min.
- Adicione 2 mL FACS de tampão para células e centrifugar a 4 oC 400 rcf por 5-10 min.
- Um dia antes de ativar o MoDC com tumor IC, substitua MoDC meios de cultura, que contém o GM-CSF. Para fazer isso, delicadamente aspirar a mídia e lavar as células uma vez com meios de cultura completa previamente aquecido.
- Ressuspender as células em buffer de FACS 200 μL.
- Adicionar 0,5 - 1 μg/mL de DAPI 1-2 min antes de executar as amostras, para excluir as células mortas de análises. Não excesso incube DAPI, como MoDC vai ocupá-lo dentro de 10-15 min.
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Representative Results
Inicialmente comparamos a capacidade dos anticorpos de camundongos syngeneic e alogênico de ingênuo para ligar a células tumorais. Para este fim, B16F10 e LMP linhas de células de tumor foram fixadas em paraformaldeído e lavadas extensivamente. B16F10 é uma linhagem de células de melanoma, que foi originalmente isolada de metástases de pulmão em camundongos C57Bl/6. LMP é uma célula de tumor no pâncreas que foi isolada de KrasG12D / +, ratos LSL-Trp53R172H / + e Pdx-1-Cre e cresce progressivamente em ratos 129F1. Para obter o IC, células tumorais foram incubadas por 20 min no gelo com 2 μg de IgG syngeneic ou alogênico por 1 x 105 células de tumor. IgG e IgM anticorpos foram isolados a partir da circulação de ingênuo 20 24-week-old ratos na proteína A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho, como descrito a24. As células foram então lavadas e manchadas com anticorpo secundário do rato PE-conjugados anti-rato IgG, e a média intensidade fluorescente foi analisada em um citômetro de fluxo. Como indicado na figura 1A, anticorpos IgG de alogênico camundongos C57Bl/6 vinculada LMP tumor células ex vivo muito mais eficazmente do que os anticorpos da 129S1 syngeneic ratos. Da mesma forma, coloração de B16F10 fixo com IgG alogênico 129S1 era mais de dez vezes superior, comparado a coloração com IgG syngeneic de camundongos C57Bl/6 de ingênuo. Curiosamente, ratos com tumores B16 não conseguiram produzir anticorpos com a capacidade de ligação similar àquele de ratos alogênico, mesmo durante a progressão do tumor (figura 1B).
Em seguida procuramos comparar a resposta de IC de MoDC do sangue e tumores ao de DC do baço e BM. Para isolar MoDC tumor-associado, B16F10 tumores foram enzimaticamente dissociadas para obter suspensões celulares simples. Células do sistema imune foram enriquecidas usando grânulos CD45-magnético, e MoDC mais foram classificados como SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6CEis por FACS (Figura 2A). É de salientar esse tumor diferente DC pode ter diferentes marcadores que definem-los. Para isolar o MoDC do sangue, monócitos circulantes foram enriquecidos por grânulos magnéticos CD11b-conjugados e mais classificados como SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. As células foram cultivadas em seguida para 1 dia em GM-CSF, e as células não-aderentes e frouxamente aderentes foram transferidas para uma placa nova e cultivadas por mais 4-5 dias obter MoDC (Figura 2B). Como ponto de referência, que usamos BMDC, servindo como o "padrão ouro" DC para muitos ensaios funcionais, bem como MoDC esplênica, que refletem um subconjunto de DC mais fisiológico. BMDC foram obtidos, classificando os BM pro-monócitos (CD11b+/Ly6COi/CD115Oi/MHCIIneg), seguido por seu cultivo durante 7 dias com GM-CSF, como descrito,24. MoDC esplênica foram isolados da suspensão de célula única, obtidas por triturar o baço através de um filtro de célula (pré-incubação com colagenase não é necessária para MoDC esplênica), seguido de enriquecimento com grânulos magnéticos CD11b-conjugados. As células foram então classificadas como SSCEis/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIOi/CD11cOi e cultivadas por 1 hora em RPMI completa em 37oC a Restaure a atividade da linha de base.
Para investigar o efeito do IC IgG na atividade MoDC, estamos incubados os subconjuntos de DC isolados durante a noite com células tumorais fixo ou com células de tumor fixo pré-revestido com IgG alogênico. Ativação de BMDC ou DC esplênica com IC resultou em aumento da expressão CD86 e MHCII, ao contrário de MoDC, ou tumor-associado MoDC (Figura 3A). A capacidade de absorção CFSE manchado tumor proteínas derivadas, com ou sem IgG alogênico, também foi comparada. Como observado por microscopia confocal, DC esplênica mostrou superior capacidade de internalizar as proteínas derivadas de tumor (Figura 3B).
Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o tumor DC e MoDC respondem de forma diferente do que esplênica DC e BMDC a ativação com alloIgG-IC. Portanto, estratégias de vacinação que deseja ativar o tumor que DC não pode basear-se unicamente sobre os padrões de ativação de BMDC.
Figura 1: alogênico ratos têm naturalmente anticorpos de IgG de tumor-ligação em sua circulação: R. significa intensidade de fluorescência (IFM) de células de tumor LMP manchadas com anticorpos IgG isolados do sangue de syngeneic (129S1) e ratos de ingênuo alogênico (C57Bl/6). B. significa intensidade de fluorescência (IFM) de células de tumor B16F10 incubadas com anticorpos IgG isolados da circulação de ratos de tumor-rolamento syngeneic (C57Bl/6) ou alogênico (129S1) ingênuo de ratos. Esta figura foi modificada de dados estendidos 2A e 2B Carmi Y et al. Natureza 7550:99 521-104, 201524.
Figura 2: esquema de mouse MoDC do sangue e B16 tumores de classificação. A. isolamento e regime de classificação de MoDC cultivada de monócitos do mouse. Imagem de microscopia confocal DIC de monócitos inflamatórias e patrulhamento após 4 dias na cultura (x400). B. isolamento e regime de classificação de tumor-associado MoDC de tumores B16. Imagem DIC microscopia confocal representativa de MoDC isolada do B16 tumores após a cultura da noite (x400). Esta figura foi modificada da figura complementar 1 Carmi Y et al. percepção JCI 1:18:e89020, 201625. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: MoDC do baço e BM exibir diferentes padrões de ativação do tumor e MoDC de sangue após incubação com IC. R. fluxo cytometric análise de expressão MHCII e CD86 por DC incubado durante a noite com tumor-IgG IC. B. Confocal imuno-histoquímica de captação do tumor (verde) e expressão de MHCII (vermelho) por DC incubado durante a noite com tumor CFSE-rotulado IC. Esta figura foi modificada em figuras 3A e 3DCarmi Y et al Akt e SHP-1 são intrínsecos DC pontos de verificação para a imunidade do tumor. Visão JCI 1:18:e89020, 201625. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Dado o grande número de DC necessário para vacinar os ratos (aproximadamente 2-4 x 106 DC por um rato), a maioria da vacinação estratégias em camundongos baseiam-se no isolamento de DC do BM e do baço, seguido por sua ativação ex vivo . No entanto, tenta ativar tumor DC em vivo, usando as mesmas condições para ativar o baço e BM DC, muitas vezes ter sido mal sucedido em produzir imunidade eficaz. Em duas publicações subsequentes, Carmi et al. descobriram que sangue e tumor MoDC diferem significativamente de baço e BM DC, dado que eles suportar naturalmente altos níveis intrínsecos de tirosina fosfatase e exigem a preparação antes da ativação com IC24,25. Além disso, estes resultados ainda mais estresse a necessidade de tomar precauções extras para manter o DC em um estado de ativação que melhor reflete seu estado fisiológico. Portanto, o presente protocolo visa fornecer uma descrição detalhada do processo de isolamento de MoDC de tumores e a circulação e para destacar as etapas que podem resultar em sua ativação prematura.
Primeiro, a fim de obter um número suficiente de DC de sangue e tumores, há uma necessidade de um número muito maior de ratos, comparada com a de protocolos para isolar BMDC. Para aumentar o rendimento do DC usamos ratos de 16 semanas de idade, que têm maiores volumes de sangue e célula total conta. Rotineiramente temos 5-8 x 104 MoDC por 1 mL de sangue sem injeção de GM-CSF e 4-5 x 105 MoDC seguinte injeção. Para tumor DC, obtemos aproximadamente 6-8 x 104 MoDC de um tumor de3 100 mm, mas o número pode variar entre ratos individuais e entre modelos de tumor. Aumentando os resultados de tamanho do tumor em um menor rendimento de DC, como um tumor de3 mm 1.000 terá apenas cerca de 5.000 DC. Em vez disso, nós injetamos ratos com células tumorais em vários locais (geralmente 4-6), obtendo assim até 4 x 105 MoDC por rato.
Além disso, recomendamos que antes da sua utilização experimental, anticorpos, linhas celulares, tubos e reagentes de laboratório geral devem ser testados de endotoxinas por ensaio LAL e pelo chapeamento mídia sobre ágar bacteriana AC. Linhas de células de tumor são frequentemente infectadas com micoplasma e, portanto, devem ser testadas por PCR antes de sua incubação com DC. Uso de preparações de colagenase bruto, tais como tipos 1 e 4, é uma fonte primária de endotoxinas devido ao isolamento das colagenases de Clostridium histolyticum. Preparações padrão de colagenase podem conter tanto quanto EU/10mg de Endotoxinas, que é cerca de 1-2 ng da endotoxina por mL da mistura de digestão. Et al . Jahr descobriram que a colagenase preparações 2.7-6,7 ng/mL de endotoxinas induzirá 1.415-3.967 ng/mL de IL-1 β cultura com PBMC29a seguir. Com efeito, escorva de DC é rotineiramente feita com 1 ng de LPS por mídia mL, no entanto, menos de 100 picogramas/mL é suficiente para eles prime30,31,32. Outra fonte potencial de endotoxinas é FBS, podendo conter 25 EU/mL ou mais de Endotoxinas, ou menos de 10 EU/mL. Assumindo que os meios de cultura contém 10% FBS, a carga de endotoxinas poderia chegar 0,5 ng/mL, que é suficiente para aprontar a DC.
Além disso, muitos protocolos usam anticorpos anti-CD16/32 para bloquear os receptores Fc como um meio de aumentar a especificidade do seu painel de anticorpos antes da classificação. Apesar de tudo, cross-linking de FcγRIII (CD16) leva à fosforilação de Syk/ZAP-70 e PLC-γ, liberação de Ca2 + intracelular 33e fosforilação da P38 e ERK1/2 em ambos humana34 e mouse monócitos35. Em nossas mãos, adição de anti-CD16/32 para culturas MoDC consistentemente induz uma forte fosforilação de quinases P38 e ERK1/2 em DC dentro de um minuto de exposição. Nós, portanto, recomendamos fortemente que evitando o uso de anti-CD16/32 quando isolando MoDC para os ensaios em vitro funcional.
Outro protocolo comum usa enriquecimento de DC por CD11c grânulos magnéticos antes da sua ordenação por FACS. CD11c é um tipo eu glicoproteína transmembrana que reconhece uma variedade de ligantes, incluindo o fibrinogênio, LPS, tipo I, colágeno e a subunidade de C3b inactivada. Rezzonico et al . demonstraram essa ligadura de CD11c com anticorpos induz ativação de NFκB potente e secreção de quimiocinas36. Em nossa experiência, anticorpos anti-CD11c imobilizado induzem ativação celular e apoptose, enquanto o uso de sua forma solúvel na classificação de FACS não induz a fosforilação de P38 ou ERK1/2.
Em geral, este protocolo é projetado para atingir o isolamento de MoDC com ativação tão pouco quanto possível, para que sua ativação subsequente em vitro reflete as condições requeridas para sua ativação na vivo.
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Disclosures
Todos os autores declaram que eles têm nenhum conflito de interesses e que eles não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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