Summary
Monocytt-avledet DC (MoDC) kan forstand mindre mengder fare-assosiert molekyler og er derfor lett fylt. Vi gir en detaljert protokoll for isolering av MoDC blod svulster og Aktivisering med immun komplekser mens uthevingen nøkkel forholdsregler som bør vurderes for å unngå deres tidlig aktivering.
Abstract
Dendrittiske celler (DC) er heterogene celle populasjoner som avviker i cellemembranen markører, migrasjon og distribusjon, og i deres antigen presentasjon og T celle aktivering kapasiteter. Siden de fleste vaksiner eksperimentelle svulst modeller krever millioner av DC, er de mye isolert fra benmarg eller milten. Men disse DC betydelig forskjellig fra blod og svulst DC i sine Svar å immun komplekser (IC) og formodentlig andre forhold-kombinert Lektiner reseptorer. Viktigst, gitt sensitiviteten av DC til fare-assosiert molekyler, endotoxins eller antistoffer som krysskobling aktivisering reseptorer i en av de isolere kan medføre grunning FM og dermed påvirker parametere, eller minst dosering, må aktivere dem. Derfor beskriver her vi en detaljert protokoll for å isolere MoDC fra blod og svulster og unngå deres tidlig aktivering. I tillegg finnes en protokoll for MoDC aktivering med svulst IC og deres påfølgende analyser.
Introduction
Siden oppdagelsen sin, har dendrittiske celler (DC) vært fokus for omfattende forskning unike evne til å skew T celle differensiering1. De siste tiårene, har et omfattende forskning forsøk søkt å definere ulike DC delsettene og deres funksjon under svulst progresjon og immunitet 2. DCs er sammensatt av ulike celle populasjoner som skiller seg fra hverandre i deres mønstergjenkjenning reseptorer, vev distribusjon, trekkfugler og antigen presentasjon evner3,4,5. Sammenlignet med andre DC undergrupper, monocytt-avledet DC (MoDC) er langt mer rikelig i svulster og lett kan genereres fra sirkulerende eller svulst-infiltrere monocytter6,7. Derfor er mange kliniske forsøk søker å utnytte sin relative utbredelse basert på i vivo og ex vivo manipulering av autologous MoDC for å lokke fram T celle immunitet 8,9.
Tilsvarende DC-baserte vaksinasjon av eksperimentelle svulst modeller krever 2-3 føljetong injeksjoner, 5-7 dagers mellomrom, 1-2 x 106 aktivert DC pulserende med svulst antigener. Derfor, for å oppnå antall DC, de fleste mus studier har primært brukes MoDC kultivert fra benmargen (BM) forløpere i GM-CSF 7-9 dager (IL-4 ikke er nødvendig i innstillingen mus)10,11. Likevel, gitt at GM-CSF knockout mus har samlet normal DC kupé 12,13, og gitt blandet befolkningen fått fra denne kulturen,14 fysiologiske relevansen av disse DC har blitt kalt inn spørsmålet.
Alternativt kan DC være rutinemessig isolert fra milt celler. Imidlertid DC utgjør bare 0,3 0,8% av totale milt celler (resulterer i ca 7 x 105 FM/milt), og av disse cellene, bare CD103+ DC og MoDC kan overføre tilbake til lymfoide organer. Siden MoDCs utgjør ca 10-15% av splenic DC bestander15,16, gir de fleste isolasjon protokoller ca 1 x 105 MoDC per milten. Utvidelse av MoDC kan oppnås ved å injisere transfekterte B16 celler det avsondre GM-CSF, resulterer i en 100-fold økning i splenic MoDC17. Men bruk av MoDC for å utvikle DC vaksiner er begrenset ettersom denne fremgangsmåten ikke kan utføres i mennesker og innhentet MoDC er allerede svært aktivert.
I tillegg til å skaffe tilstrekkelig antall DC, innebærer en utfordring for å utvikle effektive DC vaksiner mot autologous kreftceller mangel på tilstrekkelig fare signaler i innstillingen svulst fullt aktivere DC. Induksjon av co-stimulatory signaler er vanligvis oppnås gjennom aktivering av mønstergjenkjenning reseptorer (PRR), eller c-type Lektiner signalnettverk trasé18,19,20,21. En ytterligere tilnærming for å aktivere DC utnytter deres evne til å ta opp antigener gjennom interaksjoner med overflate Fcγ reseptorer (FcγR). Faktisk en rekke viktige manuskripter har vist at injeksjon av MoDC fra BM forløpere aktivert med svulst-IgG IC kan hindre tumor vekst i forebyggende innstillinger, og kan føre til utrydding av etablerte svulster22,23 .
To nyere verk oppdaget Carmi et al. at i motsetning til BMDC og milt DC, MoDC fra blod og svulster ikke kan svare på IgG KI uten ekstra stimuli. Dette ble funnet for å være av høy intracellulær nivåer av tyrosin phosphatases regulerer FcγR signalering24,25. Ved å definere en kritisk checkpoint i DC, gitt dette arbeidet en viktig innsikt i kravene for vellykket DC-baserte vaksinasjon. Behovet for ytterligere stimuli aktivere FcγR signalering, og antagelig signalene fra andre Lektiner reseptorer bruker en lignende fosforylering cascade, dermed understreker behovet for å unngå grunning FM under deres isolasjon.
Derfor nåværende protokollen beskriver isolering av MoDC fra blod og svulster, som avviker markant BM og milt DC, og fremhever forholdsregler verdt å vurdere under prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollene nedenfor refererer til isolering av musen MoDC, men de generelle prinsippene gjelder kanskje andre DC delsett celler, også. 12 - 16-uke-gamle C57Bl/6j mus ble opprettholdt i et American Association for akkreditering av laboratoriet Animal Care-akkreditert dyr anlegget. Alle protokoller ble godkjent av Stanford University og Tel-Aviv University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. isolering av svulst forbundet monocytt-avledet DC
- I laminær strømning hette, fjerne svulster fra CO2 euthanized mus og plasser svulster i RPMI medium uten fosterets bovin serum (FBS).
Merk: Det anbefales sterkt å barbere mus og spray dem med 70% etanol før tumorer, for å minimere mulig forurensing fra pelsen. Være sikker på at svulsten ikke overstiger 25-40 mm2 siden større tumorer har færre DC som pleier å være sårbar og utsatt å gjennomgå celledød. Hvis større antall DC er nødvendig, kan hver musen injiseres med svulster celler på flere nettsteder. - Under sterilt laminær hette, hogge svulstene med kirurgi saks i små biter (ca 1 x 1 mm2).
- Legge til alle svulst fragmenter fra en mus i en 30-mL steril flat bunn rør med magnetic røre barer, som inneholder 5 mL av Hanks balansert salt løsning (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV og 0,01 mg/mL DNase jeg.
Forsiktig: Myeloide celler produserer energi igjennom glykosylering, selv under steady state. Derfor vil bare bruke medier som inneholder glukose (f.eks HBSS, RPMI og DMEM), som glukose sult for så lite som 10-15 min resultere i celledød og apoptose innen 24 h. Bruk bare en lav endotoxin collagenase IV som collagenase er produsert av Gram-positive bakterier (Clostridium histolyticum).
- Legge til alle svulst fragmenter fra en mus i en 30-mL steril flat bunn rør med magnetic røre barer, som inneholder 5 mL av Hanks balansert salt løsning (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV og 0,01 mg/mL DNase jeg.
- Rør på ca 200-400 rpm i en 37 oC inkubator med en magnetisk rørestang i 20-30 min.
- Legg til 5 mL av komplett og å suspendere kraftig.
- Filtrere celler gjennom en 70-µm celle sil. Sentrifuge ved 4 oC 400 rcf for 5-10 min å pellets cellene.
Forsiktig: Ikke prøv å isolere cellene direkte følge enzymatisk fordøyelsen, som noen svulster er necrotic og inneholder relativt store mengder celle rusk eller ekstracellulær matrix. Bruke celler på 15% tetthet gradert medium for å hente bare cellene. - Suspendere 9 mL av tetthet gradert medium med 1 mL 10 x PBS justere osmolality, og å få 100% Percoll lagerløsning. Mix 1.5 mL tetthet gradert medium lagerløsning med 8,5 mL HBSS og bland det kraftig med svulst-avledet celle pellets. Forsiktig laget 2 mL DMEM på 15% tetthet gradert medium og sentrifuge på 400 rcf for 20 min ved romtemperatur. Kast supernatants, som cellene vil danne pellets nederst på røret.
- Vask pelleted cellene to ganger ved å henge dem i 10 mL HBSS som inneholder 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin, og 10 mM EDTA (isolasjon Buffer) og sentrifuger ved 4 oC 400 rcf i 5-10 min å pellets cellene.
- Antall celler i et hemocytometer bruker trypan blå under lys mikroskop.
- Nytt suspendere 1 x 108 celler i 1 mL isolasjon buffer og ruge dem på 4 oC med 30 μL CD11b+ konjugert magnetiske perler i 15 min.
Forsiktig: Unngå bruk av CD11c-konjugerte perler, da dette vil aktivere DC og indusere celledød. Ikke forsøk å blokkere FcγRII og FcγRIII med anti-CD16/32 antistoffer. Blokkerer antistoffer ligate FcγR og indusere sterk fosforylering av kart kinaser og prime DC.- Fjerne overflødig ubundet perler ved å legge 9 mL av isolasjon buffer og sentrifuger celler på 400 rcf for 5-10 minutter til 4oC.
- Sug opp nedbryting og å suspendere celler i 1 mL isolasjon buffer. Bruke cellene på en prewashed magnetisk kolonne. Vask kolonnen to ganger med 3 mL isolasjon buffer.
- Fjern kolonnen fra magneten. Pipetter 6 mL av isolasjon buffer på kolonnen og skylle ut magnetisk-merket cellene i et sterilt samling rør ved å skyve stempelet. Sentrifuger cellene på 400 rcf for 5-10 minutter til 4 oC.
- Nytt suspendere cellene på 100 μL per 1 x 107 celler og flekker med følgende fluorophore-konjugerte Antistoffene: Linage negative (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI og Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
- Sortere cellene etter gating liten cellene, bruker siden xy (SSC) og videresende scatter (FSC) og kultur i fullstendig middels med 5 ng/mL GM-CSF. Inkuber celler i 1 time ved 3 7 oC for å tillate makrofager å overholde platen. Deretter overføre den løst og ikke-tilhenger celler til en ny kultur parabol.
Merk: Mus MoDC defineres som CD11b+/CD11c+/MHCIIHei/Ly6Clo/int 7,26,27. Uttrykk for Ly6C kan variere dramatisk mellom tumor modeller, og i noen modeller (f.eks LMP) MoDCs absolutt mangel Ly6C uttrykk. Overall, en 100 mm3 B16F10 svulst inneholder vanligvis 5 x 104 FM, noe som resulterer i ca 4-5 x 106 totalt celler. Av disse cellene, 10-15% er immunceller og 8-10% er MoDC. Økende DC kan oppnås ved å injisere mus med svulster på flere nettsteder. Sorter bare små SSC/FCS celler, som andre myeloide celler kan uttrykke markører som CD11c og Ly6C.
Valgfritt: Sortere svulst-infiltrere monocytt som små SSC/FSC celler som uttrykker Ly6CHei og er negativt for MHCII. Etterpå kultur monocytter i vitro med 50 ng/mL GM-CSF hente DC.
2. isolering monocytt-avledet FM fra perifert blod
Merk: Siden eldre MoDCs er relativt sjeldne i musen blod, protokollen nedenfor refererer til deres avledning i vitro fra sorterte monocytter.
- Du kan øke nivåene av monocytter i blodet, bedøve mus med 4% isoflurane og injisere dem subcutaneously (SC) med 1 μg av GM-CSF i 50 μL PBS.
- Etter 1-2 h, ofre mus ved hjelp av CO2.
Forsiktig: Ikke ofre mus for cervical forvridning, da dette vil føre til indre blødninger. - Umiddelbart etter euthanization, spray musen med 70% etanol og fjerne huden som dekker hjertet med kirurgisk saks, under sterilt laminær strømning hette. Rengjør saksen med etanol og kuttet rett atrium av hjertet. Sakte, tømme hjertet gjennom høyre ventrikkel med 20 mM EDTA HBSS bruker 10-mL sprøyte og 25-G pinnen.
- Samle blod med sterile sprøyter fra pleural hulrom i et sterilt rør som inneholder heparan sulfate og EDTA. Fortsette å spyle hjertet til leveren og lungene blir rosa og hvit.
- Bruk blod på en tetthet gradert mediumand sentrifuge på 400 rcf ved romtemperatur i 15 min med lav brems.
Forsiktig: Bruk endotoxin-fri tetthet gradert medium (vanligvis mindre enn 0,12 EU per mL).- Samle mononukleære celler i en ny tube. Vask cellene ved å suspendere i 10 mL HBSS som inneholder 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 10 mM EDTA (isolasjon buffer) og deretter sentrifugering på 4 oC 400 rcf for 5-10 min å pellets cellene.
Advarsel: Bruk bare mediet som inneholder minst 1 g/L av glukose.
- Samle mononukleære celler i en ny tube. Vask cellene ved å suspendere i 10 mL HBSS som inneholder 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 10 mM EDTA (isolasjon buffer) og deretter sentrifugering på 4 oC 400 rcf for 5-10 min å pellets cellene.
- For CD11b positiv valg, å suspendere 1 x 108 celler i 1 mL isolasjon buffer og Inkuber dem i 15 min med 50 μL av CD11b-konjugerte magnetiske perler på 4 oC.
- Vask overflødig perler ved å legge 9 mL isolasjon bufferen og sentrifugering på 400 rcf for 5-10 minutter til 4 oC. leveringstanken supernatants og å suspendere cellene i 1 mL isolasjon buffer. Bruke cellene på en prewashed magnetisk kolonne i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fjern kolonnen fra magneten Pipetter 6 mL av isolasjon buffer på kolonnen og skylle ut magnetisk-merket cellene i et sterilt samling rør ved å skyve stempelet. Sentrifuge cellene på 400 rcf for 5-10 minutter til 4 oC. Wash kolonnen to ganger med 3 mL isolasjon buffer.
- Nytt suspendere cellene på 1 x 107 celler/100 μL isolasjon buffer og beis med følgende fluorophore-konjugerte Antistoffene: 0,1 μg CD115 og 0,25 μg MHCII 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 celler.
- Sortere cellene etter gating på små side scatter (SSC) og små fremover xy (FSC) celler.
Merk: Mus inflammatorisk monocytter er generelt definert som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHeiog patruljerer monocytter er definert som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5. I tilfeller der ingen skille mellom de to delsettene er nødvendig, totalt SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo celler kan sorteres. Både naive og svulst rentebærende mus inneholder ca 5-8 x 104 MoDC per 1 mL blod og opptil 4-5 x 105 MoDC følgende injeksjon av GM-CSF. Av dem, ca 70% er provoserende monocytter og 30% patruljerer monocytter. - Plate cellene i en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL i en komplett media med 20 ng/mL GM-CSF. Etter 1 dag overføre ikke-tilhenger og løst tilhenger cellene til en ny plate og kultur for ytterligere 4-5 dager.
Forsiktig: DC media bør ikke suppleres med pyruvate.
3. forberedelse av svulst-IgG immun komplekser
- Kultur kreftceller i 75 cm2 kultur kolbe til 70% samløpet i fullstendig DMEM medier.
- Legg 2 mL 0,25% trypsin/EDTA koble celler fra kultur kolbe og overvåke cellen morfologi under lys mikroskop å unngå over trypsinization.
- Legge til 8 mL fullstendig kultur medier (per 2 mL av trypsin) for å hemme trypsin fordøyelsen og sentrifuge ved 4 oC, 400 rcf for 5-10 min å pellets cellene.
Merk: Pass på å se kreftceller etter Mycoplasma bruker en kommersiell PCR kit. Test for tilstedeværelsen av Gram-negative bakterier og sopp endotoxins bruker Limulus Amebocyte Lysate . (LAL) analysen28). Serum må være filtrert gjennom 0.22 μM og testet for 9 Code of Federal Regulations virus. I tillegg teste kultur medier og serum ved å slippe 100-200 μL på LB agar eller buljong og kultur for 2 dager på 37 oC. - Vask celler igjen fra trypsin og serum ved å henge dem i 10 mL PBS og sentrifuge på 400 rcf for 5-10 min. leveringstanken nedbryting og gjenta vask 2 ganger.
- Ordne celler i 1,8% bufret paraformaldehyde i 10 min ved romtemperatur.
- Vask cellene ved å henge dem i 10 mL PBS og sentrifuger ved 4 oC 400 rcf i 5-10 min.
- Leveringstanken supernatants og gjenta vask to ganger.
Valgfritt: For svulst opptak analyser, celler kan merkes med rugende dem i 5 min på 37 oC i PBS som inneholder 1 μM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). CFSE er så slukket med komplett medier for 10 min i isen. Cellene bør vaskes grundig i PBS som inneholder 2% serum fjerne gjenværende fargestoff.
- Nytt suspendere celler i FACS buffer (PBS supplert med 2% FCS + 5 mM EDTA) og 0,5 μg/mL av anti-CD16/32 for å blokkere potensielle uspesifisert protein-protein interaksjoner. Platen i en U-form 96 brønner/plate i en konsentrasjon av 1 x 105 celler per 100 μL.
- Legge til ulike fortynninger av svulst-bindende antistoffer fra 5 μg - 5 ng/1 x 105 celler. Inkuber plate is i 15-20 min.
Merk: IgG antistoffer ble isolert fra serum naiv 20-24 uker gamle kvinnelige mus på protein A kolonner, som beskrevet24.
- Legge til ulike fortynninger av svulst-bindende antistoffer fra 5 μg - 5 ng/1 x 105 celler. Inkuber plate is i 15-20 min.
- Vask celler ved å legge 150 μL av PBS og sentrifugering platen ved 4 oC 400 rcf i 5-10 min.
- Kast i supernatants og gjenta vask to ganger. Nytt suspendere celler i 100 μL FACS bufferen som inneholder fluorophore-konjugerte sekundære antistoff. Inkuber plate is 20 min.
- Vask celler ved å legge til 200 μL FACS bufferen og sentrifugering platen på 400 rcf i 5-10 min. forkaste i supernatants og gjenta vask.
- Analysere svulst binding av flowcytometri og bestemme minimal konsentrasjonen må pels cellene.
Merk: Antistoffer som ikke øker bety fluorescens intensitet (MFI) av farget kreftceller av minst fivefold isotype kontroll bør ikke brukes i påfølgende funksjonelle analyser.
4. aktivering av MoDC med Tumor-IgG KI
- Jakke kreftceller med minimal IgG konsentrasjon, som beskrevet i avsnittene 3.1 gjennom 3.4.3
- En dag før aktivering MoDC med svulst IC, erstatte MoDC kultur medier, som inneholder GM-CSF. Gjør forsiktig Sug opp media og vask cellene gang med forvarmes fullstendig kultur medier.
Merk: Isolert modne svulst-assosiert MoDC bør bli kultivert for minst 2-3 h (eller selv overnatting) etter sortering i komplett media uten GM-CSF og aktivere dem med IC. - For svulst opptak analyser, legge til CFSE-merket svulsten IC MoDC i forholdet 1:5 (IC:MoDC) og ruge over natten for 12-16 h i 1 mL av komplett medier per 1 x 106 DC.
- For FACS analyser MoDC aktivisering eksperimenter, legge svulst IC på 1:1 (IC:MoDC) forhold og ruge over natten for 12-16 h.
Merk: Det anbefales å ta en positiv kontroll Vel, som MoDC er stimulert med 1 μg/mL av LPS eller andre TLR agonister. - Etter natten aktivisering, Sug opp supernatants og vask celler forsiktig tre ganger med isolasjon buffer, eller 10 mM EDTA HBSS.
- Hvis du vil koble DC fra platen, ruge celler for 2-3 min i 1 mL HBSS inneholder 10 mM EDTA, og koble celler av energisk pipettering.
- Sentrifuge cellene på 400 rcf og å suspendere 1 x 106 DC i 90 μL PBS med 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS buffer) og 0,5 μg av blokkering antistoffer. Ruge på isen i 5-10 min.
- Legg til 10 μL flekker antistoffer blanding til cellene og ruge på isen i 15 min.
- Legge til 2 mL FACS buffer celler og sentrifuger ved 4 oC 400 rcf i 5-10 min.
- En dag før aktivering MoDC med svulst IC, erstatte MoDC kultur medier, som inneholder GM-CSF. Gjør forsiktig Sug opp media og vask cellene gang med forvarmes fullstendig kultur medier.
- Nytt suspendere celler i 200 μL FACS buffer.
- Legge til 0,5 - 1 μg/mL av DAPI 1-2 min før prøvene, å utelukke døde celler fra analyser. Ikke over ruge DAPI, som MoDC vil ta det i 10-15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sammenlignet først kapasitet av antistoffer fra naive syngeneic og allogene mus til å binde til kreftceller. Dette ble B16F10 og LMP svulst cellelinjer løst i paraformaldehyde og vasket mye. B16F10 er melanom cellen linje, som ble opprinnelig isolert fra lunge metastaser i C57Bl/6 mus. LMP er en bukspyttkjertelen svulst celle som ble isolert fra KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + og Pdx-1-grobunn mus, og vokser jevnt i 129F1 mus. For å få IC, ble kreftceller inkubert etter 20 min på is med 2 μg av syngeneic eller allogene IgG per 1 x 105 kreftceller. IgG og IgM antistoffer ble isolert fra sirkulasjonen av naiv 20-24-uke-gamle mus på protein A, etterfulgt av størrelse-utestenging kromatografi som beskrevet24. Cellene ble deretter vasket og farget med PE-konjugerte rotte anti-musen IgG sekundære antistoff, og mener fluorescerende intensiteten var analysert i en flyt cytometer. Som vist i figur 1A, bundet IgG-antistoffer fra C57Bl/6 allogene mus langt mer effektivt enn antistoffer LMP tumor celler ex vivo fra 129S1 syngeneic mus. Tilsvarende var farging av fast B16F10 med 129S1 allogene IgG mer enn ti ganger høyere, forhold til farging med syngeneic IgG fra naive C57Bl/6 mus. Interessant, kunne mus bærer B16 svulster produsere antistoffer med lignende bindende kapasiteten av allogene mus, selv under svulst progresjon (figur 1B).
Vi søkte neste sammenligne IC svaret av MoDC fra blod og svulster som FM fra milt og BM. For å isolere svulst-assosiert MoDC, ble B16F10 svulster enzymatisk avstand for å få enkeltcelle suspensjoner. Immunceller ble beriket med CD45-magnetiske perler, og MoDC ble ytterligere sortert SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo av FACS (figur 2A). Det er bemerkelsesverdig at ulike svulsten DC kan ha forskjellige indikatorer som definerer dem. For å isolere MoDC fra blodet, sirkulerende monocytter beriket av CD11b-konjugerte magnetiske perler og videre sorteres som SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. Celler var så kultivert for en dag i GM-CSF, og ikke-tilhenger og løst tilhenger cellene ble overført til en ny plate og kultivert for ytterligere 4-5 dager å få MoDC (figur 2B). Som referansepunkt vi brukte BMDC, som "gold standard" DC for mange funksjonell analyser, i tillegg til splenic MoDC, som gjenspeiler et mer fysiologiske DC delsett. BMDC ble oppnådd ved å sortere BM pro-monocytter (CD11b+/Ly6CHei/CD115Hei/MHCIIneg), etterfulgt av deres dyrking i 7 dager med GM-CSF, som beskrevet24. Splenic MoDC ble isolert fra enkelt celle suspensjon ved mose milten gjennom en celle sil (pre-inkubering med collagenase er ikke nødvendig for splenic MoDC), etterfulgt av berikelse med CD11b-konjugerte magnetiske perler. Cellene ble deretter sortert som SSClo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIHei/CD11cHei og kultivert i 1 time i fullstendig RPMI på 37oC til gjenopprette opprinnelig aktivitet.
For å undersøke effekten av IgG KI MoDC aktivitet, ruges vi isolert DC delsettene natten med fast kreftceller eller fast kreftceller pre-belagt med allogene IgG. Aktivering av BMDC eller splenic DC med IC førte til økt CD86 og MHCII uttrykk, i motsetning til MoDC, eller svulst-assosiert MoDC (figur 3A). Muligheten til å opptak CFSE-farget svulst-avledet proteiner, med eller uten allogene IgG, ble også sammenlignet. Som observert av AC confocal mikroskopi, viste splenic DC overlegne evne til å internalisere svulst-avledet proteiner (figur 3B).
Til sammen tyder disse resultatene på at svulsten DC og MoDC reagere annerledes enn splenic DC og BMDC å aktivisering med alloIgG IC. Derfor vaksinasjon strategier som vil aktivere svulst DC ikke kan være basert utelukkende på aktivisering mønstre av BMDC.
Figur 1: allogene mus har naturlig forekommende svulst-bindende IgG-antistoffer i opplaget: A. mener fluorescens intensitet (MFI) av LMP kreftceller med IgG-antistoffer isolert fra syngeneic (129S1) og allogene (C57Bl/6) naiv mus blod. B. mener fluorescens intensitet (MFI) av B16F10 kreftceller inkubert med IgG-antistoffer isolert fra sirkulasjonen av syngeneic svulst rentebærende mus (C57Bl/6) eller allogene (129S1) naiv mus. Dette tallet er endret fra utvidet data 2A og 2B Carmi Y et al. Natur 521 7550:99-104, 201524.
Figur 2: sortering av musen MoDC fra blod og B16 svulster. A. isolering og sortering ordningen med MoDC kultivert fra musen monocytter. AC confocal mikroskopi DIC bilde av inflammatoriske og patruljering monocytter etter 4 dager i kultur (x400). B. isolering og sortering ordningen av svulst-assosiert MoDC fra B16 svulster. Representant AC confocal mikroskopi DIC bilde av MoDC isolert fra B16 tumorer etter overnatting kultur (x400). Dette tallet er endret fra supplerende figur 1 Carmi Y et al. JCI innsikt 1:18:e89020, 201625. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: MoDC fra milten og BM vise ulike mønstre av aktivisering enn svulst blod MoDC etter inkubasjon med IC. A. flyt cytometric analyse av MHCII og CD86 uttrykk av DC ruges natten med svulst-IgG IC. B. AC Confocal immunhistokjemi av svulst opptak (grønn) og MHCII uttrykk (rød) av DC ruges natten med IC-CFSE-merket svulst. Dette tallet har blitt endret fra tallene 3A og 3DCarmi Y et al. Akt og SHP-1 er DC-innebygde sjekkpunkter for svulst immunitet. JCI innsikt 1:18:e89020, 201625. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitt det store antallet DC kreves for vaccinating mus (ca 2-4 x 106 DC per ett museklikk), de fleste av vaksinasjon strategier i mus er basert på isolering av DC fra BM og milt etterfulgt av ex vivo aktivisering. Imidlertid forsøker å aktivere svulst DC i vivo, bruker de samme betingelsene for å aktivere milten og BM DC, har ofte vært mislykket produsere effektive immunitet. I to påfølgende publikasjoner, Carmi et al. har funnet at blod og tumor MoDC avvike betydelig fra milt og BM DC, gitt at de bære naturlig høye iboende nivåer av tyrosin fosfatase og krever grunning før aktivering med IC24,25. Videre gjenspeiler disse resultatene ytterligere stress behovet for å ta ekstra forholdsregler for å opprettholde fm i en aktiveringsstatus som bedre fysiologiske status. Derfor søker nåværende protokollen å gi en detaljert beskrivelse av isolasjon prosessen med MoDC fra svulster og sirkulasjon og markere trinnene som kan føre til deres tidlig aktivering.
Først, for å få tilstrekkelig antall fm fra blod og svulster, det er behov for et mye større antall mus sammenlignet med protokoller for å isolere BMDC. For å øke avkastningen av DC vi bruker 16-uke-gamle mus, som har større blod volum og generelle celle teller. Vi rutinemessig får 5-8 x 104 MoDC per 1 mL blod uten injeksjon av GM-CSF, og 4-5 x 105 MoDC følgende injeksjon. For svulst DC, vi får ca 6-8 x 104 MoDC fra en 100 mm3 svulst, men antallet kan variere mellom individuelle mus og mellom tumor modeller. Økende tumor størrelse resulterer i en lavere DC avkastning, som en 1000 mm3 svulst har bare ca 5000 DC. I stedet injisere vi mus med kreftceller på flere nettsteder (vanligvis 4-6), dermed få opptil 4 x 105 MoDC per musen.
Videre anbefaler vi at før deres eksperimentell bruk, antistoffer, linjer, rør og generell lab reagenser bør testes for endotoxins ved LAL analysen og plating media på AC bakteriell agar. Svulst cellelinjer er ofte infisert med Mycoplasma og bør derfor være testet av PCR før deres inkubasjon med fm. Bruk av råolje collagenase preparater, som typer 1 og 4, er en primær kilde til endotoxins på grunn av isolering av collagenases fra Clostridium histolyticum. Standard preparater av collagenase kan inneholde så mye som 10 EU/mg av endotoxins, som er omtrent 1-2 ng av endotoxin per mL fordøyelsen blanding. Jahr et al. har funnet at collagenase preparater som inneholder 2.7-6,7 ng/mL endotoxins vil indusere 1,415-3,967 ng/mL av IL-1β etter kultur med PBMC29. Faktisk fylling av DC gjøres rutinemessig med 1 ng av LPS per mL media, men som 100 picograms/mL er tilstrekkelig Prime dem30,31,32. En annen potensiell kilde til endotoxins er FBS, som kan inneholde 25 EU/mL eller flere av endotoxins, eller mindre enn 10 EU/mL. Antar at kulturen mediet inneholder 10% kan FBS, endotoxin belastningen nå 0,5 ng/mL, hvilke er nok Prime DC.
I tillegg bruke mange protokoller anti-CD16/32 antistoffer blokkere Fc reseptorer som et middel for å øke spesifisiteten av deres antistoff-panelet før sortering. Likevel fører cross-linking av FcγRIII (CD16) til fosforylering forhold/ZAP-70 og PLC-γ, utgivelsen av intracellulær Ca2 + 33og fosforylering av P38 og ERK1/2 i både menneskelige34 og mus monocytter35. I våre hender induserer tillegg av anti-CD16/32 MoDC kulturer konsekvent en sterk fosforylering av P38 og ERK1/2 kinaser i DC innen ett minutt eksponering. Vi derfor foreslår sterkt unngå bruk av anti-CD16/32 når isolere MoDC for i vitro funksjonelle analyser.
En annen vanlig protokoll bruker berikelse FM av CD11c magnetiske perler før deres sortering etter FACS. CD11c er en type jeg transmembrane glykoprotein som gjenkjenner en rekke ligander, inkludert fibrinogen, LP-plater, skriver jeg kollagen og deaktivert C3b delenhet. Dei Frari et al. har vist at ligation av CD11c med antistoffer induserer potent NFκB aktivisering og sekresjon av chemokines36. I vår erfaring indusere immobilisert anti-CD11c antistoffer celle aktivering og apoptose, mens bruk av sin løselig form i FACS sortering ikke induserer fosforylering enten P38 eller ERK1/2.
Samlet er denne protokollen designet for å oppnå isolering av MoDC aktiveringen så lite som mulig, slik at deres påfølgende aktivisering i vitro gjenspeiler vilkårene som kreves for deres aktivisering i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer de har noen interessekonflikt og at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
