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Immunology and Infection

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

Este protocolo fornece uma visão geral dos procedimentos para o isolamento do RNA para o perfil de transcriptomic do nó de linfa de tecidos de animais de grandes porte, incluindo etapas na identificação e excisão dos gânglios linfáticos do gado e animais selvagens, abordagens de amostragem para fornecer consistência em vários animais e considerações mais resultados representativos para a preservação de pós coleta e processamento para a análise do RNA.

Abstract

Animais de grandes porte (gado e animais selvagens) servem como importantes reservatórios de agentes patogénicos zoonóticos, incluindo Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellae Escherichia colie são úteis para o estudo da patogênese e/ou propagação das bactérias em hospedeiros naturais. Com a função chave de linfonodos na resposta imune do hospedeiro, linfonodo tecidos servem como uma fonte potencial de RNA para análises de transcriptomic a jusante, a fim de avaliar as mudanças temporais na expressão gênica em células no decorrer de uma infecção. Este artigo apresenta uma visão geral do processo de coleção de nó de linfa, amostragem de tecido e a jusante do RNA processamento em gado, usando bovinos (Bos taurus) como um modelo, com exemplos adicionais provenientes do Bisão-americano (bison Bison ). O protocolo inclui informações sobre a localização, identificação e remoção dos gânglios linfáticos de diversos sites chaves no corpo. Além disso, uma metodologia de amostragem de biópsia é apresentada que permite a uma consistência de amostragem em vários animais. Várias considerações para preservação de amostra são discutidas, incluindo a geração de RNA apropriado para jusante metodologias como a sequenciação do ARN e RT-PCR. Devido os longos atrasos inerentes a estudos de curso de tempo grandes animais vs rato, apresentam-se resultados representativos de bison e tecidos de bovinos do nó de linfa para descrever o tempo de degradação neste tipo de tecido, no contexto de uma revisão da trabalho metodológico anterior na degradação de RNA em outros tecidos. Em geral, este protocolo será útil para ambos os pesquisadores veterinários começando transcriptome projetos em grandes amostras de animais e biólogos moleculares interessados em aprender técnicas para processamento de em vitro e em vivo amostragem de tecido.

Introduction

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A sequenciação do ARN da transcriptoma de linfonodos fornece a oportunidade para caracterizar a resposta imune dos animais para uma variedade de agentes patogénicos. Enquanto esta metodologia tem sido utilizada extensivamente em camundongos, análises tem recentemente expandido para maiores mamíferos1,2. Pecuária/grandes animais linfonodos podem ser usados para caracterizar respostas do hospedeiro a uma infecção, não só para a sua utilização em estudos de susceptibilidade genética ou vacina e para a identificação de alvos para o desenvolvimento de drogas, mas também como sistemas modelo para estudos em humanos em doenças zoonóticas. Por exemplo, no caso da brucelose (uma doença bacteriana zoonótica que impactos meio milhão de pessoas ao redor do mundo cada ano), apesar do aumento significativamente os custos, estudos em ovinos ou caprinos são mais relevantes para a infecção humana e vacina humana desenvolvimento de modelos animais de laboratório. Modelos de infecção mouse recapitular a infecção do sistema reticuloendotelial, mas não os sinais clínicos característicos3.

Em experimentos com animais grandes em comparação com estudos de animais de laboratório, o processo de tecido colheita necessariamente envolve um atraso maior entre a eutanásia e a coleção de tecido, que apresenta um potencial desafio para a preservação da RNA de alta qualidade. O RNA intacto é essencial para a geração de dados transcriptomic biologicamente relevantes. A geração do RNA de alta qualidade das amostras de tecido é particularmente crítico para estudos de grande patógeno animal realizado em instalações de contenção. Tais estudos são inerentemente mais difíceis de executar, como eles não só exigem aprovado instalações e pessoal altamente treinado, mas também carregam custos financeiros significativos, que, dependendo do trabalho, que podem variar de dezenas a centenas de milhares de dólares. Estes tipos de estudos envolvem também uma colaboração interdisciplinar e o conhecimento interdisciplinar para a sua conclusão, adicionando à sua complexidade. Portanto, formação sobre, desenvolvimento e adesão a um sistema simplificado para a coleta de amostra e preservação fornece benefícios significativos para a jusante estudos moleculares de tecidos de animais infectados.

A coleção de linfonodos maiores apresenta desafios adicionais para a coleta de tecido, em comparação com a amostragem semelhante de murino linfonodos. A preparação para a excisão de amostra exige um conhecimento básico da anatomia do nó de linfa, incluindo as estruturas internas relevantes. A estrutura de um nó de linfa é composta por lóbulos linfoides rodeados por seios cheios de linfa. Estas estruturas são colocadas dentro de uma cápsula fibrosa, resistente. 4 um lóbulo linfoide é "anatômica e funcional unidade básica do nó de linfa" e é composto de folículos, uma unidade profunda cortical e cordões medulares e seios4 (figura 1A). Linfócitos B e T são home aos folículos e profundo corticais unidades, respectivamente. Essas estruturas fornecem um andaime 3D e facilitam a interação entre os linfócitos e antígeno ou células apresentadoras.

Grosseiramente, folículos e unidades profundo corticais podem ser identificadas na superfície de corte como eles contêm uma malha reticular mais densa e aparecem mais escuros do que os seios, que são compreendidos por uma malha reticular mais delicada e aparecem mais leves (figura 1B). Por convenção, os patologistas referem-se às regiões dos gânglios linfáticos como o córtex superficial (folículos), o paracórtex (fundo corticais unidades) e a medula (cordões medulares e seios). Um exame adequado das três regiões tem sido considerado como a melhor prática em diretrizes de exame patológico de rotina para linfonodos5. Observe que há uma variação considerável a consistência, tamanho e cor dos gânglios linfáticos, mesmo dentro de um único animal. Como idade de animais, os gânglios linfáticos tendem a diminuir de tamanho e tornam-se mais firme do que aqueles de animais mais jovens, normalmente devido a um aumento em seu tecido conjuntivo e uma redução do linfoide normal estrutura6,7.

Figure 1
Figura 1. Anatomia do nó de linfa. (A), esta imagem mostra a anatomia do nó de linfa, representando estruturas chaves. (B) ainda esta imagem mostra um nó de linfa bovina cortado em secção transversal. Destacam-se as estruturas relevantes/camadas que são visíveis a olho nu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dependendo a questão experimental, linfonodos diferentes será de interesse para a recolha e análise. Linfonodos periféricos são aqueles localizados profundamente no tecido subcutâneo. Nos bovinos, linfonodos periféricos ou superficiais frequentemente utilizados na prática clínica e experimental incluem parótida, submandibular, retrofaríngeos, pré-escapulares, pré-femurais (precrural) e superficial inguinal (supramamários nas fêmeas, escrotal nos machos) ( A Figura 2). Na tabela 1, as propriedades de chaves linfáticos superficiais, conforme descrito no gado sistema8, são descritas. Abaixo, alguns planos de recolha de linfonodo potenciais para doenças infecciosas bacterianas, de gado são apresentados como ponto de partida para a investigação.

Brucella abortus/Brucella melitensis: padrão necropsies por b. abortus-infectados de gado e b. melitensis-cabras infectadas no centro nacional de doença Animal recuperar supramamários das, prescapular e tecido de linfonodo parotídeo , tanto para a moagem para a enumeração de bactérias e para a preparação de RNA para o perfil de expressão acolhimento do RNA. B. abortus regularmente podem ser recuperados em cada um destes gânglios linfáticos em bovinos experimentalmente infectados9. A presença de bactérias em cada um desses tipos de nó de linfa pode ser detectada em b. melitensis-infectados cabras até pós-infecção pelo menos nove meses, utilizando as metodologias baseadas em RNA de nossos estudos (Boggiatto et al, inédito). Salmonela SP.: O prescapular, subiliac (pré-femurais), e linfonodos mesentéricos foram úteis durante a criação de perfil de carcaças de gado para uma prevalência de Salmonella 10,11,12 e seria de interesse potencial para estudos de transcriptomic. Escherichia coli O157: H7: linfonodos mesentéricos (no intestino médio e intestino delgado distal locais) podem ser os sites de uma recuperação ocasional das bactérias em bezerros infectados (mas não em bovinos adultos infectados)13. Leptospirose (Leptospira SP.): uma crônica persistência das bactérias tem sido observada em linfonodos drenam a glândula mamária14. Mycobacterium bovis : Nos bovinos, as bactérias foram recuperada infecção pós-experimental de gânglios linfáticos do mediastino e traqueobrônquica de bezerros15. Além disso, o linfonodo RNA tem sido utilizado para examinar as respostas de grande animal hospedeiro de vírus, tais como a síndrome respiratória e reprodutiva suína vírus2. A Figura 2 mostra a localização de um subconjunto desses principais linfonodos do corpo de bovinos.

Figure 2
Figura 2: Cartoon retratando locais selecionados do nó de linfa no Bos taurus . Os linfonodos numerados são anotados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este documento e o vídeo associado, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes linfonodos animais para estudos de RNA, projetados para ser informativo para biólogos moleculares envolvidos em estudos de transcriptomic de infecções de animais grandes. Primeiro, nós fornecemos uma visão geral do procedimento de isolamento para os gânglios linfáticos, usando amostragem de tecidos bovinos e bison como exemplos. Emparelhado com esta demonstração, conforme exibido no vídeo, é um fluxo de trabalho para uma amostra de tecido pode ser reproduzido para isolamento de RNA. Em seguida, descrevemos considerações importantes para o processamento de um linfonodo infectado, com foco na segurança, consistência e qualidade do RNA.

A preparação do RNA do tecido com um reagente de isotiocianato de guanidina-fenol acidificado é baseada no método original de Chomczynski e Sacchi16,17, com uma purificação sobre colunas de rotação silicone-baseado na presença de agentes de caotrópicas baseados no trabalho de Vogelstein e Gillespie18original. Também examinamos o potencial para a recuperação do RNA para transcriptomics de gado gânglios linfáticos preservados por métodos alternativos. Finalmente, podemos explorar o impacto da variável tempo sobre a qualidade do RNA em necropsias de animais grandes, incluindo uma experiência representativa, retratando o efeito de um aumento no tempo entre a eutanásia e a amostragem no perfil de RNA recuperado de bison e linfonodos de bovinos. Este artigo será útil não apenas para biólogos moleculares, mas também ao veterinários pesquisadores iniciando estudos transcriptomic.

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Protocol

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Os procedimentos de necropsia animal retratados aqui abrangidos os protocolos aprovados IACUC no centro nacional de doença Animal, Ames, IA. Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes aprovadas para cuidados com animais e bem-estar.

1. pré-planejamento antes de necropsia

  1. Antes da necropsia, prepare os seguintes materiais para o transporte para a suíte de necropsia:
    1. repleto de 1,5 ou 2 tubos de microcentrifuga mL ~ 1,0 mL da solução de preservação de RNA, em um recipiente de rack ou transporte. Certifique-se de seguir as orientações do fabricante para a proporção do volume da solução de preservação para o volume do tecido.
    2. Bisturis descartáveis e pinça limpa e esterilizada: um conjunto para dissecação da pele e um conjunto diferente de recolha dos gânglios linfáticos (uma para cada nó de linfa, por animal), evitando assim a contaminação da pele e flora ambiental com o nó de linfa tecidos.
    3. 3 mm socar ferramentas de biópsia, necrópsia, facas, um recipiente de objectos cortantes de bisturis usados e ferramentas de biópsia e tábuas de corte ou bandejas descartáveis para uso na dissecção linfonodal.
    4. Use equipamento de protecção pessoal, incluindo os EPI necessário para o trabalho ao nível adequado para o sistema BSL.
    5. Autoclave reutilizáveis ferramentas de metal, incluindo o fórceps, panelas de metal antes da necropsia, utilizando os utensílios/armarinhos configuração.

2. identificação e amostragem dos gânglios linfáticos no gado e Bison

Figure 3
Figura 3 . Gânglios linfáticos do pescoço e cabeça bovina. (A), esta imagem mostra selecionados linfonodos da cabeça e do pescoço de Bos taurus. (B) esta imagem mostra o linfonodo parotídeo em secção transversal (à esquerda) em comparação com a glândula salivar parótida em secção transversal (à direita). Observe a diferença entre os tipos de duas tecido texturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Isolamento dos linfonodos pré-escapulares em gado e bison
    1. Eutanásia animal (gado ou bisão de qualquer idade, conforme apropriado para o experimento) baseado no protocolo IACUC local. Confirme a morte por métodos especificamente descritos no protocolo IACUC institucional, incluindo a falta de um batimento cardíaco, a falta de respiração e ausência de reflexo corneal. Mudar o animal para o andar de necropsia.
      Nota: Existem vários métodos de eutanásia humana usados na prática laboratorial de animais de grandes porte. No entanto, a administração intravenosa de solução de sódio pentobarbital de sódio e fenitoína é mais comumente aprovaram e utilizaram de forma. Consulte as diretrizes de AVMA para a eutanásia de animais. 19
      Atenção: Siga todos os protocolos de biossegurança relevantes para uma necropsia na instituição anfitriã, incluindo as orientações para a eliminação segura de objectos cortantes em um recipiente à prova de punção e a descontaminação de facas de metal reutilizáveis e fórceps. Este protocolo gera resíduos de objectos cortantes do uso de Bisturis descartáveis. Use equipamento de proteção individual conforme ditado pelas orientações institucionais, incluindo botas, macacão, luvas e óculos de proteção.
    2. Identifica 3 participantes para trabalhar sobre os tecidos animais.
      Nota: Aqui, Dissecador 1 vai ser encarregado em grande escala de corte dos tecidos animais desejados, Dissecador 2 irá se recuperar dos gânglios linfáticos as seções diferentes de animais e Dissecador 3 vai funcionar em uma tabela separada para isolar as secções de cada nó de linfa e transferi-los para tubos com uma solução de conservante.
    3. Comece colocando o animal em prostração lateral.
    4. Estender o ombro ao mover o membro da frente de volta ao nível do joelho (carpo); Este movimento irá trazer de volta o ombro e permitir uma mais fácil palpação do nó de linfa. Sentir a presença do nó de linfa "caroço".
      Nota: Durante condições de doença, linfadenopatia pode estar presente, que facilita a identificação dos linfonodos, mas esse processo também pode afetar a arquitetura do linfonodo, composição e consistência.
    5. Uma vez localizado e com o ombro ainda estendido, use uma faca bisturi ou necropsia tornar-se uma incisão na pele ao longo do contorno do ombro.
      Nota: Não restringir o tamanho da incisão, mesmo se o linfonodo foi localizado através da palpação. Uma incisão maior fornece fácil acesso aos tecidos mais profundos e facilita a excisão do nó de linfa para o Dissecador.
    6. Usando um par de pinças, retrai a pele para revelar o ponto do ombro e a musculatura do pescoço.
      Nota: Os linfonodos pré-escapulares é frequentemente encontrado na gordura subcutânea, especialmente em animais overconditioned.
    7. Mais uma vez, palpe a localização do nó de linfa (Figura 3A).
      Nota: Ao contrário da gordura subcutânea, o linfonodo manterá sua forma quando palpados. Além disso, linfonodos não são contíguos com qualquer tecido circundante, como eles são delimitados por uma fina cápsula fibrosa.
    8. Depois de localizar o linfonodo pré-escapulares, cuidadosamente dissecar a gordura subcutânea, usando um bisturi e uma pinça e isolar o nó de linfa.
      1. Olha para a presença de uma cápsula fibrosa fina, conforme representado na figura 1B, para distinguir entre o nó de linfa e tecido adiposo; gânglios linfáticos não são contíguos com qualquer tecido circundante.
    9. Transferência do nó de linfa para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.
      Nota: A aparência destes gânglios linfáticos no bison é semelhante. O associado vídeo retrata a aparência do nó de linfa pré-escapulares como dissecados fora o ombro direito de um Bisão-americano.
  2. Isolamento dos linfonodos parotídeos em gado e bison
    1. Comece colocando o animal em prostração lateral no chão necropsia. Localize a articulação temporomandibular (ATM).
      1. Se isto é difícil de localizar, mover a mandíbula lentamente e determinar o local em que a mandíbula anexa ao crânio; Esta é a TMJ.
    2. Usando um bisturi ou necropsia faca, cuidadosamente fazer uma incisão na pele. Iniciar a incisão dorsal para a articulação e estendê-lo ventralmente/verticalmente ao longo do queixo.
    3. Disse a pele fora para revelar o tecido subcutâneo. Glândula salivar parótida será visível em primeiro lugar, devido ao seu grande tamanho, aparência de superfície lobulada e coloração vermelha.
    4. Usando fórceps e um bisturi, mova a glândula salivar parótida lado para encontrar o linfonodo parotídeo sentado só craniana e medial à glândula salivar (Figura 3A). Examine o tecido do linfonodo parotídeo para textura antes de processamento adicional.
      Nota: gânglios linfáticos do rosto (parótido e submandibular) estão associados com as glândulas salivares, que pode confundir o isolamento do nó de linfa. Em comparação com os gânglios linfáticos, as glândulas salivares são muito maiores e têm uma aparência de superfície lobulada. Além disso, na superfície de corte, as glândulas salivares são homogêneas na natureza e não exibem o clássico padrão arquitetural cortical e medular dos gânglios linfáticos (Figura 3B).
    5. Impostos especiais de consumo a glândula com um bisturi. Transferi-lo para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.
  3. Isolamento dos linfáticos supramamários em gado feminino e bison
    1. Coloque o animal em prostração lateral.
    2. Levante as pernas traseiras para expor a região inguinal e localizar o úbere.
      Nota: Em um animal saudável, não lactantes, palpação destes gânglios linfáticos pode não ser possível. Em um animal em lactação, estes linfonodos pode ser palpáveis na borda caudal da base do úbere.
    3. Usando um bisturi, fazer uma incisão dorsal só para o úbere, correndo ao longo da parte superior da coxa, para expor as supramamários das glândulas.
    4. Dissecar o tecido subcutâneo e localizar o nó de linfa supramamários das incorporado em uma fina camada de gordura subcutânea. Se não é visualmente diferenciável, palpe o tecido exposto a presença de uma estrutura firme dentro da gordura subcutânea.
    5. Usando fórceps e um bisturi, disse cuidadosamente para fora do nó de linfa de gordura. Transferi-lo para a mesa de dissecação do nó de linfa, usando uma bandeja plástica para a transferência de tecido, para cortar ainda mais.

3. corte e armazenamento dos gânglios linfáticos

  1. Passe os linfonodos isolados do Dissecador 2 para dissector 3 numa mesa de dissecação adjacente ao espaço principal de necropsia. Coloque cada linfonodo em uma seção fresca de uma placa de corte. Pre-rotule as tábuas de corte em seções por nó de linfa, para facilitar o recebimento de múltiplos linfonodos em sucessão. De amostras infecciosas, use bandejas descartáveis.
  2. Usando fórceps e uma faca descartável de bisturi ou necropsia, remova uma seção do nó de linfa. Usando uma faca afiada, fazer um corte sagital de abrir o nó de linfa.
  3. Examinar o interior do linfonodo, especialmente em espécimes de animais infectados, à procura de assimetria, lesões, as diferenças de cor, etc. registar as observações.
  4. (Opção 1) Pequenos cortes histologicos
    1. Use Bisturis descartáveis para excisar as partes de cada nó de linfa que são menos de 5 mm de espessura e cada pedaço de transferência para um tubo com uma solução de preservação de RNA com pinça limpa.
  5. (Opção 2) Metodologias de biópsia ou seccionamento de linfonodo
    Nota: Biópsias ou corte metodologias, quando aplicada às secções paralelas do nó de linfa através de diferentes nós e os animais, fornecem consistência do tecido amostrado para uma análise de RNA em massa.
    1. Cunha, método de seccionamento
      1. Depois de examinar a seção sagital para capturar células através do perfil do nó de linfa, impostos especiais de consumo uma cunha em forma de torta do nó de linfa, do centro para a cápsula externa. Para um nó de 2 cm de largura (tamanho padrão; ver tabela 1), uma cunha de corte para o centro que é de 4 mm de comprimento de arco exterior e 5 mm de espessura, terá um peso molhado de ~ 100 mg.
      2. Usando o bisturi, corte da Cunha em pedaços pequenos, não mais espessas do que 5 mm e aproximadamente 50-100 mg cada no peso do tecido molhado.
        Nota: Para obter consistência, processe todas as peças da cunha de um único nó de linfa ou em um lote ou em tubos separados seguido de RNA pool para fornecer um perfil representativo do RNA a partir do nó de linfa de interesse.
      3. Coloque os pedaços de tecido com pinça para tubos contendo pelo menos 10 volumes de solução de preservação de RNA, em comparação com o volume do tecido.
    2. Método de biópsia do perfurador
      1. Se o objectivo é recolher seções específicas, tais como folículos específicos do nó, selecione uma ferramenta de biópsia do perfurador. Selecione uma ferramenta consistente com o tamanho da amostra desejada por coleção. Soco biópsia ferramentas estão disponíveis em uma variedade de tamanhos, de 1 a 8 mm de diâmetro.
      2. Localize visualmente as regiões de interesse para amostra no nó de linfa.
      3. Use a ferramenta de biópsia do perfurador para excisar as seções de interesse, pressionando e girando a ferramenta no tecido para criar o núcleo. Transferi o pedaço de tecido com fórceps para um tubo contendo pelo menos 10 volumes de solução de preservação de RNA. Se mais espessa do que 5 mm, use fórceps e um bisturi para dividir ainda mais o tecido em pedaços menores.
  6. Uma vez que as amostras foram transferidas para a solução de preservação (EG., RNALater), transportá-los para o laboratório à temperatura ambiente.
  7. Armazene as amostras em 4 ° C durante a noite para permitir a penetração do tecido.
  8. No dia seguinte, decantar a solução conservante de RNA em excesso e armazenar as amostras a-80 ° C. Remova o conservante tanto quanto possível antes de congelar as amostras. Use uma ponta de micropipeta P1000 e/ou P200 para uma eficiente remoção de solução conservante de RNA.
    Cuidado: Descarte a solução de preservação decantada apropriadamente, baseada nas propriedades infecciosas do agente patogénico utilizados bem como os riscos químicos e ambientais da solução conservante conforme especificado na ficha de segurança.
    Nota: As orientações fornecidas aqui são fornecidas para a solução de preservação de RNA descrita na Tabela de materiais. Consulte as orientações do fabricante se usando soluções alternativas de preservação.

4. processamento de RNA linfonodos

Atenção: Use um jaleco, luvas e protecção ocular adequada para as etapas de processamento.

Nota: O reagente fenol-base usado aqui é descrito na Tabela de materiais (e o protocolo baseia-se sobre as orientações do fabricante)20. O uso de reagentes alternativos baseados em fenol pode necessitar de uma modificação do procedimento, com base em recomendações do fabricante para o produto específico adquirido.

  1. Antes de acessar as amostras, pre-alíquota o reagente de fenol-base refrigerada (4 ° C) para tubos de homogeneização (1,5 mL/tubo), usando uma pipeta.
    Atenção: O fenol é tóxico, corrosivo e um perigo para a saúde. Clorofórmio é tóxico e um perigo para a saúde. Complete etapas de processamento 4.1-4,9 em uma capa das emanações químicas e usar luvas para evitar qualquer contacto com os produtos químicos. Nos Estados Unidos, o clorofórmio é um resíduos perigosos; Elimine os tubos contendo resíduos perigosos de acordo com as directrizes locais e institucionais. Processo de amostras de tecido de animais infectados com patógenos sob a BSL-2 correspondente, BSL-3 ou diretrizes de BSL-4.
  2. Uma vez que uma amostra pode ser solta dos tubos de microcentrifuga com pinça limpa, imediatamente transferi aproximadamente 50-100 mg do tecido preservado para o tubo de homogeneização contendo o reagente fenol-baseado.
    1. Limite a descongelar antes da adição de reagente fenol-baseado. Use armazenamento em gelo seco quando múltiplas amostras são removidas do congelador para processamento.
  3. Firmemente o tubo do tampão, coloque-o sobre o homogenizador e homogeneizar a amostra com um homogeneizador de rotor-estator no reagente fenol-baseado. Complete o processamento em temperatura ambiente. Quando terminar, verifique para uma aparência turva garantir que a amostra foi homogeneizada com êxito; o tecido deve ser disperso em uma suspensão turva.
    Nota: Uma configuração de extração de 2 min do RNA é usada (a configuração de RNA_02_1 pré-estabelecidos para o homogeneizador descrito na Tabela de materiais; projetado para tecidos congelados). O rotor-estator especificado no presente protocolo (ver a Tabela de materiais) é grande-dentado e adaptada para a homogeneização de uma gama de tipos de tecido, incluindo o material fibroso. A configuração de RNA_02_01 é projetada especificamente para congelados (ao contrário de frescos) tecidos. Como linfonodos tem componentes de tecido conjuntivo fibroso, recomenda-se um homogeneizador de rotor-estator do mesmo modo otimizado para alcançar uma dissociação eficaz. Consulte o Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental21 para obter informações adicionais sobre as recomendações de homogeneização.
    1. Se grandes pedaços de tecido permanecem após a homogeneização, repita o procedimento de homogeneização. A fim de recuperar com eficiência o RNA, o tecido deve ser bem dissociado.
    2. Para peças de linfonodo mais fibrosas, use pinças e tesouras pré-cortar o pedaço do nó de linfa em vários pedaços menores, antes da transferência para o tubo de homogeneização. Conforme descrito na introdução, linfonodo tecidos de animais mais velhos podem ser mais fibrosos.
      Nota: Se uma dupla análise do hospedeiro e patógeno RNA é desejada, tratamento adicional (como homogeneização do grânulo) pode ser necessário para a recuperação do RNA bacteriano, especialmente se patógenos gram-positivos estão presentes nos tecidos.
  4. Imediatamente Retire os tubos de amostra homogeneizada e transferi-lo para livre de RNase microcentrifuga tubos (2,0 mL no tamanho) com uma micropipeta P1000.
  5. Centrifugar a amostra por 5 min a 12.000 x g a 4 ° C para remover quaisquer resíduos da amostra. Usando uma ponta de micropipeta P1000, transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, deixando a pelota.
  6. Incube o sobrenadante por 5 min à temperatura ambiente. Dividi cada amostra entre microcentrifuga dois 1.5 tubos.
  7. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL do reagente fenol-base (ou seja, 0,3 mL de uma amostra de 1,5 mL); invertê-lo à mão por 1-2 min misturar as fases, mas não o vórtice da amostra. -Incube por 2 min à temperatura ambiente.
  8. -Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
  9. Remova cuidadosamente a fase superior, aquosa clara, com uma ponta de micropipeta (P1000 ou P200) que formará a camada superior, sem interromper a intérfase ou camada de vermelho de fenol-clorofórmio. Transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugadora.
  10. Misturar com igual volume de etanol 100%; homogeneiza por inversão do tubo de 4 - 5 vezes. O tubo vai aparecer muitas vezes nublado.
  11. Com uma ponta da micropipeta, transferi o líquido para uma coluna de rotação comercial baseada em sílica, purificar e eluir o RNA, seguindo instruções22 as indicações do fabricante. Eluir o RNA gerado a partir de ~ 50 mg de tecido em 50-100 µ l de água livre de RNase.
    Nota: Enquanto a extração de reagente fenol-base remove DNA na fase orgânica, para o uso a jusante do RNA em qRT-PCR e/ou aplicações de sequenciação do ARN, é recomendado um tratamento adicional de amostras do RNA com DNase.
  12. Alíquota do RNA eluted para separar os tubos para uso em uma avaliação de quantificação e de qualidade, para reduzir qualquer congelamento-descongelamento da amostra principal do RNA. Transferi os tubos a-80 ° C para armazenamento.
  13. No caso de linfonodo amostras provenientes de animais infectados com patógenos zoonóticos, sobretudo a nível de contenção a BSL-3, validar a amostra de RNA resultante da ausência de patógenos se a amostra será movida para uma área de contenção nível de biossegurança inferior para análise da qualidade, RT-PCR, e/ou elaboração de biblioteca-a sequenciação do ARN.
    Nota: É fundamental considerar os regulamentos locais, e no caso das diretrizes de inactivação do CDC (centros de controle e prevenção de doenças) para trabalho com agentes selecionados, é necessário validar todos os procedimentos de inativação no site local do pesquisador.
    1. Remova volume 1/10th de cada amostra de RNA eluted da etapa 4.12 (ou seja, 5 µ l de 50 µ l de RNA total). Usando uma técnica estéril, misture a amostra com 100 µ l de caldo de crescimento bacteriano em um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL. Usando um difusor de plástico estéril, espalhe a mistura de caldo-RNA através da superfície de uma placa de ágar.
      Nota: Selecione uma caldo tipo ágar placa e consistente com o crescimento do patógeno com o qual os animais foram desafiados.
    2. Incube a placa de ágar-ágar em condições específicas para o crescimento do patógeno com o qual os animais foram desafiados. Verifique a ausência de bactérias recuperadas antes de retirar as amostras a contenção BSL-3.
      Nota: O RNA eluted resultante, após a quantificação e testes de integridade, é adequado para aplicações a jusante, incluindo uma análise de RT-PCR e sequenciamento de RNA.
  14. Avalie a recuperação de RNA e pureza usando um espectrofotômetro. Para avaliar a qualidade do RNA, carrega 1-2 µ l da amostra eluted RNA para o espectrofotômetro para uma análise. Grave um espectro da amostra na faixa ultravioleta (UV).
    1. Do espectro UV, gravar a uma260/A280 ratio, a uma260/A230 ratio e o valor para a amostra260 (A = absorvância).
    2. Como single-stranded do RNA em uma concentração de 40 µ g/mL tem uma absorvância de 1.0 em 260 nm, calcular a concentração de RNA (µ g/mL), multiplicando-se o A260 x 40 para as amostras purificadas.
  15. Como um método rápido de avaliação da integridade do RNA, para excluir qualquer amostras degradadas de uma análise mais aprofundada, misture 2 µ l de cada amostra de RNA com 4 µ l de 1,5 x formamide de carregamento corante [95% desionisada formamida, 0.025% (p/v) de bromofenol, 0.025% (p/v) xileno cianol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% (p/v) SDS] em 1,5 mL microcentrifuge tubos de23,24.
  16. Aqueça os tubos a 70 ° C por 1 min e depois transferir os tubos em gelo por 1 min.
  17. Carregar as amostras de um gel de agarose 1% preparada em 1 x TBE (para uma descrição completa de uma eletroforese em gel de agarose nativo para o RNA, veja Rio, Ares Jr., Hannon e Nilsen)24. Separar as amostras por métodos de eletroforese de gel de padrão e confirmar a presença de bandas de RNA ribossomal 28S e 18S.
  18. Acompanhar a eletroforese em gel com métodos de análise quantitativa para a determinação de integridade do RNA [por exemplo, uma análise (número de integridade do RNA) Bioanalyzer e RIN] conforme descrito nos Resultados de representante e no Mueller, O. et al. 25 e Schroeder, a. et al. 26.

5. método de extração alternativa de fixada em formol, tecidos de parafina (FFPE)

Nota: Embora a preservação de tecidos FFPE não representa o método mais robusto de preservação de ácido nucleico, o protocolo apresentado abaixo pode ser uma maneira de estudar algumas alterações transcricionais quando outros tecidos preservados estão indisponíveis.

  1. Prepare reagentes de formalina para a preservação do tecido pela dispensação formalina em recipientes de plástico. Os tecidos devem ser conservados em formol, com uma relação de peso/volume de formalina: tecido de 20:1, respectivamente.
    Atenção: O formol é um conhecido carcinógeno humano e embora não agudamente tóxicos, exposição crônica (normalmente através de vapores inalados) pode representar um risco significativo para a saúde. Ventilação adequada e PPE (ou seja, o uso de luvas de nitrilo, para ser alterado dentro de 15 minutos após a exposição inicial) são necessárias para minimizar os riscos de saúde. Referem-se à norma formaldeído OSHA (29 CFR 1910.1048) para obter informações adicionais sobre a exposição de monitoramento e avaliação de riscos.
    Nota: Usar muito pouco formol pode afetar a capacidade do tecido de tornar-se totalmente preservada quando submerso em conservante.
  2. Após o isolamento do tecido de interesse, apare cuidadosamente o tecido a menos de 5 mm de espessura.
    1. Usando a pinça, cuidadosamente mergulhe o tecido aparado formalina para minimizar qualquer espirro.
      Nota: Os tecidos devem ser completamente mergulhados em formol para permitir uma completa fixação. É fundamental que todas as superfícies do tecido são completamente cobertas com formalina.
  3. Uma vez que os tecidos têm sido submersa em formol, permitem a fixação de tecidos ocorra para pelo menos 24 horas à temperatura ambiente.
    Nota: Formol penetra tecidos lentamente, a uma taxa de 1 mm por hora de todas as superfícies27,28. Portanto, mantendo a espessura das secções de tecido para menos do que os resultados de 5 mm em uma fixação rápida do tecido inteiro.
  4. Após a fixação, transferi os tecidos para um reagente adequado para a incorporação de parafina.
    Nota: por exemplo, os tecidos examinados neste manuscrito foram transferidos para etanol a 70% antes da incorporação.
  5. Incorpore os tecidos em parafina. 29
  6. Secção do tecido para 80-10 µm de espessura (uso 10-20 µm se miRNA é desejado a ser extraído)29.
  7. Usando o bisturi e pinça, retire um pedaço de tecido de 40 mg de cada amostra a ser processada e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga estéril, livre de nuclease.
  8. Utilize um kit comercial projetado para deparaffinization e recuperação de ácidos nucleicos de amostras de tecido FFPE para extrair o RNA das amostras preservadas.
    Nota: O kit referenciado na Tabela de materiais utiliza xileno e etanol lava para remover a parafina, uma etapa de tratamento de protease e um filtro de fibra de vidro para purificar o RNA.

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Representative Results

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O uso das considerações apresentadas neste artigo (passos 1-4 do protocolo) vai ajudar na recuperação do RNA de grandes amostras de animais que é adequada para uma análise a jusante em estudos de expressão de gene de anfitrião. A qualidade do RNA para aplicações a jusante é avaliada através de várias medidas padrão. Por espectrofotometria, a uma260/A280 ratio fornece uma medida da contaminação da proteína, e a uma260/A230 ratio fornece um outro meio de avaliação de pureza que irá detectar contaminantes químicos tais como fenol. Em cada caso, rácios de ~ 2.0 são provas do RNA de alta qualidade, e diminuição da rácios são sinais de contaminação. Importante, estas relações não fornece qualquer informação sobre a degradação de RNA, que pode ser avaliada qualitativamente (etapas 4.15-4.17) e quantitativamente (etapa 4.18, tais como através de um RNA número de integridade ou RIN Pontuação).

É importante notar que o nível de qualidade esperada do RNA recuperado de cortes de tecido do nó de linfa é, em média, inferior para o RNA recuperado de amostras de células brancas do sangue bovino. Em uma série abrangente de extracções de RNA de linhas de células e tecidos de bovinos, Fleige e Pfaffl30 encontrar que a média RIN (números de integridade do RNA como medido em um Bioanalyzer) variam entre < 5 para tecido jejuno e rúmen e > 9 de sangue branco células e corpo lúteo, com golo de RIN linfonodo caindo em meio a uma média de 6,9. Em geral, Fleige e Pfaffl nota30 que tecidos sólidos produzem escores RIN, variando de 6-8 e que os tecidos com maior concentração de tecido conjuntivo apresentam uma maior degradação média. A densidade do tecido conjuntivo no nó de linfa, além do nível intrínseco de RNases neste tipo de tecido, pode ser responsável para a incapacidade de consistentemente recuperar RNA com RIN escores > 9 de gânglios linfáticos.

No entanto, um exemplo de um perfil de Bioanalyzer para o RNA recuperado de um nó de linfa supramamários das bison utilizando a metodologia apresentada aqui é exibido na Figura 4A, demonstrando a recuperação de RNA com uma pontuação de RIN de 8,6 (principalmente intacto e apropriado para essencialmente todas as aplicações a jusante). RNA gerado a partir deste procedimento tem sido utilizado para gerar com êxito bibliotecas para uso na sequenciação do ARN; Este protocolo permite o isolamento regular de amostras do RNA de bison e linfonodos de bovinos com valores > 8 RIN (e muitas vezes > 9). Para um conjunto de amostra de oito amostras de RNA extraídos, o rácio de absorvância média em 260 nm/280 nm era 2.1 e em 260 nm/230 nm era 2.1, indicando uma contaminação de baixa proteína e uma baixa contaminação com produtos químicos como fenol, respectivamente. A recuperação média de ácidos nucleicos de cada extração foi 97 µ g ± 10 por ~ 100mg ou um rendimento de ~ 1 µ g de RNA/mg de tecido do nódulo linfático.

Figure 4
Figura 4 . Traços de qualidade representativa retratando a qualidade do RNA a partir de metodologias de extração. (A) este painel mostra um RNA total rastreamento do RNA de alta qualidade gerado a partir de um nó de linfa de bison, usando o procedimento apresentado neste manuscrito. (B), este painel mostra um traço de um bovino FFPE-amostra selecionada da tabela 4, retratando o RNA muito degradado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Devido aos desafios associados com o isolamento rápido de tecidos de carcaças grandes, especialmente no caso de amostragem de espécies selvagens, o impacto do atraso de tempo entre a eutanásia e a colocação das peças de tecido em uma preservação de RNA solução é de potencial interesse na análise. As informações na literatura sobre a estabilidade do RNA em linfonodo tecidos, em particular, são limitadas. Portanto, para fornecer informações sobre os parâmetros aceitáveis para coleta de tecido, caracterizou-se a estabilidade do RNA em eutanásia pós do bisão do nó de linfa.

Para este experimento, considerou-se como o tempo que o animal foi pronunciado morto pela falta de batimentos cardíacos e uma ausência de reflexo corneal tempo 0. Após o transporte da carcaça e o início da necropsia, ~ 15 min tinha decorrido antes da recuperação da primeira amostra do linfonodo (15-20 min era padrão em nossas observações para a recuperação de animais do campo; cursos de tempo irão variar dependendo da localização ). O linfonodo supramamários das foi identificado, e uma pequena parte do tecido foi removida e mantida à temperatura ambiente. Seções foram posteriormente tomadas em intervalos de aproximadamente 15 min e transferidas para o RNA conservante; no meio do curso do tempo, uma segunda amostra de linfonodo foi obtida o animal para o segundo conjunto de 4 pontos de tempo da série (Figura 5A; círculos fechados, Figura 5). RNA foi extraído em paralelo entre as peças do nó de linfa usando o método descrito acima. Este h 1 experimento revela que o linfonodo RNA retidos a maioria de sua integridade em todo o curso do tempo, com apenas ligeira redução da nota de RIN no final do curso de tempo (Figura 5B e 5C). Da mesma forma, RNA de bovinos pré-escapulares e parotídeos manteve sua integridade como medido pela pontuação RIN sobre ~ tempo 1h cursos post-mortem (Figura 5; o animal informações são fornecidas na tabela 2). Além disso, RNA foi extraído supramamários das seções de linfonodo que foram coletadas 8 h após a morte, com seções inteiras em meios de cultura de células em qualquer temperatura ambiente ou a 37 ° C para simular o tempo de armazenagem em uma carcaça de animal. RNA ribossómico foi observável mesmo após 8 h segurando vezes (Figura 5).

Figure 5
Figura 5 . Qualidade do RNA em amostras de linfonodo bison coletados através de tempo cursos pós-morte. (A), este painel mostra uma visão experimental de um procedimento de curso do tempo de 1 h. (B, C) Estes painéis mostram uma análise da qualidade do RNA para amostras colhidas através de um curso de tempo de 1 h de um nó de linfa supramamários das isoladas de um Bisão-americano. Gel de reflete amostras do RNA desnaturada em formamida e separaram em um gel não-desnaturação de 1%. Painel (C) retrata as mudanças no golo de RIN para cada amostra. Os dados de experimentos adicionais em bovinos pré-escapulares e parotídeos são sobrepostos como indicado. (D) este painel mostra um exemplo de gel do RNA, conforme descrito para o gel usado no painel (B), para amostras de linfonodos supramamários das processadas após 8 h de incubação em qualquer temperatura (faixa 1) ou a 37 ° C (faixa 2) em meios de cultura de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esses achados representativos são consistentes com os resultados de estabilidade do RNA para outras fontes e tipos de tecido. Tabela 3 fornece um resumo dos resultados de uma amostra de artigos publicados que investigaram a estabilidade do RNA sobre cursos de pré-preservação tempo. Nota que apenas tendências de golo de RIN e/ou rRNA gel observação (RNA total) estão incluídos na tabela, embora alguns papéis oferecem uma análise adicional da integridade do mRNA, como através da determinação dos rácios de 5' x 3' segmentos de RNAs selecionados (por exemplo, Fajardy et al) 31. no entanto, é importante lembrar que a tempos mais longos entre a morte e uma amostra de preservação podem resultar em alterações nos perfis de expressão de RNA, como demonstrado, por exemplo, para o tecido placentário31. Em comparação com transcrições estáveis, RNAs mais instáveis podem estar esgotados. Portanto, é importante utilizar um fluxo de trabalho rápido e simplificado para a recuperação de tecido para reduzir qualquer atraso, uma vez que o animal está disponível para necrópsia, para atingir os perfis mais biologicamente válidos do RNA. Seria um erro supor que a presença de intacto ribossómico (ARNR) indica a ausência de quaisquer alterações no perfil do transcriptoma. Ainda, os resultados representativos sugerem que mesmo com o aumento de processamento vezes necessário para amostragem de animais grande, é possível preparar o RNA que é adequado para uma análise de expressão do gene de amostras do nó de linfa.

Além disso, analisou-se o impacto da variável tempo pós descongelação; durante este tempo, o RNA é suscetível a degradação das nucleases presentes no tecido. A qualidade das amostras de RNA processado usando este protocolo com 0 ou 64 min de segurar o tempo à temperatura ambiente pós-descongelamento no passo 4.1 foi medida por um placar de RIN. Este experimento demonstra que o protocolo é bastante insensível para o tempo de degelo, tornando-o robusto para o processamento de amostras múltiplas (figura 6A).

Figure 6
Figura 6. Análise adicional dos parâmetros de qualidade de RNA. (A), este painel mostra a qualidade do RNA resultados por RNA purificado ou imediatamente após o descongelamento (0 min) ou após a realização de 64 min à temperatura ambiente antes do processamento. As barras representam a média de 3 peças de tecido para cada condição, ± o desvio-padrão. Todos os tecidos foram armazenados em uma solução de conservante de RNA antes de descongelar, conforme descrito no protocolo. (B), este painel mostra um Bioanalyzer rastreamento de uma amostra de um pedaço de mal homogeneizado linfonodo contendo grandes secções de tecido conjuntivo. O pequeno tamanho dos picos 28S e 18 anos, em comparação com os picos na faixa de 5S, é evidente. Isso também pode ocorrer devido à degradação do RNA, embora a linha de base relativamente plana entre o intervalo de 5S e o pico de 18S é alternativamente sugestiva de extração pobre; Ver Avraham, r. et al . 48 para obter detalhes adicionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como um ponto de comparação para o isolamento do RNA de linfonodos, realizou-se uma recuperação experimental de RNA de pedaços de linfonodos mesentéricos FFPE de gado. Conforme descrito acima, as amostras foram fixadas para 1 semana em formol antes da parafina incorporação, seguidos de 4 meses de armazenamento em parafina à temperatura ambiente. Os tecidos foram seccionados em seções de cinco a 10 µm, e usando o procedimento de extração de FFPE, aproximadamente 62 ng / µ l de RNA por amostra (± 14 ng / µ l) foi recuperado. Os rácios de absorvância a 260 nm/280 nm em média 1,9, indicando um produto com baixos níveis de contaminação de proteína, embora os rácios de230 A260/A eram desfavoráveis (tabela 4). Observe que o golo de RIN observado para estas amostras foram muito baixa (< 2), indicando uma degradação dos produtos RNA (tabela 4Figura 4B), consistente com a descrição de Srinivasan et al. 45. em ensaios utilizando qPCR, tipicamente pequenas secções do RNA, ou mais especificamente do cDNA (< 200 bp), são amplificados. Portanto, a amplificação de produtos pequenos ainda pode ocorrer a partir de amostras degradadas e qPCR análise pode ser realizada. Por exemplo, foi possível amplificar um segmento da proteína ribosomal S9 (RPS9) transcrição destas amostras FFPE-recuperado por qPCR. Os valores de CT foram consistentes entre as amostras e a média de 19,2 ± 1,8. Tenha em mente as limitações que estão presentes quando utilizando as amostras FFPE-preparados, no entanto, como produtos maiores não estão necessariamente presentes, e a degradação não pode ter ocorrido em uma taxa uniforme em todas as amostras. Portanto, este material pode ser usado para estudos com ressalvas, mas limitações significativas estão presentes para todas as aplicações a jusante como a sequenciação do ARN.

Tipo de nó de linfa Localização Comprimento Largura Regiões drenadas por nós
Prescapular Só medial à articulação do ombro; incluímos na gordura subcutânea e sob uma camada de músculo 1-10 cm 1,5-2 cm Pele do pescoço; ombro; e pele, músculos e articulações do membro inferior torácica (Ref. 8)
Pré-femurais (também chamado de precrural) Só dorsal e medial para a asfixiar, aproximadamente 12-15 cm acima da patela 8-10 cm 2,5 cm Pele do membro pélvico, abdômen e porções caudais do tórax (Ref. 8)
Retrofaríngeos Encontrado na linha média dorsal para a faringe 4-5 cm 2-3.5 cm Língua, membranas mucosas da cavidade oral, gengivas, lábios, palato duro, glândulas salivares, a maioria dos músculos do pescoço
Parótida Por via subcutânea localizado ventral para articulação temporomandibular, caudal ao músculo masseter (Ref. 8) 6-9 cm 2-3 cm Pele, subcutis, a maioria dos músculos da cabeça, músculos do olho e orelha, pálpebras, glândula lacrimal, porção rostral da cavidade nasal
Submandibular (pode ser o presente de 1-3) Localizado por via subcutânea na face medial do ângulo da mandíbula, associado com as glândulas salivares 3-4 cm 2-3 cm Focinho, lábios, bochechas, palato duro, parte rostral da cavidade nasal, a ponta da língua, pele e músculos da cabeça (Ref. 8)
Supramamários das (fêmea superficial inguinal, normalmente 2 presentes) Encontrado caudalmente e dorsalmente em relação as glândulas mamárias 6-10 cm Úbere, vulva, vestíbulo da vagina, pele sobre os aspectos de caudais e medial da coxa, face medial da perna
Escrotal (versão masculina de superficial inguinal) Encontrou-se abaixo do tendão prepublic dentro de uma camada de gordura ao redor do pescoço do escroto 3-6 cm Escroto, prepúcio e pênis

Tabela 1. Visão geral dos bovinos linfáticos superficiais.

Descrição do animal Localização no manuscrito Idade Sexo Estado de saúde
Gravou o bison Bison Bison em vídeo - recuperação de linfonodo 5-6 yo Fêmea Saudável
Filmado Bos taurus Bovina em vídeo - recuperação de linfonodo 7-8 Ei Macho castrado Saudável
Bison bison para estudo de estabilidade do RNA Fig. 5A-C 5-6 yo Fêmea Saudável
Bos taurus A para estudo de estabilidade do RNA Fig. 5, Fig. 6A 7-8 Ei Macho castrado Saudável
Bos taurus B para estudo de estabilidade do RNA Fig. 5 7-8 Ei Macho castrado Saudável
Bos taurus para estudo de qualidade FFPE Tabela 4, Fig. 4B 0,5 yo Macho castrado Saudável (controle de estudo de infecção O157: H7)
Note-se que a metodologia tem sido usada em vários adicionais gado, bison e amostras de linfonodo de bode, além daquelas que são destacadas aqui.
Além disso, usamos a mesma metodologia no linfonodo coletado de uma 1.5 mo. de idade fêmea bezerro.

Tabela 2. Características dos animais utilizados em estudos-piloto.

Tipo de tecido Método de preservação Segurando as condições Conclusão de degradação Referência
Bovino músculo esquelético, tecido adiposo, fígado Encaixe de congelamento (líquido N.2) 4 ° C, vácuo embalados tecido Músculo do RNA mais estável (mesmo a 8 dias de armazenamento); adiposo e fígado principalmente estável-24 h. avaliada pelo aparecimento de bandas de rRNA Bastos et al. (2007)32
Cólon humano, cancro colo-rectal Solução de preservação de RNA Temp do quarto. RIN preservado por 2 h., mas o subconjunto dos genes mostram mudanças na expressão de 0,5-2 h. Yamagishi et al (2014)33
Fígado de rato, baço Solução de preservação de RNA, ou snap congelamento (chorume de gelo seco) Dentro da carcaça do mouse (37 ° C) Amostras do baço foram estáveis fora a 1,5 h; amostras de fígado exibiram degradação anterior (redução de 24% no RIN em 105 min.) Choi et al (2016)34
Fígado de rato Nenhum (homogeneizada fresca em guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio) 25 ° C, 37 ° C Degradação limitada para fora às 4 h. a 25 ° C, mas extensa degradação a 37 ° C por 4 h. (conforme observado usando o golo de RIN). Almeida et al (2004)35
Íleo humano Solução de preservação de RNA, ou snap congelando 4 ° C, 37 ° C Geralmente estável a 1,5 h. a 37 ° C; Estável contra h. 6 a 4 ° C (conforme observado usando o golo de RIN).  Note que os autores também fornecem um resumo dos recursos selecionados de estabilidade do RNA em S1 de mesa que pode servir como uma referência adicional para aqueles interessados em análise posterior do tecido literatura de integridade do RNA. Lee et al (2015)36
Fígado humano Encaixe de congelação (líquido N2 ou isopentano) Temp do quarto. Degradação observada em 1 h. (até 0,85 ΔRIN); mais degradação em pequenas amostras de fígado do que em amostras maiores. Kap et al (2015)37
Câncer colorretal humano Encaixe de congelamento (N2 líquido/isopentano) 4 ° C Degradação observada por 1 h.; Pontuação de RIN de 4.2 somente após 90 min. de atraso no tempo de congelação Hong et al (2010)38
Fígado humano Solução de preservação de RNA, também flash congelamento (líquido N.2) 4 ° C, temperatura ambiente Amostras foram estáveis mesmo para fora a 1 m. no gelo; degradação observada após 1 m. em temperatura ambiente. (mas não depois das 3 h.; como observado usando o golo de RIN) Lee et al (2013)39
Músculo esquelético, tecido adiposo de cavalo Encaixe de congelamento (líquido N.2) 13 ° C Autores recomendam que melhor integridade para músculo foi até 2 horas.; preservação de tecido adiposa dentro 0,5 h. recomendado pelos autores (como observado pela aparência de gel de rRNA) Morrison et al (2014)40
Salmão cérebro, músculo do rim, fígado, Solução de preservação de RNA Temp do quarto. Cérebro do RNA estável para h. 4-8, rim e músculo exhbiit alguma degradação por 8 h. (gel, RIN Pontuação ambos usadas) Seear & Sweeney (2008)41
Coelho do tecido conjuntivo (ligamento, tendão, cartilagem) Encaixe de congelamento (líquido N.2) 4 ° C, temperatura ambiente. Sem degradação "evidente" para fora-96 h. após a morte, como observado pela aparência de gel de rRNA Marchuk et al (1998)42
Cérebro de rato, coração, pulmão, fígado Aparenta ser extraído fresco Dentro da carcaça do rato realizado na incubadora de 20 ° C Maior estabilidade do RNA observada no cérebro (pôde-se observar bandas de rRNA daqui a 7 dias após a morte, embora a degradação estava presente), estabilidade moderada no pulmão e coração, baixa estabilidade no fígado; como observado pela aparência de gel de rRNA Inoue et al. (2002)43
Amígdala humana, colon Com e sem solução de preservação de RNA, então snap-congelados Temp do quarto. (22 ° C), solução de preservação de 4 ° C RNA, solução salina fria ou gelo (0 ° C) Estável às 16 h. no gelo ou em solução de preservação de RNA; ligeira degradação em 6 ou 16 h. em soro fisiológico frio ou em RT (medido pelo golo de RIN) Micke et al (2006)44

Tabela 3. Amostra de conclusões anteriores sobre a estabilidade do RNA em amostras de tecido post mortem. As entradas representam os manuscritos selecionados da literatura sobre a estabilidade do RNA, com uma variedade de tipos de tecido representado, incluindo murino, biópsia humana e veterinários exemplos. Os métodos para a preservação, o modo de pré-extração de armazenamento e um breve resumo dos resultados são fornecidos para cada exemplo. Salvo indicação em contrário, as amostras foram armazenadas em condições que variam de gelo a 37 ° C, seguido de congelamento snap ou uma infusão com solução de preservação de RNA, curso de pós-tempo (em outras palavras, estabilidade não era ser medida na presença de um RNA solução de preservação durante a incubação, a menos que indicado).

ID de amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Um260/A280 1,96 1,98 1,98 1,91 1,98 1.89 1.89 1,91 1.9 1.84 1.84 1,97
Um260/A230 0,67 0,14 0,19 0,26 0,61 0,69 1.33 0.11 0.21 0,39 0.1 0,44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabela 4. Representante resulta de RNA isolado de bovinos FFPE linfonodos mesentéricos. A tabela mostra os resultados de espectrofotométrico e análises de qualidade de uma série de amostras de bovinos linfonodo FFPE processado usando o método descrito neste manuscrito. Em cada caso, os resultados refletem RNA altamente degradado.

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Discussion

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A maioria dos estudos de transcriptomic e os protocolos associados concentrar em amostras humanas, rato, rato ou post-mortem. No entanto, investigações em animais e animais selvagens fornecem uma ampla gama de oportunidades para a caracterização da resposta imune à doença, tanto como aplicáveis à medicina veterinária e, no que diz respeito a doenças zoonóticas, a saúde pública. Este protocolo fornecido um resumo das considerações-chave para extração de RNA de alta integridade de tecidos de animais de grandes porte, tais como o gado, bison, cabras e ovelhas. O tamanho dos animais, bem como as condições para a coleta de amostra, fazer a recuperação de um processo mais extenso, com mais tempo processamento post-mortem do que para a recuperação do nó de linfa do mouse. Da mesma forma, o tamanho grande destes gânglios linfáticos exige protocolos que recuperar amostras paralelas de diferentes animais, bem como amostras representativas das alterações imunológicas/patológico dentro do nó de linfa. As sugestões para coleta de amostra neste protocolo preveem a recuperação do RNA intacto também quanto aos perfis representativos baseada o seccionamento do nó de linfa.

Como uma demonstração da importância de uma estratégia de amostragem padronizados e protocolo, tal como apresentado aqui, foi retomado 25 papéis de banco de dados PubMed Central que caracteriza a transcriptomes de gado dos gânglios linfáticos. Um papel indicado o processamento de uma seção grande do nó de linfa ao mesmo tempo, um discutidos métodos de microdissection captura específica do laser, um mencionou que uma "amostra representativa" foi coletada a partir do nó de linfa e apenas um papel46 indicado que a peça de linfonodo coletado (10mm3 no tamanho) incluía regiões tanto o córtex e medula. Enquanto outros jornais observou que pequenas amostras (geralmente 30-100 mg) foram processadas para análise de RNA, 84% dos papéis não mencionou uma estratégia de amostragem para a coleta dessas peças de tecido. Como a sequenciação do ARN ainda é relativamente cara, a análise de várias seções por nó de linfa é improvável que seja financeiramente viável na maioria dos casos, especialmente desde que amostras biológicas normalmente são priorizadas para análise estatística. Através da recolha de uma amostra através de uma cunha de um linfonodo essas seccionado, RNA de linfonodo regiões ricas em diferentes tipos de células do sistema imunológico é capturado em todas as amostras. Este protocolo pode, portanto, servir como uma referência para uma estratégia de amostragem reprodutíveis e documentadas para linfonodo transcriptomics.

Na preparação do RNA dos tecidos, existem várias etapas-chave para a tomada de decisões processual. Primeiro, a literatura metodológica é misturada em termos de utilização de preservação soluções versus o uso de amostras de tecido congelado (e posterior moagem de temperatura fria). Especialmente no caso de necropsias de animais grandes, existem vários benefícios processuais potenciais para o uso de uma solução de preservação, como incorporadas no presente protocolo. Primeiro, as amostras de tecido podem ser armazenadas durante a necropsia em solução de preservação, sem a necessidade de transferir imediatamente os tubos para nitrogênio líquido. Em segundo lugar, o uso de uma solução de preservação fornece proteção adicional antes do processamento da amostra para a extração de RNA, particularmente se a amostra parcial ou brevemente derrete antes de homogeneização. Os resultados na figura 6A indicam que esse efeito protetor estende-se ao tecido do nó de linfa. Em contraste, amostras congelado devem ser mantidas em estado congelado até o momento da homogeneização em um buffer contendo fenol. Finalmente, para necropsias de campo de animais de grandes porte, onde o nitrogênio líquido não está prontamente disponível, as amostras podem ser armazenadas em solução de preservação até eles podem ser devolvidos para o laboratório.

Vantagens adicionais dos componentes moleculares do procedimento aqui apresentados incluem a presença de fenol durante o processamento inicial de tecido, que serve como um desinfetante durante o processo de geração de aerossol de homogeneização de amostras de infectados, animais e a utilização do procedimento de coluna de rotação para remover o fenol residual e isotiocianato de guanidina da amostra. Os resultados representativos demonstram que o procedimento gera RNA de alta qualidade, avaliadas por um260/A280 e um260/A230 rácios, gel de eletroforese e RIN pontuações e é robusto em face de tempo curso desafios de gado e amostragem de animais selvagens. O emparelhamento de preservação de tecidos (por exemplo, em RNALater), homogeneização em reagentes fenol-baseado (por exemplo, TRIzol) e purificação da coluna de sílica tem sido utilizado com sucesso na literatura para testes padrões da expressão de gene de perfil em ovinos abomasal linfonodos infectados com nematódeos gastrointestinais46 e em linfonodos de bovinos infectados com um herpesvírus47, com golo de RIN superior a 8 e superior a 7 em todas as amostras, respectivamente.

No caso de um RNA resultante com partituras RIN inaceitáveis para análise a jusante, as seguintes variáveis, que são padrão para o processamento do RNA, devem ser avaliadas: o tempo total de processamento post-mortem, a condição dos tecidos, o tempo de processamento/atraso pós-degelo, a técnica durante a extração de RNA e a pós-extração de tratamento de RNA. O total de processamento post-mortem de tempo deve ser avaliado especialmente no caso de tecidos recuperados de animais encontrados mortos, em oposição a eutanásia de animais. Conforme descrito acima, o RNA é relativamente estável nos linfonodos, mas longos atrasos no processamento podem levar à degradação, especialmente para as transcrições instáveis. Uma variável de tempo a confusão poderia estar presente se as amostras são comparadas entre carcaças que permaneceram no campo, para diferentes quantidades de tempo. A condição dos tecidos deve ser avaliada, porque a degradação da integridade do tecido, devido a alterações patológicas associadas com a infecção, pode reduzir a estabilidade do RNA. Por exemplo, baixa qualidade de RNA tem sido observada no placentome de Brucella-infectados pós-aborto animais (Boggiatto et al., submetido). O pós-degelo de processamento de tempo de atraso é mitigado pelo uso de soluções de preservação, como descrito neste protocolo. Certifique-se de que a espessura das peças tecido é baixa o suficiente para permitir uma adequada e rápida penetração da solução conservante no tecido (espessura de 5 mm de < usando o preservativo, mencionado na Tabela de materiais). Durante a extração de RNA, os buffers devem ser livre de RNase e contato com luvas e outros itens contaminados (RNases estão presentes na pele) devem ser evitados. Para a moagem do tecido do nó de linfa, a maior fonte de RNases potencial será no tecido em si, mas é benéfica reduzir a introdução de contaminantes em todas as fases do procedimento. Para lidar com a extração de RNA pós, conforme descrito no protocolo, alíquota do RNA amostras para tubos antes do congelamento e armazenamento a-80 ° C, para eliminar a necessidade de congelamento e descongelamento das amostras para uma análise de qualidade e quantidade.

Baixos rendimentos no procedimento, além de resultantes da degradação de amostras do RNA, pode ser devido a uma homogeneização ineficiente do tecido do nó de linfa no passo 4.3 no protocolo. Note-se que a incubação em uma solução de preservação de RNA pode alterar a textura do tecido (aumento de firmeza), embora a maioria dos tecidos de linfonodo dissociados efetivamente em corre-piloto com o grande dentado dissociador do rotor-estator descrito aqui. Conforme observado na etapa 4.3.1, a homogeneização no reagente fenol-base deve ser repetido se a dissociação é incompleta. Almofariz e pilão moagem, seguido por uma ressuspensão de amostra em um reagente à base de fenol, é outra alternativa para laboratórios sem acesso a um homogenizador com essas especificações. No entanto, uma homogeneização em tubos descartáveis apresenta várias vantagens potenciais sobre a moagem do tecido congelado em um almofariz e um pilão, incluindo um mais viável e mais curto de fluxo de trabalho para o processamento de amostras múltiplas, ausência de perda de amostra quando moagem , sem limpeza e sem potencial contato com amostras de alimentado, no caso de tecidos de animais infectados.

Avraham et al 48 descrever que um pico de RNA 5S grande no produto final do RNA, emparelhado com uma baixa recuperação de 28S e 18S RNA ribossomal, pode ser um sinal de uma incompleta da lise das células (que por sua vez, para o processamento do nó de linfa, pode ser devido a uma dissociação incompleta do tiss UE). Figura 6B fornece um exemplo de um perfil de RNA gerado a partir de um pedaço de bovino linfonodo parotídeo que era muito alta no tecido conjuntivo e não homogeneizar eficazmente. Rendimentos de RNA devem ser calculados e monitorados através de amostras em um conjunto de análise confirmar que as recuperações semelhantes são obtidas por mg de tecido, e amostras para comparação direta por sequenciação do ARN devem ser processadas em lote, usando a mesma homogeneização estratégia para todas as amostras. Note-se que a abordagem de amostragem Cunha também auxilia na evitando uma coleção de uma amostra que é exclusivamente uma região extensa do tecido conjuntivo.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar. Toda pesquisa é financiada com fundos intramurais do departamento de agricultura dos EUA, Agricultural Research Service. Todas as referências a produtos específicos são fornecidas com a finalidade de reprodutibilidade experimental e não representam qualquer endosso destes produtos pelo governo federal.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer James Fosse pelo seu excelente trabalho em todos os Videografia e processamento de vídeo; Michael Marti pelo seu excelente trabalho na geração de imagens digitalizadas de gado; Lilia Walther por sua ajuda com a extração do RNA e Bioanalyzer é executado; Mitch Palmer e Carly Kanipe para sua revisão útil e feedback sobre imagens de linfonodo; e os cuidados com animais e pessoal veterinário no centro nacional de doença Animal para todos de seu trabalho árduo e assistência com a pecuária e a preparação para necropsias.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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