Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

Abstract

חיות גדולות (הן חיות המשק וחיות) לשמש חשוב מאגרים של גורמי מחלה נגיפית, לרבות Brucella, חיידקי סטרפטקוקוס בוביס Mycobacterium, סלמונלהו- e. coli, והם שימושיים ללימוד פתוגנזה ו/או התפשטות החיידק ב hosts טבעי. כאשר פונקציית מפתח של בלוטות הלימפה בתגובה החיסונית המארח, רקמות לימפה לשמש מקור פוטנציאלי של RNA עבור ניתוחים transcriptomic במורד הזרם, כדי להעריך את השינויים הטמפורלי של ביטוי גנים בתאים במהלך זיהום. מאמר זה מציג סקירה של התהליך של הצומת לימפה אוסף דגימה רקמה, RNA במורד הזרם עיבוד במשק, באמצעות בקר (פרות, המטופחות) כמודל, עם דוגמאות נוספות מסופקים של ביזון אמריקאי (ביזון ביזון ). הפרוטוקול כולל מידע אודות מיקום, זיהוי, הסרה של בלוטות הלימפה מאתרים מרכזיים מרובים בגוף. בנוסף, מתודולוגיה דגימה ביופסיה מוצג המאפשר עקביות הדיגום מעבר בעלי חיים מרובים. מספר שיקולים לשימור הדגימה הנזכרים, כולל הדור של RNA מתאים מתודולוגיות במורד הזרם כמו רצפי RNA ו- RT-PCR. בשל עיכובים ממושכים הטמונה גדולים בעלי חיים לעומת העכבר פעם קורס לימודי, מוצגים תוצאות נציג ביזון ורקמות הלימפה שור כדי לתאר את מהלך הזמן השפלה בסוג זה רקמות, בהקשר של סקירה של עבודה מתודולוגי קודמות ב- RNA השפלה ברקמות אחרות. בסך הכל, פרוטוקול זה יהיה מועיל שני חוקרים וטרינרי מתחיל transcriptome פרויקטים על דגימות בעלי חיים גדולים, פיצחו המעוניינים ללמוד טכניקות ויוו רקמות דגימה ועיבוד במבחנה .

Introduction

ניתוח ה-RNA-רצף של transcriptome של בלוטות הלימפה מספק את ההזדמנות כדי לאפיין את התגובה החיסונית של חיות למגוון של פתוגנים. אמנם יש כבר מנוצל מתודולוגיה זו בהרחבה בעכברים, ניתוח הרחבת לאחרונה לתוך יונקים גדולים1,2. משק חי/גדולים בעלי חיים בלוטות הלימפה יכול לשמש כדי לאפיין תגובות המארח, זיהום, לא רק לשימוש שלהם חיסון או רגישות גנטית מחקרים, לצורך זיהוי מטרות עבור פיתוח התרופה, אלא גם דגם מערכות עבור מחקרים בבני אדם על מחלות שפוגעות. לדוגמה, במקרה של ברוצלוזיס (מחלה חיידקית שפוגעות כי ההשפעות חצי מיליון אנשים ברחבי העולם בכל שנה), למרות גדל באופן משמעותי בעלויות, לימודי כבשים או עיזים שהן יותר רלוונטיות הדבקת בני אדם, החיסון האנושית פיתוח מודלים חיות מעבדה. העכבר זיהום מודלים מסכם את הדברים הזיהום מערכת reticuloendothelial אבל לא את הסימנים הקליניים האופייניים3.

בניסויים בבעלי חיים גדולים לעומת מעבדה מחקרים שנעשו בבעלי חיים, התהליך של רקמות קציר בהכרח כרוך עיכוב ארוך יותר בין המתת החסד ואת האוסף רקמות, אשר מהווה אתגר פוטנציאל לשימור RNA באיכות גבוהה. RNA תקין חיוני לדור של נתונים transcriptomic רלוונטי מבחינה ביולוגית. הדור של RNA באיכות גבוהה של דגימות רקמה קריטי במיוחד ללימודי הפתוגן בעלי חיים גדולים מתבצע תוך מתקני כליאה. מחקרים כאלה הם מטבעם יותר קשה לבצע כפי שהם דורשים אישרה מתקנים, מאומנים כוח אדם אלא גם לשאת משמעותי בעלות הכספית, אשר, בהתאם לעבודה, יכול לנוע בין עשרות למאות אלפי דולרים. סוגי מחקרים אלה כרוכים גם שיתוף פעולה בין-תחומית והידע רב-תחומי להשלמת שלהם, הוספת את המורכבות שלהם. לכן, הדרכה, התפתחות, ואת הדבקות מערכת יעילה של המדגם אוסף שימור מספק יתרונות משמעותיים במחקרים מולקולריים במורד הזרם של רקמות של חיות נגועות.

האוסף של בלוטות הלימפה גדול מציג אתגרים נוספים עבור אוסף רקמה לעומת דגימה דומה מאתר בלוטות הלימפה. ההכנה הכריתה מדגם מחייבת הבנה בסיסית של האנטומיה של הצומת לימפה, לרבות המבנים הפנימיים הרלוונטיים. המבנה של הלימפה מורכבת של האוניות הלימפה מוקף הסינוסים מלא הלימפה. מבנים אלה מוקפים בתוך כמוסה קשה, סיביים. 4 lobule הלימפה "אנטומי פונקציונלי היחידה הבסיסית של הצומת לימפה", מורכב זקיקי, יחידת עמוק בקליפת המוח, ואת מיתרי מדולרי הסינוסים4 (איור 1 א'). B ו- T לימפוציטים הם ביתו זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח, בהתאמה. מבנים אלה מספקים לפיגום תלת-ממד, להקל על האינטראקציה בין לימפוציטים וגם אנטיגן או אנטיגן הצגת תאים.

רווחתה, זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח ניתן לזהות במשטח לחתוך כפי שהם מכילים meshwork רשתי צפופה מופיעים יותר הסינוסים, המורכב מעובדים meshwork רשתי עדין יותר ואשר נראה בהיר יותר כהה (איור 1B). לפי המוסכמות, פתולוגים להפנות האזורים של בלוטות הלימפה כמו קליפת שטחית (זקיקים), את paracortex (יחידות עמוק בקליפת המוח) לשד (מיתרי מדולרי, הסינוסים). בדיקה נכונה של כל שלושה אזורים שסברו הטובה ביותר תרגול בהנחיות שגרתית פתולוגיים הלימפה5. שימו לב כי יש וריאציה ניכר עקביות, גודל וצבע של בלוטות הלימפה, אפילו בתוך חיים בודד. כמו בעלי חיים גיל, בלוטות הלימפה שלהם נוטים להקטין את גודל להיות מוצק יותר מאלה של חיים צעירים, בדרך כלל עקב גידול רקמות החיבור שלהם וירידה רגיל הלימפה מבנה6,7.

Figure 1
איור 1. אנטומיה של הצומת לימפה. (א) תמונה קריקטורה זו מראה את האנטומיה של הצומת לימפה, המתארים מבנים מרכזיים. (B) תמונה זו עדיין מציגה לימפה שור חותכים חתך הרוחב. המבנים/השכבות הרלוונטיות הגלויים לעין מודגשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בהתאם השאלה ניסיוני, הלימפה שונים יהיה עניין עבור איסוף וניתוח. בלוטות הלימפה ההיקפית הם אלה נמצא עמוק בתוך הרקמה התת עורית. הבקר, בלוטות הלימפה היקפי או שטחי משמש לעתים קרובות באימון קליניים וניסויים לכלול הפרוטיד, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural), שטחי במפשעה (supramammary אצל נקבות, האשכים אצל זכרים) ( איור 2). טבלה 1, מאפייני מפתח בלוטות הלימפה שטחית, כמתואר ב- במערכת ' בקר '8, מתוארים. להלן, כמה תוכניות אוסף הצומת לימפה פוטנציאל למחלות זיהומיות חיידקים של הבקר מוצגים כנקודת התחלה עבור החקירה.

Melitensis abortus/Brucella brucella: תקן necropsies עבור abortus דרב-נגוע בקר ו melitensis דרב-עזים נגוע במרכז הלאומי חיה המחלה לשחזר supramammary, prescapular, רקמות parotid בלוטת לימפה , הן של שיוף שהספירה חיידקי ועל ההכנה RNA פרופיל ביטוי מארח ה-RNA. Abortus דרב ניתן לשחזר באופן קבוע בכל אחד מאותם בלוטות הלימפה בקר נגוע השפעול9. הנוכחות של חיידקים בכל אחד מסוגי הלימפה ניתן להבחין ב- melitensisבנגוע עזים עד לפחות תשעה חודשים לאחר הפגיעה באמצעות למתודולוגיות מבוססי ה-RNA ממחקרים שלנו (Boggiatto. et al., לא פורסם). סלמונלה sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), ואת בלוטות לימפה mesenteric היו שימושיים במהלך יצירת פרופילים של פגרי הבקר סלמונלה השכיחות10,11,12 , יהיה עניין פוטנציאלי ללימודי transcriptomic. E. coli O157:H7: בלוטות לימפה mesenteric (-המעי הדק האמצעית והמיקומים המעי הדק הדיסטלי) יכול להיות האתרים של שחזור של פה ושם של חיידקים עגלים הנגוע (אך לא נגוע הבקר מבוגרים)13. לפטוספירוזיס (Leptospira sp.): התמדה כרונית של החיידקים נצפתה בקשרי הלימפה ניקוז בלוטת חלב14. Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס : בבקר, החיידק כבר התאושש זיהום שלאחר ניסיוני של בלוטות הלימפה mediastinal, tracheobronchial של עגלים15. בנוסף, הצומת לימפה RNA יש כבר מנוצל כדי לבחון תגובות לארח בעלי חיים גדולים וירוסים, כגון וירוס חזירי תסמונת הרבייה, מערכת הנשימה2. איור 2 מציג את המיקום של קבוצת משנה של אלה הלימפה העיקרי בגוף הבקר.

Figure 2
איור 2: קריקטורה המתארים במיקומים שנבחרו הלימפה בבית השחי הצומת פרות, המטופחות . בלוטות הלימפה ממוספרת הם מבואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נייר זה ווידאו משויך, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של גדול הלימפה חיה ללימודים RNA, תוכנן להיות אינפורמטיבי עבור פיצחו המעורבים במחקרים transcriptomic של זיהומים בעלי חיים גדולים. ראשית, אנו מספקים סקירה של ההליך בידוד בלוטות הלימפה, באמצעות דגימת רקמות שור, ביזון כדוגמאות. מזווג עם ההדגמה, כפי שהוא מוצג בסרט, הוא זרימת עבודה עבור דגימה רקמה לשחזור לבידוד RNA. בשלב הבא, אנו מתארים שיקולים חשובים עיבוד של הצומת לימפה נגועות, עם דגש על בטיחות, עקביות ואיכות RNA.

הכנת RNA מתוך הרקמה עם ריאגנט isothiocyanate פנול acidified-guanidine מבוסס על השיטה המקורית של Chomczynski וסאקי16,17, בטהרה על-מבוססות-סיליקה ספין עמודות רכוש סוכני chaotropic בהתבסס על העבודה המקורית של Vogelstein ו גילספי18. אנו בוחנים גם את הפוטנציאל ההתאוששות של RNA עבור transcriptomics מן הבקר הלימפה שנשמרו על-ידי שיטות אלטרנטיביות. לבסוף, אנו חוקרים את ההשפעה של המשתנה פעם על איכות ה-RNA ב necropsies בעלי חיים גדולים, כולל ניסוי נציג המתארים את ההשפעה של עלייה זמן בין המתת החסד הדגימה על הפרופיל RNA התאושש מן ביזון, . בלוטות לימפה שור מאמר זה יהיה מועיל לא רק פיצחו אלא גם ל וטרינרי חוקרים מתחיל transcriptomic מחקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים necropsy בעלי חיים המתואר כאן מכוסים במסגרת הפרוטוקולים המאושרים IACUC במרכז הלאומי חיה המחלה, איימס, חקירות פנים כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות מאושרים עבור טיפול בבעלי חיים ורווחה.

1. קדם תכנון לפני Necropsy

  1. לפני necropsy, להכין את החומרים הבאים עבור הובלה לסוויטה necropsy:
    1. 1.5 או 2 מ"ל microcentrifuge צינורות מלאים ~ 1.0 מ"ל של תמיסת השימור RNA, במיכל מתלה או תחבורה. הקפד לעקוב אחר הנחיות היצרן היחס בין הנפח של הפתרון שימור לנפח של הרקמה.
    2. ואזמלי מנתחים חד פעמיות ומלקחיים נקי, בלוק: ערכה אחת ניקוד על העור ועל מערכת שונה לאיסוף בלוטות הלימפה (אחד עבור כל הצומת לימפה, לכל בעלי חיים), ובכך למנוע את זיהום של העור פלורה סביבתי עם הצומת לימפה רקמות.
    3. 3 מ מ מבלטים ביופסיה, necropsy סכינים, מכולה שרפ עבור ואזמלי מנתחים בשימוש ואת כלי ביופסיה, קרשי חיתוך או בתבניות חד פעמיות לשימוש dissection הלימפה.
    4. השתמש ציוד מגן אישי, כולל עיקרון השוויון הפוליטי הדרוש לעבודה ברמה BSL המתאימה עבור המערכת.
    5. אוטוקלב לשימוש חוזר כלי מתכת, כולל המלקחיים, מחבתות מתכת לפני necropsy, באמצעות את הסחורה כלי/יבש הגדרת.

2. דגימה של בלוטות הלימפה בקר ו ביזון וזיהוי

Figure 3
איור 3 . בלוטות הלימפה של שור הראש והצוואר. (א) זו דמות מצויירת מראה שנבחר הלימפה של הראש והצוואר של פרות, המטופחות. (B) תמונה זו מציגה את הצומת לימפה parotid חתך רוחב (משמאל) לעומת parotid בלוטת הרוק חתך רוחב (מימין). שימו לב ההבדל בין רקמות שני סוגי טקסטורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. בידוד של בלוטות הלימפה prescapular הבקר, ביזון
    1. להרדימו (בקר או ביזון בכל גיל, בהתאם לניסוי) בהתבסס על פרוטוקול IACUC מקומיים. לאשר את מותו על ידי בשיטות המתוארות במפורש בפרוטוקול IACUC המוסדי, לרבות העדר דופק, חוסר נשימה, העדר רפלקס המצמוץ. הזז את החיה על הרצפה necropsy.
      הערה: קיימות שיטות שונות של ההומני בשימוש בפועל מעבדה של בעלי חיים גדולים. אולם, עירוי לוריד של פתרון נתרן סודיום פנטוברביטל, פניטואין הוא הכי נפוץ מאושרים ולא מנוצל טופס. התייעץ עם המנחים AVMA על המתת החסד של בעלי חיים. 19
      התראה: פעל כל פרוטוקולי אבטחה הרלוונטיים necropsy במוסד המארח, כולל הנחיות לרשות בטוח שרפ מיכל ניקוב-הוכחה, וכן את הטיהור של סכינים מתכת לשימוש חוזר וחדים. פרוטוקול זה מייצר פסולת שרפ מן השימוש ואזמלי מנתחים חד פעמיות. ללבוש ציוד מגן אישי כפי שמכתיבה את ההנחיות המוסדי, כולל מגפיים, הסרבל, כפפות הגנה העין.
    2. לזהות 3 משתתפים לעבוד על רקמות חיות.
      הערה: כאן, בניתוח 1 להיות אחראי רחבת היקף חלוקתה של רקמות חיות הרצוי בניתוח 2 יהיה לשחזר את בלוטות הלימפה ממקטעים שונים בעלי חיים, בניתוח 3 יעבוד בטבלה נפרדת כדי לבודד חלקים מן כל הצומת לימפה, להעביר אותם צינורות עם פתרון משמר.
    3. להתחיל על ידי הצבת החיה recumbency לרוחב.
    4. להרחיב את הכתף על-ידי הזזת את האיבר קבלה בחזרה ברמה של הברך (עצמות שורש כף היד); תנועה זו להחזיר את הכתף ולאפשר מישוש קל של הצומת לימפה. מרגיש נוכחות של הצומת לימפה "גוש".
      הערה: במהלך המחלה תנאים, לימפדנופתיה עשוי להיות נוכח, אשר מקלה את הזיהוי של בלוטות הלימפה, אך תהליך זה יכול להשפיע גם על עקביות, קומפוזיציה ואדריכלות של הצומת לימפה.
    5. ברגע ממוקם עם הכתף עדיין מורחב, השתמש בסכין שהאזמל או necropsy לעשות חתך בעור לאורך קווי המתאר של הכתף.
      הערה: לא תגביל את הגודל של החתך, אפילו אם הצומת לימפה היה ממוקם באמצעות מישוש. חתך גדול יותר מספק גישה קלה יותר לרקמות העמוקות ומקל על הכריתה של הצומת לימפה עבור בניתוח.
    6. באמצעות זוג מלקחיים, תמשוך את העור וחושף את הנקודה של הכתף או צוואר מערכת השרירים.
      הערה: הצומת לימפה prescapular נמצא לעיתים קרובות השומן התת עורית, במיוחד אצל בעלי חיים overconditioned.
    7. שוב, ימשש את המיקום של הצומת לימפה (איור 3 א).
      הערה: בניגוד שומן תת עורית, הצומת לימפה תקיים את צורתו כאשר palpated. בנוסף, בלוטות הלימפה אינם רציפים עם כל הרקמה הסובבת, כפי שהם מוקפים על ידי קפסולה סיבית דק.
    8. לאחר איתור הצומת לימפה prescapular, בזהירות לנתח השומן התת עורית, באמצעות אזמל מלקחיים, ולבודד את הצומת לימפה.
      1. חפשו את הנוכחות של קפסולה סיבית דק, כפי שהיא מתוארת איור 1B, כדי להבדיל בין הצומת לימפה רקמת שומן; בלוטות הלימפה אינם רציפים עם כל הרקמה הסובבת.
    9. העברת הצומת לימפה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.
      הערה: המראה של אלה הלימפה ביזון דומה. וידאו הקשורים מתאר את המראה של הצומת לימפה prescapular כמו גזור מחוץ הכתף הימנית של ביזון אמריקאי.
  2. בידוד parotid בלוטות הלימפה בקר ו ביזון
    1. להתחיל על ידי הצבת החיה recumbency לרוחב על הרצפה necropsy. אתר את מפרק לסתי-רקתי (TMJ).
      1. אם זה קשה מאוד לאתר, הלסת התחתונה לאט לאט, לקבוע את המיקום שבו הלסת התחתונה מייחסת הגולגולת; . זה למפרק לסתי-רקתי
    2. בזהירות באמצעות סכין שהאזמל או necropsy, לעשות חתך בעור. . תתחיל לחתוך הגבי המשותף ולהרחיב אותו ventrally/אנכית לאורך קו הלסת.
    3. לנתח את העור כדי לחשוף את הרקמה התת עורית. בלוטת הרוק parotid יהיה גלוי קודם, בשל גודל גדול שלה, מראה פני השטח lobulated, צבע אדום.
    4. באמצעות מלקחיים אזמל, להזיז את בלוטות parotid הצידה כדי למצוא את הצומת לימפה parotid יושב רק הגולגולת המדיאלי כדי בלוטת הרוק (איור 3 א). לבחון את רקמת הלימפה parotid ' מרקם ' לפני עיבוד נוסף.
      הערה: בלוטות הלימפה של הפנים (parotid, submandibular) קשורים עם בלוטות הרוק, אשר יכול לבלבל את הבידוד הצומת לימפה. בהשוואה הלימפה, בלוטות הרוק הן גדולות הרבה יותר, יש מראה פני השטח lobulated. יתר על כן, על השטח לחתוך, בלוטות הרוק הומוגנית בטבע, לא להפגין את קלאסי קורטיקליים ו מדולרי דפוס אדריכלי של בלוטות הלימפה (איור 3B).
    5. לסלק את בלוטת עם אזמל. להעביר את זה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.
  3. בידוד של supramammary הלימפה נקבה ובקר ביזון
    1. מקם את החיה recumbency לרוחב.
    2. להגביה את הרגל האחוריות כדי לחשוף את האזור מפשעי ולאתר עטין.
      הערה: של חיים בריא, שאינו מיניק, מישוש הלימפה האלו לא ייתכן. חיים מניקות, אלה בלוטות הלימפה עשוי להיות מוחשי על הגבול סימטרית של הבסיס של עטין.
    3. באמצעות אזמל, לבצע חתך פשוט הגבי עטין, רץ לאורך הרגל העליונה, כדי לחשוף את בלוטות supramammary.
    4. לנתח את הרקמה התת עורית, למצוא את הצומת לימפה supramammary נעוץ שכבה דקה של השומן התת עורית. אם לא מבחינה ויזואלית ניתן להבחנה, ימשש את הרקמה החשוף לנוכחות של מבנה מוצק בתוך השומן התת עורית.
    5. באמצעות מלקחיים, אזמל, לנתח בזהירות את הצומת לימפה מן השומן. להעביר את זה השולחן לנתיחה הלימפה בבית השחי הצומת, באמצעות מגש פלסטיק לצורך העברת רקמות, עבור עוד יותר חלוקתה.

3. חלוקתה ואחסון של בלוטות הלימפה

  1. עוברים את בלוטות הלימפה מבודד מן בניתוח 2 כדי 3 ליד שולחן חיתוך סמוך למרחב הראשי necropsy dissector. במקום כל הצומת לימפה על קטע טריים של קרש חיתוך. תווית מראש את לוחות חיתוך קטעים מאת הלימפה, כדי להקל על קבלת מספר בלוטות לימפה ברצף. לקבלת דוגמאות זיהומיות, להשתמש בתבניות חד פעמיות.
  2. באמצעות מלקחיים וסכין חד פעמיות שהאזמל או necropsy, להסיר מקטע של הצומת לימפה. בעזרת סכין חדה, לבצע חתך הסאגיטלי לפתוח את הצומת לימפה.
  3. לבחון את הפנים של הצומת לימפה, בפרט דגימות של חיות נגועות, מחפש א-סימטרי, נגעים, הבדלי צבע, וכו ' להקליט התצפיות.
  4. (אפשרות 1) קטעי רקמה קטנה
    1. השתמש ואזמלי מנתחים חד פעמיות כדי לסלק חתיכות של כל הצומת לימפה, פחות מ 5 מ מ עובי, להעביר כל קטע צינור עם פתרון שימור RNA עם מלקחיים נקי.
  5. (אפשרות 2) הצומת לימפה ביופסיה או חלוקתה מתודולוגיות
    הערה: ביופסיות או מתודולוגיות אופטים, כאשר חל מקטעים מקבילים הלימפה בבית השחי הצומת על פני צמתים שונים ובעלי חיים, לספק עקביות של רקמות שנדגמו ניתוח RNA בצובר.
    1. טריז חלוקתה שיטה
      1. לאחר בחינת המקטע הסאגיטלי ללכוד תאי מעבר לפרופיל של הצומת לימפה, בלו טריז בצורת עוגה מן הצומת לימפה, מהמרכז הקפסולה החיצוני. עבור צומת 2 ס מ רוחב (גודל סטנדרטי; ראה טבלה 1), חותכים טריז למרכז זה 4 מ מ אורך קשת החיצוני ויהיה 5 מ מ עובי משקל רטוב של ~ 100 מ ג.
      2. באמצעות את האזמל, לחתוך את התבנית לחתיכות קטנות, לא עבה מ 5 מ מ ו כ 50-100 מ"ג כל רקמות רטוב במשקל.
        הערה: עקביות, לעבד כל החלקים טריז מן לימפה בודד באצווה אחת או צינורות נפרדת ואחריו RNA באגירת לספק פרופיל RNA נציג מן הצומת לימפה עניין.
      3. מקם את חתיכות רקמה עם מלקחיים לתוך צינורות המכיל לפחות 10 כרכים של תמיסת השימור RNA, לעומת הנפח של הרקמה.
    2. שיטת ביופסיה אגרוף
      1. בחרו בכלי ביופסיה אגרוף אם המטרה היא לאסוף בחלקים מסוימים, כגון זקיקים ספציפי מהצומת. בחרו כלי תואם גודל המדגם הרצוי עבור אוסף. אגרוף ביופסיה כלים זמינים במגוון של גדלים, מ- 1 עד 8 מ מ קוטר.
      2. חזותית לאתר את האזורים להעסיק מדגם הצומת לימפה.
      3. השתמש בכלי ביופסיה אגרוף לסלק את המקטעים של עניין, לחיצה ארוכה על הפעלת הכלי לתוך הרקמה כדי ליצור את הליבה. העבר את פיסת רקמה עם מלקחיים שפופרת המכילה לפחות 10 כרכים של תמיסת השימור RNA. אם סמיך 5 מ מ, להשתמש מלקחיים, אזמל לחלק נוסף של הרקמה לחתיכות קטנות יותר.
  6. ברגע הדגימות הועברו אל תמיסת השימור (למשל., RNALater), להעביר אותם חזרה למעבדה בטמפרטורת החדר.
  7. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר חדירה לרקמות.
  8. למחרת, יוצקים את הפתרון שימור עודף RNA ולאחסן את דגימות רקמה ב-80 מעלות צלזיוס. להסיר כמה שיותר חומר משמר ככל האפשר לפני הקפאת הדגימות. השתמש טיפ micropipette P1000 ו/או P200 להסרת משמרים פתרון יעיל RNA.
    התראה: למחוק את הפתרון שימור יצק בהתאם, בהתבסס על מאפייני המחלה מנוצל כמו גם הסכנות כימיים וסביבתיים של הפתרון שימור כפי שצוין בגיליון נתונים בטיחות זיהומיות.
    הערה: ההנחיות כאן הינם מסופקים עבור הפתרון שימור RNA המתוארות בטבלה של חומרים. התייעץ עם הנחיות היצרן, אם באמצעות פתרונות חלופיים שימור.

4. עיבוד RNA בלוטות הלימפה

התראה: ללבוש חלוק מעבדה, כפפות והגנה עיניים נאות עבור הצעדים עיבוד.

הערה: הכימית מבוסס-פנול המשמש כאן מתוארת בטבלה של חומרים (ו הפרוטוקול מבוסס על הנחיות היצרן)20. השימוש של ריאגנטים מבוסס-פנול חלופי המחייב שינוי של ההליך, בהתבסס על ההמלצות של היצרן עבור המוצר הספציפי רכשה.

  1. לפני שתיכנסו הדגימות, טרום aliquot הכימית מבוסס-פנול צוננת (4 ° C) כדי המגון צינורות (1.5 mL/צינור), באמצעות פיפטה.
    התראה: פנול הוא רעיל, מאכל, סיכון בריאותי. כלורופורם הוא רעיל, סיכון בריאותי. להשלים את שלבי עיבוד 4.1-4.9 בשכונה fume כימי, יש ללבוש כפפות כדי למנוע מגע עם הכימיקלים. בארצות הברית, כלורופורם הוא בזבוז מסוכנים; תשליך צינורות המכיל פסולת מסוכנת בהתאם להנחיות מקומיות ומוסדיים. תהליך דגימות רקמה של בעלי חיים נגועים עם פתוגנים תחת BSL המתאימים-2, BSL-3, או הנחיות BSL-4.
  2. לאחר דגימה יכול ישמט מן הצינורות microcentrifuge עם מלקחיים נקי, מיד להעביר כ 50-100 מ"ג של הרקמה נשמר הצינור המגון המכיל הכימית מבוסס-פנול.
    1. להגביל את הפשרתו לפני התוספת הכימית מבוסס-פנול. השתמש אחסון על קרח יבש כאשר מספר דוגמאות יוסרו מן המקפיא לעיבוד.
  3. בחוזקה קאפ הצינור, להניחה מהמגן, homogenize את הדגימה עם מהמגן רקמות הרוטור-בפיתולי גלגל מכון ב הכימית מבוסס-פנול. להשלים את העיבוד בטמפרטורת החדר. מתי להשלים, בדוק על עכירות להבטיח שהמדגם היה הומוגני בהצלחה; צריך להיות מפוזרים הרקמה להשעיה מעונן.
    הערה: הגדרה חילוץ 2 דקות RNA משמש (ההגדרה RNA_02_1 שנקבע מראש עבור מהמגן תיאר את הטבלה של חומרים; מיועד רקמות קפוא). הרוטור-בפיתולי גלגל מכון שצוין בפרוטוקול זה (ראה הטבלה של חומרים) הוא גדול הטרשית, מותאם המגון של מגוון סוגי רקמות, כולל חומר סיבי. ההגדרה RNA_02_01 תוכנן במיוחד עבור קפוא (בניגוד טריים) ברקמות. כמו בלוטות הלימפה יש רקמת חיבור סיבית רכיבים, מהמגן רוטור אופטימיזציה באופן דומה-בפיתולי גלגל מכון מומלץ להשיג של דיסוציאציה יעיל. ראה את נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה21 לקבלת מידע נוסף אודות המלצות המגון.
    1. אם נתחים גדולים של רקמות נשארים לאחר המגון, חזור על התהליך המגון. כדי לשחזר בצורה יעילה את הרנ א, הרקמה חייב להיות טוב חלופה מועדפת.
    2. עבור סיבי יותר הלימפה חתיכות, להשתמש מלקחיים ומספריים מראש לקצוץ את החתיכה הצומת לימפה לחתיכות קטנות יותר מספר לפני העברת הצינור המגון. כפי שתואר במבוא, רקמות לימפה מחיות ישנים יותר עשויים להיות סיבי יותר.
      הערה: אם ניתוח כפול של המארח, פתוגן RNA היא הרצויה, ייתכן טיפול נוספים (כגון חרוז המגון) יהיה צורך עבור ההתאוששות של RNA חיידקי, במיוחד אם גראם חיוביים פתוגנים נוכחים ברקמות.
  4. מיד להסיר את הדגימה homogenized של הצינורות, להעביר אותו ללא RNase microcentrifuge צינורות (2.0 mL בגודל) עם micropipette P1000.
  5. Centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב g x 12,000 ב 4 ° C כדי להסיר את כל פסולת מדגם. באמצעות טיפ micropipette P1000, להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge טריים, כשמאחוריו בגדר.
  6. דגירה של תגובת שיקוע למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיצול כל מדגם בין microcentrifuge 1.5 שני צינורות.
  7. הוספת 0.2 מ של כלורופורם לכל 1 מ"ל מהתרכובת מבוסס-פנול (קרי, mL 0.3 עבור מדגם 1.5 mL); היפוך זה ביד למשך 1-2 דקות לערבב את השלבים, אבל לא מערבולת המדגם. דגירה זה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. Centrifuge זה למשך 15 דקות ב g x 12,000-4 מעלות צלזיוס.
  9. הסר בזהירות את השלב העליון, ברור מימית עם micropipette טיפ (P1000 או P200) שיהוו השכבה העליונה, מבלי להפריע את לאטמוספרה או השכבה פנול אדום-כלורופורם. להעביר אותו צינור microcentrifuge.
  10. ערבב את זה עם אמצעי אחסון שווה של אתנול 100%; לערבב את זה באופן יסודי על-ידי היפוך הצינור 4 - 5 פעמים. הצינור יופיעו לעיתים קרובות מעונן.
  11. עם טיפ micropipette, להעביר את הנוזל לעמודה מבוסס-סיליקה ספין המסחרי, כדי לטהר עוד יותר, elute את הרנ א, בעקבות ההוראות של היצרן22. Elute את ה-RNA שנוצר מתוך ~ 50 מ"ג של רקמה לתוך µl 50-100 RNase ללא מים.
    הערה: בזמן החילוץ ריאגנט מבוסס-פנול מסיר DNA בשלב אורגני, עבור השימוש במורד הזרם של RNA לרביעיית-PCR ו/או יישומים רצפי RNA, טיפול נוספים של RNA דגימות עם DNase מומלץ.
  12. Aliquot הרנ א eluted כדי להפריד בין צינורות לשימוש הערכה כימות ואיכות, כדי להפחית כל ההקפאה-הפשרתו של המדגם RNA הראשי. העברת הצינורות-80 ° C עבור אחסון.
  13. במקרה של הצומת לימפה דגימות נגזר בעלי חיים נגועים עם גורמי מחלה נגיפית, במיוחד באותה רמת הבלימה BSL-3, לאמת את הדגימה RNA שנוצר על ההיעדרות של פתוגנים אם המדגם תועבר אל איזור לבלימה רמת אבטחה נמוכה יותר ניתוח איכות, RT-PCR, ו/או RNA-רצף ספריית הכנה.
    הערה: זה קריטי לשקול תקנות מקומיות, במקרה של ה-CDC (המרכז לבקרת מחלות ומניעתן) איון הנחיות לעבודה עם סוכנים בחר, זה הכרחי לאמת את כל ההליכים איון באתר המקומי של החוקר.
    1. הסר 1/10בתאנון נפח של כל מדגם ה-RNA eluted מהשלב 4.12 (קרי, µl 5 מ- µl 50 של RNA הכולל). באמצעות טכניקה סטרילי, מערבבים את הדגימה עם 100 µl התפתחות חיידקים מרק צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי. שימוש של מפזר פלסטיק סטרילית, ומשטחים את התערובת RNA-מרק על פני צלחת אגר.
      הערה: בחר ציר אגר וסוג צלחת עקבית עם הצמיחה של המחלה שבה לערער את החיות.
    2. דגירה של צלחת אגר בתנאים מסוימים לצמיחה של המחלה שבה לערער את החיות. בדוק היעדר חיידקים התאושש לפני הסרת הדגימות הכלילה BSL-3.
      הערה: RNA eluted, וכתוצאה מכך כימות, בדיקות של תקינות, מתאים ליישומים במורד הזרם, הכוללים רצפי RNA, ניתוח ה-RT-PCR.
  14. להעריך את ה-RNA שחזור ואת טוהר באמצעות ספקטרופוטומטרים. כדי להעריך את איכות ה-RNA, עומס 1-2 µl לדוגמה RNA eluted ספקטרופוטומטרים עבור ניתוח. שיא קשת של המדגם בטווח אולטרה סגול (UV).
    1. מ קשת UV, להקליט את היחס280 A /A260היחס230 א /A260, הערך260 A עבור המדגם (A = ספיגת).
    2. כמו ה-RNA חד-גדילי-ריכוז של 40 µg/mL יש של ספיגת של 1.0 ב-260 nm, לחשב את ריכוז ה-RNA (µg/mL) על-ידי הכפלת את A260 x 40 על הדגימות מטוהרים.
  15. כשיטה מהירה של הערכת תקינות RNA, כדי לא לכלול דוגמיות מפורק ניתוח נוסף, מערבבים 2 µl של כל מדגם ה-RNA עם 4 µl של 1.5 x formamide טעינה צבע [95% יונים formamide, 0.025% (w/v) bromophenol כחול, 0.025% (w/v) קסילן cyanol, 5 מ מ EDTA (pH 8.0), 0.025% (w/v) מרחביות] ב- 1.5 mL microcentrifuge צינורות23,24.
  16. חום הצינורות ב 70 ° C עבור 1 דקות, ולאחר מכן להעביר הצינורות לקרח במשך 1 דקה.
  17. לטעון את הדוגמאות כדי 1% agarose ג'ל המבושלות 1 x TBE (לקבלת תיאור מלא של בג'ל מקורי agarose עבור ה-RNA, ראה ריו, ארס ג'וניור, האנון ו נילסן –)24. להפריד את הדוגמאות על ידי תקן ג'ל אלקטרופורזה שיטות ואשר נוכחותם של להקות ribosomal RNA 28S ו- 18S.
  18. מעקב על אלקטרופורזה בג'ל עם שיטות ניתוח כמותי לקביעת תקינות RNA [למשל, ניתוח (RNA תקינות מספר) Bioanalyzer ורין] כמתואר נציג תוצאות וב -מילר, O. et al. 25 ושרדר, א. et al. 26.

5. שיטת החילוץ חלופית של פורמלין-קבוע, רקמות-מוטבע פרפין (FFPE)

הערה: למרות שימור רקמות FFPE אינו מייצג את השיטה החזקה ביותר של חומצת גרעין השימור, פרוטוקול שיובאו להלן ניתן דרך ללמוד כמה שינויים תעתיק. כאשר רקמות שהשתמרו אחרות אינן זמינות.

  1. הכן פורמלין ריאגנטים למען שימור הרקמה על ידי dispensing פורמלין לתוך מיכלי פלסטיק. רקמות צריך להישמר בפורמלין עם יחס של 20:1 פורמלין: רקמת נפח ומשקל, בהתאמה.
    התראה: פורמלין הוא חומר מסרטן ידוע אנושי, אמנם לא רעיל בחריפות, חשיפה כרונית (בדרך כלל באמצעות אדים נשאפים) יכול לייצג סיכון בריאותי משמעותי. אוורור נאות, עיקרון השוויון הפוליטי (כלומר, השימוש nitrile כפפות, להיות שונה בתוך 15 דקות לאחר החשיפה הראשונית) נדרשים כדי למזער את הסיכונים הבריאותיים. לעיין בתקן פורמלדהיד OSHA (29 CFR 1910.1048) לקבלת מידע נוסף על הערכת סיכונים ובקרה חשיפה.
    הערה: באמצעות פורמלין מעט מדי יכול להשפיע את היכולת של רקמת להיות נשמר באופן מלא בעת שקוע בתוך חומר משמר.
  2. לאחר הבידוד של הרקמה עניין, גזור בקפידה רקמות פחות מ 5 מ מ עובי.
    1. בזהירות באמצעות מלקחיים, להטביע את הרקמה החתוך לתוך פורמלין למזער כל מתיז.
      הערה: הרקמות צריך לגמרי מתחת לפני המים בפורמלין כדי לאפשר אובססיה מוחלטת. . זה קריטי כי כל המשטחים של הרקמה יהיו מכוסים לגמרי פורמלין
  3. ברגע הרקמות יש שהושרתה בפורמלין, מאפשרים הקיבעון רקמות להתרחש לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פורמלין חודר לרקמות לאט לאט, בקצב של 1 מ מ לשעה של משטחים כל27,28. לכן, שמירה על העובי של הסעיפים רקמות עד פחות מ 5 מ מ תוצאות אובססיה מהירה של הרקמה כולה.
  4. לאחר הקיבעון, העברת הרקמות ריאגנט המתאים להטבעת פרפין.
    הערה: לדוגמה, הרקמות שנבדקו כתב יד זה הועברו אתנול 70% לפני ההטמעה.
  5. להטביע את הרקמות לתוך פרפין. 29
  6. אזור הרקמה 10-80 מיקרומטר עובי (שימוש 10-20 מיקרומטר אם miRNA רצוי לחלץ)29.
  7. באמצעות אזמל ומלקחיים, הסר פיסת רקמה 40 מ ג כל מדגם יעובדו ולמקם אותו לתוך צינור סטרילי, נטולת נוקלאז microfuge.
  8. לנצל את ערכת מסחרי המיועד deparaffinization והשחזור חומצת גרעין של דגימות רקמה FFPE לחלץ הדוגמאות שהשתמרו RNA.
    הערה: הערכה שאוזכרו טבלה של חומרים מנצל קסילן, אתנול שוטף כדי להסיר פרפין, צעד טיפול פרוטאז ומסנן סיבי זכוכית לטהר את ה-RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש של השיקולים שהוצגו במאמר זה (שלבים 1-4 לפרוטוקול) יסייעו בשחזור של RNA מדגימות חיות גדולות מתאים ניתוח במורד הזרם במחקרים ביטוי גנים המארח. איכות ה-RNA ליישומים במורד הזרם מוערך על ידי אמצעים סטנדרטיים מרובים. עבור ספקטרופוטומטר, היחס280 A /A260מספק מדד לזיהום חלבון, היחס230 א /A260מספק אמצעי נוסף של טוהר, להערכת יזהה מזהמים כימיים כגון פנול. בכל מקרה, יחסי של ~ 2.0 הן ראיות של RNA באיכות גבוהה, ירד יחס הם עדות לזיהום. חשוב, יחסי אלה אינם מספקים מידע כלשהו על השפלה RNA, אשר יכול להיות מוערך איכותית (צעדים 4.15-4.17), באופן כמותי (שלב 4.18, כגון דרך RNA תקינות מספר או רין ניקוד).

חשוב שים לב רמת האיכות הצפויה של RNA התאוששה מקטעי רקמת הלימפה הוא, בממוצע, נמוכות יותר עבור RNA התאוששה דגימות של תא דם לבן. בסדרה מקיפה של RNA ושילוב רקמות שור וקווים תא, Fleige, Pfaffl30 למצוא כי הממוצע רין (RNA שלמות מספרים כפי שנמדדו על Bioanalyzer) משתנות בין < 5 על רקמת מעי צם ו של כרס מעלי גרה > 9 דם לבן התאים, גופיף צהוב, עם קשריות לימפה רין ציונים נופל באמצע-בממוצע 6.9. באופן כללי, Fleige ו- Pfaffl הערה30 כי רקמות מוצק לייצר רין הציונים הנע בין 6-8 וזה רקמות עם ריכוזים גבוהים יותר של רקמת חיבור התערוכה הפירוק הממוצע גבוה יותר. הצפיפות של רקמת חיבור הצומת לימפה, בנוסף לרמת מהותי RNases בסוג זה של רקמות, עשוי להיות אחראי על חוסר היכולת בעקביות לשחזר RNA עם רין ציונים > 9 של בלוטות הלימפה.

עם זאת, דוגמה של פרופיל Bioanalyzer הרנ א התאוששה ביזון supramammary לימפה באמצעות המתודולוגיה המוצגת כאן מוצג איור 4A, הממחיש את ההתאוששות של RNA עם ציון רין של 8.6 (בעיקר תקין ומתאים למעשה כל במורד יישומים). RNA שנוצר מתוך הליך זה שימש בהצלחה ליצור ספריות לשימוש ב- RNA-רצף; פרוטוקול זה מאפשר הבידוד הרגיל של RNA דגימות של ביזון ואת בלוטות הלימפה שור עם ערכים > 8 רין (ו לעיתים קרובות > 9). עבור ערכת דגימת שמונה דגימות RNA שחולץ, היחס ספיגת הממוצע ב 260 ננומטר/280 ננומטר 2.1 והיה ב 260 nm/230 ננומטר 2.1, המציין זיהום חלבון נמוכה וזיהום נמוכים עם כימיקלים כמו פנול, בהתאמה. ההתאוששות חומצת גרעין הממוצע בין כל החילוץ היה 97 µg ± 10 לכל ~ 100 מ ג או תשואה של ~ 1 µg רנ א/מ"ג של רקמת הלימפה.

Figure 4
איור 4 . נציג איכות עקבות המתארים RNA איכות של מתודולוגיות החילוץ. (א) סימן זה מראה RNA הכולל לוח באיכות גבוהה RNA שנוצר מתוך ביזון לימפה, באמצעות ההליך שהוצגו בכתב היד. (B) לוח זה מראה עקבות של שור FFPE-מדגם שנבחר מתוך טבלה 4, המתארים RNA המאוד מדולדלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

בשל האתגרים הקשורים עם הבידוד מהירה של רקמות מן הגוויות גדולים, במיוחד במקרה של דגימה של בעלי־החיים, השפעת משך ההשהיה בין המתת החסד, והנחת חתיכות רקמה שימור RNA הפתרון הוא דאגה פוטנציאליים בניתוח. המידע בספרות על היציבות של RNA ברקמות הצומת לימפה, בפרט, הוא מוגבל. לכן, כדי לספק מידע אודות פרמטרים מקובלים לאיסוף רקמות, התאפיינה את היציבות של RNA ביזון הצומת לימפה בהמתת פוסט.

עבור ניסוי זה, נחשב זמן 0 זמן שהחיה הוכרזה מתה על-ידי חוסר דופק ולאחר היעדרות של רפלקס המצמוץ. בעקבות העברת הגופה לבין תחילת necropsy, ~ 15 דקות שחלפו לפני לקיחת הדגימה הלימפה הראשונה (15-20 דקות היה סטנדרטי התצפיות שלנו עבור ההתאוששות של חיות השדה; זמן קורסים ישתנו בהתאם למיקום ). הצומת לימפה supramammary זוהה, קטע קטן של הרקמה הוסר ומתוחזק בטמפרטורת החדר. סעיפים היו שצולמו במרווחים של 15 דקות לאחר מכן, להעביר את הרנ א משמר; באמצע הקורס זמן, מדגם השני של הצומת לימפה אוחזרה החיה על הסט השני של 4 נקודות הזמן בסדרה (איור 5A; מעגלים סגורים, איור 5C). RNA שהופק במקביל מן החלקים הלימפה באמצעות השיטה המתוארת לעיל. זה h 1 ניסוי מגלה כי הצומת לימפה RNA נשמרים רוב שלמותו לאורך מסלול הזמן, עם רק קלה הפחתות של הציון רין בסוף מסלול הזמן (איור 5B ו ג 5). באופן דומה, RNA של שור prescapular, parotid בלוטות הלימפה נשמר את תקינותו כפי שהיא נמדדת התוצאה רין מעל ~ 1 h זמן קורסים פוסט-מורטם (איור 5C; החיה המידע מסופק בטבלה מס ' 2). בנוסף, RNA שהופק ממקטעים הצומת לימפה supramammary אסף 8 שעות לאחר המוות, מחזיק אזורים שלמים בתקשורת תרבות תא בטמפרטורת החדר או או ב 37 ° C כדי לדמות הפעם אחזקות של חיה ברוטב. Ribosomal RNA היה נצפות אפילו אחרי 8 שעות מחזיק פעמים (איור 5D).

Figure 5
איור 5 . RNA איכות בדגימות הלימפה בבית השחי הצומת בייסון שנאספו לאורך זמן קורסים לאחר המוות. (א) לוח זה מציג סקירה ניסיוני של הליך 1 h זמן הקורס. (B, C) לוחות אלה מראים בחינת איכות RNA עבור דגימות שנלקחו על פני מסלול הזמן 1 h מ supramammary לימפה מבודד של ביזון אמריקאי. ג'ל משקף RNA דגימות שפגע בסימני ב formamide ומופרדים על ג'ל denaturing 1%. לוח (C) מתארת את השינויים ברין ציונים עבור כל דגימה. נתוני ניסויים נוספים על שור prescapular, parotid בלוטות הלימפה הוא בשכבות כמצוין. (D) לוח זה מראה דוגמה של RNA ג'ל, כמתואר על הג'ל בשימוש בלוח (B), לדוגמאות הצומת לימפה supramammary מעובד לאחר 8 שעות של דגירה בטמפרטורת החדר או (ליין 1) או ב- 37 מעלות צלזיוס (ליין 2) בתקשורת התרבות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נציג ממצאים אלה הם עקביים עם תוצאות יציבות הרנ א בשביל לרקמות סוגים אחרים של מקורות. טבלה 3 מספקת סיכום של תוצאות מדגם של מאמרים שפורסמו חקרו את יציבות ה-RNA לאורך זמן השימור קדם קורסים. הערה רק מגמות רין ציונים ו/או rRNA ג'ל תצפית (סה כ RNA) כלולים בטבלה, למרות כמה ניירות מספק ניתוח נוסף של mRNA שלמות, כגון באמצעות קביעת יחס של 5' לעומת 3' מקטעים של RNAs שנבחרו (למשל, Fajardy. et al.) 31. עם זאת, חשוב לזכור כי פעמים יותר בין שימור מוות ודגימת עלולה לגרום לשינויים הפרופילים ביטוי RNA, כפי שמתואר, לדוגמה, בשביל לרקמות היפרדות31. לעומת תעתיקים יציב, RNAs יציבה יותר יכול להיות דלה. לכן, חשוב לנצל את זרימת עבודה מהירה, יעילה עבור התאוששות הרקמות במטרה לצמצם את העיכוב ברגע החיה זמין עבור necropsy, על מנת להשיג את פרופילי ה-RNA תקף ביותר מבחינה ביולוגית. זה יהיה טעות להניח כי הנוכחות של שלם ribosomal RNA מצביעה על העדר שינויים בפרופיל transcriptome. עדיין, התוצאות נציג מראים כי אפילו עם צורך פעמים עיבוד מוגברת לדיגום בעלי חיים גדולים, ניתן להכין RNA מתאים מפענוח ביטוי מדגימות הצומת לימפה.

בנוסף, נבדקה ההשפעה של המשתנה פעם פוסט-המפשיר; במהלך תקופה זו, ה-RNA היא חשופה השפלה מ nucleases נוכח הרקמה. האיכות של הדגימות RNA מעובד באמצעות פרוטוקול זה עם 0 או 64 דקות של להחזיק זמן בטמפרטורת החדר מפשיר שלאחר שלב 4.1 נמדדה על ידי ניקוד רין. הניסוי מדגים כי הפרוטוקול היא חסרת הזמן הפשרה, הפיכתה חזקים עיבוד הדגימות מרובים (איור 6A).

Figure 6
איור 6. ניתוח נוספים מהפרמטרים איכות RNA. (א) לוח זה מראה איכות ה-RNA תוצאות עבור RNA מטוהרים מיד לאחר מפשיר (0 דקות) או אחרי מחזיק 64 דקות בטמפרטורת החדר לפני העיבוד. העמודות מסמנות את הממוצע של 3 חתיכות רקמה עבור כל תנאי, ± סטיית התקן. לכל רקמות אוחסנו בפתרון משמרים RNA לפני מפשיר, כמפורט בפרוטוקול. (B) לוח זה מראה עקבות Bioanalyzer של מדגם מתוך פיסת הלימפה לקוי הומוגני המכילים חלקים גדולים של רקמת חיבור. גודל קטן של הפסגות 28S ו- 18S, לעומת הפסגות בטווח 5S, ניכרת. זה יכול גם להתרחש עקב מהשפלת הרנ א, אמנם הבסיס שטוחה יחסית בין הטווח 5S הפסגה 18S לחלופין רמיזות של מיצוי עניים; ראה אברהם, רבי. et al. 48 לפרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

גם נקודת השוואה את בידודה של RNA של בלוטות הלימפה, נערך החלמה הניסיון של RNA מפיסות מצע המעי העליון הלימפה בבית השחי הצומת FFPE מן הבקר. כמתואר לעיל, הדגימות היו קבוע במשך שבוע בפורמלין לפני פרפין הטבעה, ואחריו 4 חודשים של אחסון בפרפין בטמפרטורת החדר. הרקמות היו למחלקה למקטעים חמש 10 מיקרומטר, באמצעות ההליך החילוץ FFPE, נמצאה כ 62 ng/µL של RNA עבור דגימה (± 14 ng/µL). היחס ספיגת-260 ננומטר/280 ננומטר בממוצע 1.9, המציין מוצר עם רמות נמוכות של חלבון זיהום, למרות היחס230 א /A260היו שלילי (טבלה 4). שימו לב כי הציונים רין שנצפו עבור הדוגמיות הללו היו מאוד נמוכים (< 2), המציינת את הפירוק של המוצרים RNA (בטבלה 4; איור 4B), בקנה אחד עם התיאור של בני רוקח ואח. 45. במבחני ניצול qPCR, קטעים קטנים בדרך כלל של RNA, או ליתר דיוק cDNA (< 200 bp), הם מוגבר. לכן, ההגברה של מוצרים קטנים עדיין יכול להתרחש מדגימות מפורק, ניתן לבצע ניתוח qPCR. לדוגמה, ניתן להגביר את מקטע של החלבון ribosomal S9 (RPS9) היה תעתיק מדגימות אלו ששוחזרו FFPE על ידי qPCR. ערכי CT היו עקביים על-פני הדגימות לבין בממוצע 19.2 ± 1.8. זכור את המגבלות נוכחים כאשר ניצול הדגימות FFPE, מוכנים, עם זאת, כמו מוצרים גדולים אינם בהכרח נוכחים, ההשפלה לא אירעו בקצב אחיד בכל הדוגמאות. לכן, החומר הזה יכול לשמש עבור מחקרים עם אזהרות, אך מגבלות משמעותיות קיימים עבור כל היישומים במורד הזרם כמו ה-RNA-רצף.

הצומת לימפה סוג מיקום אורך רוחב אזורים סחוט על ידי צמתי
Prescapular רק המדיאלי המשותף הכתף; מוטבע השומן התת עורית, תחת שכבה של שריר 1-10 ס מ 1.5-2 ס מ עור הצוואר; הכתף; העור, השרירים, המפרקים של האיבר בית החזה התחתון (הפניה למעורר 8)
Prefemoral (פעולה הנקראת גם precrural) רק הגבי, המדיאלי כדי חנוק, כ 12-15 ס מ מעל עצם הפיקה 8-10 ס מ 2.5 ס מ העור של האיבר האגן, הבטן, חלקים סימטרית של בית החזה (הפניה למעורר 8)
Retropharyngeal נמצאו בהאמצע הגבי אל הלוע 4-5 ס מ 2-3.5 ס מ לשון, הקרומים הריריים של חלל הפה, חניכיים, שפתיים, בחך, בלוטות הרוק, רוב שרירי הצוואר
הפרוטיד מלון subcutaneously הגחוני / כדי המפרק, סימטרית כדי שריר המלעס (הפניה למעורר 8) 6-9 ס מ 2-3 ס מ העור, subcutis, רוב השרירים של הראש, שרירי העין והאוזן, העפעפיים, בלוטת הדמעות, חלק rostral של חלל האף
Submandibular (עשוי להיות מתנה 1-3) ממוקם subcutaneously על האספקט המדיאלי של זווית הלסת התחתונה, הקשורים עם בלוטות הרוק 3-4 ס מ 2-3 ס מ הלוע, השפתיים, הלחיים, בחך, חלק rostral של חלל האף, קצה הלשון, העור והשרירים של הראש (הפניה למעורר 8)
Supramammary (נקבה שטחית המפשעתית, בדרך כלל 2 הנוכחי) מצא את הקליפה, dorsally ביחס בלוטות החלב 6-10 ס מ עטין, הפות, פרוזדור של הנרתיק, העור על ההיבט סימטרית המדיאלי של הירך, השטח המדיאלי של הרגל
האשכים (זכר הגירסה של שטחי במפשעה) נמצאו מתחת הגיד prepublic בתוך שכבת שומן סביב צווארה של שק האשכים 3-6 ס מ שק האשכים, עורלה, פין

טבלה 1. סקירה של שור הלימפה שטחית.

תיאור בעלי חיים מיקום בכתב היד גיל סקס מצב תקינות
נוהלים ביזון ביזון ביזון בווידאו - שחזור הצומת לימפה 5-6 יו נקבה בריא
נוהלים פרות, המטופחות שור בווידאו - שחזור הצומת לימפה 7-8 יו זכר מסורס בריא
ביזון ביזון למחקר יציבות הרנ א איור 5A-C 5-6 יו נקבה בריא
פרות, המטופחות א למחקר יציבות הרנ א 5C איור, איור 6A 7-8 יו זכר מסורס בריא
פרות, המטופחות B למחקר יציבות הרנ א איור 5C 7-8 יו זכר מסורס בריא
פרות, המטופחות למחקר איכותי FFPE טבלה 4, איור 4B 0.5 יו זכר מסורס תקין (פקד ממחקר זיהום O157:H7)
שימו לב כי המתודולוגיה שימש על מרובים נוספים בקר, ביזון, ודוגמאות עז הצומת לימפה, מעבר לאלה המודגשים כאן.
בנוסף, השתמשנו המתודולוגיה אותו על הצומת לימפה שנאסף מו בן 1.5 עגל הנשי.

בטבלה 2. המאפיינים של בעלי החיים שבהם משתמשים במחקרים טייס.

סוג הרקמה שיטת שימור מחזיק תנאים מסקנה השפלה הפניה
אדיפוז, השלד שריר, כבד הצמד קפוא (נוזלי N2) 4 ° C, ואקום הארוזים רקמות שריר RNA יציב יותר (אפילו 8 ימים של אחסון); השומן והכבד בעיקר יציבה עד ה 24 כפי מוערך על ידי הופעתו של rRNA להקות בכר et al. (2007)32
האדם המעי הגס, סרטן המעי הגס תמיסת השימור RNA . הנה. רין לשימור עבור ה 2, אך תת-קבוצה של גנים להציג שינויים בביטוי מ 0.5-2 h. Yamagishi et al. (2014)33
העכבר הכבד, הטחול תמיסת השימור RNA, או הצמד קפוא (slurry קרח יבש) בתוך הגופה העכבר (37 ° C) הטחול הדגימות היו יציבים החוצה כדי 1.5 שעות; דגימות הכבד בתערוכות קודמות השפלה (24% רין-105 דקות. הדירי) צ'וי et al. (2016)34
העכבר הכבד אף אחד (Homogenized טריים ב- guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם) 25 ° C, 37 ° C השפלה מוגבל החוצה כדי 4 h. ב- 25 ° C, אבל השפלה נרחב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 h (כפי שנמדדו באמצעות רין ציונים). אלמידה et al. (2004)35
מעי אנושיים תמיסת השימור RNA, או הצמד קפוא 4 ° C, 37 ° C בדרך כלל יציבה ב ה 1.5-37 מעלות צלזיוס; החוצה יציב כדי 6-אייץ ב 4 ° C (כפי שנמדדו באמצעות רין ציונים).  שימו לב כי המחברים גם מספקים סיכום של משאבים נבחרים יציבות הרנ א ב S1 השולחן יכול לשמש הפניה נוספים לאלו מעוניינים בהמשך סקירה של הרקמה RNA שלמות ספרות. לי et al. (2015)36
כבד אנושי הצמד קפוא (נוזלי N2 או איזופנטאן) . הנה. השפלה ב ח' 1 (עד 0.85 ΔRIN); השפלה יותר דגימות קטנות של כבד מאשר בדגימות גדול יותר. Kap et al. (2015)37
סרטן המעי הגס האנושי הצמד קפוא (נוזלי N2 איזופנטאן) 4 ° C השפלה שנצפה על ידי 1 h.; ציון רין 4.2 רק לאחר 90 דקות של עיכוב עוצר את הזמן הונג et al. (2010)38
כבד אנושי תמיסת השימור RNA, גם פלאש קפוא (נוזל N2) חדר temp, 4 ° C הדגימות היו יציבים אפילו מתוך 1 ד על הקרח; השפלה נצפתה לאחר 1 ד אווריריות. (אבל לא אחרי 3 ח'; כפי שנמדדו באמצעות ציונים רין) לי et al. (2013)39
הסוס אדיפוז, השלד שריר הצמד קפוא (נוזלי N2) 13 ° C המחברים ממליצים שלמות הטוב הזה שריר היה בתוך 2 h.; שימור אדיפוז בתוך ה 0.5 המומלץ על ידי מחברים (כפי שנצפה על ידי מראה ג'ל rRNA) מוריסון et al. (2014)40
סלמון במוח, בכליות, בכבד, שרירים תמיסת השימור RNA . הנה. המוח RNA יציבה ל 4-8 ח', כליות, שריר exhbiit קצת השפלה מאת 8 h (ג'ל, רין הציון בשני בשימוש) Seear & סוויני (2008)41
רקמת חיבור הארנב (רצועה, גיד, סחוס) הצמד קפוא (נוזלי N2) 4 ° C, חדר temp. אין השפלה "עבירה" החוצה כדי לאחר המוות, כפי שנצפה על ידי מראה ג'ל rRNA 96 ה Marchuk et al. (1998)42
מוח עכברוש, הריאות, הלב, הכבד מופיעה כדי לחלץ טריים בתוך הגופה עכברוש שנערך חממה 20 ° C יציבות הרנ א הגבוהה שנצפתה המוח (אפשר היה להבחין להקות rRNA החוצה עד 7 ימים לאחר המוות, למרות ההשפלה היה נוכח), יציבות בינונית הריאות והלב, יציבות נמוכה בכבד; כפי שנצפה על ידי rRNA ג'ל המראה ינו et al. (2002)43
שקדים אנושי, קולון עם או בלי תמיסת השימור RNA, ואז snap-קפוא . הנה. (22 מעלות צלזיוס), תמיסת השימור 4 ° C RNA, תמיסת מלח קרים או קרח (0 ° C) יציבה עד ה 16 על הקרח או תמיסת השימור RNA; השפלה קטנה ברמת ה 6 או 16 בתוך תמיסת מלח קרים או RT (נמדד על ידי רין ציונים) מיקה et al. (2006)44

בטבלה 3. מדגם של ממצאים קודמים על יציבות הרנ א פוסט-מורטם דגימות רקמה. הערכים מייצגים כתבי יד שנבחרו מן הספרות על יציבות הרנ א, עם מגוון של סוגי רקמות ייצג, כולל מאתר, ביופסיה אנושי, ודוגמאות וטרינרי. שיטות שימור המצב של מיצוי מראש אחסון, סיכום קצר של התוצאות הינם מסופקים עבור כל דוגמה. אלא אם צוין אחרת, הדגימות היו מאוחסנים על התנאים ועד 37 ° C, ואחריו snap הקפאה או עירוי עם תמיסת השימור RNA, כמובן שלאחר זמן קרח (במילים אחרות, יציבות לא להיות נמדדה בנוכחות RNA תמיסת השימור במהלך הדגירה, אלא אם כן צוין).

זיהוי הדגימה 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
/A260280 1.96 1.98 1.98 1.91 1.98 1.89 1.89 1.91 1.9 1.84 1.84 1.97
/A260230 0.67 0.14 0.19 0.26 0.61 0.69 1.33 0.11 0.21 0.39 0.1 0.44
רין  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

בטבלה 4. נציג נובעת RNA מבודד שור FFPE בלוטות לימפה mesenteric. הטבלה מתארת את התוצאות של spectrophotometric ומעובדים באיכות ניתוחים מתוך סדרה של דגימות שור הלימפה בבית השחי הצומת FFPE באמצעות השיטה המתוארת בכתב היד. בכל מקרה, התוצאות משקפות RNA מאוד מפורק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרוב המכריע של מחקרים transcriptomic והפרוטוקולים המשויכים מתמקדים עכבר, חולדה או פוסט-מורטם דגימות אנושי. עם זאת, חקירות חיות המשק וחיות מספקים מגוון רחב של הזדמנויות עבור האפיון של התגובה החיסונית מחלה, הן לפי הצורך רפואה וטרינרית ו, לגבי מחלות שפוגעות, לבריאות הציבור האדם. פרוטוקול זה סיפק מיתאר של שיקולים מרכזיים לחילוץ RNA גבוהה-שלמות רקמות של חיות גדולות, כגון בקר, ביזון, עזים, כבשים. הגודל של בעלי החיים, כמו גם התנאים של אוסף דגימה, להפוך ההתאוששות תהליך מקיף יותר, עם זמן פוסט-מורטם עיבוד ארוך יותר מאשר להתאוששות הצומת לימפה העכבר. באופן דומה, גודלו של בלוטות הלימפה אלה מחייבת פרוטוקולים להתאושש מדגמים מקבילים בעלי חיים שונים, כמו גם דגימות מייצגות השינויים אימונולוגי פתולוגיים בתוך הצומת לימפה. ההצעות לאיסוף הדגימה של פרוטוקול זה מספקים ההתאוששות של RNA תקין גם לגבי פרופילים ייצוגית המבוססת על חלוקתה של הצומת לימפה.

בתור הדגמה על החשיבות של הדגימה מתוקננת אסטרטגיה פרוטוקול, כפי שהוצג כאן, אנו שנסקרו 25 מסמכים ממסד הנתונים של מרכז PubMed שאפיינו את transcriptomes של משק-החי הלימפה. נייר אחד המצוין של העיבוד של מקטע הלימפה גדול בבת אחת, אחת דנו לייזר ספציפיות לכידת microdissection שיטות, אחד הזכיר כי "מדגם מייצג" נאסף מן הצומת לימפה, ונייר אחד בלבד46 הצביעו היצירה של הצומת לימפה שנאספו (10 מ מ3 בגודל) כולל אזורים בקליפת המוח והן לשד. בעוד שעיתונים. אחרים ציינו כי דגימות קטן (בדרך כלל 30-100 מ"ג) עובדו לניתוח RNA, 84% של העיתונים לא הזכיר אסטרטגיה דגימה עבור אוסף היצירות רקמות. כמו רצפי RNA הוא עדיין יקר יחסית, הניתוח של מספר מקטעים לכל הצומת לימפה סביר להיות להתקיים מבחינה פיננסית ברוב המקרים, במיוחד משום שכפל דגימות ביולוגיות הן בדרך כלל עדיפות לשם ניתוח סטטיסטי. על ידי איסוף דגימה על פני פלח לימפה sagittally המחולקת למקטעים, RNA מאזורים הצומת לימפה, עשיר בסוגים שונים של תאים חיסוניים נלכד כל הדגימות. פרוטוקול זה יכול, לפיכך, לשמש כנקודת התייחסות אסטרטגיה מתועדת, לשחזור דיגום בלוטת לימפה transcriptomics.

בהכנה של RNA רקמות, ישנם מספר השלבים המפתח לקבלת החלטות פרוצדוראליות. ראשית, הספרות מתודולוגי מעורב מבחינת השימוש של שימור פתרונות לעומת השימוש של רקמות קפואה (ודוגמאות טחינת בטמפרטורות קרות עוקבות). במיוחד במקרה של necropsies בעלי חיים גדולים, ישנם יתרונות פרוצדורלי פוטנציאליים רבים לשימוש של פתרון שימור, שולבו פרוטוקול זה. ראשית, ניתן לאחסן דגימות רקמה במהלך necropsy בתמיסה שימור ללא צורך להעביר מיד את הצינורות חנקן נוזלי. שנית, השימוש של שימור פתרון מספק הגנה נוספת לפני עיבוד הדגימה לחילוץ RNA, במיוחד אם המדגם חלקית או בקצרה מפשירה לפני המגון. התוצאות ב- 6A איור מציינים כי זה השפעה מגנה משתרע על רקמת הלימפה. לעומת זאת, דגימות קפואה חייב להישמר במצב קפוא עד רגע המגון במאגר המכיל פנול לבסוף, עבור שדה necropsies של חיות גדולות, איפה חנקן נוזלי אינו זמין, דגימות יכול להיות מאוחסן תמיסת השימור עד שהם ניתן להחזיר למעבדה.

יתרונות נוספים של רכיבי מולקולרית של הפרוצדורה המוצגת כאן כוללים את הימצאותם של פנול במהלך עיבוד הרקמה הראשונית, שבה מגישים כמו חיטוי במהלך תהליך המגון עבור דגימות ביצירת תרסיס נגוע חיות, ושימוש של התהליך עמודה ספין כדי להסיר שאריות פנול guanidine isothiocyanate מן המדגם. התוצאות נציג להדגים כי ההליך יוצר RNA באיכות גבוהה כפי לאומדן /A260280 ואת יחסי230 /A של260, ג'ל אלקטרופורזה, ותוצאות רין, היא חזקה אל מול הזמן קורס אתגרים של חיות משק החי והצומח הדגימה. הזיווג של שימור רקמות (למשל, ב- RNALater), המגון מבוסס-פנול ריאגנטים (למשל, TRIzol), סיליקה עמודות טיהור יש בהצלחה נעזרו בספרות על פרופיל ביטוי גנטי דפוסים ovine abomasal בלוטות לימפה נגועים עם מערכת העיכול נמטודות46 , בבלוטות הלימפה בקר נגוע ההרפס47, עם ציונים רין גדול מ- 8 וגדול מ- 7 בכל הדוגמאות, בהתאמה.

במקרה RNA שנוצר עם ציונים לא מקובל רין לניתוח במורד הזרם, וצריך להעריך את המשתנים הבאים, אשר הינם סטנדרטיים עבור עיבוד RNA,: הפוסט-מורטם את זמן העיבוד הכולל, התנאי של הרקמות, עיבוד/העיכוב פוסט להפשיר, הטכניקה במהלך החילוץ RNA, החילוץ שלאחר טיפול ה-RNA. וצריך להעריך את הסכום הכולל עיבוד זמן פוסט-מורטם במיוחד במקרה של הרקמות התאוששו חיות נמצא מת, לעומת חיות לאללה. כמתואר לעיל, RNA יציב יחסית בבלוטות הלימפה, אך עיכובים ממושכים בעיבוד יכול להוביל השפלה, במיוחד עבור תעתיקים לא יציב. משתנה הזמן מבלבלים יכול להיות נוכח אם הדגימות משווים בין הגוויות נשארו בשטח עבור סכומים שונים של זמן. התנאי של הרקמות וצריך להעריך, כי ההשפלה של רקמות תקינות, עקב שינויים פיפטות המשויך זיהום, עשויה להפחית את יציבות ה-RNA. לדוגמה, איכות נמוכה של RNA נצפתה את placentome של Brucella-נגוע חיות שלאחר ההפלה (Boggiatto. et al., נאספו). ההפשרה שלאחר עיבוד/השהיה חמאני השימוש של פתרונות שימור, כפי שמתואר פרוטוקול זה. להיות בטוחים כי העובי של החלקים הרקמה הוא נמוך מספיק כדי לאפשר חדירה נכונה ומהירה של הפתרון שימור לתוך הרקמה (< 5 מ מ עובי באמצעות את משמר הזכיר את הטבלה של חומרים). במהלך החילוץ RNA, המאגרים צריך להיות נטול RNase, קשר עם כפפות ושאר החפצים הנגועים (RNases נמצאים על העור) יש להמנע ממנו. שיוף של רקמת לימפה, המקור הגדול ביותר של RNases פוטנציאלי יהיה בתוך הרקמה עצמה, אבל זה מועיל להפחתת חדירת מזהמים בכל שלבי ההליך. כדי לטפל החילוץ שלאחר ה-RNA, כמפורט בפרוטוקול, aliquot הרנ א דוגם לתוך צינורות לפני ההקפאה של אחסון ב- 80 ° C, כדי למנוע את הצורך ההקפאה-להפשיר הדגימות עבור ניתוח איכות וכמות.

נמוך התשואות בשגרה, בנוסף הנובע ההשפלה של דגימות ה-RNA, יכול לנבוע המגון לא יעיל רקמת לימפה בשלב 4.3 בפרוטוקול. שימו לב כי הדגירה בפתרון שימור RNA יכול לשנות את המרקם של הרקמה (עלייה מוצקות), למרות שרוב רקמות לימפה הפומבית ביעילות ב פועל פיילוט עם הגדול מצוי הרוטור-בפיתולי גלגל מכון dissociator המתוארים כאן. כאמור בשלב 4.3.1, המגון ב מבוסס-פנול ריאגנט צריך להיות חוזר על עצמו אם הדיסוציאציה אינו שלם. חומרי מליטה-איחדו שחיקה, ואחריו resuspension של דגימת קרקע בריאגנט מבוסס-פנול, הוא חלופה נוספת עבור מעבדות ללא גישה מהמגן עם מפרטים אלה. עם זאת, המגון צינורות חד פעמיות מציג מספר יתרונות פוטנציאליים חריקת רקמות קפוא ובוכנה, כולל יותר ריאלי, קצר יותר זרימת עבודה עבור עיבוד דגימות מרובים, היעדרות של אובדן לדוגמה בעת טחינת , אין ניקוי, שום קשר פוטנציאלי עם דגימות מופעל, במקרה של רקמות חיות נגועות.

אברהם. et al. 48 לתאר כי לשיא RNA 5S גדולים במוצר ה-RNA הסופי, יחד עם החלמה נמוכים של RNAs ribosomal 28S ו- 18S, יכול להיות סימן פירוק לא שלם של התאים (אשר בתורו, לעיבוד הצומת לימפה, יכול להיות כתוצאה דיסוציאציה לא שלם של tiss מורה). איור 6B מספק דוגמה של פרופיל של RNA שנוצר מחתיכת שור parotid בלוטת לימפה היתה גבוהה מאוד בתוך רקמת החיבור, לא homogenize בצורה יעילה. התשואות RNA צריך להיות מחושב ופיקחו מדגמים בערכת לניתוח לאשר כי ושחזורים דומה מתקבלים לכל מ"ג של רקמות, דוגמיות להשוואה ישירה על ידי RNA-רצף תעובד אצווה, באמצעות המגון אותו אסטרטגיה עבור כל הדגימות. שימו לב כי הגישה טריז הדגימה גם מסייע הימנעות אוסף של מדגם זה אך ורק באזור של רקמת חיבור מקיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף. כל מחקר ממומן בכספים מגזר של החקלאות האמריקאי, שירות המחקר החקלאי. כל ההפניות מוצרים ספציפיים הינם מסופקים לצורך הפארמצבטית ניסיוני, לא מייצגות שום חסות של מוצרים אלה על ידי הממשל הפדרלי.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות פוסי ג'יימס על עבודתו מעולה על כל צילום וידאו ועיבוד וידאו; מייקל מרטי עבור עבודתו מעולה דור של בקר דיגיטלי תמונות; ליליה וולתר עזרה עם החילוץ-RNA ו- Bioanalyzer פועל; מיטש פאלמר, קארלי Kanipe סקירה מועילה, משוב על הצומת לימפה תמונות; טיפול בבעלי חיים ואת צוות וטרינרי המרכז הלאומי למחלות בעלי חיים על כל העבודה הקשה שלהם, סיוע עם גידול בעלי חיים והכנה necropsies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459 (2015).
  2. Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
  3. Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
  4. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  5. Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
  6. Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
  7. Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
  8. Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
  9. Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
  10. Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
  11. Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
  12. Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
  13. Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
  14. Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
  15. Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
  16. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  18. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
  19. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
  20. TRIzol Reagent Manual. , ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
  21. Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
  22. PureLink RNA Mini Kit Protocol . , Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
  23. RNA Gel-loading Buffer. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
  24. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  25. Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
  26. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  27. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. China. (2012).
  28. Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
  29. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  30. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
  31. Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
  32. Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
  33. Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
  34. Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391 (2016).
  35. Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
  36. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214 (2015).
  37. Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
  38. Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
  39. Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
  40. Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810 (2014).
  41. Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
  42. Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
  43. Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
  44. Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
  45. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  46. Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823 (2015).
  47. Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
  48. Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 135 RNA הצומת לימפה בקר ביזון transcriptome איכות RNA משק-החי
איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M.,… More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter