Summary
Denne protokol giver et overblik over procedurerne til isolering af RNA for transkriptom profilering af lymfeknude væv fra store dyr, herunder trin i identifikation og excision af lymfeknuder fra husdyr og vilde dyr, prøveudtagning tilgange at give sammenhæng på tværs af flere dyr, og overvejelser samt repræsentative resultater for efter samling bevaring og forarbejdning til RNA analyse.
Abstract
Store dyr (husdyr og vilde dyr) tjener som vigtig reservoirer af zoonotiske patogener, herunder Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaog E. coli, og er nyttig for studiet af patogenesen og/eller spredning af bakterier i naturlige værter. Med nøglefunktion i lymfeknuder i vært immunrespons tjene lymfeknude væv som en potentiel kilde til RNA for downstream transkriptom analyse, for at vurdere de tidsmæssige ændringer i genekspression i celler i løbet af en infektion. Denne artikel indeholder en oversigt over processen med lymfeknude samling, væv prøveudtagning og downstream RNA forarbejdning i husdyr, ved hjælp af kvæg (Bos taurus) som model, med yderligere eksempler hentet fra den amerikanske bison (Bison bison ). Protokollen indeholder oplysninger om placering, identifikation og fjernelse af lymfeknuder fra flere centrale steder i kroppen. Derudover præsenteres en biopsi prøveudtagning metodik der giver mulighed for en sammenhæng af prøveudtagning på tværs af flere dyr. Flere overvejelser for eksempel konservering er drøftet, herunder generation af RNA egnet til downstream metoder som RNA-sekventering og RT-PCR. På grund af de lange forsinkelser iboende i store dyr vs musen gang kursus undersøgelser, er repræsentative resultater fra bison og kvæg lymfeknude væv præsenteret for at beskrive tidsforløb nedbrydning i denne vævstype, i forbindelse med en gennemgang af tidligere metodologiske arbejde på RNA nedbrydning i andre væv. Samlet set vil denne protokol være nyttigt at begge veterinær Forskerne begynder transkriptom projekter på store dyr prøver og molekylær biologer interesseret i at lære teknikker i vivo væv prøveudtagnings-og in vitro- behandling.
Introduction
RNA-sekventering analyse af transkriptom af lymfeknuder giver mulighed for at karakterisere immunrespons i dyr til en bred vifte af patogener. Mens denne metode har været udnyttet flittigt i mus, har analyser for nylig ekspanderende til større pattedyr1,2. Husdyr/store dyr lymfeknuder kan bruges til at karakterisere vært svar til en infektion, ikke kun for deres anvendelse i vaccine eller genetiske modtagelighed undersøgelser og til identifikation af målene for udvikling af lægemidler, men også som modelsystemer for humane undersøgelser på zoonotiske sygdomme. For eksempel, i tilfælde af brucellose (en zoonotiske bakteriel sygdom at virkninger en halv million mennesker verden over hvert år), trods betydeligt øgede omkostninger, undersøgelser hos får eller geder er mere relevante for human infektion og menneskelige vaccine udvikling end laboratorium dyremodeller. Infektion musemodeller sammenfatte Retikuloendoteliale system infektion, men ikke den karakteristiske kliniske tegn3.
I store dyreforsøg i forhold til laboratoriet dyreforsøg indebærer processen med væv høst nødvendigvis en længere forsinkelse mellem eutanasi og samlingen væv, der udgør en potentiel udfordring for bevarelsen af høj kvalitet RNA. Intakt RNA er afgørende for generation af biologisk relevante transkriptom data. Generation af høj kvalitet RNA fra vævsprøver er særligt kritiske for store dyr patogen undersøgelser gennemført i indeslutningsfaciliteter. Sådanne undersøgelser er i sagens natur mere vanskeligt at udføre ikke blot kræver godkendt faciliteter og højt uddannede personale men også bære betydelige finansielle omkostninger, som afhængigt af arbejdet, kan variere fra titusinder til hundredtusinder af dollars. Disse typer af undersøgelser også omfatte et tæt tværfagligt samarbejde og tværfaglig viden for deres færdiggørelse, føje til deres kompleksitet. Derfor giver uddannelse, udvikling af og tilslutning til en strømlinet system for prøvetagning og bevarelse betydelige fordele for downstream molekylære studier af væv fra inficerede dyr.
Samling af større lymfeknuder præsenterer yderligere udfordringer for samlingen væv i forhold til lignende prøveudtagning af murine lymfeknuder. Forberedelsen af prøven excision nødvendiggør en grundlæggende forståelse af anatomien af lymfeknude, herunder de relevante interne strukturer. Strukturen i en lymfeknude består af lymfoide lobules omgivet af bihulerne fyldt med lymfeknuder. Disse strukturer er indkapslet i en hård, fibrøst kapsel. 4 en lymfoide lobule er "grundlæggende anatomiske og funktionelle enhed af lymfeknude" og er sammensat af hårsække, en dyb kortikale enhed, og medullær snore og bihuler4 (figur 1A). B og T lymfocytter er hjemsted for follikler og dybt kortikale enheder, henholdsvis. Disse strukturer giver en 3D stillads og lette samspillet mellem lymfocytter og antigen eller antigen præsentere celler.
Groft, follikler og dybt kortikale enheder kan identificeres på snitfladen da de indeholder en tættere retikulære meshwork og vises mørkere end bihuler, som består af en mere delikat retikulære meshwork og synes lysere (figur 1B). Af konventionen henviser patologer til områder af lymfeknuder som den overfladiske cortex (follikler), paracortex (dyb kortikale enheder) og medulla (medullær ledninger og bihulerne). En ordentlig undersøgelse af alle tre regioner har været anset som bedste praksis i rutinemæssig patologisk undersøgelse retningslinjer for lymfeknuder5. Bemærk at der er en betydelig variation i konsistensen, størrelse og farve af lymfeknuder, selv inden for et enkelt dyr. Som dyr alder, deres lymfeknuder tendens til at falde i størrelse og blive fastere end yngre dyr, typisk på grund af en stigning i deres bindevæv og en reduktion af den normale lymfoide strukturere6,7.
Figur 1. Anatomi af lymfeknude. (A) Denne tegneserie billede viser anatomien af lymfeknude, skildrer afgørende strukturer. (B) dette stadig billede viser en kvæg lymfeknude skåret i tværsnit. De relevante strukturer/lag, der er synlige for det blotte øje, er fremhævet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Afhængigt af den eksperimentelle spørgsmål, vil forskellige lymfeknuder være af interesse for indsamling og analyse. Perifere lymfeknuder er dem, der ligger dybt i det subkutane væv. I kvæg, perifere eller overfladiske lymfeknuder ofte anvendt i klinisk og eksperimentel praksis omfatter parotideale, submandibulære, retropharyngeale, bovlymfeknuden, glandel (precrural) og overfladiske lyskelymfeknuder (yverets i hunner, scrotalt hos mænd) () Figur 2). I tabel 1, er egenskaberne af centrale overfladiske lymfeknuder, som beskrevet i kvæg system8, skitseret. Nedenfor præsenteres nogle potentielle lymfeknude samling planer for smitsomme bakterielle sygdomme hos kvæg som udgangspunkt for undersøgelsen.
Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies for B. abortus-inficeret kvæg og B. melitensis-inficerede geder på National Animal sygdom Center inddrive yverets, prescapular og parotideale lymfeknude væv , både til slibning til bakteriel tælling og for RNA forberedelse til vært RNA udtryk profilering. B. abortus kan inddrives regelmæssigt i hver af disse lymfeknuder i eksperimentelt inficeret kvæg9. Tilstedeværelsen af bakterier i hver af disse lymfeknude typer kan blive opdaget i B. melitensis-inficeret geder op til mindst ni måneder efter infektionen ved hjælp af de RNA-baserede metoder fra vores undersøgelser (Boggiatto et al., upubliceret). Salmonella Sp.: prescapular, subiliac (knæfoldslymfeknuderne), og mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder har været nyttige i profilering af kvæg slagtekroppe for en Salmonella prævalens10,11,12 og ville være af potentiel interesse for transkriptom undersøgelser. E. coli O157: H7: mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder (på den midterste tyndtarmen og distale tyndtarmen steder) kan være steder, hvor en lejlighedsvis inddrivelse af bakterier i inficerede kalve (men ikke i inficerede voksent kvæg)13. Leptospirose (Leptospira sp.): en kronisk persistens af bakterier er blevet observeret i lymfeknuderne dræning mælkekirtlen14. Mycobacterium bovis : I kvæg, er bakterier blevet genoprettet efter eksperimentel infektion fra lymfeknuder mediastinale og tracheobronchial kalve15. Derudover er lymfeknude RNA blevet udnyttet til at undersøge store dyr vært svar til vira, såsom porcint reproduktions- og respirationssyndrom virus2. Figur 2 viser placeringen af et undersæt af disse store lymfeknuder i selve kvæg.
Figur 2: Tegneserien skildrer udvalgte lymfeknude steder i Bos taurus . De nummererede lymfeknuder er kommenteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I dette papir og den tilhørende video præsenterer vi en protokol til isolering af store dyr lymfeknuder for RNA undersøgelser, designet til at være informative for Molekylær biologer involveret i transkriptom undersøgelser af store dyresygdomme. Først, vi giver et overblik over proceduren isolation for lymfeknuder, ved hjælp af stikprøver fra kvæg og bison væv som eksempler. Parret med denne demonstration, som vises i videoen, er en arbejdsproces for en reproducerbar væv stikprøveudtagning RNA isolering. Næste, vi beskriver vigtige overvejelser i forbindelse med behandling af en inficeret lymfeknude, med fokus på sikkerhed, konsistens og RNA kvalitet.
Forberedelse af RNA fra væv med et syrnet phenol-guanidin isothiocyanat reagens er baseret på den oprindelige metode til Chomczynski og Sacchi16,17, med en rensning over silica-baserede spin kolonner i chaotropic agenter baseret på det oprindelige arbejde af Vogelstein og Gillespie18. Vi undersøger også mulighederne for inddrivelse af RNA for transcriptomics fra kvæg lymfeknuder bevaret af alternative metoder. Endelig vil vi udforske virkningen af variablen tid på RNA kvalitet i stor animalsk necropsies, herunder en repræsentant eksperiment skildrer virkningen af en stigning i tid mellem eutanasi og prøveudtagning på den gendannede RNA profil fra bison og kvæg lymfeknuder. Denne artikel vil være nyttigt ikke kun til molekylærbiologer, men også til veterinær Forskerne begynder transkriptom undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De animalske obduktion procedurer afbildet her er omfattet af godkendte IACUC protokoller på National Animal sygdom Center, Ames, IA. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer for pasning af dyr og dyrevelfærd.
1. planlægning forudgående før obduktion
- Før obduktion, forberede de følgende materialer for transport til obduktion suite:
- 1,5 eller 2 mL microcentrifuge rør fyldt med ~ 1,0 mL af RNA bevarelse løsning, i et rack eller transport container. Sørg for at følge producentens retningslinjer for forholdet mellem mængden af bevarelse løsning til volumen af vævet.
- Engangs skalpeller og ren, autoklaveres pincet: ét sæt for dissekere huden og et andet sæt til indsamling af lymfeknuder (en for hver enkelt lymfeknude, pr. dyr), hvilket forhindrer en krydskontaminering af huden og miljømæssige flora med lymfeknude væv.
- 3 punch mm biopsi værktøjer, obduktion knive, skarpe beholder for brugte skalpeller og biopsi værktøj, opskæring bestyrelser eller engangs bakker til brug i lymfeknude dissektion.
- Bruge personlige værnemidler, herunder PPE krævede for arbejde på det relevante BSL niveau for systemet.
- Autoklave genanvendelige metal værktøjer, herunder pincet, i metal pander inden obduktion, bruge redskaber/tørt gods indstilling.
2. identifikation og prøveudtagning af lymfeknuder i kvæg og Bison
Figur 3 . Lymfeknuder af kvæg hoved og hals. (A) Denne tegneserie billede viser valgte lymfeknuder af hoved og hals af Bos taurus. (B) dette billede viser den parotideale lymfeknude i tværsnit (venstre) sammenlignet med de parotideale spytkirtel i tværsnit (til højre). Bemærk forskellen i teksturer mellem to vævstyper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Isolering af bovlymfeknuden lymfeknuder i kvæg og bison
- Aflive dyr (kvæg eller bison på alle alderstrin, som passer til eksperimentet) baseret på lokale IACUC-protokollen. Bekræfte død efter metoder, der specifikt er beskrevet i den institutionelle IACUC protokol, herunder manglen på et splitsekund, manglen på respiration og fraværet af en cornea refleks. Flytte dyret til obduktion gulvet.
Bemærk: Der er forskellige metoder til human eutanasi bruges i laboratoriepraksis store dyr. Intravenøs indgift af pentobarbital natrium og phenytoin natrium løsning er dog mest almindeligt godkendt og udnyttet form. Konsultere de AVMA retningslinjer for aflivning af dyr. 19
Forsigtig: Følg alle relevante biosikkerhed protokoller for en obduktion på værtsinstitutionen, herunder retningslinjer for sikker bortskaffelse af klid i en punktering-bevis beholder og dekontaminering af genanvendelige metal knive og pincet. Denne protokol genererer klid affald fra brugen af engangs skalpeller. Bære personlige værnemidler, da dikteres af de institutionelle retningslinjer, herunder støvler, overtræksdragt, handsker og beskyttelse af øjne. - Identificere 3 deltagere til at arbejde på de animalsk væv.
Bemærk: Her, dissector 1 vil ansvarlig for den omfattende skæring af de ønskede dyrevæv, dissector 2 vil genoprette lymfeknuder fra de forskellige dyrs sektioner og dissector 3 vil arbejde på en separat tabel at isolere sektioner fra hver enkelt lymfeknude og Overfør dem til rør med en konserverende løsning. - Begynde ved at placere dyret i lateral recumbency.
- Udvide skulderen ved at flytte den forreste rand tilbage på niveauet for knæet (forknæled); denne bevægelse vil bringe skulderen tilbage og giver mulighed for en lettere palpering af lymfeknude. Føle for tilstedeværelsen af lymfeknude "klump".
Bemærk: Under sygdomstilstande, lymfadenopati kan være til stede, der letter identifikation af lymfeknuder, men denne proces kan også påvirke konsistensen, sammensætning og arkitektur af lymfeknude. - Når beliggende, og med skulderen stadig udvidet, skal du bruge en skalpel eller obduktion kniv til at gøre en hud indsnit langs konturen af skulderen.
Bemærk: Ikke Begræns størrelsen af incisionen, selvom lymfeknude har været placeret via palpation. Et større indsnit giver lettere adgang til dybere væv og gør excision af lymfeknude lettere for dissector. - Ved hjælp af et par pincet, trække huden til at afsløre punktet af skulder og nakke muskulaturen.
Bemærk: Bovlymfeknuden lymfeknude er ofte fundet i spæk, især hos overconditioned dyr. - Endnu en gang palpere placeringen af lymfeknude (figur 3A).
Bemærk: I modsætning til spæk, lymfeknude vil holde sin form når palpering. Derudover er lymfeknuder ikke sammenhængende med alle omkringliggende væv, som de er omsluttet af en tynd fiberholdigt kapsel. - Efter at lokalisere bovlymfeknuden lymfeknude, omhyggeligt dissekere ud spæk, ved hjælp af en skalpel og pincet, og isolere lymfeknude.
- Ser for tilstedeværelse af en tynd fiberholdigt kapsel, som afbilledet i figur 1B, for at skelne mellem lymfeknude og fedtvæv; lymfeknuder er ikke sammenhængende med alle omkringliggende væv.
- Overføre lymfeknude lymfeknude dissektion tabel, ved hjælp af en plastik bakke for væv overførsel, for yderligere skæring.
Bemærk: Udseendet af disse lymfeknuder i bison er lignende. Den tilknyttede videoen viser udseendet af bovlymfeknuden lymfeknude som dissekeret ud af højre skulder af en amerikansk bison.
- Aflive dyr (kvæg eller bison på alle alderstrin, som passer til eksperimentet) baseret på lokale IACUC-protokollen. Bekræfte død efter metoder, der specifikt er beskrevet i den institutionelle IACUC protokol, herunder manglen på et splitsekund, manglen på respiration og fraværet af en cornea refleks. Flytte dyret til obduktion gulvet.
-
Isolering af parotideale lymfeknuder i kvæg og bison
- Begynde ved at placere dyret i laterale recumbency obduktion i stueetagen. Find kæbeleddet (TMJ).
- Hvis det er vanskeligt at lokalisere, flytte mandiblen langsomt og bestemme placering hvormed mandiblen tillægger kraniet; Dette er TMJ.
- Med en skalpel eller obduktion kniv, omhyggeligt gøre et snit i huden. Start indsnittet dorsal til fælles og udvide det ventrally/lodret langs jawline.
- Dissekere hud væk for at afsløre det subkutane væv. Den parotideale spytkirtel vil være synlig først, på grund af dens store størrelse, lobulated overflade udseende og rød farve.
- Brug af pincet og en skalpel, flytte den parotideale spytkirtel til side for at finde de parotideale lymfeknude sidder bare kranie og mediale til spytkirtel (figur 3A). Undersøge parotideale lymfeknude væv for tekstur før videre behandling.
Bemærk: lymfeknuder i ansigtet (parotideale og submandibulære) er forbundet med spytkirtlerne, som kan forvirre lymfeknude isolation. I forhold til lymfeknuder, spytkirtlerne er meget større og har en lobulated overflade udseende. Desuden på snitfladen, spytkirtlerne er homogen i naturen og udviser ikke de klassiske kortikale og medullær arkitektonisk mønster af lymfeknuder (figur 3B). - Punktafgifter kirtel med en skalpel. Overfør det til tabellen lymfeknude dissektion, bruger en plastik bakke til væv overførslen, for yderligere skæring.
- Begynde ved at placere dyret i laterale recumbency obduktion i stueetagen. Find kæbeleddet (TMJ).
-
Isolering af yverets lymfeknuder i kvindelige kvæg og bison
- Placere dyret i lateral recumbency.
- Løfte bagben for at afsløre den lyskelymfeknuder region og Find yveret.
Bemærk: I en sund, ikke-Lakterende dyr, palpering af disse lymfeknuder kan være muligt. I en diegivende dyr, kan disse lymfeknuder være håndgribelig ved caudale grænsen af bunden af yveret. - Ved hjælp af en skalpel, gøre et snit lige dorsal til yveret, kører langs låret, at eksponere yverets kirtler.
- Find noden yverets lymfeknuder indkapslet i et tyndt lag spæk og dissekere det subkutane væv. Hvis ikke visuelt skelnes, palpere den udsatte væv for tilstedeværelsen af en fast struktur i det subkutane fedt.
- Brug af pincet og en skalpel, omhyggeligt dissekere ud lymfeknude fra fedt. Overfør det til tabellen lymfeknude dissektion, bruger en plastik bakke til væv overførslen, for yderligere skæring.
3. skæring og opbevaring af lymfeknuder
- Passere de isolerede lymfeknuder fra dissector 2 til dissector 3 på en dissektion tabel støder op til den vigtigste obduktion plads. Placere hver enkelt lymfeknude på en frisk sektion af et skærebræt. Pre label skærebrætter i sektioner af lymfeknude, at lette modtagelsen af flere lymfeknuder i træk. Smitsomme prøver at bruge engangs bakker.
- Brug af pincet og en engangs skalpel eller obduktion kniv, fjerne en sektion af lymfeknude. Brug en skarp kniv, gøre en sagittal skåret åbne lymfeknude.
- Undersøge kraterets lymfeknude, især i prøver fra smittede dyr, udkig asymmetri, læsioner, farveforskelle, etc. registrere observationer.
-
(Mulighed 1) Lille væv sektioner
- Bruge engangs skalpeller til punktafgifter stykker af hver enkelt lymfeknude, der er mindre end 5 mm i tykkelse og overføre hvert stykke til en tube med en RNA bevarelse løsning med ren pincet.
-
(Mulighed 2) Lymfeknude biopsi eller skære metoder
Bemærk: Biopsier eller skære metoder, når de påføres parallelt lymfeknude sektioner på tværs af forskellige noder og dyr, giver sammenhæng i stikprøven væv for en bulk RNA analyse.-
Kile skæring metode
- Efter at have undersøgt den sagittal sektion til fange celler på tværs af profilen af lymfeknude, punktafgifter en cirkel-formet kile fra lymfeknude, fra centrum til den ydre kapsel. For en node 2 cm i bredde (standard størrelse, se tabel 1), en kile skåret til midten, der er 4 mm i ydre bue længde og 5 mm i tykkelse vil have en våd vægt ~ 100 mg.
- Ved hjælp af en skalpel, skære kile i små stykker, ikke tykkere end 5 mm, og cirka 50-100 mg hver i vådt væv vægt.
Bemærk: For konsistens, behandle alle kile stykker fra en enkelt lymfeknude enten i en batch eller i separate rør efterfulgt af RNA gruppering for at give en repræsentativ RNA profil fra lymfeknude af interesse. - Placere væv stykker med pincet i rør indeholdende mindst 10 bind af RNA bevarelse løsning, i forhold til mængden af væv.
-
Punch biopsi metode
- Vælg en punch biopsi værktøj, hvis målet er at indsamle bestemte sektioner, såsom specifikke follikler fra noden. Vælg et værktøj i overensstemmelse med størrelsen af prøven ønskes for samling. Punch biopsi værktøjer er tilgængelige i en vifte af størrelser, fra 1 til 8 mm i diameter.
- Synligt lokalisere områder af interesse for prøve i lymfeknuderne.
- Brug værktøjet punch biopsi til punktafgifter sektioner af interesse, at trykke og dreje værktøjet ind i vævet til at skabe kernen. Overføre vævet stykke med pincet til et rør, der indeholder mindst 10 bind af RNA bevarelse løsning. Hvis tykkere end 5 mm, skal du bruge pincet og en skalpel yderligere inddele vævet i mindre stykker.
-
Kile skæring metode
- Når prøverne er blevet overført til bevarelse løsning (fx., RNALater), transportere dem tilbage til laboratoriet ved stuetemperatur.
- Opbevare prøver ved 4 ° C natten over at tillade væv penetration.
- Den næste dag, hæld det overskydende RNA konserverende løsning og gemme vævsprøver ved-80 ° C. Fjern så meget konserveringsmiddel som muligt før frysning prøverne. Bruge en P1000 og/eller P200 mikropipette tip til en effektiv RNA konserverende løsning fjernelse.
Forsigtig: Kassér den dekanterede bevarelse løsning korrekt, baseret på egenskaberne infektiøst sygdomsbærer udnyttet samt de kemiske og miljømæssige farer ved den konserverende løsning som angivet på sikkerhedsdatabladet.
Bemærk: De retningslinjer, her er fastsat RNA bevarelse løsning er beskrevet i Tabel af materialer. Konsultere producentens retningslinjer, hvis bruger alternativ opbevaring løsninger.
4. behandling fra RNA lymfeknuder
Forsigtig: Brug en laboratoriekittel, handsker og ordentlig øjenbeskyttelse for behandlingstrin.
Bemærk: Den phenol-baserede reagens, der anvendes her er beskrevet i Tabel af materialer (og protokollen er baseret på producentens retningslinjer)20. Anvendelse af alternative phenol-baserede reagenser kan nødvendiggøre en ændring af proceduren, baseret på producentens anbefalinger til den specifikke produkt, der købes.
- Forud for at få adgang til prøverne, før alikvot kølet (4 ° C) phenol-baserede reagens til homogenisering rør (1,5 mL/tube), ved hjælp af en pipette.
Forsigtig: Phenol er giftigt, ætsende og sundhedsfare. Chloroform er giftige og sundhedsfare. Komplet behandlingstrin 4.1-4.9 i en kemisk stinkskab, og handsker for at undgå enhver kontakt med kemikalier. I USA er chloroform et farligt affald; bortskaffe rør, der indeholder farligt affald efter lokale og institutionelle retningslinjer. Processen vævsprøver fra dyr inficeret med patogener under tilsvarende BSL-2, BSL-3 eller BSL-4 retningslinjer. - Når en prøve kan være løsnet fra microcentrifuge rør med ren pincet, straks overføre ca 50-100 mg af det bevarede væv til homogenisering rør indeholdende phenol-baserede reagens.
- Begrænse optøning inden de tilsættes til phenol-baserede reagens. Bruge lagring på tøris, når flere prøver er fjernet fra fryseren til forarbejdning.
- Stramt cap røret, placere den på homogeniseringsapparat og homogeniseres prøven med et rotor-stator væv homogeniseringsapparat i phenol-baserede reagens. Komplet behandling ved stuetemperatur. Når du er færdig, tjek for en uklar udseende til at sikre, at prøven blev homogeniseret; vævet skal blive spredt i en overskyet suspension.
Bemærk: Bruges en 2 min RNA udvinding indstillingen (den forudindstillede RNA_02_1 indstilling til homogeniseringsapparat beskrevet i Tabel af materialer, designet til frosne væv). Rotor-stator angivet i denne protokol (Se Tabel af materialer) er stortandede og tilpasset til homogenisering af en række forskellige typer væv, herunder fibermateriale. Indstillingen RNA_02_01 er designet specielt til frosne (i stedet for friske) væv. Som lymfeknuder har fibrøst bindevæv komponenter, anbefales en tilsvarende optimeret rotor-stator homogeniseringsapparat at opnå en effektiv dissociation. Se nationale Institut for Environmental Health Sciences21 for yderligere oplysninger om homogenisering anbefalinger.- Hvis store bidder af væv forbliver efter homogenisering, Gentag proceduren homogenisering. At effektivt inddrive RNA, skal vævet adskilles godt.
- For mere fiber lymfeknude stykker, brug saks og pincet til at pre snittes lymfeknude stykke i flere mindre stykker inden overdragelsen til homogenisering tube. Som beskrevet i indledningen, kan lymfeknude væv fra ældre dyr være mere fiber.
Bemærk: Hvis en dobbelt analyse af vært og patogen RNA ønskes, yderligere behandling (såsom perle homogenisering) kan være nødvendigt for inddrivelse af bakterielle RNA, især hvis Gram-positive patogener er til stede i væv.
- Umiddelbart fjerne den homogeniserede prøve fra rør og overføre det til RNase-fri microcentrifuge rør (2,0 mL i størrelse) med en P1000 mikropipette.
- Der centrifugeres prøven i 5 min på 12.000 x g ved 4 ° C til at fjerne eventuelle rester, prøve. Brug en P1000 mikropipette tip, overførsel supernatanten til en frisk microcentrifuge tube, efterlod pelleten.
- Inkuber supernatanten i 5 min ved stuetemperatur. Opdele hver prøve mellem to 1,5 microcentrifuge rør.
- Der tilsættes 0,2 mL chloroform per 1 mL af phenol-baserede reagenset (dvs., 0,3 mL for en 1,5 mL prøve); Vend det i hånden i 1-2 min. Bland faserne, men gør ikke vortex prøven. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
- Det der centrifugeres i 15 min. ved 12.000 x g ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt den øverste, klar vandig fase med en mikropipette spids (P1000 eller P200), der udgør det øverste lag, uden at forstyrre interphase eller røde phenol-chloroform lag. Overføre den til en ny microcentrifuge tube.
- Bland det med et lige saa stort volumen af 100% ethanol; Bland det grundigt ved at vende røret 4 - 5 gange. Røret vil ofte blive vist overskyet.
- Med en mikropipette tip, væsken overføres til en kolonne med silica-baserede kommercielle spin, at rense og elueres RNA, efter producentens anvisninger22. Elueres RNA genereret fra ~ 50 mg af væv i 50-100 µl af RNase-fri vand.
Bemærk: Mens phenol-baserede reagens udvinding fjerner DNA i den organiske fase for downstream brugen af RNA i qRT-PCR og/eller RNA-sekvens applikationer, anbefales en supplerende behandling af RNA prøver med DNase. - Alikvot eluted RNA til separate rør til brug i en kvantificering og kvalitet vurdering, at reducere enhver fryse-optøning i eksemplet vigtigste RNA. Overføre rør til-80 ° C til opbevaring.
- I tilfælde af lymfeknude prøver fra dyr inficeret med zoonotiske patogener, især på indeslutningsniveau BSL-3 validere den resulterende RNA prøve for fravær af patogener hvis prøven vil blive flyttet til et lavere niveau biosikkerhed afspærringszonen for kvalitet analyse, RT-PCR, og/eller RNA-sekvens bibliotek forberedelse.
Bemærk: Det er kritisk at overveje lokale regler, og i tilfælde af CDC (Centers for Disease Control og forebyggelse) inaktivering retningslinjer for arbejdet med udvalgte agenter, er det nødvendigt at validere alle inaktiveringsprocedurer på forskerens lokale websted.- Fjerne 1/10th volumen af hver eluted RNA prøve fra trin 4.12 (dvs., 5 µl fra 50 µl af den samlede RNA). Med en steril teknik, bland prøven med 100 µl af bakterievækst bouillon i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør. RNA-bouillon blandingen fordelt ved hjælp af et sterilt plastik spreader, på overfladen af en agar plade.
Bemærk: Vælg en bouillon type og agar plade overensstemmelse med væksten af patogenet, som dyrene blev udfordret. - Inkuber agar plade under betingelser, der er specifikke for væksten af patogenet, som dyrene blev udfordret. Kontrol for fravær af gendannede bakterier før du fjerner prøverne fra BSL-3 indeslutning.
Bemærk: Den resulterende eluted RNA, efter kvantificering og test af integritet, er velegnet til downstream applikationer, herunder et RNA-sekventering og RT-PCR analyse.
- Fjerne 1/10th volumen af hver eluted RNA prøve fra trin 4.12 (dvs., 5 µl fra 50 µl af den samlede RNA). Med en steril teknik, bland prøven med 100 µl af bakterievækst bouillon i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør. RNA-bouillon blandingen fordelt ved hjælp af et sterilt plastik spreader, på overfladen af en agar plade.
- Vurdere RNA opsving og renhed ved hjælp af et spektrofotometer. For at vurdere RNA kvalitet, indlæse 1-2 µl af eluted RNA prøven Spektrofotometer for en analyse. Optage et spektrum af prøven i rækken ultraviolet (UV).
- Fra UV-spektret, optage A260/A280 forholdet, A260/A230 ratio og A260 værdien for prøven (A = absorbans).
- Som enkeltstrenget RNA i en koncentration på 40 µg/mL har en absorbans på 1,0 på 260 nm, beregne RNA-koncentrationen (µg/mL) ved at multiplicere A260 x 40 renset prøverne.
- Som en hurtig metode til vurdering af RNA integritet, for at udelukke enhver nedbrudte prøver fra yderligere analyse, Bland 2 µl af hver prøve, RNA med 4 µl af 1,5 x formamide loading farvestof [95% deioniseret formamid, 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% (w/v) SDS] i 1,5 mL rør microcentrifuge23,24.
- Varme rør ved 70 ° C i 1 min., og derefter overføre rør til is i 1 minut.
- Indlæse prøverne til en 1%-agarosegel, forberedt i 1 x TBE (for en fuld beskrivelse af en indfødt Agarosen gelelektroforese for RNA, se Rio, Ares Jr., Hannon og Nilsen)24. Adskille prøverne af standard gel elektroforese metoder og bekræfte tilstedeværelsen af 28S og 18S ribosomale RNA bands.
- Følg op gelelektroforese med kvantitative analysemetoder til RNA integritet bestemmelse [f.eks., en Bioanalyzer og RIN (RNA integritet antallet) analyse] som beskrevet i de Repræsentative resultater og Mueller, O. mfl. 25 og Schroeder, A. et al. 26.
5. alternative ekstraktion metode fra Formalin-fast, Paraffin-embedded (FFPE) væv
Bemærk: Selvom FFPE væv bevarelse ikke repræsenterer den mest robuste metode af nukleinsyre bevarelse, protokollen præsenteres nedenfor kan være en måde at studere nogle transcriptional ændringer, når andre bevarede væv er ikke tilgængelig.
- Forbered formalin reagenser væv konservering ved dispensering formalin i plastbeholdere. Væv bør bevares i formalin med et forhold på 20:1 formalin: væv volumen/vægt, henholdsvis.
Forsigtig: Formalin er et kendt kræftfremkaldende og selvom ikke akut giftigt, kronisk eksponering (typisk gennem inhaleret røg) kan udgøre en betydelig sundhedsrisiko. Ordentlig ventilation og PPE (dvs., brug af nitrilhandsker, skal skiftes inden for 15 min efter den første eksponering) er forpligtet til at minimere sundhedsrisici. Henvise til OSHA formaldehyd Standard (29 fr 1910.1048) for yderligere oplysninger om overvågning og risiko vurdering af eksponeringen.
Bemærk: Ved hjælp af for lidt formalin kan påvirke vævet evne til at blive fuldt bevaret når nedsænket i konserveringsmiddel. - Efter isolering af væv af interesse, omhyggeligt trimme væv til mindre end 5 mm i tykkelsen.
- De klippede væv bruge pincet, omhyggeligt dykke ind i formalin at minimere eventuelle sprøjt.
Bemærk: Væv bør være helt nedsænket i formalin at give mulighed for en fuldstændig fiksering. Det er afgørende, at alle overflader af væv er helt dækket med formalin.
- De klippede væv bruge pincet, omhyggeligt dykke ind i formalin at minimere eventuelle sprøjt.
- Når væv har været nedsænket i formalin, mulighed for væv fiksering til at opstå i mindst 24 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Formalin trænger væv langsomt, med en hastighed på 1 mm pr. time fra alle overflader27,28. Derfor, holder tykkelsen af afsnittene væv til mindre end 5 mm resultater i en hurtig fiksering af hele væv. - Efter fiksering, overføre væv til en passende reagens til paraffin indlejring.
Bemærk: For eksempel væv undersøges i dette manuskript blev overført til 70% ethanol før integrering. - Integrere væv i paraffin. 29
- Afsnit væv til 10-80 µm i tykkelse (brug 10-20 µm hvis miRNA ønskes der skal udvindes)29.
- Brug skalpel og pincet, fjerne en 40 mg væv stykke fra hver prøve skal behandles og læg det i en steril, nukleasen-fri mikrofuge tube.
- Udnytte en kommerciel kit designet til deparaffinization og nukleinsyre genopretning af FFPE vævsprøver til at udtrække RNA fra de konserverede prøver.
Bemærk: Det kit, der refereres til i Tabellen af materialer udnytter xylen og ethanol vasker for at fjerne paraffin, en protease behandling skridt og en glasfiber filter til at rense RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brugen af de overvejelser, der er præsenteret i denne artikel (trin 1-4 i protokollen) vil støtte i inddrivelse af RNA fra store dyr prøver, der er egnet til en downstream analyse i vært gen expression undersøgelser. RNA kvalitet for downstream ansøgninger vurderes af flere tiltag. Spektrofotometri, A260/A280 ratio giver et mål for protein forurening og A260/A230 ratio giver et andet middel til renhed vurdering, som vil afsløre kemiske forurenende stoffer såsom phenol. I hvert enkelt tilfælde, nøgletal for ~ 2.0 er dokumentation af høj kvalitet RNA, og nedsat nøgletal er tegn på forurening. Vigtigere, disse nøgletal giver ikke nogen oplysninger om RNA nedbrydning, som kan vurderes kvalitativt (trin 4.15-4.17) og kvantitativt (trin 4.18, som gennem en RNA integritet antallet eller RIN score).
Det er vigtigt at bemærke, at den forventede kvalitetsniveau af RNA inddrives fra lymfeknude væv sektioner er, i gennemsnit, lavere end for RNA inddrives fra kvæg hvide blodlegemer prøver. I en omfattende serie af RNA ekstraktioner fra kvæg væv og cellelinjer finde Fleige og Pfaffl30 , at gennemsnitlige RIN (RNA integritet tal målt på et Bioanalyzer) varierer mellem < 5 for jejunum og vomacidose væv og > 9 for hvide blodlegemer celler og corpus luteum, med lymfeknude RIN scores falder i midten på et gennemsnit på 6,9. I almindelighed, Fleige og Pfaffl30 Bemærk at solid væv producere RIN scorer lige fra 6-8, og at væv med højere koncentrationer af bindevæv udviser en højere gennemsnitlig forringelse. Tætheden af bindevæv i lymfeknuderne, plus den iboende niveau af RNases i denne vævstype, kan være ansvarlig for manglende evne til at konsekvent genoprette RNA med RIN scores > 9 fra lymfeknuder.
Et eksempel på et Bioanalyzer profil for RNA inddrives fra en bison yverets lymfeknuder node ved hjælp af den metode, der præsenteres her vises dog i figur 4A, demonstrerer inddrivelse af RNA med en RIN score på 8,6 (primært intakt og egnet for stort set alle downstream-programmer). RNA genereret fra denne procedure har været anvendt med held oprette biblioteker til brug i RNA-sekvens; denne protokol giver mulighed for regelmæssig isolering af RNA prøver fra bison og kvæg lymfeknuder med RIN værdier > 8 (og ofte > 9). For en stikprøve sæt af otte ekstraheret RNA prøver, den gennemsnitlige absorbans ratio på 260 nm/280 nm var 2.1 og 260 nm/230 nm var 2,1, der angiver en lav protein forurening og en lav forurening med kemikalier som phenol, henholdsvis. Den gennemsnitlige nukleinsyre recovery fra hver udvinding var 97 ± 10 µg pr. ~ 100 mg eller et udbytte på ~ 1 µg RNA/mg af lymfeknude væv.
Figur 4 . Repræsentative kvalitet spor skildrer RNA kvalitet fra udvinding metoder. (A) dette panel viser en total RNA spor af høj kvalitet RNA genereret fra en bison lymfeknude, ved hjælp af den procedure, der er fremlagt i dette håndskrift. (B) dette panel viser spor af en kvæg FFPE-prøve valgt fra tabel 4, skildrer meget nedbrudt RNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
På grund af udfordringerne forbundet med hurtige isolering af væv fra store kroppe, især i tilfælde af prøveudtagning fra wildlife arter, virkningen af forsinkelse mellem eutanasi og placeringen af væv stykker i en RNA bevarelse Løsningen er af potentiel interesse i analysen. Oplysninger i litteraturen om stabilitet af RNA i lymfeknude væv, især er begrænset. Derfor, for at give oplysninger om acceptable parametre for væv samling, stabilitet af RNA i bison lymfeknude efter eutanasi blev karakteriseret.
For dette eksperiment, blev tid 0 betragtet som den tid dyret blev erklæret død af manglen på et splitsekund og fravær af en cornea refleks. Efter transport af slagtekroppen og begyndelsen af obduktion, ~ 15 min var gået før hentning af den første lymfeknude prøve (15-20 min var standard i vores bemærkninger til genopretning af feltet dyr; tidsforløbet varierer afhængigt af placering ). Noden yverets lymfeknuder blev identificeret, og en lille del af væv blev fjernet og vedligeholdes ved stuetemperatur. Sektioner blev efterfølgende taget med ca 15 min. mellemrum og overført til RNA konserveringsmiddel; i midten af tidsforløb, blev et andet udsnit af lymfeknude hentet fra dyr, for det andet sæt af 4 tid point i serien (figur 5A, lukkede cirkler, figur 5 c). RNA blev udvundet i parallel fra lymfeknude stykker ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode. Denne 1 h eksperiment afslører at lymfeknude RNA bevaret størstedelen af dens integritet over tidsforløb, med kun lille reduktion af RIN score ved slutningen af tidsforløb (figur 5B og 5 C). Ligeledes RNA fra kvæg bovlymfeknuden og parotideale lymfeknuder beholdt sin integritet som målt ved RIN score over ~ 1 h tid kurser post mortem (figur 5 c; dyret oplysninger er givet i tabel 2). Derudover blev RNA udvundet fra yverets lymfeknude sektioner, der blev indsamlet 8 h efter døden, holder hele sektioner i celle kultur medier enten stuetemperatur eller ved 37 ° C til at simulere tidsrum i et dyrs slagtekrop. Ribosomale RNA var observerbare selv efter 8 h holding gange (fig. 5 d).
Figur 5 . RNA kvalitet i bison lymfeknude prøver indsamlet over tid kurser efter død. (A) dette panel viser en eksperimentel oversigt over en 1 h tid kursus procedure. (B, C) Disse paneler viser en undersøgelse af RNA kvalitet for prøver udtaget på tværs af en 1 h tidsforløb fra en yverets lymfeknuder node isoleret fra en amerikansk bison. Gel afspejler RNA prøver denatureret i formamid og adskilt på en 1% ikke-denatureringen gel. Panelet (C) skildrer ændringerne i RIN noder for hver prøve. Data fra yderligere eksperimenter på kvæg bovlymfeknuden og parotideale lymfeknuder er overlejret som angivet. (D) dette panel viser et eksempel på RNA gel, som beskrevet for gel anvendes i panelet (B), yverets lymfeknude prøver behandles efter 8 h inkubation ved enten stuetemperatur (Lane 1) eller ved 37 ° C (Lane 2) i celle kultur medier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Disse repræsentative resultater er konsistente med RNA stabilitet resultater for andre vævstyper og kilder. Tabel 3 indeholder en sammenfatning af resultaterne af en stikprøve af offentliggjorte papirer, der har undersøgt RNA stabilitet over pre bevarelse tidsforløbet. Bemærk at kun tendenser fra RIN scores og/eller rRNA gel observation (total RNA) er inkluderet i tabellen, selv om nogle papirer giver en yderligere analyse af mRNA integritet, som gennem bestemmelse af nøgletal for 5' vs 3' segmenter af valgte RNA'er (fxFajardy et al.) 31. det er imidlertid vigtigt at huske, at længere gange mellem død og prøve bevarelse kan medføre ændringer i RNA udtryk profiler, som demonstrerede, eksempelvis for placenta væv31. I forhold til stabil udskrifter, kan mere ustabile RNA'er være udtømt. Det er derfor vigtigt at udnytte en hurtig, strømlinet arbejdsproces til væv nyttiggørelse for at reducere enhver forsinkelse, når dyret er tilgængelig for obduktion, for at opnå de mest biologisk gyldig RNA profiler. Det ville være en fejltagelse at antage, at tilstedeværelsen af intakt ribosomale RNA angiver mangel af eventuelle ændringer i profilen transkriptom. Stadig, repræsentative resultaterne tyder på, at selv med øget behandling gange nødvendigt for store dyr prøveudtagning, er det muligt at forberede RNA, der er egnet til et gen expression analyse fra lymfeknude prøver.
Derudover blev det undersøgt virkningerne af variablen efter optøningen tid; i løbet af denne tid er RNA modtagelige for nedbrydning fra nukleaser stede i vævet. Kvaliteten af RNA prøver forarbejdet ved hjælp af denne protokol med enten 0 eller 64 min af hold tid ved stuetemperatur efter optøning på trin 4.1 blev målt af en RIN score. Dette eksperiment viser, at protokollen er helt ufølsom over for tø tid, hvilket gør den robust til behandling af flere prøver (figur 6A).
Figur 6. Yderligere analyse af RNA kvalitetsparametre. (A) dette panel viser RNA kvalitet resultater af RNA renset enten umiddelbart efter optøning (0 min) eller holding til 64 min. ved stuetemperatur før behandlingen. Barer repræsenterer gennemsnittet af 3 væv stykker for hver betingelse, ± standardafvigelse. Alt væv blev opbevaret i en RNA konserverende løsning forud for optøning, som beskrevet i protokollen. (B) dette panel viser en Bioanalyzer spor af en prøve fra en dårligt homogeniseret lymfeknude stykke indeholder store dele af bindevæv. Den lille størrelse af 28S og 18S toppene, sammenlignet med toppe i bjergkæden 5S er indlysende. Dette kan også opstå på grund af nedbrydning af RNA, selv om det relativt flad baseline mellem rækken 5S og 18S peak er alternativt tyder på dårlig udsugning; Se Avraham, R. et al. 48 for yderligere detaljer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som et punkt af sammenligning til isolering af RNA fra lymfeknuder, blev en retssag genopretning af RNA fra FFPE mesenteriallymfeknuderne lymfeknude stykker fra kvæg gennemført. Som beskrevet ovenfor, blev prøverne fastsat til 1 uge i formalin før paraffin indlejring, efterfulgt af 4 måneders opbevaring i paraffin ved stuetemperatur. Væv blev opdelt i fem 10 µm sektioner, og bruger FFPE ekstraktionsmetode, ca 62 ng/µL af RNA pr. sample (± 14 ng/µL) blev genvundet. Absorbans nøgletal på 260 nm/280 nm i gennemsnit 1,9, der angiver en vare med lavt indhold af protein forurening, selv om A260/A230 nøgletal var negativ (tabel 4). Bemærk at RIN scores observeret for disse prøver var meget lav (< 2), der angiver en nedbrydning af RNA produkter (tabel 4; Figur 4B), overensstemmelse med beskrivelse af Srinivasan mfl. 45. i assays udnytte qPCR, typisk små sektioner af RNA, eller mere specifikt cDNA (< 200 bp), forstærkes. Derfor, forstærkning af små produkter stadig kan forekomme fra nedbrudte prøver, og qPCR analyse kan udføres. For eksempel, det var muligt at forstærke et segment af de ribosomale protein S9 (RPS9) udskrift fra disse FFPE-genvundet prøver af qPCR. CT -værdier blev konsekvent på tværs af prøverne og gennemsnit 19,2 ± 1.8. Husk på de begrænsninger, der er til stede når udnytte FFPE-rede prøver, men, som større produkter er ikke nødvendigvis til stede, og nedbrydningen ikke er opstået ved en ensartet sats på tværs af alle prøver. Derfor dette materiale kan anvendes til undersøgelser med forbehold, men væsentlige begrænsninger findes for enhver downstream applikationer såsom RNA-sekvens.
| Lymfeknude Type | Beliggenhed | Længde | Bredde | Regioner drænet af noder |
| Prescapular | Bare mediale til skulderleddet; indlejret i spæk og under et lag af muskler | 1-10 cm | 1,5-2 cm | Huden på halsen; skulder; og hud, muskler og led af lavere thorax lemmer (ref. 8) |
| Glandel (også kaldet precrural) | Bare dorsale og mediale til knæ, ca 12-15 cm over knæskallen | 8-10 cm | 2,5 cm | Huden af bækken lemmer, maven og caudale dele af thorax (ref. 8) |
| Retropharyngeale | Fundet i midterlinjen dorsal til svælget | 4-5 cm | 2-3,5 cm | Tungen, slimhinder i mundhule, tandkød, læber, hårde gane, spytkirtler, de fleste af musklerne i nakken |
| Parotideale | Placeret subkutant ventral til kæbeleddet, caudale til kæbemuskel (ref. 8) | 6-9 cm | 2-3 cm | Huden, underhuden, de fleste af musklerne i hovedet, musklerne i øjet og øret, øjenlåg, lacrimal kirtel, rostralt del af næsehulen |
| Submandibulære (kan være 1-3 dag) | Placeret subkutant på den mediale aspekt af vinklen af mandiblen, forbundet med spytkirtler | 3-4 cm | 2-3 cm | Snude, læber, kinder, hårde gane, rostralt del af næsehulen, spidsen af tungen, hud og muskel i hovedet (ref. 8) |
| Yverets (kvinde overfladiske lyskelymfeknuder, typisk 2 nuværende) | Fundet caudally og dorsalt i forhold til mælkekirtler | 6-10 cm | Yveret, vulva, forhal i skeden, huden på de mediale og caudale aspekter af låret, mediale overflade af benet | |
| Scrotalt (mandlige version af overfladiske lyskelymfeknuder) | Fundet under prepublic senen i et lag af fedt rundt om halsen i pungen | 3-6 cm | Pungen, forhud og penis |
Tabel 1. Oversigt over kvæg overfladiske lymfeknuder.
| Animalske beskrivelse | Placering i håndskriftet | Alder | Køn | Sundhedsstatus |
| Videofilmer Bison bison | Bison i video--lymfeknude opsving | 5-6 yo | Kvinde | Sund |
| Videofilmer Bos taurus | Kvæg i video--lymfeknude opsving | 7-8 yo | Kastrerede handyr | Sund |
| Bison bison for RNA stabilitet undersøgelse | Fig. 5A-C | 5-6 yo | Kvinde | Sund |
| Bos taurus A står for RNA stabilitet undersøgelse | Fig. 5 c, Fig. 6A | 7-8 yo | Kastrerede handyr | Sund |
| Bos taurus B for RNA stabilitet undersøgelse | Fig. 5 c | 7-8 yo | Kastrerede handyr | Sund |
| Bos taurus FFPE kvalitet undersøgelse | Tabel 4, Fig. 4B | 0,5 yo | Kastrerede handyr | Sund (kontrol fra O157: H7 infektion undersøgelse) |
| Bemærk, at metoden, der er blevet brugt på flere ekstra kvæg, bison og ged lymfeknude prøver, ud over dem, der er fremhævet her. | ||||
| Desuden, vi brugte den samme metode på lymfeknude indsamlet fra en 1,5 mdr gammel kvindelige kalv. | ||||
Tabel 2. Karakteristik af dyr, der anvendes i pilotundersøgelserne.
| Vævstype | Bevarelse metode | Holding betingelser | Nedbrydning konklusion | Reference |
| Kvæg fedt, knogle muskel, lever | Fastgør frysning (flydende N2) | 4 ° C, vakuum pakket væv | Muskel RNA mere stabil (endda ud til 8 dage oplagring); fedtholdigt og lever stabile hovedsageligt til 24 h. som vurderet af udseendet af rRNA bands | Bahar et al. (2007)32 |
| Menneskelige kolon, kolorektal cancer | RNA bevarelse løsning | Stue temp. | RIN bevaret for 2 h., men undersæt af gener Vis ændringer i udtryk fra 0,5-2 h. | Yamagishi et al. (2014)33 |
| Mus lever, milt | RNA bevarelse løsning eller snap frysning (tøris gylle) | Inde i musen slagtekroppen (37 ° C) | Milt prøver var stabilt ud til 1,5 h; leveren prøver udstillet tidligere nedbrydning (24% fald i RIN på 105 min.) | Choi et al. (2016)34 |
| Mus lever | Ingen (Homogenized guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform i frisk) | 25 ° C, 37 ° C | Begrænsede nedbrydning ud til 4 h. ved 25 ° C, men omfattende nedbrydning ved 37 ° C i 4 h. (som observeret ved hjælp af RIN scores). | Almeida et al. (2004)35 |
| Menneskelige ileum | RNA bevarelse løsning eller snap frysning | 4 ° C, 37 ° C | Generelt stabil på 1,5 h. ved 37 ° C; Stabilt ud til 6 h. ved 4 ° C (som observeret ved hjælp af RIN scores). Bemærk, at forfatterne også giver en oversigt over udvalgte RNA stabilitet ressourcer i tabel S1, der kan tjene som en ekstra reference for dem interesseret i yderligere gennemgang af væv RNA integritet litteratur. | Lee et al. (2015)36 |
| Menneskelige leveren | Fastgør frysning (flydende N2 eller isopentane) | Stue temp. | Nedbrydning observeret ved 1 h. (op til 0.85 ΔRIN); flere nedbrydning i mindre prøver af leveren end i større prøver. | Kap et al. (2015)37 |
| Menneskelige kolorektal cancer | Fastgør frysning (flydende N2/isopentane) | 4 ° C | Observeret forringelse af 1 h.; RIN score kun 4.2 efter 90 min. forsinkelse i frysning tid | Hong et al. (2010)38 |
| Menneskelige leveren | RNA bevarelse løsning, også flash frysning (flydende N2) | Værelse temp, 4 ° C | Prøver var stabil selv ud til 1 d. på isen; nedbrydning observeret efter 1 d. ved stue temp. (men ikke efter 3 h.; som observeret ved hjælp af RIN scores) | Lee et al. (2013)39 |
| Hest fedt, knogle muskel | Fastgør frysning (flydende N2) | 13 ° C | Forfatterne anbefaler at bedste integritet for muskel var inden for 2 h.; fedt bevarelse inden for 0,5 h. anbefalet af forfattere (som observeret af rRNA gel udseende) | Morrison et al. (2014)40 |
| Laks hjerne, nyre, lever, muskler | RNA bevarelse løsning | Stue temp. | Hjernen RNA stabil til 4-8 h., nyre og muskler exhbiit nogle nedbrydning af 8 h. (gel, RIN score begge brugt) | Seear & Sweeney (2008)41 |
| Kanin bindevæv (ledbånd, sener, brusk) | Fastgør frysning (flydende N2) | 4 ° C, værelse temp. | Ingen "overt" nedbrydning ud til 96 h. obduktion, konstateret ved rRNA gel udseende | Martjuk et al. (1998)42 |
| Rotte hjerne, lunge, hjerte, lever | Synes at være udvundet frisk | Inde i rotte slagtekroppen afholdt i 20 ° C inkubator | Højeste RNA stabilitet observeret i hjernen (kunne observere rRNA bands ud til 7 dage obduktion, selvom nedbrydning var til stede), moderat stabilitet i lungen og hjertet, lave stabilitet i leveren; som observeret af rRNA gel udseende | Inoue et al. (2002)43 |
| Menneskelige tonsil, colon | Med og uden RNA bevarelse løsning derefter snap-frosset | Stue temp. (22 ° C), 4 ° C RNA bevarelse løsning, kolde saltvand eller is (0 ° C) | Stabil til 16 h. på is eller i RNA bevarelse løsning; lille nedbrydning på 6 eller 16 h. i kolde saltvand eller RT (målt ved RIN scores) | Micke et al. (2006)44 |
Tabel 3. Udsnit af tidligere resultater på RNA stabilitet i post mortem vævsprøver. Posterne repræsenterer udvalgte håndskrifter fra litteratur på RNA stabilitet, med en vifte af vævstyper repræsenteret, herunder murine, menneskelige biopsi og veterinære eksempler. Metoder til bevaring, tilstand af opbevaring før udvinding og et kort resumé af resultaterne leveres for hvert eksempel. Medmindre andet er angivet, prøverne blev opbevaret på betingelser, der spænder fra is til 37 ° C, efterfulgt af snap frysning eller en infusion med RNA bevarelse løsning, post tid kursus (med andre ord stabilitet blev ikke måles i overværelse af en RNA bevarelse løsning under inkubation, medmindre angivet).
| Sample ID | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| En260/A280 | 1,96 | 1,98 | 1,98 | 1,91 | 1,98 | 1.89 | 1.89 | 1,91 | 1.9 | 1,84 | 1,84 | 1,97 |
| En260/A230 | 0,67 | 0,14 | 0,19 | 0,26 | 0,61 | 0,69 | 1.33 | 0,11 | 0,21 | 0,39 | 0,1 | 0,44 |
| RIN | 1,6 | 1.1 | 1.3 | 1.2 | 1 | 1.3 | 2 | 1.1 | 1.2 | 1 | 1 | 1 |
Tabel 4. Repræsentant resultater fra RNA isoleret fra kvæg FFPE mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder. Tabellen viser resultaterne fra spektrofotometriske og kvalitetsmålinger fra en serie af FFPE bovin lymfeknude prøver behandlet ved hjælp af metoden i dette håndskrift. I hvert tilfælde afspejler at resultaterne meget nedbrudt RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fleste af transkriptom undersøgelser og de tilknyttede protokoller fokusere på mus, rotte eller post mortem-menneskelige prøver. Men undersøgelser i husdyr og vilde dyr og giver en bred vifte af muligheder for karakterisering af immunrespons til sygdom, både som gælder for veterinærmedicin og med hensyn til zoonoser, offentlige sundhedsfare. Denne protokol leveret en oversigt over centrale overvejelser i forbindelse med høj-integritet RNA udvinding fra væv fra store dyr som kvæg, bison, geder og får. Størrelsen af dyr, samt betingelserne for prøvetagning, gøre inddrivelsen en mere omfattende proces, med en længere post mortem behandlingstid end for musen lymfeknude opsving. Ligeledes, den store størrelse i disse lymfeknuder nødvendiggør protokoller, der gendanne parallelle prøver fra forskellige dyr samt prøver, der er repræsentative for de immunologiske/patologiske ændringer i lymfeknuderne. Forslag til prøvetagning i denne protokol giver til genopretning af intakt RNA såvel som for repræsentative profiler baseret på skæring af lymfeknude.
Som en demonstration af betydningen af en standardiseret prøvetagningsmetode og protokol, som præsenteres her, undersøgte vi 25 papirer fra PubMed Central database, der prægede transcriptomes af husdyr lymfeknuder. Et papir angivet ved forarbejdning af et stort lymfeknude afsnit ad gangen, en diskuteret specifikke laser fange microdissection metoder, en nævnte, at en "repræsentativ stikprøve" blev indsamlet fra lymfeknude, og kun én papir46 angivet at stykke af lymfeknude indsamlet (10 mm3 i størrelse) omfattede både cortex og medulla regioner. Mens andre papirer bemærkede, at små prøver (normalt 30-100 mg) blev behandlet for RNA analyse, nævne 84% af papirerne ikke en prøvetagningsmetode for indsamlingen af disse væv stykker. Som RNA-sekventering er stadig forholdsvis dyrt, analyse af flere sektioner pr. lymfeknude er usandsynligt at være rentabelt i de fleste tilfælde, især da biologiske Kontraprøverne, der udtages typisk prioriteres til statistiske analyser. Ved at indsamle en prøve på tværs af en kile af en sagittally sektioneret lymfeknude, er RNA fra lymfeknude regioner rige på forskellige typer af immunceller fanget i alle prøver. Denne protokol kan derfor tjene som en reference til en dokumenteret og reproducerbare prøvetagningsmetode for lymfeknude transcriptomics.
Under forberedelse af RNA fra væv er der flere vigtige skridt for proceduremæssige beslutningstagning. Først, den metodologiske litteratur er blandet med hensyn til brug af bevarelse løsninger vs. brug af flash-frosset væv prøver (og efterfølgende kolde temperatur slibning). Især for stor animalsk necropsies er der flere potentielle proceduremæssige fordele til brugen af en bevarelse løsning, som er indarbejdet i denne protokol. Først, vævsprøver kan gemmes under obduktion i bevarelse løsning uden behovet for at straks overføre rør til flydende kvælstof. For det andet giver brugen af en bevarelse løsning ekstra beskyttelse inden prøven forarbejdning for RNA udvinding, især hvis prøven kortvarigt eller delvist smelter inden homogenisering. Resultaterne i figur 6A tyder på at denne beskyttende effekt strækker sig til lymfeknude væv. Derimod skal flash-frosset prøver holdes i frossen tilstand indtil homogenisering i en phenol-holdige buffer. Endelig, for feltet necropsies store dyr, hvor flydende nitrogen ikke er let tilgængelige, prøver kan gemmes i bevarelse løsning indtil de kan returneres til laboratoriet.
Yderligere fordele af de molekylære komponenter af den procedure, der er præsenteret her omfatter tilstedeværelsen af phenol under den oprindelige væv behandling, der fungerer som et desinfektionsmiddel under den aerosol-genererende proces, homogenisering for prøver fra inficerede dyr og brugen af spin kolonne procedure at fjerne resterende phenol og guanidin isothiocyanat fra prøven. Repræsentative resultaterne viser, at proceduren genererer høj kvalitet RNA som vurderet af en260/A280 og en260/A230 nøgletal, gel elektroforese og RIN scores, og er robust over for tiden kursus udfordringer husdyr og vilde dyr prøveudtagning. Parring af væv bevaring (f.eks.i RNALater), homogenisering i phenol-baserede reagenser (f.eks.TRIzol) og silica kolonne rensning er blevet med succes udnyttet i litteratur til profil gen expression mønstre i fåre abomasal lymfeknuder inficeret med gastrointestinal nematoder46 og i kvæg lymfeknuder inficeret med en herpesvirus47med RIN score større end 8 og større end 7 på tværs af alle prøver, henholdsvis.
I tilfælde af en resulterende RNA med uacceptable RIN noder for downstream analyse, følgende variabler, som er standard for RNA forarbejdning, bør vurderes: samlede behandling tid obduktion, tilstanden af væv, behandling/forsinkelse efter tøbrud teknik under RNA udvinding og RNA håndtering efter udvinding. Den samlede behandling tid post mortem bør vurderes især for væv inddrives fra dyr fundet døde, i modsætning til aflivede dyr. Som beskrevet ovenfor, RNA er forholdsvis stabilt i lymfeknuder, men lange forsinkelser i behandlingen kunne føre til nedbrydning, især til ustabile udskrifter. En forstyrrende tid variabel kunne være til stede hvis prøver sammenlignes mellem slagtekroppe, der har opholdt sig i feltet i forskellige mængder af tid. Tilstanden af væv bør vurderes, fordi nedbrydning af væv integritet, på grund af patologiske ændringer forbundet med infektion, kan reducere RNA stabilitet. For eksempel, lavere RNA kvalitet er blevet observeret i placentome af Brucella-inficerede dyr efter abort (Boggiatto et al., indsendt). Forarbejdning tid/forsinkelse efter optøning er dæmpet ved brug af opbevaring løsninger, som beskrevet i denne protokol. Være sikker på, at tykkelsen af vævet stykker er lav nok til at tillade en korrekt og hurtig penetration af konserveringsmiddel løsningen ind i vævet (< 5 mm tykkelse ved hjælp af konserveringsmiddel nævnt i Tabel af materialer). Under RNA udvinding, buffere skal være RNase-fri og kontakt med handsker og andre forurenede elementer (RNases er til stede på huden) skal undgås. Til slibning af lymfeknude væv, den største kilde til potentielle RNases bliver i væv, sig selv, men det er gavnligt at reducere indførelsen af forurenende stoffer i alle faser af proceduren. For at håndtere RNA efter udvinding, som beskrevet i protokollen, alikvot RNA prøver i rør før frysning og oplagring på-80° C, til at eliminere behovet for at fryse-tø prøver til en kvalitativ og kvantitativ analyse.
Lave udbytter i proceduren ud over som følge af nedbrydning af RNA prøver, kan være på grund af en ineffektiv homogenisering af lymfeknude væv på trin 4.3 i protokollen. Bemærk, at inkubation i en RNA bevarelse løsning kan ændre tekstur af væv (stigning fasthed), selv om de fleste lymfeknude væv adskilles effektivt i pilot løber med den store tandede rotor-stator dissociator beskrevet her. Som har noteret i trin 4.3.1, homogenisering i phenol-baserede reagens skal gentages, hvis dissociation ufuldstændige. Morter og pistil slibning, er efterfulgt af en ophvirvling af jorden prøven i et phenol-baserede reagens, en anden alternativ til laboratorier uden adgang til en homogeniseringsapparat med disse specifikationer. Dog præsenterer en homogenisering i Engangsrør flere potentielle fordele i forhold til slibning af frossen væv i en morter og støder, herunder en mere realistisk og kortere arbejdsgang for at behandle flere prøver, et fravær af prøven tab når slibning , ingen oprydning, og ingen potentielle kontakt med powered prøver, i forbindelse med væv fra inficerede dyr.
Avraham et al. 48 beskriver, at en stor 5S RNA peak i slutproduktet i RNA, parret med en lav udnyttelse af 28S og 18S ribosomale RNA'er, kan være et tegn på en ufuldstændig lysering af celler (som gengæld for lymfeknude behandling, kan være på grund af en ufuldstændig dissociation af tiss UE). Figur 6B giver et eksempel på en RNA profil genereret fra et stykke kvæg parotideale lymfeknude, der var meget højt i bindevæv og ikke homogeniseres effektivt. RNA udbytter skal beregnes og overvåges på tværs af prøver i et sæt til analyse for at bekræfte, at lignende tilbagebetalinger er opnået pr. mg af væv, og prøver for direkte sammenligning af RNA-sekventering skal behandles i kørslen, ved hjælp af den samme homogenisering strategi for alle prøver. Bemærk at kile prøveudtagning tilgang også aids i at undgå en samling af en stikprøve, der er udelukkende en region af omfattende bindevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive. Alle forskning er finansieret med egne midler fra det amerikanske Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Alle henvisninger til specifikke produkter leveres med henblik på eksperimentelle reproducerbarhed og repræsenterer ikke nogen godkendelse af disse produkter af den føderale regering.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke James Fosse for hans fremragende arbejde på alle Videografi og video forarbejdning; Michael Marti for hans fremragende arbejde i generation af digitaliserede kvæg billeder; Lilia Walther for hendes hjælp med RNA udvinding og Bioanalyzer kører; Mitch Palmer og Carly Kanipe for deres nyttige anmeldelse og feedback på lymfeknude billeder; og pasning af dyr og veterinaere personale på National Animal sygdom Center for alle deres hårde arbejde og bistand med husdyrhold og forberedelse til necropsies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Disposable scalpels | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Tissue forceps, rat tooth | Fisher Scientific | 12-460-117 | Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference |
| 3 mm punch biopsy needles | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Sharps container (small and transportable for necropsy) | Stericycle | 8900SA | 1 qt. size shown here |
| Cutting boards or disposable trays | Fisher Scientific | 09-002-24A | Available in a variety of sizes, depends on user preference |
| Personal protective equipment | Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.) | ||
| Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) | ThermoFisher | 15596026 | |
| Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) | ThermoFisher | 12183018A | Designed for up to 100 mg tissue |
| 100% Ethanol (200 proof for molecular biology) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (General, for gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Can also make from scratch in the laboratory |
| Deionized formamide | EMD Millipore | S4117 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) | Agilent | G2939BA | |
| FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Plastic spreader (L-shaped spreader) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Only needed for sterility testing for samples from infected animals |
| Necropsy knives | Livestock Concepts | WI-0009209 |
References
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459 (2015).
- Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
- Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
- Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
- Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
- Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
- Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
- Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
- Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
- Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
- Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
- Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
- Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
- TRIzol Reagent Manual. , ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
- Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
- PureLink RNA Mini Kit Protocol . , Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
- RNA Gel-loading Buffer. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. China. (2012).
- Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
- Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
- Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
- Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
- Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391 (2016).
- Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214 (2015).
- Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
- Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
- Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
- Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810 (2014).
- Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
- Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
- Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
- Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823 (2015).
- Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
- Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).
