Summary
Моноцитарных DC (MoDC) может смысле незначительных количествах опасности связанных молекул и поэтому легко загрунтовать. Мы предоставляем подробный протокол для изоляции MoDC от крови и опухоли и их активации с иммунных комплексов, подчеркнув основные меры предосторожности, которые следует рассмотреть, чтобы избежать их преждевременного активации.
Abstract
Дендритные клетки (DC) являются гетерогенной клеточных популяций, которые отличаются в их маркеров клеточной мембраны, модели миграции и распределения и их презентации антигена и возможностей активации Т-клеток. Поскольку большинство прививок экспериментальной опухоли моделей требуют миллионы DC, они широко изолированы от костного мозга и селезенки. Однако эти DC значительно отличаются от крови и опухоли DC в их ответах иммунных комплексов (ИК) и, предположительно, другие Syk сочетании Лектин рецепторов. Важно, учитывая чувствительность DC опасность связанных молекул, присутствие эндотоксинов или антител, которые crosslink активацию рецепторов в одном из изоляции шагов может привести к грунтовки DC и таким образом влияют на параметры, или по крайней мере Дозировка, необходимых для их активации. Таким образом здесь мы опишем подробный протокол для изоляции MoDC из крови и опухоли, избегая их преждевременной активации. Кроме того протокол предусматривает MoDC активации с опухолью IC и их последующего анализа.
Introduction
С момента их открытия дендритные клетки (DC) были в центре внимания обширных исследований из-за их уникальную способность наклонить Т клеточной дифференцировки1. За последние несколько десятилетий обширные исследования стремилась определить различные подмножества DC и их функции в ходе опухолевой прогрессии и иммунитет 2. РСУ состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые отличаются друг от друга в их распознавания рецепторов, распределение ткани, и далеко мигрирующих и антиген презентация возможностей3,4,5. По сравнению с другими DC подмножеств, моноцитарных DC (MoDC) являются гораздо более обильные в опухоли и могут быть легко получены из циркулирующих или опухоль проникновение моноцитов6,7. Таким образом многие клинические испытания, стремящихся воспользоваться их относительную распространенность основаны на in vivo и ex vivo манипуляции аутологичной MoDC для того, чтобы выявить Т-клеток иммунитета 8,9.
Аналогичным образом, DC-основе вакцинации экспериментальной опухоли моделей требует 2-3 последовательных инъекции, 5-7 дней врозь, 1-2 х 106 активированные DC пульсирующий с опухолевых антигенов. Таким образом, для достижения этого большое количество DC, большинство исследований мыши главным образом использовали MoDC культивировали из костного мозга (БМ) прекурсоров в ГМ-КСФ для 7-9 дней (Ил-4 не требуется в параметре мыши)10,11. Тем не менее учитывая что нокаут ГМ-КСФ у мышей в целом нормальное DC отсек 12,13и смешанным населением, полученные от этой культуры,14 физиологической значимости этих DC была поставлена под вопрос.
Кроме того DC может быть регулярно изолированы от клеток селезенки. Однако, DC составляют лишь около 0,3-0,8% всего селезенка клеток (в результате приблизительно 7 x 105 DC/селезенки) и эти клетки, только CD103+ DC и MoDC можно перенести обратно в лимфоидных органов. Поскольку MoDCs составляют примерно 10-15% населения15,селезеночной DC16, большинство протоколы изоляции дают примерно 1 х 105 MoDC в селезенке. Расширение MoDC может достигаться путем инъекций transfected клеток В16, которые выделяют ГМ-КСФ, что приводит к 100-кратного увеличения селезенки MoDC17. Однако, использование MoDC для разработки вакцин DC ограничен, поскольку эта процедура не может быть сделано в организме человека и полученные MoDC уже высоко активируются.
Помимо получения достаточного количества DC, еще один вызов для разработки эффективных DC вакцин против аутологичной раковых клеток предполагает отсутствие достаточных сигналы опасности в параметре опухоль полностью активировать DC. Индукции co-stimulatory сигналов обычно достигается путем активации распознавания рецепторов (ПРР), или тип c Лектин сигнальных путей18,19,20,21. Еще один подход для активации DC эксплуатирует их способности принимать антигены путем взаимодействия с поверхности Fcγ рецепторы (FcγR). Действительно, ряд важных рукописей показали, что инъекции MoDC от БМ прекурсоров, активированный с опухоль IgG IC может предотвратить рост опухоли в профилактической настройки и может привести к ликвидации установленных опухоли22,23 .
В двух последних документах Карми et al. обнаружил, что в отличие от BMDC и селезенке DC, MoDC из крови и опухоли не может реагировать IgG IC без дополнительных стимулов. Это было признано благодаря наличию внутриклеточного уровня тирозин фосфатаз, регулирующие FcγR сигнализации24,25. Определение критических контрольных точек в DC, эта работа представил важное понимание требований для успешной вакцинации на базе DC. Потребность в дополнительных стимулов для включения FcγR сигнализацию и предположительно сигнализации от других рецепторов Лектин, используя аналогичные фосфорилирование Каскад, таким образом подчеркивает необходимость избегать грунтование DC во время их изоляции.
Таким образом настоящий Протокол описывает изоляции MoDC от крови и опухоли, которые заметно отличаются от БМ и селезенке DC, и освещаются меры предосторожности стоит рассмотреть во время процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы ниже относятся к изоляции мыши MoDC, однако общие принципы могут применяться к другим DC подмножеств клеток, а также. 12 - 16-week-old мышей C57Bl/6j поддерживались в американской ассоциации по аккредитации лабораторных животных уход – аккредитованных животных фонда. Все протоколы были одобрены Стэнфордского университета и Тель-Авивского университета институциональных животное уход и использование Комитетом.
1. изоляция опухоли связанные моноцитарных DC
- В Ламинарный шкаф удаление опухоли с CO2 умерщвлены мышей и опухоли в среду RPMI без плода бычьим сывороточным (ФБС).
Примечание: Настоятельно рекомендуется для бритья мышей и распылить их с 70% этанол перед удалением опухоли, чтобы свести к минимуму потенциальных загрязнений из меха. Будьте уверены, что опухоль не превышает 25-40 мм2 , так как большие опухоли имеют меньше DC, которые клонат быть хрупким и склонной смерти клетки. Если необходимо большее количество DC, каждая мышь может быть введен с клетками опухоли на нескольких сайтах. - В стерильные ламинарных капюшоном Чоп опухоли с помощью ножниц хирургии на мелкие кусочки (приблизительно 1 x 1 мм2).
- Добавьте все опухоли фрагменты из одной мыши в 30 мл стерильного плоскодонные трубку с магнитными перемешать баров, который содержит 5 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV и 0,01 мг/мл DNase I.
Предупреждение: Миелоидные клетки вырабатывают энергию через гликозилирования, даже при устойчивом состоянии. Таким образом только использование средств массовой информации, который содержит глюкозы (например HBSS, RPMI и DMEM), как глюкоза голода как мало, как 10-15 мин приведет к гибели клеток и апоптоз в течение 24 ч. использование только низкий эндотоксина коллагеназы IV, как коллагеназы производится грамположительных бактерии (Clostridium histolyticum).
- Добавьте все опухоли фрагменты из одной мыши в 30 мл стерильного плоскодонные трубку с магнитными перемешать баров, который содержит 5 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV и 0,01 мг/мл DNase I.
- Размешайте в около 200-400 об/мин в инкубаторе 37 oC магнитной мешалкой для 20-30 мин.
- Добавьте 5 мл полной СМИ и вновь приостановить энергично.
- Фильтр клетки через стрейнер ячейки 70 мкм. Центрифуга на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
Предупреждение: Не пытайтесь изолировать клетки, непосредственно после ферментативного пищеварения, как некоторые опухоли некротические и содержат относительно большое количество мусора клеток или внеклеточного матрикса. Примените клетки на 15% плотность градиента среднего для получения только ячейки. - Приостановите 9 мл с 1 мл раствора 10 x PBS Отрегулируйте осмотического давления и получить 100% Percoll раствор градиента плотности среды. Mix 1,5 мл плотность градиента среднего складе решение с 8,5 мл HBSS и энергично смешать его с клеток опухоли производные Пелле. Аккуратно слоя 2 мл DMEM верхней 15% плотность градиента среднего и центрифуги на 400 РПРС для 20 мин при комнатной температуре. Выбросите supernatants, как клетки будет форма гранул в нижней части трубки.
- Вымойте гранулированных клетки дважды путем повторного приостановления их в 10 мл HBSS, содержащий 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 10 мм ЭДТА (изоляция буфера) и центрифуги на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин Пелле клетки.
- Подсчитать ячейки на Горяева, используя Трипановый синий под микроскопом света.
- Буфера и инкубировать их в 4 oC с 30 мкл CD11b вновь приостановить 1 x 108 клеток в 1 мл изоляции и+ конъюгированных магнитные шарики за 15 мин.
Предостережение: Избегайте использования конъюгированных CD11c бусы, как это будет активировать DC и вызывать гибель клеток. Не пытаться блокировать FcγRII и FcγRIII с антителами anti-CD16/32. Блокирование антитела перевязать FcγR и вызывают сильное фосфорилирование киназы карты и премьер DC.- Удалите избыток свободных бусы, добавив 9 мл буфера изоляции и центрифуги клеток на 400 РРС для 5-10 мин на 4oC.
- Аспирационная супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл изоляции буфера. Примените клетки на prewashed магнитные столбца. Промойте колонку дважды с 3 мл буфера изоляции.
- Удалите столбец из магнита. Пипетка 6 мл буфера изоляции на столбец и промыть магнитно меченых клетки в стерильных коллекции трубку, нажимая на поршень. Центрифуга клетки на 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC.
- Вновь приостановить клетки на 100 мкл на 1 x 10-7 клеток и пятна с следующие Флюорофор конъюгированных антител: построчная оплата отрицательные (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI и Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
- Сортировать клетки стробирования небольшие клетки, с помощью стороны точечной (SSC) и вперед точечной (FSC) и культуры полного среднего, дополнена 5 нг/мл ГМ-КСФ. Инкубировать клетки на 1 час в 3 7 oC для того, чтобы позволить макрофаги присоединиться пластину. Затем перенесите слабо и non сторонник клетки к новой культуры блюдо.
Примечание: Мышь MoDC определяются как CD11b+/CD11c+/MHCIIПривет/Ly6CЛо/int 7,,2627. Выражение Ly6C может резко меняться между моделями опухоли, а в некоторых моделях (например LMP) MoDCs полностью отсутствует выражение Ly6C. В целом, одна 100 мм3 B16F10 опухоли обычно содержит 5 х 104 DC, что приводит к примерно 4-5 х 106 клеток всего. Эти клетки 10-15% являются иммунные клетки и 8-10%-MoDC. Увеличение числа DC может достигаться путем инъекций мышей с опухоли на нескольких сайтах. Сортировка лишь небольшие клетки SSC/FCS, как другие миелоидных клеток можно выразить маркеры, такие как CD11c и Ly6C.
Дополнительно: Сортировать Моноцит проникновения опухоли как небольшие клетки SSC/FSC, которые выражают Ly6CПривет и негативными для MHCII. Потом культура моноцитов в пробирке с 50 нг/мл ГМ-КСФ для получения постоянного тока.
2. изоляции моноцитарных DC из периферической крови
Примечание: Поскольку пожилые MoDCs относительно редки в крови мыши, протокол ниже относится к их вывода в пробирке из отсортированных моноцитов.
- Для повышения уровня моноцитов в крови, анестезировать мышей с 4% изофлюрановая и вставляют их подкожно (с.к.) с 1 мкг GM-CSF в 50 мкл PBS.
- После 1-2 ч Пожертвуйте мышей с использованием CO2.
Предупреждение: Не пожертвовать мышей шейки матки дислокации, как это вызовет внутреннее кровотечение. - Сразу же после euthanization спрей мышь с 70% этанола и снять кожу, которая покрывает сердца, используя Ножницы хирургические, под капотом стерильных ламинарного потока. Очистить ножницы с этанолом и вырезать правого предсердия сердца. Медленно очистите сердца через правый желудочек с ЭДТА HBSS с помощью 10-мл шприц и игла 25-G-20 мм.
- Сбор крови с стерильный шприц из плевральной полости в стерильную пробирку, содержащих сульфат heparan и ЭДТА. Продолжить для сброса сердце до печени и легких стать розовый или белый.
- Применить крови на центрифугу градиента средне плотность на 400 РПРС при комнатной температуре 15 мин с низкой тормозом.
Предупреждение: Использование бесплатно эндотоксина плотность градиента среднего (обычно менее 0,12 ЕС / мл).- Соберите мононуклеарных клеток в новой трубки. Вымойте клетки путем повторного приостановления в 10 мл HBSS, содержащий 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и ЭДТА 10 мм (изоляция буфера) и затем центрифугирования в 4 oC 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
Внимание: Используйте только средства массовой информации, который содержит по крайней мере 1 г/Л глюкозы.
- Соберите мононуклеарных клеток в новой трубки. Вымойте клетки путем повторного приостановления в 10 мл HBSS, содержащий 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и ЭДТА 10 мм (изоляция буфера) и затем центрифугирования в 4 oC 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
- Для CD11b позитивного выбора, вновь приостановить 1 x 108 клеток в 1 мл изоляции буфера и Инкубируйте 15 мин с 50 мкл конъюгированных CD11b магнитные бусы на 4 oC.
- Вымойте избыток бусы путем добавления 9 мл буфера изоляции и центрифугирование в 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC. аспирата supernatants и вновь приостановить клеток в 1 мл изоляции буфера. Примените клетки на prewashed магнитные столбца согласно инструкциям производителя.
- Удалите столбец из магнита, Пипетка 6 мл буфера изоляции на столбец и промыть магнитно меченых клетки в стерильных коллекции трубку, нажимая на поршень. Центрифуга клетки на 400 РРС для 5-10 мин на 4 oC. мыть столбце дважды с 3 мл буфера изоляции.
- Вновь приостановить клеток в 1 x 107 клеток/100 мкл буфера изоляции и пятно с следующие Флюорофор конъюгированных антител: 0.1 мкг CD115, 0,25 мкг MHCII и 0,1 мкг Ly-6 C/1 x 106 клеток.
- Сортировать клетки стробирования на малых стороны точечной (SSC) и малых вперед точечной (FSC) клетки.
Примечание: Воспалительные моноциты мыши обычно определяются как CD115+/MHCIIЛо/neg/Ly6CПривети патрулирование моноциты определяются как CD115+/MHCIIЛо/neg/Ly6Cneg 4,5. В тех случаях, когда требуется никакого разделения между двумя подмножествами, всего SSCЛо/FCSЛо/CD115+/MHCIIЛо клетки могут быть отсортированы. Наивно и опухоли подшипник мышей содержат приблизительно 5-8 х 104 MoDC на 1 мл крови и до 4-5 x 105 MoDC следующие впрыска GM-CSF. Из них около 70% являются воспалительные моноцитов и 30% патрулирование моноцитов. - Пластина клетки в концентрации 1 х 106 клеток/мл в полной СМИ, дополнены 20 нг/мл ГМ-КСФ. После 1 дня передачи non сторонник и слабо адэрентных клеток к новой пластины и культуре еще 4-5 дней.
Предупреждение: DC СМИ не должны дополняться с пируваткиназой.
3. Подготовка опухоли IgG иммунных комплексов
- Культуры опухолевых клеток в колбе культуры2 75 см до 70% слияния в полной DMEM СМИ.
- Добавьте 2 мл 0,25% трипсина/ЭДТА для отсоединения клетки от культуры колбу и монитор морфологии клеток под микроскопом света, чтобы избежать чрезмерной trypsinization.
- Добавьте 8 мл полного культуры средств массовой информации (на 2 мл трипсин) тормозят Пищеварение трипсина и центрифуги на 4 oC, 400 РРС для 5-10 мин до Пелле клетки.
Примечание: Не забудьте проверить опухолевых клеток на микоплазмы с использованием коммерческих комплект ПЦР. Тест на наличие грамотрицательных бактерий и грибковых эндотоксинов, используя Limulus амебоцит Lysate (Лал) пробирного28). Сыворотке должен быть фильтруется через 0,22 мкм и проверены на вирусы 9 Кодекса федеральных правил. Кроме того проверьте культуры средств массовой информации и сыворотки, сбрасывая 100-200 мкл на LB агар или бульон и культуры для 2 дней на 37 oC. - Вымыть клетки снова от трипсина и сыворотке крови остается путем повторного приостановления их в 10 мл PBS и центрифуги на 400 РПРС для 5-10 мин аспирата супернатант и повторите мытье 2 раза.
- Исправьте клетки в 1,8% буферизуются параформальдегида 10 мин при комнатной температуре.
- Вымойте клетки путем повторного приостановления их в 10 мл PBS и центрифуги на 4 oC 400 РПРС для 5-10 мин.
- Аспирационная supernatants и повторить мыть еще два раза.
Необязательно: Для поглощения анализов опухоль, клетки могут быть помечены по инкубации их за 5 мин на 37 oC на PBS, содержащие 1 мкм Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE). CFSE затем обслуживается с полным СМИ за 10 мин во льду. Клетки должны быть вымыты широко в PBS, содержащий 2% сыворотки для удаления остатков краски.
- Вновь приостановите ячейки в буфер СУИМ (PBS дополнены с FCS 2% + 5 мм ЭДТА) и 0,5 мкг/мл анти CD16/32 для того, чтобы заблокировать потенциальные неспецифической белок белковых взаимодействий. Плита в форме U 96 скважин/пластины в концентрации 1 х 105 клеток 100 мкл.
- Добавление различных разведениях опухоли связывания антител, начиная от 5 мкг - 5 нг/1 х 105 клеток. Инкубируйте пластину на льду для 15-20 мин.
Примечание: IgG антитела были изолированы от сыворотки наивно 20-24 недель самок мышей на белок А столбцы, как описано24.
- Добавление различных разведениях опухоли связывания антител, начиная от 5 мкг - 5 нг/1 х 105 клеток. Инкубируйте пластину на льду для 15-20 мин.
- Вымойте клетки путем добавления 150 мкл PBS и центрифугирование пластину на 4 oC 400 РРС для 5-10 мин.
- Отменить supernatants и повторите мыть дважды. Вновь приостановите клетки в 100 мкл СУИМ буфер, содержащий вторичное антитело проспряганное Флюорофор. Инкубируйте пластины на льду за 20 мин.
- Вымыть клетки путем добавления 200 мкл буфера СУИМ и центрифугирование пластину на 400 РРС для 5-10 мин отбросить supernatants и повторить мыть.
- Анализировать опухоли привязки проточной цитометрии и определить минимальную концентрацию, необходимые для покрытия клетки.
Примечание: Антитела, которые не увеличивают среднее флуоресценции интенсивности (MFI) окрашенных опухолевых клеток, по крайней мере пять раз изотипа контроль над не должен использоваться в последующих функциональных анализов.
4. Активация MoDC с опухоль IgG IC
- Слой опухолевых клеток с минимальной концентрации IgG, как описано в разделах 3.1 через 3.4.3
- Один день перед активацией MoDC опухоли IC, замените MoDC культуры средств массовой информации, который содержит ГМ-КСФ. Чтобы сделать это, мягко аспирационная СМИ и вымыть клетки один раз с подогретым полный культуры средств массовой информации.
Примечание: Изолированные Зрелые связанный тумором MoDC следует культивировали для по крайней мере 2-3 ч (или даже на ночь) после сортировки в полной СМИ без ГМ-КСФ и перед их активацией с IC. - Для анализа поглощение опухоли добавить CFSE-меченых опухоли IC MoDC в соотношении 1:5 (IC:MoDC) и инкубировать на ночь для 12-16 h в 1 мл полной СМИ за 1 x 10-6 DC.
- Для анализа СУИМ MoDC активации экспериментов добавить опухоли IC в соотношении 1:1 (IC:MoDC) и инкубировать на ночь для 12-16 ч.
Примечание: Настоятельно рекомендуется включить позитивный элемент, в котором MoDC стимулируются с ПЛАСТИНОК или другими агонистами TLR 1 мкг/мл. - После ночи активации, аспирационная supernatants и вымыть клетки мягко три раза с изоляции буфер, или 10 мм ЭДТА HBSS.
- Чтобы отсоединить DC от плиты, инкубации клеток для 2-3 мин в 1 мл HBSS, содержащие 10 мм ЭДТА и отсоединить клетки путем энергичных закупорить.
- Центрифуга клетки на 400 РПРС и вновь приостановить 1 х 106 DC в 90 мкл PBS, дополненная 2% FCS, 5 мм ЭДТА (FACS буфера) и 0,5 мкг блокирующих антител. Инкубируйте на льду для 5-10 мин.
- Добавить 10 мкл окрашивания смесь антитела к клеткам и инкубировать на льду за 15 мин.
- Добавьте 2 мл СУИМ буфера в клетки и центрифуги на 4 oC 400 РПРС для 5-10 мин.
- Один день перед активацией MoDC опухоли IC, замените MoDC культуры средств массовой информации, который содержит ГМ-КСФ. Чтобы сделать это, мягко аспирационная СМИ и вымыть клетки один раз с подогретым полный культуры средств массовой информации.
- Вновь приостановите клетки в 200 мкл буфера СУИМ.
- Добавить 0,5 - 1 мкг/мл DAPI 1-2 мин перед запуском образцов, чтобы исключить мертвые клетки из анализа. Не чрезмерно инкубировать DAPI, как MoDC будет принимать его в течение 10-15 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первоначально мы сравнили антител от наивного сингенных и аллогенной мышей способность связывать опухолевых клеток. С этой целью B16F10 и LMP линии клетки опухоли фиксировали в параформальдегида и тщательно промывают. B16F10 — линия клеток меланомы, который был первоначально изолирован от метастаз в легких у мышей C57Bl/6. LMP является опухоль поджелудочной железы клетки, был изолирован от KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + и Pdx-1-Cre мышей и неуклонно растет в 129F1 мышей. Чтобы получить IC, опухолевые клетки инкубировали за 20 минут на льду с 2 мкг сингенных или аллогенной IgG за 1 х 105 опухолевых клеток. IgG и IgM антитела были изолированы от обращения наивно 20-24-week-old мышей на белок, а затем размер-гель-проникающей хроматографии как описано24. Клетки были затем промывают и витражи с PE-конъюгированных крыса анти мыши IgG вторичного антитела, и средней интенсивности флуоресценции был проанализирован в проточный цитометр. Как указано на рисунке 1A, антитела IgG от аллогенной мышей C57Bl/6 связаны LMP опухолевых клеток ex vivo гораздо более эффективно, чем антитела от 129S1 сингенных мышей. Аналогичным образом окрашивание фиксированной B16F10 с 129S1 аллогенной IgG был более чем в десять раз выше, по сравнению с окрашивание с сингенной IgG от наивного мышей C57Bl/6. Интересно, что принимая опухоли В16 мышей не производить антитела с аналогичными связывающая способность, аллогенной мышей, даже во время прогрессии опухоли (рис. 1B).
Далее мы стремились сравнить IC ответ MoDC от крови и опухоли, DC от хандры и БМ. Чтобы изолировать связанный тумором MoDC, B16F10 опухоли были ферментативно отделить для получения одного клеточных суспензий. Иммунные клетки обогатились, используя CD45-магнитные бусы, и MoDC были далее сортируются как SSCЛо/FSCЛо/CD11c+/MHCII+/Ly6CЛо , СУИМ (рис. 2A). Стоит отметить, что различные опухоли DC могут иметь различные маркеры, которые определяют их. Чтобы изолировать MoDC из крови, циркулирующих моноцитов были обогащенный конъюгированных CD11b магнитные бусы и далее сортируются как SSCЛо/FSCЛо/ CD115+/MHCIIneg Лоу. Клетки были затем культивировали на 1 день в ГМ-КСФ, и non сторонник и слабо адэрентных клеток были переданы в новую плиту и культивировали в течение еще 4-5 дней для получения MoDC (рис. 2B). Как точки отсчета, что мы использовали BMDC, выступающей в качестве «золотой стандарт» DC для многих функциональных анализов, а также селезеночной MoDC, которые отражают более физиологических подмножество DC. BMDC были получены путем сортировки BM pro моноцитов (CD11b+/Ly6CПривет/CD115Привет/MHCIIОТР), а затем их культивирования в течение 7 дней с GM-CSF, как описано24. Селезеночной MoDC были изолированы от одноклеточного подвеска, полученные путем затирания через стрейнер клеток селезенки (предварительной инкубации с коллагеназы не требуется для селезеночной MoDC), следуют обогащения с конъюгированных CD11b магнитные бусы. Клетки были затем сортируются как SSCЛо/B220отрицательная/NKp46neg/CD3отрицательная/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIПривет/CD11cПривет и культивировали на 1 час в полной RPMI на 37oC до Восстановление исходных условий деятельности.
Чтобы исследовать эффект IgG IC на MoDC активность, мы инкубировали изолированные DC подмножеств на ночь с фиксированной опухолевых клеток или с фиксированной опухолевых клеток, предварительно покрытых аллогенной IgG. Активация BMDC или селезеночной DC с IC привели к увеличению CD86 и MHCII выражение, в отличие от MoDC, или связанный тумором MoDC (рис. 3A). Способность поглощения CFSE-витражи опухоли производных белков, с или без аллогенной IgG, также сравнение. Как отмечали, конфокальная микроскопия, селезеночной DC показал высокая способность усваивать белки опухоли производные (рис. 3B).
Взятые вместе, эти результаты показывают, что опухоль DC и MoDC реагируют по-разному чем селезеночной DC и BMDC для активации с alloIgG-IC. Таким образом стратегии вакцинации, хотите, чтобы активировать опухоли, которую DC не может основываться исключительно на активации модели BMDC.
Рисунок 1: аллогенной мышей имеют-естественные антитела IgG опухоли привязки в их обращении: А. означают интенсивности флуоресценции (MFI) LMP опухолевых клеток окрашенных с IgG антитела, изолированные от крови сингенных (129S1) и аллогенной наивно мышей (C57Bl/6). B. означают интенсивности флуоресценции (МФО) B16F10 опухолевых клеток, инкубировали с IgG антитела, изолированных от распространения сингенных опухоли подшипник мышей (C57Bl/6), или наивно мышей аллогенной (129S1). Эта цифра была изменена от расширенных данных 2A и 2B Карми Y и др. Природа 521 7550:99-104, к 2015 году24.
Рисунок 2: Сортировка схема мыши MoDC из крови и опухоли В16. А. изоляция и сортировки схема MoDC культивировали от мыши моноцитов. Конфокальная микроскопия DIC изображение воспалительных и патрулированию моноцитов после 4 дней в культуре (x400). B. изоляции и сортировки схема связанный тумором MoDC от опухоли В16. Представитель конфокальная микроскопия DIC образ MoDC, изолированных от опухоли В16 после ночи культуры (x400). Эта цифра была изменена от дополнительного рисунок 1 Карми Y et al. JCI понимание 1:18:e89020, 201625. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: MoDC от хандры и BM отображать различные модели активации чем опухоли и крови MoDC после инкубации с IC. A. анализ потока гранулярных выражения MHCII и CD86, DC инкубированы всю ночь с опухоль IgG IC. B. конфокальный иммуногистохимия опухоли поглощения (зеленый) и MHCII выражение (красный), DC инкубированы всю ночь с IC помечены CFSE опухоли. Эта цифра была изменена от цифры 3A и 3DCarmi Y и др. Akt SHP-1 и DC-внутренние контрольно-пропускные пункты для опухоли иммунитета. МПМ понимание 1:18:e89020, 201625. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Учитывая большое количество DC, необходимых для вакцинации мышей (около 2-4 x 106 DC за одну мышь), большая часть стратегии в мышах основаны на изоляции DC от БМ и селезенки, следуют их активации ex vivo вакцинации. Однако попытки активировать опухоли DC в естественных условиях, используя одинаковые условия для активации селезенки и BM DC, часто, не увенчались успехом в производстве эффективных иммунитет. В двух последующих изданиях Харми и др. нашли, что крови и опухоли MoDC значительно отличаются от хандры и BM DC, учитывая, что они несут естественно высокие внутренние уровни тирозин фосфатазы и требуют грунтовки до активации с IC24,25. Кроме того эти результаты далее подчеркивают необходимость принимать дополнительные меры предосторожности для поддержания постоянного тока в состояние активации, которая лучше отражает их физиологического статуса. Таким образом настоящий Протокол стремится предоставить подробное описание процесса изоляции MoDC от опухоли и циркуляции и выделить шаги, которые могут привести к их преждевременной активации.
Во-первых чтобы получить достаточное количество DC от крови и опухоли, существует необходимость значительно большее количество мышей, по сравнению с протоколов для изоляции BMDC. Увеличить выход DC мы используем 16-week-old мышей, которые имеют больший объем крови и общее количество клеток. Мы регулярно получаем 5-8 х 104 MoDC на 1 мл крови без инъекций и ГМ-КСФ, 4-5 x 105 MoDC следующие инъекции. Для опухоли DC, мы получим примерно 6-8 х 104 MoDC от 100 мм3 опухоли, хотя число может варьироваться между отдельными мышей и опухоли модели. Повышение результатов размер опухоли к снижению урожайности DC, как опухоль3 1000 мм будет иметь лишь около 5000 DC. Вместо этого мы вводим мышей с опухолевых клеток на нескольких сайтах (обычно 4-6), тем самым получение до 4 x 105 MoDC на мышь.
Кроме того мы рекомендуем, что до их экспериментального использования, антитела, клеточных линий, трубы и общие лабораторные реагенты должны быть проверены для эндотоксинов Лал пробирного и покрытие СМИ на бактериальных агар переменного тока. Линии клетки опухоли часто заражены микоплазмы и поэтому должен быть проверен ПЦР до их инкубации с DC. Использование нефти коллагеназы препараты, такие как типы 1 и 4, является основным источником эндотоксинов вследствие изоляции коллагеназы из Clostridium histolyticum. Стандартные препараты коллагеназы может содержать как ЕС/10мг эндотоксинов, что составляет около 1-2 нг эндотоксина мл смеси пищеварения. Jahr и др. обнаружили, что препараты коллагеназы, содержащие 2.7-6,7 нг/мл эндотоксинов побудит 1,415-3,967 нг/мл ИЛ 1β после культуры с КСДОР29. Действительно, грунтование DC обычно делается с 1 нг ПЛАСТИНОК за мл средства массовой информации, но как 100 пикограмм/мл достаточно для премьер их30,,3132. Еще одним потенциальным источником эндотоксинов-FBS, который может содержать 25 ЕС/мл или более эндотоксинов, или менее чем 10 ЕС/мл. Предполагая, что средства массовой информации культуры содержит 10% FBS, эндотоксин нагрузки может достигать 0,5 нг/мл, который достаточными для премьер DC.
Кроме того многие протоколы используют антитела анти CD16/32 блокировать рецепторы Fc как средства повышения специфичности их антитела группы до сортировки. Тем не менее cross-linking FcγRIII (CD16) приводит к фосфорилирование Syk/зап-70 и PLC-γ, освобождение внутриклеточных Ca2 + 33, а фосфорилирование P38 и ERK1/2 в оба человека34 и мыши моноцитов35. В наших руках добавлением анти CD16/32 MoDC культур последовательно вызывает сильное фосфорилирование P38 и ERK1/2 киназы в DC в течение одной минуты воздействия. Поэтому, настоятельно рекомендуется избегать использования анти CD16/32 когда изоляция MoDC для в vitro функциональных анализов.
Другой распространенный протокол использует обогащение постоянного тока CD11c магнитные шарики до их сортировка по СУИМ. CD11c — это тип я трансмембранный гликопротеин, который признает целый ряд лигандов, включая фибриноген, LPS, тип I, коллаген и инактивированных C3b субъединицы. Реццонико et al. показали что лигирование CD11c с антителами индуцирует секрецию chemokines36и мощным NFκB активации. По нашему опыту иммобилизованных анти CD11c антитела вызывают активации клеток и апоптоз, в то время как использование их растворимой формы в СУИМ сортировки не вызывает фосфорилирование P38 или ERK1/2.
В целом этот протокол предназначен для достижения изоляции MoDC с как мало активации как можно, таким образом, чтобы их последующей активации в пробирке отражает условия, необходимые для их активации в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов и что они не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Нет
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
