Summary
이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.
Abstract
큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 대 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.
Introduction
림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상3.
실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RNA 그대로 RNA 생물학 관련 transcriptomic 데이터의 생성을 위해 필수적 이다. 조직 샘플에서 높은-품질 RNA의 생성은 특히 큰 동물 병원 체 연구에 대 한 중요 한 실시 제약 시설에서. 이러한 연구는 본질적으로 더 그들은 뿐만 아니라 시설 승인 및 고도로 훈련 직원 필요 하지만 상당한 금융 비용을 작업에 따라 수백 수천 달러의 수만에서 배열할 수 있다 수행를 수행 하기 어렵다. 이러한 유형의 연구는 또한 크로스-징계 협업 및 그들의 복잡성을 추가 하는 그들의 완성에 대 한 크로스-징계 지식을 포함 한다. 따라서,에 대 한 교육, 개발, 샘플 수집 및 보존에 대 한 효율적인된 시스템을 준수 하는 이득을 제공 한다 중요 한 조직의 다운스트림 분자 연구에 대 한 감염 된 동물에서.
큰 림프 노드의 컬렉션 murine 림프절의 유사한 샘플링에 비해 조직 컬렉션에 대 한 추가적인 도전을 선물 한다. 샘플 절단에 대 한 준비 관련 내부 구조를 포함 한 림프절의 해부학에 대 한 기본적인 이해를 필요로 합니다. 림프 노드의 구조는 림프 lobules sinuses 림프로 가득 둘러싸인 구성 됩니다. 이러한 구조는 거친, 섬유질 캡슐 포함. 4 림프 lobule "기본 해 부와 기능적인 단위 림프 노드의" 이며 낭, 깊은 외피 단위 및 골 수 코드와 sinuses4 (그림 1A)로 구성 됩니다. B와 T 세포는 각각 낭과 깊은 외피 단위에 가정. 이러한 구조 3D 비 계를 제공 하 고 있는 림프 톨 항 원 또는 항 원 제시 세포 사이 상호 작용 촉진.
조잡 한, 낭과 깊은 대뇌 피 질의 단위 확인할 수 있습니다 잘라 표면에 그들은 빽으로 채널을 포함 하 고 보다 더 섬세 한 망상 채널의 구성 되어 나타나고 라이터는 sinuses 표시 (그림 1B). 규칙에 따라 병리학 표면 피 질 (낭), paracortex (깊은 외피 단위)와 골 수 (골 수 코드와 sinuses) 림프절의 영역을 참조 하십시오. 모든 3 개의 영역의 적절 한 시험 간주 되었습니다 최고로 림프절5에 대 한 일상적인 병 적인 시험 지침에 연습. 참고 일관성, 크기, 및 단일 동물 내 에서도 림프절의 색상에 상당한 변이가 있다. 동물 나이, 그들의 림프절 크기 감소와 젊은 동물의 그들 보다는 더 확고 한 되, 일반적으로 그들의 결합 조직 및 림프 정상의 감소에서 증가로 인해6,7을 구조 하는 경향이 됩니다.
그림 1. 림프절의 해부학. (A)이 만화 이미지 표시, 림프절의 해부학 키 구조를 묘사. (B)이 여전히이 이미지 횡단면으로 잘라 소 림프 노드를 보여 줍니다. 육안으로 볼 수 있습니다 관련 구조/레이어 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
실험적인 질문에 따라 다른 림프절 수집 및 분석에 대 한 관심이 될 것입니다. 주변 림프절은 피하 조직에 깊이 있는. 가축, 주변 또는 표면 림프절 임상 및 실험 연습에서 자주 사용 한다 포함 귀 밑, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural)와 표면 사 타 구니 (supramammary 여성, 남성에서 음 낭에서) ( 그림 2)입니다. 표 1주요 표면 림프절의 속성 가축 시스템8에 설명 된 대로 설명 되어 있습니다. 아래 소의 세균성 전염병에 대 한 몇 가지 잠재적인 림프 노드 컬렉션 계획 조사에 대 한 시작 지점으로 제공 됩니다.
세라 abortus/세라 melitensis: 표준을 B. abortus위한 necropsies-가축 및 B. melitensis감염-감염 된 염소 국립 동물 질병 센터에서 supramammary, prescapular, 및 선 림프절 조직 복구 모두 호스트 RNA 식 프로 파일링에 대 한 RNA 준비를 위한 세균성 열거형에 대 한 분쇄. B. abortus 정기적으로 실험적으로 감염 된 가축9. 에 이러한 림프절의 각 재기 될 수 있다 B. melitensis에 이러한 림프 노드 형식 각각에 있는 박테리아의 존재를 검출 될 수 있다-우리의 연구 (Boggiatto 그 외 여러분, 미 출판)에서 RNA 기반 방법론을 사용 하 여 감염 된 후 적어도 9 개월까지 염소를 감염. 살 모 넬 라 sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), 그리고 mesenteric 림프절 살 모 넬 라 보급10,,1112 에 대 한 가축 시체를 프로 파일링 하는 동안 유용 하 게 되었습니다, transcriptomic 연구에 대 한 잠재적인 관심의 것입니다. E. 콜라이 O157:H7: (중간 소장 원심 소장 위치에서) Mesenteric 림프절 박테리아 감염 된 송아지 (에 감염 된 성인 가축)13의 가끔 회복의 사이트 수 있습니다. 렙 (Leptospira sp.): 박테리아의 만성 지 속성 유선14배출 림프절에서 관찰 되었습니다. 진 균 bovis : 가축, 박테리아 종 아리15의 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절에서 복구 된 후 실험 감염 되었습니다. 또한, 림프절 RNA 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스2등 큰 동물 호스트 응답을 검사 하 이용 되어 있다. 그림 2 는 가축 시체에서 이러한 주요 림프절의 하위 집합의 위치를 보여 줍니다.
그림 2: 선택 된 림프 노드 위치를 묘사 하는 만화 보스 토 러 스 . 번호가 매겨진된 림프절은 주석 처리 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 문서와 관련 된 비디오, 선물이 큰 동물 감염의 transcriptomic 연구에 관련 된 분자 생물학에 대 한 유익 하도록 설계 된 RNA 연구에 대 한 큰 동물 림프절의 격리에 대 한 프로토콜. 먼저, 우리 제공 격리 절차의 개요, 림프절에 대 한 예제로 소과 들소 조직에서 샘플링을 사용 하 여. 와 결합 하 여이 데모 비디오에 표시 된 대로, RNA 격리에 대 한 재현 조직 샘플링에 대 한 워크플로우가 이다. 다음, 우리는 감염 된 림프절, 안전, 일관성, 그리고 RNA 품질에 초점을 맞춘의 처리에 대 한 중요 한 고려 사항을 설명합니다.
산성화 페 놀 guanidine isothiocyanate 시와 조직에서 RNA의 준비 Chomczynski 및 Sacchi16,17, 실리 카 기반 스핀 열의 존재에 대해 정화의 원래 방법에 따라 Vogelstein 길18의 원래의 작품에 따라 chaotropic 대리인. 우리는 또한 transcriptomics에 대 한 대체 방법으로 보존 하는 가축 림프절에서 RNA의 복구에 대 한 가능성을 검사 합니다. 마지막으로, 우리는 안락사와 들소에서 복구 된 RNA 프로 파일에 샘플링 사이의 시간 증가의 효과 묘사 하는 대표적인 실험을 포함 하 여 큰 동물 necropsies에서 RNA 품질에 시간 변수의 영향을 탐구 하 고 소 림프 노드입니다. 이 문서 뿐만 아니라 분자 생물학 하지만 transcriptomic 연구를 개시 하는 또한 하 수의 연구자에 유용할 것 이다.
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Protocol
여기에 묘사 된 동물 검 시 절차 국립 동물 질병 센터, Ames, 아이오와에 승인된 IACUC 프로토콜 적용 모든 실험 동물 보호 및 복지에 대 한 승인 된 지침에 따라 실시 했다.
1. 미리 검 시 전에 계획
- 전에 검 시 검 시 스위트 전송에 대 한 다음 자료 준비:
- 1.5 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 가득 ~ 1.0 mL 랙 또는 수송 컨테이너에 RNA 보존 솔루션의. 조직의 볼륨을 보존 솔루션의 볼륨의 비율에 대 한 제조업체의 지침에 따라 해야 합니다.
- 일회용 scalpels와 깨끗 한, 압력가 마로 소독 집게: 피부와 림프절 (한 동물 당 각 림프절), 수집 하기 위한 다른 세트를 해 부에 대 한 설정 하나 피부와 림프 노드 환경 식물의 교차 오염을 방지 조직입니다.
- 3 m m 사용된 scalpels와 생 검 도구 및 절단 보드와 sharps 컨테이너 또는 림프절 절 개에 사용 하기 위해 일회용 쟁반 생 검 도구, 검 시 칼을 펀치.
- PPE는 시스템에 대 한 적절 한 BSL 수준 작업에 필요한을 포함 한 개인 보호 장비를 사용 합니다.
- 압력솥 재사용 가능한 금속 도구, 설정 기구/드라이 제품을 사용 하 여 검 시 전에 금속 팬에 집게를 포함 하 여.
2. 식별 및 가축과 들소에서 림프절의 샘플링
그림 3 . 소 머리와 목의 림프절. (A)이 만화 이미지 쇼 선택한 림프 노드 머리와 보스 토 러 스의 목의. (B)이이 이미지는 단면 (오른쪽)에 단면 (왼쪽)에 비해 선 침 샘에에서 선 림프 노드를 보여 줍니다. 두 조직 종류 텍스처 차이 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
-
가축과 들소 prescapular 림프절의 절연
- 현지 IACUC 프로토콜에 따라 동물 (가축 또는 모든 나이의 실험에 대 한 적절 한 들소) 안락사 특히 심장 박동, 호흡, 부족 부족과 각 막 반사의 부재를 포함 하 여 기관 IACUC 프로토콜에서 설명 하는 방법으로 죽음을 확인 합니다. 검 시 바닥에 동물을 이동 합니다.
참고: 큰 동물의 실험실 연습에 사용 하는 자비 롭 안락사의 다양 한 방법이 있습니다. 그러나, pentobarbital 나트륨과 phenytoin 나트륨 솔루션의 정 맥 행정은 가장 일반적으로 승인 하 고 활용 하는 형태. 동물의 안락사에 AVMA 지침을 문의 하십시오. 19
주의: 펑크-증거 컨테이너와 재사용 가능한 금속 칼 및 집게 정화 sharps의 안전한 처리에 대 한 지침을 포함 하 여 호스트 기관에 검 시에 대 한 모든 관련 biosafety 프로토콜을 따르십시오. 이 프로토콜은 일회용 scalpels의 사용에서 sharps 낭비를 생성합니다. 부츠, 작업복, 장갑, 눈 보호를 포함 하 여 기관 지침에 의해 규정 개인 보호 장비를 착용 하십시오. - 3 참가자는 동물의 조직에서 작동을 식별 합니다.
참고: 여기, 것 1 것입니다 수는 대규모 담당 단면 원하는 동물의 조직의 것 2 다른 동물 섹션에서 림프절을 복구할 것 이다, 것 3 각 림프절에서 섹션을 별도 테이블에 작동 하 고 방부 제 솔루션 튜브에 그들을 전송. - 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다.
- 어깨 무릎 (손목);의 수준에서 앞 다리를 다시 이동 하 여 확장 이 모션 다시 어깨를가지고 하 고는 림프절의 쉽게 촉진에 대 한 허용 합니다. 림프 노드 "덩어리"의 존재에 대 한 느낌.
참고: 질병 상태, lymphadenopathy 존재할 수 있습니다, 쉽게 림프절의 식별, 하지만이 과정 또한 영향을 미칠 수 일관성, 구성, 및 림프 노드 아키텍처. - 일단, 그리고 여전히 확장 어깨, 어깨의 윤곽선을 따라 피부 절 개를 만들기 위해 메스 또는 검 시 칼을 사용 합니다.
참고: 림프 노드 위치 를 통해 촉진 되었습니다 경우에 절 개의 크기를 제한 하지 않습니다. 더 큰 절 개 깊은 조직에 쉽게 액세스를 제공 하 고 쉽게는 림프절의 절제는 것. - 집게의 쌍을 사용 하 여, 어깨의 포인트를 공개와 목 근육을 피부 철회.
참고: prescapular 림프 노드는 overconditioned 동물에 (서) 특히 피하 지방에서 자주 발견 된다. - (그림 3A) 림프절의 위치를 다시 한번 만져.
참고: 달리 피하 지방, 림프 노드 모양을 palpated 때를 개최 한다. 또한, 그들은 얇은 섬유 캡슐을 둘러싸인으로 림프절 어떤 주변 조직으로 인접 하지 않습니다. - Prescapular 림프 노드를 찾는 후 신중 하 게 피하 지방, 메스와 집게를 사용 하 여 밖으로 해 부하 고 림프 노드를 분리.
- 같이 그림 1B, 림프절 및 지방 조직; 사이 구별 하는 얇은 섬유질 캡슐의 존재에 대 한 보고 림프절은 어떤 주변 조직으로 연속.
- 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 림프 노드를 전송.
참고: bison에 이러한 림프절의 모양이 비슷합니다. 관련된 비디오는 아메리카 들소의 오른쪽 어깨에서 해 부로 prescapular 림프절의 모양을 보여 줍니다.
- 현지 IACUC 프로토콜에 따라 동물 (가축 또는 모든 나이의 실험에 대 한 적절 한 들소) 안락사 특히 심장 박동, 호흡, 부족 부족과 각 막 반사의 부재를 포함 하 여 기관 IACUC 프로토콜에서 설명 하는 방법으로 죽음을 확인 합니다. 검 시 바닥에 동물을 이동 합니다.
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가축과 들소에 선 림프절의 절연
- 검 시 바닥에 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다. 턱 관절을 (TMJ)를 찾습니다.
- 이 찾을 어려운 경우는 mandible를 천천히 이동 하 고는 mandible 두개골;을 연결 하는 위치를 결정 이것은 TMJ 이다.
- 신중 하 게 메스 또는 검 시 칼을 사용 하 여, 피부에 절 개를 확인 합니다. 공동으로 지 절 개를 시작 하 고 그것 ventrally/수직으로 연장 jawline 따라.
- 피하 조직을 떨어져 피부를 해 부. 선 침 샘 표시 됩니다 처음, 그것의 큰 크기, lobulated 표면 외관, 및 빨간 채색 때문.
- 사용 하 여 집게와 메스, 선 침 샘을 이동 제쳐두고 그냥 두개골 및 침 샘 (그림 3A)에 중간 앉아 선 림프 노드를 찾을. 추가 처리 전에 텍스처에 대 한 선 림프절 조직을 검사 합니다.
참고: (선, submandibular) 얼굴의 림프절은 림프 노드 격리를 혼동 수 있습니다 침 샘, 연관. 비해 림프절, 침 샘 훨씬 더 큰 이며 lobulated 표면 모습. 또한, 절단된 표면에 침 샘 자연에 균질 이며 림프절 (그림 3B)의 고전적인 대뇌 피 질과 골 수 건축 패턴을 전시 하지 않습니다. - 메스와 선을 삭제하시오 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.
- 검 시 바닥에 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다. 턱 관절을 (TMJ)를 찾습니다.
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Supramammary 림프절 여성 가축과 들소의 격리
- 측면 recumbency에 동물을 배치 합니다.
- 사 타 구니 영역을 노출 하 고 젖 통을 찾아 뒷 다리를 상승 합니다.
참고: 건강 하 고, 젖을 비 동물에서 이러한 림프절의 촉진 하지 가능. 젖이 동물에서 이러한 림프절 젖 통의 기지의 꼬리 테두리에 만져 서 있을 수 있습니다. - 메스를 사용 하 게 절 개 단지 등 위쪽 다리 노출 supramammary 동맥을 따라 젖 통.
- 피하 조직 해 부 고 피하 지방에의 얇은 계층에 포함 된 supramammary 림프 노드. 시각적으로 구별할 수, 경우 피하 지방 내에서 확고 한 구조의 존재에 대 한 노출된 조직 만져.
- 포 셉, 메스 using, 신중 하 게 지방에서 림프 노드 밖으로 해 부. 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.
3. 단면 및 림프절의 저장
- 주 검 시 공간에 인접 한 해 부 테이블에 3 dissector에 것 2에서에서 격리 된 림프절을 전달 합니다. 마의 신선한 섹션에 각 림프 노드를 배치 합니다. 미리 림프 노드를 연속적으로 여러 개의 림프절의 영수증을 촉진 하 여 절단 보드 섹션에 레이블을 지정 합니다. 감염 샘플에 대 한 일회용 트레이 사용 합니다.
- 집게와 일회용 메스 또는 검 시 칼을 사용 하면, 림프 노드의 섹션 제거할. 날카로운 칼을 사용 하 여 림프 노드를 열어 화살 컷을 확인 합니다.
- 특히 감염 된 동물 표본에서에서 림프절의 내부 검사, 비대칭을 찾고, 병 변, 색상 차이, 등 기록 관측.
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(옵션 1) 작은 조직 단면도
- 일회용 scalpels를 사용 하 여 삭제할 두께에서 5 m m 미만 하 고 깨끗 한 집게와 RNA 보존 솔루션 튜브 각 조각을 전송 각 림프절의 조각.
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(옵션 2) 림프절 생 검 또는 단면 방법론
참고: 생 검 또는 단면 방법론, 다른 노드 및 동물, 병렬 림프 노드 섹션에 적용 하는 경우 대량 RNA 분석을 위한 샘플링 조직의 일관성을 제공 합니다.-
웨지 단면 메서드
- 후 세포 림프 노드의 프로필 전체를 삭제할 외부 캡슐에 센터에서 림프절에서 파이 모양 쐐기를 화살 섹션 검토. 노드 2 cm 폭 (표준 크기; 표 1참조), 쐐기 외부 아크 길이 4 m m 센터에 자르고 5mm 두께에서 젖은 무게 해야한다 ~ 100mg.
- 메스를 사용 하 여, 작은 조각, 5 밀리미터, 그리고 약 50-100 mg 각 젖은 조직 무게에서 보다 두꺼운 쐐기 잘라.
참고: 일관성을 위해 모든 웨지 조각 또는 별도 튜브에 하나의 일괄 처리에서 다음 RNA 풀링 관심의 림프절에서 대표적인 RNA 프로 파일을 제공 하는 단일 림프절에서 처리 합니다. - 조직의 볼륨에 비해 RNA 보존 솔루션의 적어도 10 볼륨 포함 된 튜브에 집게와 조직 조각을 놓습니다.
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펀치 생 검 방법
- 목표는 노드에서 특정 낭 등 특정 섹션을 수집 하는 경우 펀치 생 검 도구를 선택 합니다. 컬렉션에 대 한 원하는 샘플의 크기와 일치 하는 도구를 선택 합니다. 펀치 생 검 도구 직경 8 m m 1에서 크기의 범위에서 사용할 수 있습니다.
- 시각적으로 림프절에 샘플에 대 한 관심의 영역을 찾습니다.
- 펀치 생 검 도구를 사용 하 여 관심, 누르고 도구를 만드는 핵심 조직으로 선회의 섹션을 삭제할. 집게와 RNA 보존 솔루션의 적어도 10의 볼륨을 포함 하는 관 조직 조각을 전송. 5 m m 보다 두꺼운 경우 추가 조직 더 작은 조각으로 분할 하 포 셉, 메스를 사용 합니다.
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웨지 단면 메서드
- 일단 샘플 보존 솔루션에 전송 (예., RNALater), 실 온에서 실험실 등을 맞댄 그들을 수송.
- 4 ° C 하룻밤 조직 침투 수 있도록에서 샘플을 저장 합니다.
- 다음 날, 과잉 RNA 방부 제 솔루션을 부 어 고-80 ° c.에서 조직 샘플을 저장 샘플을 동결 하기 전에 가능한 많은 방부 제를 제거 합니다. P1000 / P200 micropipette 팁을 사용 하 여 효율적인 RNA 방부 제 솔루션 제거를 위한.
주의: 폐기 decanted 보존 솔루션 적절 하 게, 안전 데이터 시트에 지정 된 대로 방부 제 솔루션의 화학 및 환경 위험 뿐만 아니라 활용 하는 병원 체의 감염 속성에 따라.
참고: 여기에 제공 된 지침 자료의 테이블에서에서 설명 하는 RNA 보존 솔루션에 대 한 제공 됩니다. 대체 보존 솔루션을 사용 하는 경우 제조업체의 지침을 참조 하십시오.
4. RNA 림프절에서 처리
주의: 실험실 외 투, 장갑, 그리고 처리 단계에 대 한 적절 한 눈 보호를 착용 하십시오.
참고: 여기에 사용 되는 페 놀 기반 시 약 재료의 테이블에서 에서 설명 하는 (그리고 프로토콜 제조업체의 지침에 따라)20. 다른 페 놀 기반 시 약의 사용에는 구입한 특정 제품에 대 한 제조업체의 권장 사항에 따라 절차의 수정 할 거 수 있습니다.
- 샘플, 사전 약 균질 튜브 (1.5 mL/튜브), 냉장된 (4 ° C) 페 놀 기반 시 약 수에 액세스 하기 전에 피 펫을 사용 하 여.
주의: 페 놀은 독성, 부식성, 및 건강 위험. 클로 프롬은 독성과 건강 위험. 화학 증기 두건 4.1 4.9 처리 단계를 완료 하 고 화학 물질과 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용. 미국에서는, 클로 프롬은 위험한 폐기물; 튜브를 포함 하는 지역 및 기관 지침에 따라 유해 폐기물의 처분. 프로세스 조직 샘플 해당 BSL-2, BSL-3, 또는 BSL-4 지침 아래 병원 체 감염 동물에서. - 일단 샘플 깨끗 한 집게와 microcentrifuge 튜브에서 느슨하게 될 수 있습니다, 즉시 페 놀 기반 시 약을 포함 하는 균질 튜브 보존된 조직의 약 50-100 mg 전송.
- 페 놀 기반 시 약을 추가 하기 전에 녹고 제한 합니다. 드라이 아이스에 스토리지를 사용 하 여 여러 샘플 처리에 대 한 냉동 고에서 제거 됩니다 때.
- 단단히 튜브 캡, 균질 화기에 배치 하 고 페 놀 기반 시 약에서 회전자-stator 조직 균질 화기와 샘플을 균질. 실 온에서 처리를 완료 합니다. 언제 완료, 검사 샘플은 성공적으로 무 균; 되도록 흐린 외관에 대 한 조직 흐린 현 탁 액에 분산 한다.
참고: 2 분 RNA 추출 설정이 사용 됩니다 (는 균질 화기에 대 한 사전 설정된 RNA_02_1 설정 테이블의 자료에서 설명, 냉동된 조직에 대 한 설계). 이 프로토콜에 지정 된 회전자 고정자 (참조 테이블의 자료) 이며 큰 이빨 균질 섬유 소재를 포함 하 여 조직 유형의 범위에 대 한 적응. RNA_02_01 설정은 설계 구체적으로 (반대로 신선한) 냉동 조직. 림프절 섬유질 결합 조직 구성으로, 마찬가지로 최적화 된 회전자-stator 균질 화기는 효과적인 분리를 달성 하기 것이 좋습니다. 국립 연구소의 환경 건강 과학21 균질 권장 사항에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.- 직물의 큰 덩어리는 균질 후 유지, 균질 절차를 반복 합니다. 효율적으로 RNA를 복구, 조직 해야 합니다 수 잘 해리 했다.
- 더 섬유 림프 노드 조각에 대 한 사전 림프 노드 조각 균질 튜브를 전송 전에 여러 작은 조각으로 잘라 집게와가 위를 사용 합니다. 소개에 설명 된 대로 더 오래 된 동물에서 림프절 조직 섬유 더 있을 수 있습니다.
참고: 호스트와 병원 체 RNA의 이중 분석을 원하는 경우 (예: 구슬 균질) 추가 치료 필요할 수 있습니다 세균 RNA의 복구에 대 한 그람 양성 균은 조직에 존재 하는 경우에 특히.
- 즉시 무 균된 샘플 튜브에서 제거 하 고 RNase 무료 microcentrifuge (2.0 mL 크기에서)와 함께 튜브 P1000 micropipette 전송.
- 어떤 샘플 파편 든 지 제거 하 4 ° C에서 12000 x g에 5 분에 대 한 샘플 원심 P1000 micropipette 팁을 사용 하는 펠 릿을 남겨두고 신선한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
- 실 온에서 5 분 동안 상쾌한 품 어. 두 개의 1.5 microcentrifuge 튜브 사이의 각 샘플 분할.
- 페 놀 기반 시 약 (즉, 1.5 mL 샘플 0.3 mL);의 1 mL 당 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 혼합 단계, 하지만 하지 소용돌이 샘플 1-2 분이 손으로 반전. 실 온에서 2 분 동안 그것을 품 어.
- 4 ° c.에 12000 x g에서 15 분 동안 원심
- 조심 스럽게 제거는 interphase 또는 빨간색 페 놀-클로 프롬 레이어를 방해 하지 않고 상위 계층을 형성 하는 micropipette 팁 P1000 (P200) 위, 명확한 수성 단계. 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
- 100% 에탄올;의 동등한 양으로 혼합 반전 튜브 4-5 배 하 여 철저 하 게 믹스. 튜브는 흐린 자주 표시 됩니다.
- Micropipette 팁을 더 정화 하 고 RNA, 다음 제조 업체의 지침22elute 상업 스핀 실리 카 기반 열에 액체를 전송. 생성 된 RNA elute ~ 50mg RNase 무료 물 50-100 µ l로 조직.
참고: 페 놀 기반 시 약 추출 qRT-PCR 그리고/또한 RNA 시퀀싱 응용 프로그램에 RNA의 다운스트림 사용을 위해 유기 단계에서 DNA를 제거 하는 동안 DNase RNA 샘플의 추가 치료를 것이 좋습니다. - 약 수를 줄이기 위해 어떤 동결 해빙 주요 RNA 샘플의 정량화 및 품질 평가에 사용 하기 위해 튜브를 분리 하는 eluted RNA. 저장용-80 ° C에 튜브를 전송 합니다.
- 샘플 낮은 biosafety 수준 포함 영역으로 이동 됩니다 병원 체의 부재에 대 한 결과 RNA 샘플 확인 림프절 샘플 BSL-3 견제 수준에서 특히 zoonotic 병원 체 감염 동물에서 파생 된 경우 품질 분석, RT-PCR 및 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비
참고: 그것은 중요 한 현지 규정을 고려 하 고 CDC (질병 통제 예방 센터) 비활성화 선택 에이전트와 작업에 대 한 지침, 경우 그것은 연구자의 로컬 사이트에 모든 비활성화 절차의 유효성을 검사 하는 데 필요한.- 1/10번째 볼륨 단계 4.12에서에서 각 eluted RNA 샘플의 (즉, 총 RNA의 50 µ l에서 5 µ l)를 제거 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 샘플 100 µ l 세균성 성장 국물 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서의 혼합. 살 균 플라스틱 분산기를 사용 하 여 한 천 배지 표면 RNA 국물 혼합 분산.
참고: 국물 종류와 한 접시는 동물 도전 하는 병원 체의 성장을 일치를 선택 합니다. - 병원 체는 동물도 전했다의 성장에 특정 조건 하에서 한 천 배지를 품 어. BSL-3 봉쇄에서 샘플을 제거 하기 전에 복구 된 박테리아의 부재를 확인 합니다.
참고: 결과 eluted RNA, 정량화 및 무결성, 테스트 후는 RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램에 적합.
- 1/10번째 볼륨 단계 4.12에서에서 각 eluted RNA 샘플의 (즉, 총 RNA의 50 µ l에서 5 µ l)를 제거 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 샘플 100 µ l 세균성 성장 국물 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서의 혼합. 살 균 플라스틱 분산기를 사용 하 여 한 천 배지 표면 RNA 국물 혼합 분산.
- RNA 복구 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 평가 합니다. RNA 품질을 평가 하는 분석을 위한 분 광 광도 계에 eluted RNA 샘플의 1-2 µ l을 로드 합니다. 자외선 (UV) 범위에 샘플의 스펙트럼을 기록 합니다.
- UV 스펙트럼에서 A260/A280 비율, A260/A230 비율, 그리고 샘플 A260 값 기록 (A = 흡 광도).
- 40 µ g/mL의 농도에서 단일 가닥 RNA 260에서 1.0의 흡 광도 nm A260 x 40 정화 샘플을 곱하여 RNA 농도 (µ g/mL)을 계산.
- RNA 무결성의 평가의 빠른 방법으로 어떤 저하 샘플 추가 분석에서 제외, 혼합 각 RNA 샘플의 2 µ l과 1.5 x formamide 로드 염료 [95% 이온된 formamide, 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA (pH 4 µ l 8.0), 0.025% (w/v) SDS] 1.5 ml에서 microcentrifuge23,24튜브.
- 1 분에 70 ° C에서 튜브가 열 하 고 1 분 동안 얼음에 튜브를 전송.
- 1에서 준비 1 %agarose 젤에 샘플 로드 x TBE (RNA에 대 한 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법의 전체 설명에 대 한 리오, Ares 주니어, Hannon, 및 참조 Nilsen)24. 표준 젤 전기 이동 법 방법으로 샘플 고 28S와 18S 리보솜 RNA 밴드의 존재를 확인 합니다.
- 젤 전기 이동 법 [예를 들어, Bioanalyzer 및 린 (RNA 무결성 번호) 분석] RNA 무결성 확인에 대 한 정량 분석 방법 대표 결과 뮬러, O. 에에서 설명 된 대로 따라 외. 25 와 슈뢰더, A. 외. 26.
5. 대체 추출 방법에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직
참고: FFPE 직물 보존 팬 들은 핵 산 보존의 가장 강력한 방법의 정보를 대표 하지 않는다, 하지만 아래 제시 하는 프로토콜 수 다른 보존된 조직에 사용할 수 없는 경우 일부 transcriptional 변화를 공부 하는 방법을.
- 플라스틱 용기에 포 르 말린을 분배 하 여 조직 보존을 위한 포 르 말린 시 약을 준비 합니다. 조직 말린 포 르 말린: 조직 볼륨/무게 20: 1의 비율에 각각 유지 한다.
주의: 말린 알려진된 인간 발암 물질 이며 비록 심하게 독성, (일반적으로 흡입된 가스)를 통해 만성 노출 중요 한 건강 위험을 나타낼 수 있습니다. 적절 한 환기 및 PPE (즉, 니트 릴 장갑, 초기 노출 후 15 분 이내에 변경할 수 사용) 건강 위험을 최소화 하기 위해 필요 합니다. OSHA 포름알데히드 표준 참조 (29 CFR 1910.1048) 노출 모니터링 및 위험 평가 대 한 자세한 내용은.
참고: 너무 작은 포 르 말린을 사용 하 여 방부에 빠져들 때 완벽 하 게 보존 되는 조직 수에 영향을 수 있습니다. - 관심의 조직 분리 후 신중 하 게 두께에서 5mm 미만 조직을 정돈 한다.
- 트림 된 조직 어떤 splashing을 최소화 하기 위해 포 르 말린으로 잠수함 신중 하 게 집게를 사용 하 여.
참고: 조직 해야 합니다 수 완전히 침수 말린 완전 한 고정에 대 한 허용에. 그것은 중요 한 조직의 모든 서피스는 완전히 말린 덮여입니다.
- 트림 된 조직 어떤 splashing을 최소화 하기 위해 포 르 말린으로 잠수함 신중 하 게 집게를 사용 하 여.
- 일단 조직 포 르 말린에 빠져들 되었습니다가지고, 실 온에서 24 시간 이상 발생 조직 고정 하실 수 있습니다.
참고: 말린 침투 조직 천천히, 모든 표면27,28에서 시간당 1 m m의 속도로. 따라서, 유지 조직 단면도의 두께 5mm 결과 보다는 더 적은 전체 조직의 빠른 정착에. - 고정, 후 조직 파라핀 포함에 대 한 적절 한 시 약으로 전송.
참고: 예를 들어 조직 검사이 원고에 포함 하기 전에 70% 에탄올으로 옮겨 졌다. - 파라핀으로 조직을 포함 합니다. 29
- 10-80 µ m 조직 두께 (사용 10-20 µ m 미르를 원하는 경우)에 섹션29.
- 메스와 집게를 사용 하면, 처리 하는 살 균, nuclease 무료 microfuge 관으로 각 샘플에서 40 mg 조직 조각을 제거할.
- Deparaffinization 및 핵 산 복구 FFPE 조직 샘플의 보존된 샘플에서 RNA를 추출 하기 위한 상업 키트를 활용.
참고: 재료의 테이블에서 에서 참조 하는 키트 활용 크 실 렌 그리고 파라핀, 효소 치료 단계 및 RNA를 정화 하는 유리 섬유 필터를 제거 하 에탄올 세척.
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Representative Results
이 문서 (프로토콜의 단계 1-4)에서 제공 하는 고려를 사용 하 여 호스트 유전자 표현 연구에 다운스트림 분석 적합 큰 동물 샘플에서 RNA의 회복에 도움이 됩니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA 품질은 여러 표준 측정에 의해 평가 됩니다. 분 광 광도 학, 단백질 오염 물질의 측정을 제공 하는 A260/A280 비율 및 A260/A230 비율 순수성 평가 페 놀 등 화학 오염 물질 감지의 다른 수단을 제공 합니다. 각각의 경우의 비율 ~ 2.0 높은-품질 RNA의 증거 이며 감소 비율 오염의 증거. 중요 한 것은, 이러한 비율 질적으로 평가 될 수 있다 RNA 저하에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 (4.15-4.17 단계) 및 양적 (4.18를 단계는 RNA를 통해 무결성 번호 또는 린 점수와 같은).
그것은 림프절 조직 섹션에서 복구 하는 RNA의 예상된 품질 수준은, 평균에, 소과 흰색 혈액 세포 샘플에서 발견 하는 RNA에 대 한 보다 낮은 해야 합니다. 소 조직 및 세포에서 RNA 추출의 포괄적인 시리즈, Fleige 및 Pfaffl30 는 평균 린 (RNA 무결성 숫자는 Bioanalyzer에서 측정) 다릅니다 < 5 공장 및 제일 위 조직에 대 한 > 백혈구에 대 한 9를 찾아 세포와 림프 노드 린 점수 6.9의 평균 중간에 빠지는 luteum. 일반적으로, Fleige 및 Pfaffl30 노트 단단한 조직 결합 조직의 높은 농도 가진 6-8, 그리고 그 조직에서 배열 하는 린 점수 생산 높은 뜻 저하 전시. 린와 일관 되 게 복구 RNA 점수 > 림프절에서 9에 대 한 결합 조직에 림프 노드 밀도 플러스이 조직 유형에 RNases의 본질적인 수준 책임 있을 수 있습니다.
그러나, 여기에 제시 된 방법론을 사용 하 여 들소 supramammary 림프 노드를 복구 하는 RNA에 대 한 Bioanalyzer 프로필의 예 그림 4A, 8.6 (주로 그대로 및 적당 한의 린 점수 RNA의 회복을 보여주는 표시 됩니다. 기본적으로 모든 다운스트림 응용 프로그램) 합니다. 이 절차에서 생성 된 RNA 성공적으로 RNA 시퀀싱;에 사용 하기 위해 라이브러리를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이 프로토콜 들소와 린 값 > 8 (그리고 종종 > 9) 소 림프절에서 RNA 샘플의 일반 격리에 대 한 수 있습니다. 8 추출 된 RNA 샘플의 샘플 집합에 대 한 평균 흡 광도 비율 260 nm/280 nm에는 2.1와 260 nm/230 nm 2.1, 낮은 단백질 오염 및 낮은 오염 화학 물질 페 놀, 같은를 각각 나타내는 했다. 각 추출에서 평균 핵 산 복구 했다 당 97 ± 10 µ g ~ 100 mg 또는의 항복 ~ 1 µ g 림프절 조직의 RNA/mg.
그림 4 . RNA 추출 방법론에서 품질을 묘사한 대표적인 품질 추적. (A) 높은-품질 RNA 들소 림프절에서 생성 된이 원고에 제시 하는 절차를 사용 하 여이 패널 쇼 총 RNA 흔적. (B)이이 패널 매우 저하 RNA를 묘사한 소 FFPE 샘플 표 4에서 선택한 추적을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도전 때문에 연결 된 야생 동물 종에서 샘플링의 경우 특히 큰 시체에서 조직의 급속 한 격리는 안락사와는 RNA 보존 조직 조각의 사이의 시간 지연의 영향 해결책은 분석에서 잠재적인 관심사의 이다. 정보 문학에서 안정성에 대 한 RNA의 림프절 조직, 특히, 제한 됩니다. 따라서, 조직 컬렉션에 대 한 적절 한 매개 변수에 대 한 정보를 제공 하도록 들소 림프 노드 후 안락사에 RNA의 안정성 특징 이었다.
이 실험에 대 한 시간 0는 심장 박동의 부족 및 각 막 반사의 결핍으로 죽은 동물 였으며 시간으로 고려 되었다. 시체 검 시의 시작의 전송 다음 ~ 15 분 첫 번째 림프절 샘플을 검색 하기 전에 경과 했다 (15-20 분 필드 동물의 복구에 대 한 우리의 관찰에 표준; 시간 코스 위치에 따라 달라 집니다 ). Supramammary 림프 노드를 식별 하 고 조직의 작은 부분 제거 되 고 실내 온도에 유지. 섹션 이후 약 15 분 간격으로 고로 RNA 방부 제; 시간 코스 중간 림프절의 두 번째 샘플은 4 시간 포인트 (그림 5A; 닫힌된 원, 그림 5C) 시리즈에서의 두 번째 집합에 대 한 동물에서 검색 됩니다. RNA는 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 림프 노드 조각에서 동시에 추출 되었다. 이 1 시간 실험 림프절 RNA 시간 과정, 시간 과정 (그림 5B 및 5c)의 끝에 의해 린 점수의 단지 약간의 감소에 걸쳐 대부분의 무결성의 유지 보여. 소 prescapular 고 선 림프절에서 RNA에 린 점수에 의해 측정 된 그것의 무결성을 유지 하는 유사 하 게, ~ 1 h 시간 코스 사후 (그림 5C, 동물 정보 표2에서). 또한, RNA 세포 배양 중 실내 온도에 또는 동물 시체의 처리 시간을 시뮬레이션 하기 위해 37 ° C에서에 전체 섹션을 잡고 죽음 후에, 8 h 수집 된 supramammary 림프 노드 섹션에서 추출 했다. 리보솜 RNA (그림 5D) 시간 잡고 8 h 후에 관찰 했다.
그림 5 . Bison 림프절 샘플에서 RNA 품질 시간 코스 후 죽음에 걸쳐 수집한. (A)이이 패널 1 h 시간 과정 절차의 실험 개요를 보여 줍니다. (B, C) 이러한 패널 표시 미국 들소에서 격리 supramammary 림프절에서 1 h 시간 과정에 걸쳐 샘플에 대 한 RNA 품질의 검사. 젤 반영 formamide에 변성 RNA 샘플 1% 비 변성 시키기 젤에서 분리 합니다. 패널 (C) 린 점수 각 샘플에 대 한 변경 내용을 보여 줍니다. 소 prescapular 고 선 림프절에 대 한 추가 실험에서 데이터 표시 된 대로 중첩 됩니다. (D)이이 패널 예가 나와 RNA 젤의 패널 (B)에서 사용 하는 젤에 대 한 설명 된 대로 supramammary 림프절 샘플 8 h 부 화 하거나 실 온 (1 레인)에서 또는 세포 배양에서 37 ° C (2 차선)에서 후 처리에 대 한 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이러한 대표적인 연구 결과 다른 조직 유형 및 소스에 대 한 RNA 안정성 결과와 일치 하는. 표 3 사전 보존 시간 과정을 통해 RNA 안정성 조사 게시 된 논문의 샘플의 결과의 요약을 제공 합니다. 몇 가지 서류와 같은 5' 대 의 비율의 결정을 통해 3' 선택 된 RNAs의 세그먼트에 mRNA 무결성의 추가 분석 제공 린 점수 또는 rRNA만 동향 관찰 (총 RNA) 젤 참고 테이블에 포함 (예를 들어, Fajardy 그 외 여러분) 그러나 31., 그것은 같이, 예를 들어31태 반 조직 대 한 죽음 및 샘플 보존 사이 긴 시간 RNA 식 프로필에 변경 될 수 있습니다 기억 하는 것이 중요. 안정적인 성적에 비해, 더 불안정 RNAs 고갈 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 생물학적으로 가장 유효한 RNA 프로필을 달성 하기 위하여 동물 검 시를 위해 제공 되 면 어떤 지연 줄이기 위해 조직 복구에 대 한 신속 하 고 효율적인 워크플로 활용 하는 것이 중요. 그것은 그대로 ribosomal RNA의 존재 transcriptome 프로필에서 변경 부재 가정 하 실수일 것 이다. 아직도, 대표적인 결과 큰 동물 샘플링의 증가 처리 시간 필요와도 가능 하다는 것 준비 RNA 유전자 표정 분석 림프절 샘플에서 적합 하 것이 좋습니다.
또한, 후 녹고 시간 변수의 영향 조사 되었다; 이 시간 동안 RNA는 조직에 존재 nucleases에서 저하를 받기 쉽습니다. 0 또는 64 분이이 프로토콜을 사용 하 여 처리 유지 시간 단계 4.1에서 녹고 후 실 온에서 RNA 샘플의 품질 린 점수를 측정 했다. 이 실험에서는 프로토콜 아니다는 것을 확실히 해 동 시간에 민감한 여러 샘플 (그림 6A)의 처리에 대 한 강력한 만들기 보여 줍니다.
그림 6입니다. RNA 품질 매개 변수의 추가 분석. (A)이이 패널 (0 분) 녹고 후 즉시 또는 처리 하기 전에 실내 온도에 64 분 후 정화 RNA RNA 품질 결과 보여줍니다. 막대 3 조직 조각 각 조건, ± 표준 편차에 대 한 평균을 나타냅니다. 모든 조직 프로토콜에 설명 된 대로 이전에 녹고, RNA 방부 제 솔루션에 저장 되었습니다. (B)이이 패널 결합 조직의 큰 부분을 포함 하는 제대로 무 균된 림프 노드 조각에서 샘플의 Bioanalyzer 추적을 보여 줍니다. 5S 범위에 봉우리에 비해 28S와 18S 봉우리의 소형은 분명 하다. 5S 범위와 18S 피크 사이의 비교적 평탄한 기준선 또는 가난한 추출;의 암시 이지만이 또한, RNA의 저하로 인해 발생할 수 있습니다. 아브라함, R. 그 외 참조 48 자세한 내용은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
림프절에서 RNA의 격리에 비교의 시점으로 가축에서 FFPE mesenteric 림프 노드 조각에서 RNA의 시험 복구를 실시 했다. 위에서 설명한 것 처럼 샘플 파라핀 포함, 실 온에서 파라핀에 스토리지의 4 개월 전에 포 르 말린에 1 주에 대 한 고정 했다. 조직 되었다 5 10 µ m 섹션으로 구분 하 고 약 62 ng / µ L의 RNA 샘플 (± 14 ng / µ L) 당 복구 FFPE 추출 절차를 사용 하 여. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 비율 평균 1.9 A260/A230 비율 불리 (표 4) 비록 단백질 오염, 낮은 수준의 제품을 나타내는. 참고 린 점수 관찰이 샘플 했다 매우 낮은 (< 2), RNA 제품 (표 4;의 저하를 나타내는 그림 4B), 산 외의 묘사와 일치. 45. 분석 정량, RNA, 또는 좀 더 구체적으로 cDNA (< 200 bp)의 일반적으로 작은 부분을 활용 하 여, 증폭 됩니다. 따라서, 작은 제품의 증폭 저하 샘플에서 여전히 발생할 수 있습니다 및 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 S9 ribosomal 단백질 (RPS9) 세그먼트를 증폭 수 정량에 의해 이러한 FFPE 복구 샘플 증명서. CT 값 샘플 걸쳐 일관 했다 고 평균 19.2 ± 1.8. 그러나 FFPE 준비 샘플을 활용 하 여, 더 큰 제품 반드시 존재 하지 않습니다 그리고 저하 하지 발생 한 균일 한 속도로 모든 샘플에서 존재 하는 제한 사항을 명심에서 하십시오. 따라서,이 자료, 경고와 더불어 연구에 사용할 수 있습니다 하지만 중요 한 한계는 RNA 시퀀싱 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.
| 림프 노드 형식 | 위치 | 길이 | 너비 | 노드에 의해 배수 지역 |
| Prescapular | 그냥 중간에 어깨 관절; 피하 지방에서 및 근육의 계층에서 포함 된 | 1-10 cm | 1.5-2 c m | 피부의 목; 어깨; 그리고 피부, 근육, 그리고 낮은 흉부 사지 (참고. 8)의 관절 |
| Prefemoral (또한 precrural 이라고) | 그냥 지 하 고 억압, 슬 개 골 위에 약 12-15 cm에 중간 | 8-10 cm | 2.5 c m | 다리를 골반, 복 부, 흉부 (참고. 8)의 꼬리 부분의 피부 |
| Retropharyngeal | 중간 선 인 두에 지 있습니다 | 4-5 cm | 2-3.5 cm | 혀, 구강, 잇 몸, 입술, 하드 미각, 침 샘, 목의 근육의 대부분의 점 막 |
| 귀 밑 | 턱 관절, 저작 근육 (참고. 8) 꼬리에 복 부 피하 위치 | 6-9 cm | 2-3 cm | 피부, subcutis, 머리, 눈, 귀, 눈 꺼 풀, 눈물 동맥의 근육, 비 강의 rostral 부분 근육의 대부분 |
| Submandibular (1-3 현재 수 있습니다) | 피하 mandible, 침 샘과 관련 된의 각도의 중간 부분에 위치한 | 3-4 cm | 2-3 cm | 총구, 입술, 뺨, 하드 미각, rostral 부분의 비 강, 혀, 피부와 근육 머리 (참고. 8)의 팁 |
| Supramammary (천박한 여자 사 타 구니, 일반적으로 2 현재) | 유 방 땀 샘을 기준으로 caudally dorsally 발견 | 6-10 cm | 젖 통, 외 음부, 질, 허벅지, 다리의 중간 표면의 중간과 꼬리 측면에 피부의 현관 | |
| (남성 버전 표면의 사 타 구니) 음 낭 | 음 낭의 목에 지방 층 내에서 prepublic 힘 줄 아래 | 3-6 cm | 음 낭, 포 피, 음 경 |
표 1입니다. 소 표면 림프절의 개요.
| 동물 설명 | 원고에 위치 | 나이 | 섹스 | 건강 상태 |
| Videoed 들소 들소 | 비디오-림프 노드 복구 들소 | 5-6 요 | 여성 | 건강 한 |
| Videoed 보스 토 러 스 | 비디오-림프 노드 복구에 소 | 7-8 요 | 거세 남성 | 건강 한 |
| Bison에 bison RNA 안정성 연구 | 그림 5A-C | 5-6 요 | 여성 | 건강 한 |
| 보스 토 러 스 RNA 안정성 연구에 대 한 A | 그림 5C, 그림 6A | 7-8 요 | 거세 남성 | 건강 한 |
| 보스 토 러 스 RNA 안정성 연구에 대 한 B | 그림 5C | 7-8 요 | 거세 남성 | 건강 한 |
| 보스 황소 FFPE 품질 연구 | 표 4, 그림 4B | 0.5 요 | 거세 남성 | 정상 (O157:H7 감염 연구에서 제어) |
| 참고 여러 추가, 들소, 소와 염소 림프절 샘플, 사람 여기에 강조는에 방법론 사용 되었습니다. | ||||
| 또한, 우리는 림프절에서 수집 된 동일한 방법론을 사용는 1.5 미주리-오래 된 여성 송아지. | ||||
표 2입니다. 파일럿 연구에서 사용 하는 동물의 특성.
| 조직 유형 | 보존 방법 | 조건 보유 | 저하 결론 | 참조 |
| 소 해 지방, 골격 근육, 간 | 동결 (액체 N2) 스냅 | 4 ° C, 진공 포장 조직 | 근육 보다 안정적인 RNA (심지어 스토리지의 8 일); 지방 및 간 주로 안정적인 24 h. 하 rRNA 밴드의 외모로 평가 | Bahar 외. (2007 년)32 |
| 인간의 대 장, 대 장 암 | RNA 보존 솔루션 | 방 온도 | 린 2 헤에 대 한 보존 하지만 유전자의 하위 집합 표시 변경 0.5-2에서 h. | Yamagishi 외. (2014)33 |
| 마우스 간, 비장 | RNA 보존 솔루션, 또는 동결 (드라이 아이스 슬러리) 스냅 | 마우스 시체 (37 ° C) 내부 | 비장 샘플은 1.5 h; 밖으로 안정 간 샘플 전시 이전 저하 (24% 감소 린에서 105 분.) | 최 외. (2016)34 |
| 마우스 간 | 없음 (Homogenized guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬에 신선한) | 25 ° C, 37 ° C | 25 ° C에서 4 헤에 개 제한 저하 하지만 4 헤 (때 린 점수를 사용 하 여 관찰) 37 ° C에서 광범위 한 저하. | 알 메 이다 외. (2004)35 |
| 인간의 회장 | RNA 보존 솔루션, 또는 동결 스냅 | 4 ° C, 37 ° C | 37 ° C에서 1.5 헤 일반적으로 안정적인 (때 린 점수를 사용 하 여 관찰) 4 ° C에서 6 헤에 안정적인 밖으로. 으로 사용할 수 있는 추가 참조를 그에 대 한 추가 검토 조직의 RNA 무결성 문학에에서 관심이 테이블 s 1에 선택 된 RNA 안정성 리소스에 대 한 요약을 제공 하는 저자 note. | 이 외. (2015)36 |
| 인간의 간 | (액체 N2 또는 isopentane) 스냅 | 방 온도 | (최대 0.85 ΔRIN); 1 헤에서 저하 간 보다 큰 샘플의 작은 샘플에 더 저하 | 갑 외. (2015)37 |
| 인간의 대 장 암 | 동결 (액체 n 2/isopentane) 스냅 | 4 ° C | 1 시간에 의해 저하 관찰.; 지연 시간에 90 분 후 4.2만의 린 점수 | 홍 외 (2010)38 |
| 인간의 간 | 또한 플래시 동결 (액체 N2) RNA 보존 솔루션 | 객실 온도, 4 ° C | 샘플 1 개도 안정 했다 d. 얼음; 1 후 저하 관찰 방 온도에서 디. (하지만 3 헤; 후로 관찰 린 점수를 사용 하 여) | 이 외. (2013)39 |
| 말 많은, 골격 근육 | 동결 (액체 N2) 스냅 | 13 ° C | 저자는 최고의 무결성 추천 근육 2 h 이내 했다.; 권장 작성자 (rRNA 젤 모양에 의해 관찰) 0.5 헤 내 지방 보존 | 모리슨 외. (2014)40 |
| 연어 두뇌, 신장, 간, 근육 | RNA 보존 솔루션 | 방 온도 | 8. (젤, 린 점수 모두 사용) 일부 저하 4-8 헤, 신장 및 근육 exhbiit에 안정적인 뇌 RNA | Seear & 스 위 니 (2008)41 |
| 토끼 결합 조직 (인 대, 힘 줄, 연골) | 동결 (액체 N2) 스냅 | 4 ° C, 방 온도. | 96 h. 사후, rRNA 젤 모양에 의해 관찰로를 밖으로 "명백한" 저하 없음 | Marchuk 외. (1998)42 |
| 쥐 두뇌, 폐, 심장, 간 | 신선한 추출 될 것으로 보인다 | 20 ° C 배양 기에서 개최 하는 쥐 시체 내부 | 뇌 (관찰할 수 있었다 rRNA 밴드 밖으로 7 일 사후, 저하는 존재 하지만), 폐와 심장, 간; 낮은 안정성에 적당 한 안정성을 관찰 하는 가장 높은 RNA 안정성 rRNA 젤 외모로 관찰 | 이노우에 외. (2002)43 |
| 인간의 편도 선, 콜론 | 와 없이 RNA 보존 솔루션, 다음 스냅인-냉동 | 방 온도 (22 ° C), 4 ° C RNA 보존 솔루션, 차가운 식 염 수, 또는 얼음 (0 ° C) | 얼음에 또는 RNA 보존 솔루션; 16 헤에 안정 RT (린 점수에 의해 측정 되는) 또는 차가운 식 염 수에 6 또는 16 헤에서 약간의 저하 | Micke 외. (2006)44 |
테이블 3입니다. 사후 조직 샘플에서 RNA 안정성에 이전 결과의 샘플. 다양 한 조직, 대표를 포함 한 유형 murine, RNA 안정성에 문학에서 선택 된 원고를 대표 하는 항목 인간의 생 검 및 수의 예. 각 예제에 대 한 보존, 저장 사전 추출의 모드와 결과의 간단한 요약에 대 한 방법은 제공 됩니다. 달리 명시 하지 않는 한 샘플 얼음에서 스냅 동결 또는 RNA 보존 솔루션, 포스트 시간 코스와 주입 다음 37 ° C에 배열 하는 상태에서 저장 된 (즉, 안정성은 하지 측정 되는 RNA의 존재 부 화, 동안 보존 솔루션 명시 되지 않는 한).
| 샘플 ID | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 260/A280 | 1.96 | 1.98 | 1.98 | 1.91 | 1.98 | 1.89 | 1.89 | 1.91 | 1.9 | 1.84 | 1.84 | 1.97 |
| 230 260/A | 0.67 | 0.14 | 0.19 | 0.26 | 0.61 | 0.69 | 1.33 | 0.11 | 0.21 | 0.39 | 0.1 | 0.44 |
| 린 | 1.6 | 1.1 | 1.3 | 1.2 | 1 | 1.3 | 2 | 1.1 | 1.2 | 1 | 1 | 1 |
표 4입니다. 대표 소 FFPE mesenteric 림프절에서 격리 하는 RNA에서 결과. 테이블 spectrophotometric에서 결과 묘사 하 고 품질 분석 FFPE 소 림프절 샘플의 시리즈에서이 원고에 설명 된 메서드를 사용 하 여 처리. 각각의 경우에 결과 매우 저하 RNA를 반영합니다.
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Discussion
마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항에 대 한 개요를 제공합니다. 샘플 컬렉션에 대 한 조건 및 동물의 크기는 복구 마우스 림프 노드 복구에 대 한 보다 긴 사후 처리 시간으로 더 광범위 한 프로세스를 확인 합니다. 마찬가지로, 이러한 림프절의 대형 샘플을 대표 림프 노드 내에서 면역/병리학 변화 뿐만 아니라 다른 동물에서 병렬 샘플을 복구 하는 프로토콜을 필요로 합니다. 림프 노드의 단면에 따라 대표 프로필 뿐만 아니라 그대로 RNA의 복구에 대 한 샘플 컬렉션이이 프로토콜에 대 한 제안을 제공 합니다.
표준화 된 샘플링 전략 및 프로토콜의 중요성의 데모로 서, 여기에 제시 된으로 우리 가축 림프절의 transcriptomes 특징 PubMed 중앙 데이터베이스에서 25 종이 조사. 한 종이 큰 림프 노드 섹션의 처리를 한 번에 표시, 하나 특정 레이저 캡처 서 방법, 하나는 "견본" 림프 노드에서 수집 된 언급 고만 하나의 종이46 표시 그 림프절의 조각을 수집 (10 m m3 크기에서) 피 질과 수 질 지역 포함. 다른 논문 지적 작은 샘플 (일반적으로 30-100 mg) RNA 분석에 대 한 처리 했다, 그러나의 84%는 이러한 조직 조각 모음에 대 한 샘플링 전략을 언급 하지 않았다. 로 RNA 시퀀싱은 여전히 상대적으로 비싼, 림프 노드 당 여러 섹션의 분석은 생물 복제 샘플은 일반적으로 통계 분석에 대 한 우선 순위를 때문에 특히 대부분의 경우, 재정적으로 가능한 것 같다. Sagittally sectioned 림프절의 걸쳐 샘플을 수집 하 여 면역 세포의 종류에 풍부한 림프 노드 지구에서 RNA는 모든 샘플에서 캡처됩니다. 이 프로토콜 수 있습니다, 따라서, 림프 노드 transcriptomics에 대 한 문서화 및 재현성 샘플링 전략에 대 한 참조 역할을 합니다.
조직에서 RNA의 준비, 절차 상의 의사 결정에 대 한 여러 주요 단계가 있습니다. 첫째, 플래시 동결 조직 샘플 (및 후속 냉 온도 연 삭)의 사용 방법 론 적 문학 보존 솔루션 대 의 사용 측면에서 혼합입니다. 특히 큰 동물 necropsies 경우이 프로토콜 통합 보존 솔루션의 사용에 여러 잠재적인 절차 이점이 있습니다. 첫째, 조직 샘플을 액체 질소에 튜브를 즉시 전송 하지 않고도 보존 솔루션에 검 시 동안 저장할 수 있습니다. 둘째, 보존 솔루션 사용 샘플 또는 짧게 부분적으로 녹아서 균질 하기 전에 하는 경우에 특히 RNA 추출 위한 샘플 처리 하기 전에 추가 보호를 제공 됩니다. 그림 6A 에 결과이 보호 효과 림프절 조직에 확장을 나타냅니다. 반면, 플래시 동결 샘플 페 놀을 포함 하는 버퍼에 균질의 순간까지 냉동된 상태에서 유지 되어야 합니다. 마지막으로, 여기서 액체 질소는 쉽게 사용할 수, 큰 동물의 필드 차례의 샘플 수 수에 저장 보존 솔루션 실험실에 반환 될 수 있습니다 때까지.
여기에 제시 된 절차의 분자 분 대의 추가 이점은 초기 조직 처리, 살 균 제에서 샘플에 대 한 균질의에 어로 졸 생성 과정 역할 중 페 놀의 존재를 포함 감염 동물, 그리고 샘플에서 잔여 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 제거 하려면 스핀 열 절차의 사용. 대표 결과 입증 절차260/A280 와260/A230 비율 평가 높은-품질 RNA 생성 젤 전기 이동 법, 그리고 린 점수, 그리고 코스에 도전 하는 시간에 얼굴에 강력 가축 및 야생 동물 샘플링. 시는 페 놀 기반 약 (예를 들어, TRIzol), 그리고 실리 카 열 정화에 균질 조직 보존 (예를 들어, RNALater에), 쌍은 성공적으로 이용 되어 프로필에 양 진 식 패턴을 문학에 abomasal 임 파선 감염 위장 nematodes46 와 가축 림프절에는 herpesvirus47, 린 점수 8 보다 큰 및 모든 샘플에 걸쳐 7 보다 큰 각각 감염.
다운스트림 분석에 대 한 용납할 수 없는 린 점수 결과 RNA의 경우는 RNA 처리에 대 한 표준, 다음 변수를 평가 합니다: 총 처리 시간 게시물-부검, 조직, 처리 시간 지연의 상태 후, RNA 추출 및 RNA 처리 후 추출 하는 동안 기술 해 동. 총 처리 시간 사후 조직 발견 죽은 동물을 안락사에 반대 하는 동물에서 발견 한 경우 특히 평가 한다. 위에서 설명한 대로 RNA 림프절, 상대적으로 안정 하지만 처리에서 긴 지연 저하, 특히 불안정 한 녹취 록에 대 한 발생할 수 있습니다. 샘플은 서로 다른 양의 시간에 대 한 필드에 남아 있는 시체 사이 비교 하는 경우 혼란 시간 변수는 있을 수 있습니다. 조직의 조건 pathologic 변경 관련 감염 된 조직의 무결성의 저하는 RNA 안정성을 줄일 수 있기 때문에 평가 한다. 예를 들어 낮은 RNA 품질 세라의 placentome에서 관찰 되었습니다-감염 된 동물-낙태 (Boggiatto 그 외 여러분, 제출). 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 시간/지연 후 재개 보존 솔루션의 사용에 의해 완화 됩니다. 조직 조각의 두께 적절 하 고 신속한 조직 ( 테이블의 자료에 언급 된 방부 제를 사용 하 여 < 5 m m 두께)으로 방부 제 솔루션의 침투를 허용 하도록 충분히 낮은 수 있습니다. RNA 추출 하는 동안 버퍼 RNase 무료 고 장갑 및 기타 연락처 오염된 항목 (RNases 피부에는) 피해 야 한다. 림프절 조직의 연 삭, 잠재적인 RNases의 가장 큰 원천, 조직에 있을 것입니다 하지만 절차의 모든 단계에서 오염 물질의 도입을 줄이기 위해 도움이 됩니다. 프로토콜에 설명 된 대로 RNA 게시물 추출, 처리, 약 RNA 수 샘플링 튜브로 냉동 고-80 ° C에서 저장 하기 전에 동결-해 동 품질 및 수량 분석을 위한 샘플을 필요에.
RNA 샘플의 저하에서 유래 뿐만 아니라 절차에 있는 수확량을 낮은, 림프절 조직 단계 4.3 프로토콜에서의 비효율적인 균질 때문일 수 있습니다. 비록 큰 파일럿 실행에서 효과적으로 해리 대부분 림프절 조직 이빨 회전자-stator dissociator 여기에 설명 된 RNA 보존 솔루션에서 외피 조직 (증가 딱딱한)의 질감을 변경할 수 있습니다 note. 페 놀 기반 시 약에 균질 이어야 한다 단계 4.3.1에서에서 설명 했 듯이, 분리 완료 되는 경우 반복. 박격포와 유 봉 연 삭,이 사양으로 균질 화기에 액세스 하지 않고 실험실에 대 한 또 다른 대안 이다 지상 샘플 페 놀 기반 시 약에의 한 물의 resuspension 다음. 그러나, 일회용 튜브에 균질 박격포와 유 봉, 더 가능 하 고 짧은 워크플로 여러 샘플 처리에 대 한 샘플 손실 연 삭 때의 부재를 포함 하 여 냉동된 조직을 분쇄 하는 데 여러 잠재적인 이점을 선물합니다 정리, 그리고 잠재적인 접촉 감염 된 동물에서 직물의 경우 전원 샘플.
아브라함 외. 48 28S와 18S 리보솜 RNAs의 낮은 복구와 마지막 RNA 제품에 큰 5S RNA 피크 (차례로, 림프 노드 처리에 대 한 수는 tiss의 불완전 한 분리로 인해 세포의 불완전 한 세포의 징조 수 있습니다 설명 ue)입니다. 그림 6B 소 선 림프 노드를 결합 조직에 매우 높은 효과적으로 균질 하지 않았다의 조각에서 생성 된 RNA 프로 파일의 예를 제공 합니다. RNA 수익률 계산 해야 하 고 샘플 분석 비슷한 복구 조직의 밀리 그램 당 가져온 RNA 시퀀싱에 의해 직접 비교를 위한 샘플 같은 균질을 사용 하 여 일괄 처리에서 처리 확인을 위해 집합에 걸쳐 모니터링 모든 샘플에 대 한 전략입니다. Note 쐐기 샘플링 접근도 피하는 광범위 한 결합 조직의 지역에 독점적으로 하는 샘플의 컬렉션에서 에이즈.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다. 모든 연구는 농업의 미국 학과, 농업 연구 서비스에서 교내 자금 투자입니다. 특정 제품에 대 한 모든 참조 실험의 재현성을 위해 제공 되 고 연방 정부에 의해이 제품의 모든 지지를 대표 하지 않는다.
Acknowledgments
저자는 제임스 포 세 모든 videography 및 비디오 처리; 그의 뛰어난 작품에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 디지털된 가축 이미지;의 세대에 그의 뛰어난 작품에 대 한 마이클 마티 릴리 아는 발터에 대 한 그녀의 RNA 추출 및 Bioanalyzer 실행; 미치 파머와 도움이 검토 및 림프 노드 이미지;에 대 한 피드백에 대 한 칼 리 Kanipe 동물 보호 그리고 그들의 노력 및 축산 지원의 모든 국립 동물 질병 센터와 차례의 준비에서 수의 직원 들.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Disposable scalpels | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Tissue forceps, rat tooth | Fisher Scientific | 12-460-117 | Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference |
| 3 mm punch biopsy needles | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Sharps container (small and transportable for necropsy) | Stericycle | 8900SA | 1 qt. size shown here |
| Cutting boards or disposable trays | Fisher Scientific | 09-002-24A | Available in a variety of sizes, depends on user preference |
| Personal protective equipment | Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.) | ||
| Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) | ThermoFisher | 15596026 | |
| Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) | ThermoFisher | 12183018A | Designed for up to 100 mg tissue |
| 100% Ethanol (200 proof for molecular biology) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (General, for gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Can also make from scratch in the laboratory |
| Deionized formamide | EMD Millipore | S4117 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) | Agilent | G2939BA | |
| FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Plastic spreader (L-shaped spreader) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Only needed for sterility testing for samples from infected animals |
| Necropsy knives | Livestock Concepts | WI-0009209 |
References
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