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Immunology and Infection

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

このプロトコルは、大型動物の同定と家畜、野生動物、アプローチをサンプリングからリンパ節の切除の手順を含むリンパ節組織のトランスクリプトームのプロファイルの RNA の隔離のための手順の概要を提供します回収後保存と RNA 解析の処理のため、複数の動物と考慮事項プラス代表の結果に一貫性を提供します。

Abstract

大動物 (家畜と野生動物の両方)ブルセラウシ結核菌サルモネラ菌大腸菌を含む、人獣共通感染病原体の重要な貯水池として、機序の解明に便利です/または自然宿主の細菌の広がり。宿主の免疫応答におけるリンパ節のキー機能により、リンパ節組織は感染の過程で細胞における遺伝子発現の変化を評価するために下流のトランスクリプトーム解析のための RNA の潜在的なソースとして機能します。本稿ではリンパ節のコレクション、組織サンプリング、および下流の RNA、家畜処理モデルとしてウシ (Bos のトーラス) を用いた (バイソン バイソンのバイソンから提供されるその他の例のプロセスの概要).プロトコルには体内場所、識別、および複数の主要サイトからリンパ節の除去に関する情報が含まれます。また、生検の方法論が表示によりサンプリングの一貫性を保つのため、複数の動物の間でされます。RNA シーケンスと RT-PCR のような下流の手法に適した RNA の生成を含む、サンプル保存に関するいくつかの考慮事項を説明します。大動物マウス時間コース研究に固有の長時間の遅延によりバイソンおよび牛リンパ節組織からの代表的な結果を表示してのレビューのコンテキストでこの組織型の劣化の経過を記述するには他の組織の RNA の分解の前の方法論的仕事。全体的に、このプロトコルは両方獣医研究者の大きな動物試料のトランスクリプトーム プロジェクトを開始し、分子生物学者組織サンプリング体内及び体外処理テクニックを学習に興味があるに役に立つでしょう。

Introduction

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リンパ節のトランスクリプトームの RNA シーケンス解析は、様々 な病原体に動物の免疫応答を特徴付けるため機会を提供します。この方法は、マウスで広く利用されている、しながら解析最近大きい哺乳類1,2に拡大しています。ワクチンや遺伝的感受性の研究での使用、医薬品開発、人間の研究のモデル系としてもターゲットの同定だけでなく、感染する宿主反応を特徴付ける家畜・大型動物リンパ節を使用できます。人獣共通感染症。たとえば、ブルセラ症 (人畜共通細菌性疾患、影響 50万の人々 世界中毎年)、場合にもかかわらず大幅コスト、羊の研究の増加やヤギ、ヒトへの感染とワクチンに関連します。動物実験よりも開発。マウス感染モデル要約細網内皮のシステム感染がないの特徴的な臨床症状3.

実験動物学と比較して大規模な動物実験、必ずしも収穫組織のプロセスは、安楽死と保全の課題と潜在的な組織のコレクションとの間の遅延が長くなります高品質の RNA。そのまま RNA は生物学的に関連するトランスクリプトーム データの生成に不可欠です。組織サンプルからの高品質の RNA の生成は特に大きな動物病原体研究の重要で実施封じ込め設備。このような研究は施設を承認、高度訓練を受けた技術者を必要とするだけでなく、また、これは、作業に応じて、数百数千ドルの数十から範囲することができます重要な金融費用を運ぶように本質的により困難です。この種の研究は、分野横断的なコラボレーションと、完了すると、その複雑さに追加するための横断的知識もあります。したがって、トレーニングの開発とサンプル収集・保存のための合理化されたシステムへの付着大きなメリットをもたらします組織の下流の分子研究のため感染している動物から。

大きなリンパ節のコレクションは、マウスのリンパ節のようなサンプリングと比較して組織コレクションの追加課題を提示します。サンプルの切除のための準備は、関連する内部構造を含むリンパ節の解剖学の基本的な理解を必要とします。リンパ節の構造は、満ちているリンパ洞に囲まれたリンパ性小葉で構成されます。これらの構造は、堅い、繊維状のカプセルに含まれています。4リンパ性小葉は、「基本的な解剖学的および機能的な単位リンパ節」包、皮質深部ユニットと髄コードと副鼻腔4 (図 1 a) で構成されます。B および T リンパ球は、それぞれ卵胞と皮質深部の単位に家します。これらの構造は、3 D 足場を提供し、リンパ球と抗原抗原提示細胞の相互作用を容易にします。

肉眼的に, 卵胞と皮質深部単位上識別できること切断面と高密度細網の網目を含む副鼻腔はより繊細な細網網目から成るし、ライターが表示よりも暗く見えます (図 1 b)。慣例では、病理学者は浅野 (包), (皮質深部単位) 皮質髄質 (髄コードや副鼻腔) とリンパ節の領域を参照してください。すべての 3 つの地域の適切な検査はルーチン検査、病理組織学的リンパ節5指針の実践として最高と判断がされています。一貫性、サイズ、および 1 つの動物の中でも、リンパ節の色でかなり変動があることに注意してください。動物の年齢、サイズが小さくなり、若い動物のものより硬くなり、通常構造の結合組織と正常リンパ球の減少の増加のための6,7がちで、リンパ節。

Figure 1
図 1.リンパ節の解剖学。(A) この漫画のイメージは、キー構造を描いたリンパ節の構造を示します。(B) この画像は、断面カット牛リンパ節を示しています。関連する構造/レイヤーは肉眼に目に見えるが強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

実験的質問によって収集および分析のための興味の別のリンパ節になります。末梢のリンパ節は、皮下の組織に深くあります。牛は臨床的および実験的練習でよく使用されます周辺機器または表在性のリンパ節、耳下腺、顎下腺、咽頭、prescapular、prefemoral (precrural) と浅鼠径 (女性、男性の陰嚢に supramammary) (図 2)。テーブル 1、キーの表在リンパ節のプロパティ牛のシステム8に示すとおりです。以下、牛の伝染性の細菌性疾患のいくつかの潜在的なリンパ節のコレクションの計画が、調査の出発点として掲載されています。

ブルセラ abortus/ブルセラ melitensis:の標準 necropsies-感染牛およびB. melitensis-国立動物病センターで感染した山羊 supramammary、prescapular、耳下腺リンパ節組織を回復、研磨細菌の列挙とホスト RNA 発現プロファイリングのための RNA の準備のための両方。実験感染牛9.でこれらのリンパ節のそれぞれでを定期的にリカバリできます。B. melitensisでこれらのリンパ節の種類ごとの細菌の存在を検出できる-私たちの研究 (Boggiatto、未発表) から RNA ベースの方法を使用して、少なくとも 9 ヶ月後感染までヤギを感染しています。サルモネラsp: prescapular、subiliac (prefemoral)、腸間膜リンパ節は、プロファイリングのサルモネラの有病率1011,12の家畜の死骸の中に有用されていると、トランスクリプトーム研究の潜在的な利益のでしょう。エシェリヒア属大腸菌 o157: h7: (中間の小腸と遠位側小腸場所) で腸間膜のリンパ節が細菌感染牛 (ただし感染の成牛ではなく)13の時折回復のサイトをすることができます。レプトスピラ症 (レプトスピラ sp.): 乳腺14リンパ節で細菌の慢性持続性が観察されています。ウシ結核菌: 細菌は牛、子牛15縦隔や気管気管支リンパ節から回復した後実験感染をされています。さらに、リンパ節の RNA はウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス2のように大きな動物宿主反応を調べるため利用されています。図 2は、牛の体のこれらの主要なリンパ節のサブセットの場所を示しています。

Figure 2
図 2:漫画で描いた内の選択したリンパ節の場所オオツノウシ. リンパ節の番号が付きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

本稿および関連のビデオ、大型動物感染症のトランスクリプトーム研究に関与する分子生物学者のために有益であること、RNA 研究の大きな動物リンパ節の隔離のためのプロトコルを提案する.まず、我々 はリンパ節の例として牛、バイソンの組織からのサンプリングを使用して分離のプロシージャの概要を示します。ビデオに表示されるのこのデモでは、ペアになって、RNA の隔離のための再現可能な組織採取のワークフローです。次に、我々 は安全性、一貫性、および RNA の品質重視で、感染したリンパ節の処理のための重要な考慮事項をについて説明します。

酸性フェノール グアニジン イソチオ シアン酸性試薬による組織からの RNA の準備は、元 Chomczynski とサッキ16,17の存在下でのシリカ系スピン列浄化法に基づいてください。カオトロ Vogelstein、ガレスピーの18の原作に基づきます。トランスクリプトミクスの代替方式と保存牛リンパ節からのリカバリーの可能性も検討します。最後に、私たちは安楽死とバイソンから回復された RNA プロファイルのサンプリング時間の増加の影響を描いた代表的な実験を含む大規模な動物の魚で RNA の品質の時間変数の影響を探索し、牛のリンパ節。この記事は分子生物トランスクリプトーム研究を開始また、獣医学の研究にだけ役に立つでしょう。

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Protocol

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ここに描かれた動物の剖検手順 Ames、アイオワ国立動物病センターで承認された IACUC プロトコルの下で覆われています。動物のケアや福祉の承認されたガイドラインに従ってすべての実験を行った。

1. 事前に計画死体解剖前に

  1. 、死体解剖前に剖検スイートへの輸送、以下の資料を準備します。
    1. 1.5 または 2 mL の遠心管に満ちて 〜 ラックまたは輸送コンテナー内の RNA 保存液 1.0 mL。組織のボリュームに保存液量の比率の製造元のガイドラインに従ってください。
    2. 使い捨てメスときれいで、オートクレーブ鉗子: 1 つは皮膚とリンパ節 (動物あたりのリンパ ノードごとに 1 つ) を収集するための別のセットを解剖するため設定皮膚やリンパ節環境植物のクロス汚染を防ぐ組織。
    3. 使用されるメスおよび生検ツールとまな板のシャープス コンテナーまたはリンパ節郭清で使用する使い捨てトレー 3 mm ツール生検、剖検ナイフをパンチします。
    4. 含む PPE システムの適切な BSL レベルでの作業に必要な保護具を使用します。
    5. オートクレーブ再利用可能な金属のツール設定用品/ドライ商品を使って死体解剖前に金属の鍋で、鉗子などを含みます。

2. 身分証明書と牛、バイソンのリンパ節のサンプリング

Figure 3
図 3.牛の頭と首のリンパ節です。(A) この漫画のイメージを示しています選択したリンパ節オオツノウシの頭頸部の。(B) この画像は、(右) 断面の断面 (左) と比較すると耳下腺の唾液腺の耳下腺リンパ節を示します。2 つの組織の種類のテクスチャの違いに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. Prescapular リンパ節牛、バイソンの分離
    1. ローカル IACUC プロトコルに基づく動物 (牛や実験に応じて、あらゆる年齢層のバイソン) を安楽死させます。ハートビートの欠如や呼吸の欠如、角膜反射の不在を含む制度の IACUC プロトコルで説明されている方法で死を確認します。剖検床に動物を移動します。
      注: 大型の動物の実験室の練習で使用される人道的な安楽死の様々 な方法があります。ただし、ペントバルビ タール ナトリウム、フェニトイン ナトリウム溶液の静脈内投与が一般的に承認し、フォームを活用です。動物の安楽死の AVMA のガイドラインを参照してください。19
      注意: パンク防止コンテナー、および再利用可能な金属製のナイフや鉗子の除染にシャープの安全な処分のためのガイドラインを含む、ホスト機関で剖検のためのすべての関連するバイオ プロトコルに従います。このプロトコルは、使い捨てメスの使用から鋭利物廃棄物を生成します。ブーツ、つなぎ服、手袋、眼の保護など制度のガイドラインに従い、保護具を着用します。
    2. 動物の組織で作業する 3 参加者を識別します。
      注: ここでは、切開 1 がする大規模担当区分目的動物組織の解剖 2 は別の動物のセクションからリンパ節を回復、凝固切開装置 3 は、各リンパ節からのセクションを分離する別のテーブルで動作して防腐剤の溶液でチューブにそれらを転送します。
    3. 横の臥床に動物を配置することによって開始します。
    4. (手根骨); 膝のレベルに戻って前肢を動かすことによって肩を拡張します。この運動は肩を戻すとリンパ節の容易に触診できます。リンパ節「しこり」の存在を感じる。
      注: 病気の条件の中にリンパ節腫脹があります現在、リンパ節の同定が容易になっているが、このプロセスも一貫性、組成、およびリンパ節のアーキテクチャに影響を与えることができます。
    5. 見つかったら、まだ拡張肩と肩の輪郭に沿って皮膚切開をするのにメスや剖検ナイフを使用します。
      注: は、リンパ節の位置による触診をされている場合でも、切開のサイズを制限しません。大きな切開は深部組織に簡単にアクセスを提供し、切開、リンパ節の切除を容易に。
    6. ピンセットのペアを使用して、肩のポイントを明らかにし、首の筋肉の皮膚を撤回します。
      注: prescapular のリンパ節は皮下脂肪、特に overconditioned 動物に多い。
    7. もう一度、リンパ節 (図 3 a) の位置を触診します。
      注意: 皮下脂肪とは違ってリンパ節は触診する際にその図形が格納されます。さらに、薄い線維性被膜に囲まれていると、リンパ節が、周囲の組織と連続していません。
    8. Prescapular リンパ節が見つかったら、慎重にメスや鉗子を使用して、皮下脂肪を解剖し、リンパ節を分離します。
      1. リンパ節や脂肪組織を区別する図 1 bで示されている、薄い線維性被膜の有無を見てください。リンパ節が、周囲の組織と連続していません。
    9. リンパ節をさらに区分のため組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。
      注: バイソンでこれらのリンパ節の外観は似ています。関連するビデオは、アメリカバイソンの右の肩の解剖と prescapular リンパ節の外観を示しています。
  2. 牛、バイソンの耳下腺リンパ節の単離
    1. 剖検階横の臥床に動物を配置することによって開始します。顎の関節 (顎関節) を探します。
      1. これは見つけるが難しい場合、顎をゆっくりと移動し、で下顎骨は頭蓋骨; アタッチ位置を決定します。これは顎関節です。
    2. 皮膚の切開をするメスや剖検のナイフを使用して、慎重に。関節の背側切開を開始し、腹/垂直方向に下顎の輪郭に沿ってそれを拡張します。
    3. 皮下組織を明らかにする皮膚を切り裂きます。耳下腺唾液腺が表示されます最初に、その大きさ、葉状の表面外観と赤い着色のため。
    4. Move を使用鉗子、メス、耳下腺唾液腺脇にちょうど頭蓋と唾液腺 (図 3 a) の内側に座っている耳下腺リンパ節を見つけます。さらに処理前にテクスチャの耳下腺リンパ節組織を調べます。
      注: (耳下腺・顎下腺) 顔のリンパ節は、リンパ節の分離を混同することができます唾液腺に関連付けられます。リンパ節と比較して唾液腺は、はるかに大きいと葉状の表面外観を持っています。また、切断面に唾液腺は本質的に同種し、リンパ節 (図 3 b) の古典的な皮質・髄質アーキテクチャ パターンを示さない。
    5. メスを持つ腺を切除します。さらに断面の組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。
  3. 雌牛、バイソンの supramammary リンパ節の単離
    1. 横の臥床に動物を配置します。
    2. 鼠径部を公開し、乳房に後ろ足を昇格させます。
      注: 健康、非泌乳動物でこれらのリンパ節の触診できない場合があります。泌乳動物でこれらのリンパ節は乳房の底辺の尾側の国境で明白なかもしれません。
    3. メスを使って切開を行いますだけ背 supramammary 腺を公開する、上の脚に沿って実行している、乳房に。
    4. 皮下組織を解剖し、皮下脂肪の薄い層に埋め込まれた supramammary リンパ節を見つけます。視覚的に区別されない場合、は、皮下脂肪内でしっかりした構造の存在を露出した組織を触診します。
    5. 脂肪からリンパ節を解剖鉗子やメスを使用して、慎重に。さらに断面の組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。

3. 断面・ リンパ節の

  1. Dissector メイン剖検スペースに隣接する解剖テーブルで 3 に解剖 2 から分離されたリンパ節を渡します。各リンパ節をまな板の新鮮なセクションに配置します。連続で複数のリンパ節の受信を容易にするために、リンパ節のセクションでまな板済みラベルします。感染性サンプル、使い捨てのトレーを使用します。
  2. リンパ節のセクションを削除する鉗子と使い捨てメスまたは剖検のナイフを使用する。鋭いナイフを使用して、リンパ節を開く矢状切口を作る。
  3. 感染している動物から標本を中心に、リンパ節の内部を確認、非対称性を探して、病変、色の違い等、観察を記録します。
  4. (オプション 1)小さな切片
    1. 使い捨てメスを使用して、厚さ 5 ミリメートル未満のものは、きれいな鉗子で RNA 保全ソリューションを管に各部分を転送する各リンパ節の部分を切除します。
  5. (オプション 2)リンパ節の生検または区分の方法論
    注: 生検や断面の方法論は、異なるノードおよび動物間で並列節のセクションに適用すると一括 RNA 解析のサンプル組織の整合性を提供します。
    1. ウェッジ切断法
      1. リンパ節のプロファイル全体のセルをキャプチャする矢状断面を調査して、外側のカプセルにセンターからのリンパ節から扇形を切除します。ノード 2 cm 幅 (標準サイズ;テーブル 1を参照)、くさびの外側の弧の長さ 4 mm センター カット、厚さ 5 mm の湿重量 ~ 100 mg。
      2. メスを使用すると、細かく、5 mm と約 50-100 mg の各ウェットティッシュ重量でより厚くウェッジをカットします。
        注: 一貫性を保つのため、RNA の関心のリンパ節から代表的な RNA プロファイルを提供するためにプールの 1 つのバッチまたは個別のチューブで続いて単一のリンパ節からすべてのくさびの部分を処理します。
      3. RNA の保存液、組織のボリュームと比較して、少なくとも 10 巻を含む管に鉗子で組織の部分を配置します。
    2. パンチ生検法
      1. 目標ノードから特定の包など、特定のセクションを収集することだ場合は、パンチ生検のツールを選択します。コレクションに必要なサンプルのサイズと一貫性のあるツールを選択します。パンチ生検ツールは、直径 8 mm に 1 からのサイズの範囲で利用できます。
      2. 視覚的にリンパ節のサンプルに興味の領域を探します。
      3. パンチ生検ツールを使用して、関心の押すとコアを作成する組織化ツール セクションを切除します。RNA 保存液の少なくとも 10 ボリュームを含む管に鉗子で組織の一部を転送します。場合は 5 mm より厚く、さらに組織をより小さな部分に分割する鉗子やメスを使用します。
  6. 一度サンプルを保存液に移管されている (e.g。、RNALater)、室温で研究室に戻ってそれらを輸送。
  7. 組織浸透を可能に 4 ° C は一晩でサンプルを格納します。
  8. 次の日、余分な RNA 防腐剤溶液を捨て、-80 ° C で組織サンプルを格納サンプルを凍結する前にできるだけ多くの防腐剤を削除します。効率的の RNA 防腐剤ソリューション除去 P1000 および/または P200 ピペット チップを使用します。
    注意: は、安全データ シートに指定されている防腐剤の溶液の化学的および環境危険だけでなく、利用されている病原体の感染のプロパティに基づいて、デカントし保存液を適切に破棄します。
    注: ここに示すガイドラインは、材料の表に記載されている RNA 保存液の提供されます。代替保存ソリューションを使用している場合は、製造元のガイドラインを参照してください。

4. RNA リンパ節から処理

注意: は、白衣、手袋、および処理手順の適切な眼の保護を着用します。

注: ここで使用されるフェノール ベースの試薬、材料表の説明 (とプロトコルは、製造元のガイドラインに基づいて)20。代替フェノール ベースの試薬の使用を購入した特定の製品の製造元の推奨事項に基づく手続きの変更が生じます。

  1. 前因数均質化チューブ (1.5 mL/チューブ)、冷蔵 (4 ° C) フェノール系試薬、サンプルにアクセスする前に、ピペットを使用してください。
    注意: フェノールは毒性、腐食性、および保健上の危険です。クロロホルムは有毒であり、健康を害するです。化学の発煙のフード、処理手順 4.1 4.9 と化学物質との接触を防ぐために手袋を着用します。アメリカ合衆国では、クロロホルムは有害廃棄物;ローカルおよび制度のガイドラインに従って有害廃棄物を含む管の処分します。プロセス対応する BSL 2、BSL-3、または BSL 4 ガイドラインの下で病原体に感染した動物から採取。
  2. サンプルは、きれいな鉗子でマイクロ遠心チューブ用から緩めることができる、一度すぐにフェノール系試薬を含む均質化管に保存された組織の約 50-100 mg を転送します。
    1. フェノール系試薬を添加する前に解凍を制限します。複数のサンプル処理のため冷凍庫から削除されるとドライアイスのストレージを使用します。
  3. しっかりとチューブのキャップ、ホモジナイザー、上に配置し、フェノール系試薬のロータ ・ ステータ組織ホモジナイザーを用いたサンプルをホモジナイズしてください。室温で処理を完了します。完了すると、確認してください正常にホモジナイズ時; ように曇った出現のため組織は、曇った懸濁液中に分散する必要があります。
    注: 2 分 RNA 抽出設定を使用 (、ホモジナイザーの事前に設定 RNA_02_1 設定表の資料に記載されている; 凍結組織用に設計された)。このプロトコルで指定されたロータ ・ ステータ (材料の表を参照)、大きい歯および繊維状物質を含む種類の組織の範囲の均質化に適応。(新鮮な) ではなく凍結のために特別に設計された RNA_02_01 設定です組織。リンパ節は線維性結合組織のコンポーネントを持って、同様に最適化されたロータ ・ ステータ ホモジナイザーは効果的な分離を達成するためにお勧めします。国立研究所の環境健康科学21均質化の推奨事項の詳細についてを参照してください。
    1. 均質化した組織の大きな塊が残っている場合は、均質化の手順を繰り返します。RNA を効率的に回復するために組織する必要がありますよく分離されます。
    2. 線維性リンパ節部分事前均質化管への転送前にいくつかのより小さな部分にリンパ節部分をチョップするのに鉗子、はさみを使用します。導入に記載されているより古い動物からリンパ節組織より線維性かもしれません。
      メモ: ホストと病原体 RNA の二重解析が必要な場合 (ビーズの均質化) などの追加治療がグラム陽性の病原体の組織に存在している場合は特に細菌の RNA の回復に必要なあります。
  4. すぐにチューブから均質化のサンプルを削除し、P1000 マイクロ ピペットで遠心管 (サイズ 2.0 mL) の RNase フリーにそれを転送します。
  5. 任意のサンプルの残骸を削除する 4 ° C、12,000 × g で 5 分間のサンプルを遠心します。P1000 マイクロ ピペット チップを使用して、新鮮な遠心管、ペレットを残して上清を転送します。
  6. 室温で 5 分間上清を孵化させなさい。2 つの 1.5 遠心チューブ間の各サンプルを分割します。
  7. クロロホルム (すなわち、0.3 mL 1.5 mL サンプル); フェノール ベースの試薬の 1 mL あたりの 0.2 mL を追加します。手でフェーズをミックスはない渦のサンプルに 1-2 分間、それを反転します。それを常温で 2 分間インキュベートします。
  8. 4 ° C で 12,000 × g で 15 分間遠心します。
  9. 中間期または赤いフェノール クロロホルム層を中断させることがなく、上層を形成するマイクロ ピペット チップ (P1000 または P200) と上、水性相を慎重に取り外します。新しい微量遠心チューブに転送します。
  10. 100% エタノールの等量を混ぜてください。徹底的に 4-5 回チューブを反転でそれをミックスします。チューブの曇りしばしば現れます。
  11. マイクロ ピペット チップでさらに浄化し、RNA、次の製造元の手順22を溶出のシリカ系商業スピン列に液体を転送します。生成された RNA 溶出 〜 50 mg を水の RNase フリーの 50-100 μ l に組織。
    注: フェノール ベースの試薬抽出 qRT PCR および RNA シーケンス アプリケーションで RNA の下流用、有機相中の DNA を削除しますと DNase の RNA のサンプルの追加治療はお勧め。
  12. 因数溶離された RNA、凍結融解のメインの RNA サンプルを減らすため、数量と品質評価用チューブを分離します。チューブを-80 ° C、ストレージに転送します。
  13. BSL 3 封じ込めのレベルで特に人獣共通の病原体に感染した動物から派生したリンパ節のサンプルの場合低いバイオ セーフティ レベル封じ込めエリアにサンプルを移動する場合に病原体の有無を調べるのため結果 RNA サンプルを検証します。品質分析、RT-PCR および RNA シーケンス ライブラリの準備。
    注: それは現地の規制を考慮する重要なと [エージェントと仕事のため CDC (疾病管理・予防センター) 不活化ガイドラインの場合研究者のローカル サイトですべて不活化の手順を検証する必要があります。
    1. 1/10thボリューム ステップ 4.12 から各溶出の RNA サンプルの (すなわち、総 RNA の 50 μ l から 5 μ l) を削除します。生殖不能の技術を使用して、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに細菌の増殖液 100 μ l のサンプルをミックスします。滅菌プラスチック スプレッダーを使用して RNA スープ混合物を寒天プレートの表面に 。
      注: は、動物が挑戦した病原体の成長と一貫性のあるスープの種類および寒天培地プレートを選択します。
    2. 挑戦された動物と病原体の成長に特定の条件下で寒天を孵化させなさい。BSL 3 封じ込めからサンプルを削除する前に復元された細菌の有無を確認します。
      注: 生じる溶離された RNA 定量化と整合性のテスト後は RNA シーケンスと RT-PCR 解析を含む下流のアプリケーションに適しています。
  14. RNA の回復および純度分光光度計を使用して評価します。RNA の品質を評価するには、分析用分光光度計に溶出の RNA のサンプルの 1-2 μ l をロードします。紫外線 (UV) 領域で、試料のスペクトルを記録します。
    1. UV スペクトルから記録 A260/A280比率、A260/A230比とサンプルの A260値 (A 吸光度を =)。
    2. 40 μ G/ml の濃度で単一座礁させた RNA は 260 で 1.0 の吸光度を nm、A260 x 40 精製サンプルを乗じて RNA 濃度 (μ g/mL) を計算します。
  15. RNA の整合性の評価の迅速な方法としてさらに分析から、劣化したサンプルを除外するミックス 2 μ l 各 RNA サンプルの 1.5 x formamide ロード染料 [純水 95% ホルムアミド、0.025% (w/v) ブロモフェノール ブルー、0.025% (w/v) キシレンシアノール、5 mM EDTA (pH の 4 μ l で8.0)、0.025% (w/v) SDS] 1.5 ml 容マイクロ チューブ23,24
  16. 1 分 70 ° C でチューブを熱し、1 分間氷にチューブを転送します。
  17. 1 で準備 1% の agarose のゲルにサンプルを読み込む x TBE (RNA のネイティブ agarose ゲル電気泳動法の完全な説明、リオ、アレス jr.、グリーンウェー、ニルセンを参照してください)24。標準的なゲル電気泳動法によって、試料を分離し、28 s、18 s リボソーム RNA のバンドの存在を確認します。
  18. 代表結果やミューラー修[例えばバイオアナライザーと凛 (RNA 整合性番号) 分析] RNA の整合性定量定量分析方法でゲルの電気泳動フォローら。 25とシュレーダー、A.26

5 ホルマリン固定から代替抽出法 (FFPE) パラフィン包埋組織

注: FFPE 組織保全は最も堅牢な核酸保存法を表さないが以下に示すプロトコルは他の保存の組織が利用できない場合、いくつかの転写の変化を研究する方法をすることができます。

  1. ティッシュの保存のためホルマリン試薬を準備するには、プラスチックの容器にホルマリンを調剤します。組織は、それぞれ比 20:1 ホルマリン: 組織容積/重量、ホルマリン漬けになった必要があります。
    注意: ホルマリンは知られている人間の発癌物質、ない急性毒性が (通常を通じて吸入ガス) 慢性露出は重要な保健上の危険を表すことができます。適切な換気と PPE (すなわち、最初の暴露後 15 分以内に変更する、ニトリル手袋の使用) は、健康上のリスクを最小限に抑える必要があります。OSHA ホルムアルデヒド標準を参照してください (29 CFR 1910.1048) 曝露モニタリングとリスク評価の詳細について。
    注: あまりホルマリンを使用して防腐剤に浸漬するとき完全に保存され、組織の能力に影響を与えることができます。
  2. 興味の組織の分離後、厚さ 5 mm より小さい組織を慎重に切り落とします。
    1. ホルマリン、飛散を最小限に抑えるためにトリミングされた組織を水没鉗子を使用して、慎重に。
      注: の組織は、完全な固定のためにホルマリンに完全に水没する必要があります。組織のすべての面がホルマリンで完全に覆われていることが重要です。
  3. 組織は、ホルマリンで水没している、少なくとも 24 時間室温で発生する組織固定用を許可します。
    注: ホルマリンはすべて表面27,28から 1 時間あたり 1 mm の割合でゆっくりと、組織浸透します。したがって、組織切片の厚さ 5 mm の結果よりも小さいの維持全体組織の急速な固定。
  4. 固定後パラフィン包埋用の適切な試薬に組織を転送します。
    注: たとえば、本稿で検討組織は、埋め込み前に 70% エタノールに移されました。
  5. 組織をパラフィンに埋め込みます。29
  6. 厚さ (使用 10-20 μ m の miRNA が抽出する必要な場合) の 10-80 μ m の組織のセクション29
  7. メスや鉗子を使用して、各サンプルを処理し、滅菌、ヌクレアーゼ フリーおよび microfuge の管に配置から 40 mg の組織部分を削除します。
  8. Deparaffinization と核酸回復 FFPE 組織サンプルの保存サンプルから RNA を抽出するために設計、市販キットを利用します。
    注:テーブルの資料で参照されているキットを利用してキシレンとエタノール洗浄パラフィン、プロテアーゼ処理ステップ、および RNA を浄化するためにガラス繊維フィルターを削除します。

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Representative Results

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(プロトコルの手順 1-4) この記事で紹介した注意事項の使用は、下流におけるホスト遺伝子発現研究に適している大規模な動物サンプルからの RNA の回復に役立ちます。下流用 RNA の品質は、複数の標準的な措置によって評価されます。吸光光度法、A260/A280の比率は、蛋白質の汚染の測定を提供し、A260/A230比は、フェノールなどの化学汚染物質を検出する純度評価の別の手段を提供します。それぞれのケースの比率で 〜 高品質 RNA の証拠であり、低下の比率は、汚染の証拠 2.0。重要なは、これらの比率は質的評価される RNA の劣化に関する情報は提供されません (4.15 4.17 のステップ) と定量的 (ステップで 4.18、RNA を介して整合性番号または鈴スコアなど)。

リンパ節組織切片から回復した RNA の期待される品質レベルは、平均で、ウシ白血球細胞サンプルから RNA よりも低くことが重要です。牛組織および培養細胞からの RNA 抽出の包括的なシリーズで Fleige と Pfaffl30を見つける平均凛 (RNA の整合性の数字、バイオアナライザー上で測定される) は異なる空腸と胃組織の 5 < と > 9 白い血の間細胞、黄体、リンパ節鈴得点 6.9 の平均で途中で落下します。一般に、固体組織が結合組織の高濃度の 6-8、およびその組織に至る鈴スコアを生成 Fleige と Pfaffl30注は高い平均劣化を展示します。リンパ節の結合組織の密度に加えて、この組織型の RNases の本質的なレベルは、凛の RNA を一貫して回復できないスコア > リンパ節から 9 の責任かもしれません。

ただし、ここで紹介する方法を用いたバイソン supramammary リンパ節から回復した rna バイオアナライザー プロファイルの例は図 4 a8.6 (主にそのまま適当なのりんスコアを RNA の回復を示すに表示します。基本的にすべて下流のアプリケーション)。このプロシージャで生成された RNA は RNA の配列で使用するためのライブラリを正常に生成する使用されていますこのプロトコルは、バイソンと鈴値 > 8 (と多くの場合 > 9) 牛のリンパ節から RNA サンプルの正規の分離できます。8 抽出した RNA サンプルのサンプル セット、260 nm/280 nm で吸光度の平均比率は 2.1、260 nm/230 nm だった 2.1, 低蛋白質の汚染およびフェノールのような化学物質と低汚染性をそれぞれ示します。それぞれの抽出から平均核酸回収されたあたり 97 ± 10 μ 〜 100 mg 及び収量の ~ 1 μ g リンパ節組織の RNA/mg。

Figure 4
図 4.抽出の方法論からの RNA の品質を描いた代表的な品質のトレース。(A) 本稿で示す手順を使用してバイソン リンパ ノードから生成された高品質 RNA のこのパネル総 RNA のショー トレース。(B) このパネルは、非常に劣化した RNA を描いたテーブル 4から選択したウシの FFPE サンプルのトレースを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

挑戦のために関連付けられている野生動物種からのサンプリングの場合、特に大型の死体から組織の急速な隔離、安楽死と RNA 保全組織部分の配置間の遅延時間の影響ソリューションは、分析で潜在的な心配です。特に、リンパ節組織、文献の安定性について RNA の情報は限定されます。したがって、組織の採取の受け入れ可能なパラメーターについての情報を提供するために、バイソン リンパ節後安楽死における RNA の安定性は特徴付けられました。

この実験の時間 0 は動物が死んで角膜反射の不在とハートビートの不足によって発音された時間として考慮されました。次の死体と剖検の最初の輸送 〜 最初のリンパ節のサンプルを取得する前に 15 分が経過していた (15-20 分は標準フィールド動物の回復のための我々 の観察に; 時間のコースは、場所によって異なります).Supramammary リンパ節が同定され、組織の小さなセクションを除去し、室温で維持されます。セクションは、その後約 15 分間隔で撮影され、防腐剤; の RNA に転送時間コースの途中でリンパ節の 2 番目のサンプルが (図 5 a; クローズド サークル、図 5) シリーズ 4 の時間ポイントの 2 番目のセットのための動物から取得されます。RNA は、上記で説明した方法を使用してリンパ節部分から並列で抽出しました。この 1 h 実験では、リンパ節の RNA が時間コース (図 5 b5 C) 末鈴スコアのわずかな減少だけで、時間のコースの間での整合性の大半を保持することを明らかにします。同様に、牛の prescapular と耳下腺リンパ節からの RNA 保持の整合性上鈴スコアで測定される 〜 1 時間コース事後 (図 5; 動物表 2の情報を提供)。さらに、RNA は、細胞培養媒体か室温でまたは動物の死骸の保持時間をシミュレートするために 37 ° C での全体のセクションを保持している死の後 8 時間を収集された supramammary リンパ節セクションから抽出されました。リボソーム RNA は、8 h (図 5) 時間保持後も観測をだった。

Figure 5
図 5.時間コース後死を介して収集されたバイソン リンパ節のサンプルの RNA の品質。(A) このパネルは 1 h 時間コース手順の実験概要を示しています。(B C)これらのパネルは、アメリカのバイソンから分離された supramammary リンパ節から 1 時間経過で撮影したサンプルの RNA の品質の検討を示します。RNA サンプル ホルムアミドに変性および 1% の非変化のゲルの分離を反映するゲル。パネル (C) は、各サンプルの鈴スコアの変化を示しています。示されるように、牛の prescapular と耳下腺リンパ節追加実験データがオーバーレイされます。(D) このパネルでは、培養細胞の培養基で 37 ° C (2 車線)、いずれかの室温 (1 車線) で 8 h 後に処理 supramammary リンパ節サンプルの RNA のゲルの例をパネル (B) で使用されるゲルのとおり示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

これらの代表的な所見は、他組織の種類とソースの RNA の安定性の結果と一致しています。表 3は、前の保存の時間のコース上の RNA の安定性を検討した論文のサンプルの結果の概要を提供します。メモりんスコアや rRNA から唯一の傾向が観察 (総 RNA) をゲルがテーブルに含まれているいくつかの論文を提供しますが mRNA 整合性の追加分析など 5'の比率の決定することによって選択した Rna の 3' セグメント(例えば、Fajardy)31します。 ただし、それが示すように、たとえば、胎盤組織の31の間死とサンプルの保存時間が長くなる可能性がある RNA 発現プロファイルの変更を覚えてすることが重要です。安定した成績と比較して、不安定な Rna が枯渇することができます。したがって、動物が剖検のため利用可能に最も生物学的に有効な RNA プロファイルを達成するために任意の遅延を減らすために組織の回復のための急速な合理化されたワークフローを活用することが重要です。それはそのままのリボソーム RNA の存在がトランスクリプトームのプロファイルの変更の不在を示していると仮定する間違いであります。まだ、代表の結果が示唆された大きな動物をサンプリングするため、高い処理回必要でもそれリンパ節のサンプルからの遺伝子発現解析に適している RNA を準備することが可能。

また、解凍後の時間変数の影響を調べた。この時間の間に RNA が組織内に存在の核酸からの低下に影響を受けやすいです。4.1 の手順で解凍後常温保持時間 0 または 64 分にこのプロトコルを使用して処理されます RNA サンプルの品質は、凛のスコアで測定しました。この実験は、それは (図 6 a) 複数のサンプルの処理の堅牢な作り、プロトコルは雪解け時にかなり敏感を示しています。

Figure 6
図 6。RNA の品質パラメーターの追加分析。(A) このパネル (0 分) を解凍後すぐにまたは処理する前に室温で 64 分間保持した後に精製した rna RNA の品質の結果を示しています。バーは、平均 ± 標準偏差は、各条件のティッシュ 3枚を表しています。プロトコルで説明されているよう、すべての組織が融解、前に RNA 防腐剤溶液で格納されていました。(B) このパネルは、結合組織の大規模なセクションを含む不十分な均質化リンパ節部分からサンプルのバイオアナライザー トレースを示しています。5 s の範囲でピークと比較すると 28 秒と 18 歳ピークの小さいサイズは、明らかです。これも発生する可能性が、RNA の劣化による 5 s と 18 歳ピークとの比較的平坦な基線はまた貧しい抽出の示唆に富むアヴラハム、r.を参照してください。48詳細について。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

リンパ節からの RNA の隔離する比較のポイントとして牛から FFPE 腸間膜リンパ節の部分からの試用リカバリーを行った。前述したように、サンプルを埋め込み、その後 4 カ月間室温でパラフィンで貯蔵にパラフィンの前にホルマリンで 1 週間修正しました。5 10 μ m のセクションに組織された断面を有する、約 62 ng/μ L の RNA サンプル (± 14 ng/μ L) あたり FFPE 抽出のプロシージャを使用すると、回復されました。260 nm/280 nm の吸光度比は平均 1.9、A260/A230比率が好ましくない (表 4) 蛋白質の汚染の低レベルの製品を示します。これらのサンプルで非常にあった凛スコアが観察されることに注意してください低 (< 2)、RNA 製品 (テーブル 4; の劣化を示す図 4 b) スリニヴァサンの記述と一致。45。 qPCR、RNA、またはより具体的に cDNA (< 200 bp) の通常小さいセクションを利用した試金が増幅されます。したがって、小型製品の増幅がまだ発生する劣化したサンプルから、qPCR 分析を実行できます。たとえば、(RPS9) リボソームタンパク質 S9 のセグメントを増幅することが可能だった qPCR によるこれらの FFPE 回収試料からの転写。CTの値は、サンプルを一貫されたし、19.2 ± 1.8 の平均します。しかし FFPE 準備のサンプルを利用する場合より大きい製品が必ずしも存在しないすべてのサンプルの均一速度で劣化が発生するいないと存在している制限に注意してください。したがって、この材料は注意事項、研究に使用できますが、RNA シーケンスのような下流のアプリケーションの重要な制限があります。

リンパ節の種類 場所 長さ ノードによって排水地域
Prescapular 肩関節をちょうど内側皮下脂肪および筋層の下に埋め込まれています。 1-10 cm 1.5-2 cm 首の皮膚肩;皮膚、筋肉と (参考文献 8) 胸部上下肢の関節
Prefemoral (また precrural と呼ばれる) ちょうど背と抑圧、膝蓋骨上約 12-15 cm の内側 8-10 cm 2.5 cm 骨盤下肢、腹部、胸部 (文献 8) の尾の部分の皮膚
咽後 咽頭の背側正中線で発見します。 4-5 cm 2 3.5 cm 舌、口腔、歯茎、唇、硬口蓋、唾液腺、頸部の筋肉のほとんどの粘膜
耳下腺 腹側顎関節、咬筋 (文献 8) を尾側に皮下に位置します。 6-9 cm 2-3 cm 皮膚、皮下組織、頭、目と耳、眼瞼、涙腺の筋肉、鼻腔吻側部の筋肉のほとんど
顎下 (1-3 プレゼントがあります) 唾液腺に関連付けられている、下顎角の内側面の皮下にあります。 3-4 cm 2-3 cm 銃口、唇、頬、口蓋、鼻腔の吻側部、舌、皮膚、頭 (文献 8) の筋肉の先端
Supramammary (女性浅鼠径、通常 2 本) 乳腺を基準にして尾側と背側を発見します。 6-10 cm 乳房、外陰部、膣、太もも、脚の内側の表面の内側、尾の側面の皮膚の前庭
(男性バージョンの浅鼠径) 陰嚢 下記の通り、陰嚢の首の周りの脂肪の層内 prepublic 腱 3-6 cm 陰茎、包皮、陰嚢

テーブル 1。牛の表在リンパ節の概要

動物の説明 原稿内の場所 年齢 セックス 健康状態
録画してるバイソン バイソン ビデオ - リンパ節回復のバイソン 5-6 よ 女性 健康的です
オオツノウシ ビデオ - リンパ節回復のウシ 7-8 よ 去勢オス 健康的です
バイソンバイソンRNA の安定性の研究 図 5 a C 5-6 よ 女性 健康的です
オオツノウシRNA の安定性研究のための 図 5、図 6 a 7-8 よ 去勢オス 健康的です
オオツノウシRNA の安定性研究のため B 図 5 7-8 よ 去勢オス 健康的です
FFPE 品質に関するオオツノウシ 表 4、図 4 b 0.5 yo 去勢オス 健康 (o157: h7 感染症研究からコントロール)
複数の追加で牛、バイソン、ヤギ リンパ節のサンプル、ここで強調表示されている以外の方法論が使用されていることに注意してください。
さらに、採集されたリンパ節に同じ方法論を用いて、 1.5 ミズーリ歳雌子牛

表 2。パイロット研究で使用される動物の特性

組織の種類 保存方法 条件を保持 劣化結論 参照
ウシ脂肪、骨格筋、肝臓 冷凍 (液体 N2) スナップします。 4 ° C、真空パッケージ化組織 筋肉 RNA より安定した (ストレージの 8 日にも、);脂肪肝主に安定を 24 h rRNA バンドの出現により評価しました。 バハール et al. (2007)32
人間の結腸、大腸癌 RNA 保存液 室内温度 鈴は 2 h. の保持しますが、遺伝子のサブセットは 0.5-2 から式に変更を表示 h。 山岸ら (2014)33
マウスの肝臓、脾臓 RNA 保存液、またはスナップ (ドライアイス スラリー) を凍結 マウス死体 (37 ° C) の内部 脾臓サンプルは 1.5 h; うち安定していた肝臓サンプル展示以前の劣化 (105 分で凛の 24% 低下。) チェら (2016)34
マウス肝臓 どれも (ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルムで新鮮な Homogenized) 25 ° C、37 ° C 25 ° C で 4 h を限定的な低下が 4 h (鈴スコアを用いた観察)、37 ° C で極端に低下。 アルメイダ et al. (2004)35
人間回腸 RNA 保存液、または凍結スナップ 4 ° C、37 ° C 一般的に 37 ° C で 1.5 h で安定にします。4 ° c (鈴スコアを用いた観察)、6 h の安定は。 作者がまたとして使用できる追加の参照、さらに RNA 整合性文学組織の見直しに興味があるテーブル S1 で選択した RNA の安定性リソースの要約を提供に注意してください。 Lee et al. (2015)36
ひと肝臓 スナップ (液体 N2またはイソペンタン) を凍結 室内温度 劣化 (0.85 ΔRIN); まで 1 h で観察大きいサンプルでよりも肝の小さいサンプルより劣化。 Kap ら (2015)37
ひと大腸癌 スナップ (液体 N2/イソペンタン) を凍結 4 ° C 1 h で観測された低下します;。凍結時間の遅れの 90 分後 4.2 のみのりんの得点 香港 et al. (2010)38
ひと肝臓 RNA 保存液、またフラッシュ (リキッド N2) を凍結 室温、4 ° C サンプルは 1 にも安定していた d. 氷;劣化観察 1 後室温で。(しかし、3 h; 後ではなく観察鈴スコアを使用して) 李ら (2013)39
馬脂肪、骨格筋 冷凍 (液体 N2) スナップします。 13 ° C 筋肉は 2 時間以内、作家はその最高の整合性をお勧めします;。(rRNA ゲル外観で観測された) の著者によって推奨 0.5 h. 内脂肪の保全 モリソンら (2014)40
サーモン脳、腎臓、肝臓、筋肉 RNA 保存液 室内温度 脳 RNA の安定が浩之 4-8、腎臓、筋肉 exhbiit にいくつかの劣化で 8 h (ゲル、鈴スコア両方使用) Seear ・ スウィーニー (2008)41
ウサギの結合組織 (靭帯、腱、軟骨) 冷凍 (液体 N2) スナップします。 4 ° C、室温。 うち 96 h の死後、rRNA ゲル外観によって観測されたが「明白な」劣化しません マルチューク et al. (1998)42
脳、肺、心臓、肝臓 新鮮な抽出するが表示されます。 ラット死体の内部 20 の ° C の定温器で開催 肺や心臓、肝臓の低い安定性の適度な安定性 (観察できる 7 日間のうち rRNA バンド死後、劣化があったが)、脳にみられる最高の RNA の安定性rRNA ゲル外観によって観測されました。 井上ら (2002)43
ヒト扁桃、コロン RNA 保存液なし、スナップ-冷凍 室内温度(22 ° C)、RNA の 4 ° C 保存液、冷たい生理食塩水、または氷 (0 ° C) 16 h RNA 保全ソリューション、氷の上に安定しました。RT (鈴スコアによって測定される)、冷たい生理食塩水で 6 または 16 h で若干低下 Micke et al. (2006)44

表 3。事後組織サンプルの RNA の安定性の前の所見のサンプル。エントリは、組織の種類、マウスを含むの範囲で、RNA の安定性に関する文献から選択した原稿を表す人間の生検と獣医の例。保存、ストレージ事前抽出モードの結果の簡単な概要、メソッドは、それぞれの例に提供されます。サンプルが氷から 37 ° C、続くスナップ凍結または RNA 保存液、経時後の輸液に至るまでの条件で保管した限り、(つまり、安定性が測定されていない RNA の存在下で保存液、インキュベーション中に指示がない限り)。

サンプル ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
260/A280 1.96 1.98 1.98 1.91 1.98 1.89 1.89 1.91 1.9 1.84 1.84 1.97
260/A230 0.67 0.14 0.19 0.26 0.61 0.69 1.33 0.11 0.21 0.39 0.1 0.44
  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

表 4。FFPE 腸間膜リンパ節のウシから分離された RNA から代表の結果。吸光光度から結果を表、一連の FFPE サンプルで牛のリンパ節からの品質分析は、本稿で説明したメソッドを使用して処理されます。それぞれのケースでは、結果は、高い劣化 RNA を反映します。

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Discussion

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トランスクリプトーム研究と関連プロトコルの大部分はマウス、ラット、または事後ひと試料に焦点を当てます。しかし、家畜や野生動物の調査は人間の公衆衛生獣医・人獣共通感染症については必要に応じて、両方の病気に免疫応答の評価の機会の広い範囲を提供します。このプロトコルは、牛、バイソン、ヤギ、羊などの大型動物から組織から整合性の高い RNA 抽出の重要な考慮事項の概要を提供します。サンプル コレクションのための条件と同様、動物のサイズに、回復マウス リンパ節復旧のためのより長い事後処理時間とのより詳細なプロセスです。同様に、これらのリンパ節の大きさは、リンパ節内で免疫学的・病理学的変化を代表するサンプルと同様に、さまざまな動物から並列の例の回復プロトコルを必要とします。このプロトコルではサンプルのコレクションのための提案は、リンパ節の区分に基づいて代表的なプロファイルはそのまま RNA 同様の回復を提供します。

標準化されたサンプリング方法とプロトコルの重要性の例としてここに示された家畜リンパ節のトランスクリプトームを特徴とする PubMed 中央データベースから 25 の論文を調査しました。1 つの論文に一度に大きなリンパ節のセクションの処理が示されている、1 つは特定のレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション法を説明した、「代表的なサンプル」はリンパ節が採取した言及と示される 1 つだけ紙46リンパ節の作品収集 (10 mm3サイズ) であることと、皮質と髄質の領域が含まれています。その他の論文は、小さなサンプル (通常 30-100 mg) が RNA 解析処理された指摘、論文の 84% はこれらのティッシュの部分のコレクションのためのサンプリング戦略を言及しなかった。として RNA シーケンスはまだ比較的高価、リンパ節ごとの複数のセクションの解析がレプリケート試料の統計解析の優先は通常、特に以来ほとんどの場合、財政的に実行可能である可能性が高い。矢断面化されたリンパ節のウェッジでサンプルを収集することにより、免疫細胞の種類の豊富なリンパ節領域からの RNA はすべてのサンプルでキャプチャされます。このプロトコルは、リンパ節トランスクリプトミクスの文書化され、再現可能なサンプリング方法の参照として使用できる、したがって、します。

組織からの RNA の準備、手続き型の意思決定に対して複数のキーのステップがあります。まず、方法論的文学保全ソリューションの使用の面で混合はフラッシュ凍結組織サンプル (およびそれに続く低温研削) の使用。大型動物の魚の場合は特にこのプロトコルに組み込まれて、保存液の使用に複数の潜在的な手続き型の利点があります。まず、組織サンプルは、すぐにチューブを液体窒素に転送することがなく保存液で剖検時に格納できます。第二に、保存液の使用は、特にサンプル部分的または簡潔に均質化する前に解凍の場合 RNA 抽出のサンプル処理の前に追加の保護を提供します。図 6Aの結果は、リンパ節組織まで、この予防効果を示します。対照的に、フラッシュ凍結サンプルは、フェノールを含むバッファーの均質化の瞬間まで凍結状態で維持されなければなりません。最後に、液体窒素が容易に利用できない、大型の動物のフィールド腑分のサンプルに格納できる保存液までラボに復帰することができます。

ここに示す手順の分子の付加的な利点として消毒剤からのサンプルの均質化のエアロゾル生成過程初期の組織の処理中にフェノールを含んでください。感染動物や残留フェノールおよびイソチオ シアン酸グアニジンをサンプルから削除するスピン列プロシージャの使用。代表的な結果を示す手順260/A280260/A230比により評価した質の高い RNA を生成しますし、ゲルの電気泳動および鈴スコアは時間コースに挑戦の面堅牢家畜と野生動物のサンプリング。フェノール系試薬 (例えばTRIzol)、および石英カラム精製で均質化 (例えばRNALater で)、組織保全のペアリングに羊の遺伝子発現パターンをプロファイルする文学で正常に利用されています。第四胃リンパ節消化管内線虫相46と牛リンパ節に感染感染ヘルペス ウイルス47、鈴スコア 8 以上とすべてのサンプルの間で 7 を超えるとそれぞれ。

RNA プロセシングのための標準は、次の変数を評価する下流解析のための容認できない凛スコアと結果 RNA の場合: 総処理時間の死体解剖、組織、処理待ち時間の条件後に解凍、RNA の抽出および RNA の処理ポスト抽出技術。合計処理時間事後動物動物の安楽死ではなく、死んでから回復した組織の場合は特に評価します。前述のように、RNA はリンパ節に比較的安定したが、処理に長時間の遅延が特に不安定な成績の低下につながる可能性が。交絡変数は時間の異なる量のフィールドに残っている死体のサンプルを比較する場合存在かもしれない。感染に伴う病理学的変化のための組織の整合性の劣化が RNA の安定性を低下させるため、組織の状態を評価されなければなりません。たとえば、下の RNA の品質は、ブルセラの placentome で観察されている-動物後中絶 (Boggiatto、提出) を感染しています。処理遅延時間/解凍後は、このプロトコルで説明されているように保全ソリューションの使用によって軽減されます。ティッシュ部分の厚さが組織 (< 5 mm 厚材の表に記載されている防腐剤を使用して) に防腐剤のソリューションの迅速・適確な浸透を許可するように十分に低くできます。RNA 抽出時にバッファーは、RNase フリーする必要があります、手袋、他と接触 (RNases が皮膚に存在) 汚染された項目を避ける必要があります。リンパ節組織の研削用組織自体に潜在的な RNases の最大の源になりますが、手順のすべての段階での汚染物質の導入を減らすために有益です。プロトコルに記載されているとおりに RNA のポスト抽出を処理するには、因数 RNA を質と量の分析用試料を凍結融解する必要性を除去するために凍結し-80 ° C で保存する前にチューブにサンプリングします。

RNA サンプルの分解に起因以外の手順で利回りの低い、プロトコルの手順 4.3 でリンパ節組織の非効率的な均質化が原因であることができます。ほとんどリンパ節組織で大規模なパイロットの実行で効果的に解離歯ロータ ステータ分解ここで説明が RNA 保全ソリューションでインキュベーション組織 (増加硬さ) のテクスチャを変更することに注意してください。4.3.1 の手順で述べたように、フェノール ベースの試薬で均質化する必要があります繰り返すかどうか、解離は完了しません。モルタルと乳棒研削、これらの仕様を持つホモジナイザーにアクセスすることがなく研究所の別の代替は、フェノール ベースの試薬の粉砕の巻き上がりが続きます。ただし、使い捨てチューブの均質化、乳鉢と乳棒、複数のサンプルを処理するためのより実行可能な短いワークフローで、サンプル損失研削時の不在などで凍結するティッシュの研削仕上の複数の潜在的な利点、ないのクリーンアップ、および感染している動物からのティッシュの場合の動力を与えられたサンプルと潜在的な接触のないです。

アヴラハム48は、28 s、18 s リボソーム Rna の回復が低いとペアになって、最終の RNA 製品の大規模な 5 s RNA のピークが (順番に、リンパ節の処理のため、tiss の不完全な解離に起因することができます細胞の不完全な換散のサインにあることを示すue)。図 6 bは、結合組織は非常に高かった、効果的に均一したないウシの耳下腺リンパ節の部分から生成される RNA プロファイルの例を提供します。RNA 利回りを計算し、分析組織の mg 当たり同じような回復が得られるし、RNA 配列による直接の比較のためのサンプルが同じの均質化を使用して、バッチで処理されることを確認するための一連のサンプル間で監視する必要があります。すべてのサンプルのための戦略。ウェッジ サンプリング アプローチが広範な結合組織の領域のみであるサンプルのコレクションを回避する上でもエイズに注意してください。

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Disclosures

著者はある利益相反を開示します。すべての研究は、米国農務省農業研究サービスから学内資金資金を供給します。特定の製品に対するすべての参照は実験的再現性を目的として提供され、連邦政府によってこれらの製品の裏書を表さない。

Acknowledgments

著者はすべてのビデオ撮影とビデオ処理; 彼の素晴らしい仕事のためジェームズ ・ フォッシーを感謝したいです。デジタル化された牛のイメージの生成の彼の素晴らしい仕事のためのマイケル ・ マルティRNA の抽出と彼女の助けのリリア ヴァルターとバイオアナライザーの実行;ミッチ パーマーと彼らの役に立つレビューとリンパ節の画像上のフィードバックのカーリー Kanipe動物の世話とすべての彼らのハードワークと畜産の支援のための国立動物病センターで魚のための準備の獣医のスタッフ。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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References

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コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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