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Immunology and Infection

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

Questo protocollo fornisce una panoramica delle procedure per l'isolamento di RNA per la profilazione di trascrittomica di linfonodo tessuti da grandi animali, compresi i passaggi nell'identificazione e l'asportazione dei linfonodi da bestiame e animali selvatici, approcci di campionamento per garantire la consistenza attraverso più animali e considerazioni più risultati rappresentativi per la conservazione post-raccolta e l'elaborazione per l'analisi del RNA.

Abstract

Grandi animali (bestiame e animali selvatici) servono come importanti serbatoi di agenti patogeni zoonotici, compreso Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaed e. colie sono utili per lo studio della patogenesi e/o diffusione dei batteri negli ospiti naturali. Con la funzione chiave di linfonodi nella risposta immunitaria ospite, linfonodo tessuti servire come una potenziale fonte di RNA per analisi trascrittomica a valle, al fine di valutare i cambiamenti temporali nell'espressione genica in cellule nel corso di un'infezione. Questo articolo presenta una panoramica del processo di raccolta di linfonodo, campioni tissutali e a valle RNA processing in bestiame, usando bovini (Bos taurus) come un modello, con ulteriori esempi forniti dal bisonte americano (bisonte del bisonte di ). Il protocollo comprende le informazioni relative all'ubicazione, identificazione e rimozione dei linfonodi da più siti chiave nel corpo. Inoltre, è presentata una metodologia di prelievo bioptico che consente per una consistenza di campionamento attraverso più animali. Diverse considerazioni per la conservazione del campione sono discusse, compreso la generazione di RNA adatto a valle metodologie come RNA-sequenziamento e RT-PCR. A causa dei lunghi ritardi insiti nella grande animale vs mouse tempo corso di studi, risultati rappresentativi da bison e tessuti bovini linfonodo sono presentati per descrivere il corso di tempo del degrado in questo tipo di tessuto, nel contesto di una revisione del precedenti lavori metodologici sulla degradazione del RNA in altri tessuti. Nel complesso, questo protocollo sarà utile per entrambi ricercatori veterinari inizio transcriptome progetti su grandi campioni di animali e per i biologi molecolari sono interessati ad apprendere tecniche per in vivo campioni tissutali e trattamento in vitro .

Introduction

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RNA-ordinando l'analisi del trascrittoma di linfonodi offre l'opportunità di caratterizzare la risposta immunitaria degli animali ad una varietà di agenti patogeni. Mentre questa metodologia è stata utilizzata estesamente in topi, analisi recentemente sono state espandendo in più grandi mammiferi1,2. Bestiame/grande animale dei linfonodi può essere utilizzati per caratterizzare la risposta dell'ospite all'infezione, non solo per il loro uso nel vaccino o gli studi di predisposizione genetica e per l'identificazione di bersagli per lo sviluppo di farmaci, ma anche come sistemi modello per studi umani su malattie zoonotiche. Ad esempio, nel caso di brucellosi (una malattia zoonotica batterica che impatti mezzo milione di persone nel mondo ogni anno), nonostante ha aumentato significativamente i costi, gli studi in pecore o capre sono più rilevanti per l'infezione umana e vaccino umano sviluppo di modelli animali di laboratorio. Modelli murini di infezione ricapitolano l'infezione del sistema reticoloendoteliale ma non i segni clinici caratteristici3.

Negli esperimenti sugli animali grandi rispetto agli studi sugli animali di laboratorio, il processo di tessuto raccolta necessariamente comporta un ritardo maggiore tra l'eutanasia e l'insieme del tessuto, che presenta una sfida per la conservazione della RNA di alta qualità. Il RNA intatto è essenziale per la generazione di dati di trascrittomica biologicamente rilevanti. La generazione di RNA di alta qualità da campioni di tessuto è particolarmente critica per gli studi di grande agente patogeno animale condotto in strutture di contenimento. Tali studi sono intrinsecamente più difficili da eseguire come non solo richiedono impianti autorizzati e personale altamente qualificato, ma anche portare significativi costi finanziari, che, a seconda del lavoro, possono variare da decine a centinaia di migliaia di dollari. Questi tipi di studi implicano anche una collaborazione interdisciplinare e conoscenza interdisciplinare per il loro completamento, aggiungendo alla loro complessità. Di conseguenza, formazione, sviluppo di e il rispetto di un sistema semplificato per la raccolta dei campioni e conservazione offre notevoli vantaggi per gli studi molecolari a valle dei tessuti da animali infetti.

La collezione dei linfonodi più grande presenta ulteriori sfide per la raccolta di tessuto rispetto al simile campionamento dei linfonodi murini. La preparazione per l'asportazione di campione richiede una conoscenza di base dell'anatomia del linfonodo, comprese le pertinenti strutture interne. La struttura di un linfonodo è costituita da lobuli linfoidi circondati da seni pieni di linfa. Queste strutture sono racchiuse da una capsula fibrosa, dura. 4 un lobulo linfoide è il "anatomica e funzionale unità base del linfonodo" ed è composto di follicoli, un'unità profonda corticale e cordoni midollari e seni4 (Figura 1A). I linfociti B e T sono sede del follicoli e corticale profonda unità, rispettivamente. Queste strutture forniscono un ponteggio 3D e facilitano l'interazione tra linfociti e cellule presentanti l'antigene o antigene.

Grossolanamente, follicoli e unità profonda corticale può essere identificato sulla superficie di taglio, dato che contengono un denso reticolo reticolare e appaiono più scuri rispetto i seni, che sono costituiti da un reticolo reticolare più delicato e appaiono più chiare (Figura 1B). Per convenzione, i patologi si riferiscono alle regioni dei linfonodi come la corteccia superficiale (follicoli), la paracorteccia (profondità corticale unità) e il midollo (cordoni midollari e seni paranasali). Un esame adeguato di tutte le tre regioni è stato considerato come migliore pratica negli orientamenti per l'esame patologico sistematico per linfonodi5. Nota che c'è una considerevole variazione nella consistenza, dimensione e il colore dei linfonodi, anche all'interno di un singolo animale. Come età animali, loro linfonodi tenderà a diminuire di dimensioni e diventare più forte di quelli degli animali più giovani, in genere a causa di un aumento nel loro tessuto connettivo e una riduzione del normale linfoide struttura6,7.

Figure 1
Figura 1. Anatomia del linfonodo. (A) questa immagine del fumetto Mostra l'anatomia del linfonodo, raffiguranti strutture chiave. (B) questo fermo immagine mostra un linfonodo bovino tagliato in sezione trasversale. Sono evidenziati le pertinenti strutture/strati che sono visibili ad occhio nudo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A seconda della domanda sperimentale, vari linfonodi sarà di interesse per la raccolta e l'analisi. Linfonodi periferici sono quelli situati nel tessuto sottocutaneo profondo. Nei bovini, linfonodi periferici o superficiale, spesso utilizzati nella pratica clinica e sperimentale includono parotide, sottomandibolare, retropharyngeal, -prescapolari, prefemorali (precrural) e superficiale inguinale (soprammammari in femmine, scrotale nei maschi) ( Figura 2). In tabella 1, sono descritte le proprietà della chiave linfonodi superficiali, come descritto nel bestiame sistema8. Sotto, alcuni potenziali piani di raccolta di linfonodo per malattie infettive batteriche del bestiame sono presentati come punto di partenza per l'indagine.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies per b. abortus-infetti bestiame e b. melitensis-capre infette al National Animal Disease Center recupero tessuto linfonodo parotideo, prescapular e soprammammari , sia per la macinazione per l'enumerazione batterica e per la preparazione di RNA per il delineamento di espressione host RNA. B. abortus possono essere recuperati regolarmente in ciascuno di questi linfonodi in bestiami infettati sperimentalmente9. La presenza di batteri in ognuno di questi tipi di linfonodo può essere rilevata in b. melitensis-infettati capre fino a post-infezione almeno nove mesi, usando le metodologie basate su RNA dai nostri studi (Boggiatto et al., non pubblicato). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemorali), e i linfonodi mesenterici sono stati utili durante la profilatura delle carcasse di bovini per una prevalenza di Salmonella 10,11,12 e sarebbe di potenziale interesse per gli studi di trascrittomica. Escherichia coli O157: H7: linfonodi mesenterici (a medio piccolo intestino e intestino tenue distale posizioni) possono essere i siti di un recupero occasionale dei batteri in vitelli infetti (ma non in bovini adulti infetti)13. Leptospirosi (Leptospira SP.): una persistenza cronica dei batteri è stata osservata nei linfonodi drenanti la ghiandola mammaria14. Mycobacterium bovis : Nei bovini, i batteri sono stati recuperati di infezione post-sperimentale dai linfonodi mediastinici e tracheobronchial vitelli15. Inoltre, RNA di linfonodo è stato utilizzato per esaminare le risposte di grande animale ospite ai virus, come la sindrome riproduttiva e respiratoria del suino virus2. Figura 2 descrive la posizione di un sottoinsieme di questi linfonodi principali nel corpo del bestiame.

Figure 2
Figura 2: Cartone animato raffigurante località selezionata di linfonodo in Bos taurus . I linfonodi numerati vengono annotati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo articolo e il video associato, presentiamo un protocollo per l'isolamento dei linfonodi grandi animali per studi di RNA, progettati per essere informativo per i biologi molecolari coinvolti negli studi di trascrittomica di grandi infezioni degli animali. In primo luogo, forniamo una panoramica della procedura di isolamento per i linfonodi, mediante campionamento dai tessuti bovini e bisonte come esempi. Accoppiato con questa dimostrazione, come mostrato nel video, è un flusso di lavoro per un campione del tessuto riproducibile per isolamento del RNA. Descriveremo inoltre considerazioni importanti per l'elaborazione di un linfonodo infetto, con un focus sulla sicurezza, la coerenza e la qualità di RNA.

La preparazione di RNA dal tessuto con un reagente di isotiocianato di fenolo-guanidina acidificato è basata sul metodo originale di Chomczynski e Sacchi16,17, con una purificazione su colonne di spin a base di silice in presenza di agenti caotropici basati sul lavoro originale di Vogelstein e Gillespie18. Esaminiamo anche il potenziale per il recupero di RNA per trascrittomica dai linfonodi bestiame conservati con metodi alternativi. Infine, abbiamo esplorare l'impatto della variabile tempo sulla qualità di RNA in grande autopsie animali, tra cui un esperimento rappresentanza raffigurante l'effetto di un aumento nel tempo tra l'eutanasia e il campionamento sul profilo del RNA recuperato da bison e bovina nei linfonodi. Questo articolo sarà utile non solo per i biologi molecolari, ma anche a veterinari ricercatori che inizia gli studi di trascrittomica.

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Protocol

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Le procedure di autopsia degli animali qui raffigurate sono coperti da protocolli approvati IACUC presso il National Animal Disease Center, Ames, IA. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli orientamenti approvati per la cura degli animali e il benessere.

1. pre-pianificazione prima autopsia

  1. Prima l'autopsia, preparare i seguenti materiali per il trasporto per la suite di autopsia:
    1. microcentrifuga da 1,5 o 2 mL riempita con ~ 1,0 mL di soluzione di conservazione di RNA, in un contenitore rack o trasporto. Assicurarsi di seguire le linee guida del produttore per il rapporto tra il volume di soluzione di conservazione per il volume del tessuto.
    2. Bisturi monouso e forcipe pulito, sterilizzato nell'autoclave: uno impostato per la dissezione della pelle e un set diverso per la raccolta dei linfonodi (uno per ogni linfonodo, per animale), impedendo così una contaminazione della pelle e dell'ambiente flora con il linfonodo tessuti.
    3. 3 punzone mm utensili biopsia, l'autopsia, un apposito contenitore per il bisturi usati e strumenti di biopsia e taglieri o vassoi monouso per uso nella dissezione di linfonodo.
    4. Utilizzare dispositivi di protezione individuale, compresi PPE necessari per il lavoro al livello BSL appropriato per il sistema.
    5. Autoclave riutilizzabile utensili metallici, tra cui il forcipe, in recipienti in metallo prima dell'autopsia, usando le merci di utensili/a secco l'impostazione.

2. identificazione e campionamento dei linfonodi nei bovini e Bison

Figure 3
Figura 3 . I linfonodi del collo e testa del bovino. (A) questa immagine cartone spettacoli selezionati dei linfonodi della testa e del collo di Bos taurus. (B) questa immagine mostra il linfonodo parotideo in sezione trasversale (a sinistra) rispetto alla ghiandola salivaria parotidea in sezione trasversale (a destra). Si noti la differenza tra i tipi di due tessuto texture. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Isolamento dei linfonodi-prescapolari nei bovini e bisonte
    1. Eutanasia animale (bovini o bisonte di qualsiasi età, come appropriato per l'esperimento) basato sul protocollo IACUC locale. Confermare la morte di metodi specificamente descritti nel protocollo IACUC istituzionale, tra cui la mancanza di un battito cardiaco, la mancanza di respirazione e l'assenza di un riflesso corneale. Spostare l'animale al piano l'autopsia.
      Nota: Ci sono vari metodi di eutanasia umana usato nella pratica di laboratorio di grandi animali. Tuttavia, la somministrazione endovenosa di soluzione di sodio sodio pentobarbital e fenitoina è il più comunemente approvato e utilizzato forma. Consultare le linee guida di AVMA per l'eutanasia degli animali. 19
      Attenzione: Seguire tutti i protocolli di biosicurezza rilevanti per un'autopsia presso l'Istituto ospitante, compresi gli orientamenti per lo smaltimento sicuro dei dispositivi taglienti in un contenitore a prova di puntura e la decontaminazione di coltelli in metallo riutilizzabili e forcipe. Questo protocollo genera rifiuti taglienti dall'uso di bisturi monouso. Indossare indumenti protettivi, come dettato dalle linee guida istituzionali, tra cui stivali, tute, guanti e occhiali di protezione.
    2. Identificare 3 partecipanti a lavorare sui tessuti animali.
      Nota: Qui, dissettore 1 verrà essere incaricato il su grande scala di sezionamento dei tessuti animali desiderati, dissettore 2 recupererà i linfonodi dalle diverse sezioni animali e dissettore 3 lavorerà ad un tavolo separato per isolare le sezioni da ogni linfonodo e trasferirli ai tubi con una soluzione conservante.
    3. Inizia mettendo l'animale in decubito laterale.
    4. Estendere la spalla spostando indietro l'arto anteriore a livello del ginocchio (carpo); Questo movimento riporterà la spalla e consentire una più facile palpazione del linfonodo. Sentire la presenza del linfonodo "grumo".
      Nota: In condizioni di malattia, linfoadenopatia può essere presente, che rende più facile l'identificazione dei linfonodi, ma questo processo può anche influenzare la coerenza, la composizione e l'architettura del linfonodo.
    5. Una volta individuato e con la spalla ancora esteso, è possibile utilizzare un coltello bisturi o l'autopsia per fare un'incisione della pelle lungo il contorno della spalla.
      Nota: Non limita la dimensione dell'incisione, anche se il linfonodo è stato posizionato tramite la palpazione. Una grande incisione fornisce l'accesso più facile ai tessuti più profondi e facilita l'asportazione del linfonodo per il dissettore.
    6. Utilizzando un paio di pinze, ritrarre la pelle per rivelare il punto della spalla e muscolatura del collo.
      Nota: Il linfonodo-prescapolari si trova spesso nel grasso sottocutaneo, soprattutto negli animali overconditioned.
    7. Ancora una volta, palpare la posizione del linfonodo (Figura 3A).
      Nota: A differenza del grasso sottocutaneo, il linfonodo terrà la sua forma quando palpated. Inoltre, i linfonodi non sono contigui con qualsiasi tessuto circostante, come essi sono racchiusi da una capsula fibrosa sottile.
    8. Dopo aver individuato il linfonodo-prescapolari, accuratamente sezionare il grasso sottocutaneo, usando un bisturi e pinze e isolare il linfonodo.
      1. Cercare la presenza di una capsula fibrosa sottile, come raffigurato in Figura 1B, per distinguere tra il linfonodo e tessuto adiposo; i linfonodi non sono contigui con qualsiasi tessuto circostante.
    9. Trasferire il linfonodo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.
      Nota: L'aspetto di questi linfonodi in bisonte è simile. Il video associato raffigura l'aspetto del linfonodo-prescapolari come dissecato fuori la spalla destra di un bisonte americano.
  2. Isolamento dei linfonodi parotidei nei bovini e bisonte
    1. Inizia mettendo l'animale in decubito laterale sul pavimento l'autopsia. Individuare il giunto temporomandibular (TMJ).
      1. Se questo è difficile da individuare, spostare lentamente la mandibola e determinare la posizione in cui la mandibola si attacca al cranio; si tratta di TMJ.
    2. Con attenzione usando un coltello bisturi o l'autopsia, fare un'incisione nella pelle. Iniziare l'incisione dorsale al giunto ed estenderlo ventralmente/verticalmente lungo la linea della mascella.
    3. Sezionare la pelle via per rivelare il tessuto sottocutaneo. Ghiandola salivaria parotidea saranno visibile in primo luogo, a causa di grandi dimensioni, aspetto superficie lobulated e colorazione rossa.
    4. Utilizzando forcipe e un bisturi, spostare la ghiandola salivaria parotidea da parte per trovare il linfonodo parotideo che si siede appena craniale e mediale alla ghiandola salivare (Figura 3A). Esaminare il tessuto del linfonodo parotideo per trama prima del successivo trattamento.
      Nota: i linfonodi del viso (parotide e sottomandibolare) sono associate a ghiandole salivari, che può confondere l'isolamento di linfonodo. Rispetto ai linfonodi, ghiandole salivari sono molto più grandi e hanno un aspetto lobulato. Inoltre, sulla superficie di taglio, ghiandole salivari sono omogenee in natura e non presentano il classico modello architetturale corticale e midollare dei linfonodi (Figura 3B).
    5. Asportare la ghiandola con un bisturi. Trasferirlo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.
  3. Isolamento dei linfonodi soprammammari nei bovini femminili e bisonte
    1. Metti l'animale in decubito laterale.
    2. Elevare la gamba posteriore per esporre la regione inguinale e individuare la mammella.
      Nota: In un animale sano, che non allattano, palpazione di questi linfonodi potrebbe non essere possibile. In un animale durante l'allattamento, questi linfonodi può essere palpabili al bordo caudale della base della mammella.
    3. Usando un bisturi, fare un'incisione appena dorsale alla mammella, che corre lungo la parte superiore della gamba, per esporre le ghiandole soprammammari.
    4. Sezionare il tessuto sottocutaneo e trovare il linfonodo soprammammari incorporato in un sottile strato di grasso sottocutaneo. Se non è visivamente distinguibile, palpare il tessuto esposto per la presenza di una struttura costante all'interno del grasso sottocutaneo.
    5. Usando un bisturi e pinze, sezionare con cura il linfonodo dal grasso. Trasferirlo alla tabella di dissezione di linfonodo, utilizzando un vassoio di plastica per il trasferimento del tessuto, per ulteriore sezionamento.

3. sezionamento e deposito dei linfonodi

  1. Passare i linfonodi isolati da dissettore 2 a dissettore 3 a un tavolo di dissezione adiacente allo spazio principale autopsia. Posizionare ogni linfonodo su una sezione fresca di un tagliere. Pre-etichettare i taglieri in sezioni di linfonodo, per facilitare la ricezione dei linfonodi multipli in successione. Per campioni infetti, utilizzare vassoi monouso.
  2. Utilizzando pinze e una lama di bisturi o l'autopsia monouso, rimuovere una sezione del linfonodo. Usando un coltello affilato, fare un taglio sagittale ad aprirsi il linfonodo.
  3. Esaminare l'interno del linfonodo, soprattutto negli esemplari di animali infetti, alla ricerca di asimmetria, lesioni, differenze di colore, ecc. registrare le osservazioni.
  4. (Opzione 1) Sezioni di tessuto piccolo
    1. Utilizzare bisturi monouso per asportare pezzi di ogni linfonodo che sono meno di 5 mm di spessore e trasferire ogni pezzo in una provetta con una soluzione di conservazione di RNA con una pinza pulita.
  5. (Opzione 2) Metodologie di sezionamento o di biopsia di linfonodo
    Nota: Le biopsie o metodologie di sezionamento, quando applicato alle sezioni parallele di linfonodo in diversi nodi e animali, forniscono coerenza del tessuto campione per un'analisi del RNA di massa.
    1. Zeppa di metodo a sezione ottica
      1. Dopo aver esaminato la sezione sagittale per catturare le cellule attraverso il profilo del linfonodo, asportare un cuneo a forma di torta dal linfonodo, dal centro verso la capsula esterna. Per un nodo di 2 cm di larghezza (dimensione standard; si veda tabella 1), un cuneo tagliato al centro che è di 4 mm di lunghezza di arco esterno e 5 mm di spessore avrà un peso bagnato di ~ 100 mg.
      2. Utilizzando il bisturi, tagliare il cuneo in piccoli pezzi, non più spesse di 5 mm e circa 50-100 mg ogni peso tessuto bagnato.
        Nota: Per motivi di coerenza, elabora tutti i pezzi di Cuneo da un singolo linfonodo in un batch o in provette separate seguita da RNA pool per fornire un profilo rappresentativo di RNA dal linfonodo di interesse.
      3. Mettere i pezzi di tessuto con il forcipe in provette contenenti almeno 10 volumi di soluzione di conservazione di RNA, rispetto al volume del tessuto.
    2. Punch biopsia metodo
      1. Selezionare uno strumento di biopsia del punzone se l'obiettivo è quello di raccogliere le sezioni specifiche, quali specifici follicoli dal nodo. Selezionare uno strumento coerenza con la dimensione del campione desiderato per la raccolta. Punch biopsia strumenti sono disponibili in una gamma di dimensioni, da 1 a 8 mm di diametro.
      2. Individuare visivamente le regioni di interesse per esempio nel linfonodo.
      3. Utilizzare lo strumento di biopsia del punzone per asportare le sezioni di interesse, premendo e ruotando lo strumento nel tessuto per creare il nucleo. Trasferire il pezzo di tessuto con il forcipe in una provetta contenente almeno 10 volumi di soluzione di conservazione di RNA. Se più spessa di 5 mm, è possibile utilizzare un bisturi e pinze per dividere ulteriormente il tessuto in pezzi più piccoli.
  6. Una volta che i campioni sono stati trasferiti alla soluzione di conservazione (ad es., RNALater), trasportarli indietro al laboratorio a temperatura ambiente.
  7. Conservare i campioni a 4 ° C durante la notte per consentire la penetrazione del tessuto.
  8. Il giorno dopo, versare la soluzione conservante di RNA in eccesso e conservare i campioni di tessuto a-80 ° C. Rimuovere tanto preservativo possibili prima di congelare i campioni. Usare una punta di una micropipetta P1000 e/o P200 per un'efficiente rimozione di soluzione conservante di RNA.
    Attenzione: Ignora la soluzione decantata conservazione in modo appropriato, sulla base delle proprietà infettive dell'agente patogeno utilizzato così come i rischi chimici e ambientali della soluzione conservante come specificato nella scheda di dati di sicurezza.
    Nota: Le linee guida qui riportate sono fornite per la soluzione di conservazione RNA descritta nella Tabella materiali. Consultare le linee guida del produttore se utilizza soluzioni di conservazione alternativo.

4. elaborazione da RNA linfonodi

Attenzione: Indossare un camice da laboratorio, guanti e protezione degli occhi adeguata per le fasi di lavorazione.

Nota: Il reagente fenolo-basato usato qui è descritta nella Tabella materiali (e il protocollo si basa sulle linee guida del produttore)20. L'uso di reagenti alternativi a base di fenolo può richiedere una modifica della procedura, sulla base delle raccomandazioni del fabbricante del prodotto specifico acquistato.

  1. Prima di accedere i campioni, pre-aliquota il reagente di fenolo-basato di freddo (4 ° C) per tubi di omogeneizzazione (1,5 mL/tubo), utilizzando una pipetta.
    Attenzione: Il fenolo è tossico, corrosivo e un pericolo per la salute. Il cloroformio è tossico e un pericolo per la salute. Completare i passaggi di elaborazione 4.1-4.9 in una cappa chimica e indossare i guanti per impedire qualsiasi contatto con le sostanze chimiche. Negli Stati Uniti, il cloroformio è un rifiuti pericolosi; Smaltire le provette contenenti rifiuti pericolosi secondo le linee guida locali e istituzionali. Campioni di tessuto di processo da animali infettati con gli agenti patogeni sotto il corrispondente BSL-2, BSL-3 o linee guida BSL-4.
  2. Una volta che un campione può essere allentato dalla microcentrifuga con una pinza pulita, trasferire immediatamente circa 50-100 mg di tessuto conservato nella provetta di omogeneizzazione contenente il reagente fenolo-basato.
    1. Limitare lo scongelamento prima dell'aggiunta per il reagente fenolo-basato. Utilizzare l'archiviazione su ghiaccio secco quando campioni multipli vengono rimossi dal freezer per l'elaborazione.
  3. Strettamente richiudere la provetta, posizionarlo sull'omogeneizzatore e omogeneizzare il campione con un omogeneizzatore del tessuto di rotore-statore nel reagente fenolo-basato. Completare il trattamento a temperatura ambiente. Quando completato, controllare per un'apparenza nuvolosa garantire che il campione è stato omogeneizzato con successo; il tessuto deve essere dispersa in una sospensione torbida.
    Nota: Viene utilizzata un'impostazione di estrazione di 2 min RNA (l'impostazione di RNA_02_1 pre-impostato per l'omogeneizzatore descritto in Tabella materiali; progettato per tessuti congelati). Rotore-statore specificato nel presente protocollo (Vedi la Tabella materiali) sono grande-dentato e adattato per l'omogeneizzazione di una gamma di tipi di tessuti, compreso il materiale fibroso. L'impostazione di RNA_02_01 è progettato specificamente per congelati (al contrario di fresco) tessuti. Come i linfonodi hanno componenti del tessuto connettivo fibroso, un omogeneizzatore a rotore-statore Analogamente ottimizzato è raccomandato per ottenere un efficace dissociazione. Vedere il National Institute of Environmental Health Sciences21 per ulteriori informazioni sui suggerimenti di omogeneizzazione.
    1. Se grandi blocchi di tessuto rimangono dopo l'omogeneizzazione, ripetere la procedura di omogeneizzazione. Al fine di recuperare in modo efficiente il RNA, il tessuto deve essere ben dissociato.
    2. Per pezzi più fibrosi di linfonodo, utilizzare pinze e le forbici pre-tagliare il pezzo di linfonodo in diversi piccoli pezzi prima del trasferimento al tubo di omogeneizzazione. Come descritto nell'introduzione, linfonodo tessuti dagli animali più anziani possono essere più fibrosi.
      Nota: Se si desidera un'analisi dual dell'ospite e patogeno RNA, trattamento supplementare (ad esempio di omogeneizzazione della perla) può essere necessaria per il recupero di RNA batterico, soprattutto se gli agenti patogeni Gram-positivi sono presenti nei tessuti.
  4. Immediatamente rimuovere il campione omogeneizzato dai tubi e trasferirlo al RNAsi-libera per microcentrifuga (2,0 mL di dimensioni) con una micropipetta P1000.
  5. Centrifugare il campione per 5 min a 12.000 x g a 4 ° C per rimuovere eventuali detriti di campione. Utilizzando una punta di una micropipetta P1000, trasferire il surnatante ad un tubo del microcentrifuge fresco, lasciando il pellet.
  6. Incubare il surnatante per 5 min a temperatura ambiente. Dividere ogni campione tra due 1.5 microcentrifuga.
  7. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per 1 mL di reagente fenolo-basato (cioè, 0,3 mL per un campione di 1,5 mL); negarlo a mano per 1-2 min a mescolare le fasi, ma non centrifugare il campione. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
  8. Si centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
  9. Rimuovere con cautela la fase superiore, acquosa limpida con una punta di una micropipetta (P1000 o P200) che forma lo strato superiore, senza danneggiarne l'interfase o lo strato di rosso fenolo-cloroformio. Trasferirlo ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
  10. Mescolare con un volume uguale di etanolo al 100%; mescolare accuratamente capovolgendo la provetta 4 - 5 volte. Il filmato apparirà spesso nuvoloso.
  11. Con una punta di micropipetta, trasferire il liquido in una colonna a base di silice commerciale spin, per ulteriormente purificare ed eluire il RNA, seguire istruzioni22 del produttore. Eluire il RNA generato da ~ 50 mg di tessuto in 50-100 µ l di acqua RNAsi-libera.
    Nota: Mentre l'estrazione di reagente fenolo-basato rimuove il DNA nella fase organica, per l'utilizzo a valle del RNA in qRT-PCR e/o RNA-sequenziazione applicazioni, è consigliabile un ulteriore trattamento di campioni di RNA con dnasi.
  12. Aliquotare il RNA eluito per separare i tubi per uso in una valutazione di quantificazione e di qualità, per ridurre qualsiasi congelamento-scongelamento del campione di RNA principale. Trasferire le provette a-80 ° C per la conservazione.
  13. In caso di linfonodo campioni derivati da animali infettati con agenti patogeni zoonotici, soprattutto a livello di contenimento BSL-3, convalidare il campione di RNA risultante per l'assenza di agenti patogeni se il campione sarà spostato in una zona più bassa del livello di contenimento biosicurezza analisi della qualità, RT-PCR e/o preparazione di RNA-sequenziamento biblioteca.
    Nota: È fondamentale considerare le normative locali, e nel caso gli orientamenti di inattivazione di CDC (Centers for Disease Control and Prevention) per lavoro con selezionati agenti, è necessario convalidare tutte le procedure di inattivazione del ricercatore locale al sito.
    1. Rimuovere il volume dith di 1/10 di ogni campione di RNA eluiti dal passaggio 4,12 (cioè, 5 µ l da 50 µ l di RNA totale). Usando una tecnica sterile, mescolare il campione con 100 µ l di brodo di crescita batterica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Utilizzando una spatola di plastica sterile, stendere l'impasto di RNA-brodo su tutta la superficie di una piastra di agar.
      Nota: Selezionare una coerente con la crescita dell'agente patogeno con cui gli animali sono stati sfidati per piastra agar e tipo di brodo.
    2. Incubare la piastra di agar sotto condizioni specifiche per la crescita dell'agente patogeno con cui gli animali sono stati sfidati. Verificare l'assenza di batteri recuperati prima di togliere i campioni il contenimento BSL-3.
      Nota: il RNA eluito risultante, dopo test di integrità e quantificazione è adatto per applicazioni a valle, tra cui un RNA-sequenziamento ed analisi di RT-PCR.
  14. Valutare il recupero di RNA e purezza utilizzando uno spettrofotometro. Per valutare la qualità di RNA, carico 1-2 µ l di campione, RNA eluito con lo spettrofotometro per un'analisi. Registrare uno spettro del campione nella gamma degli ultravioletti (UV).
    1. Dallo spettro UV, registrare il rapporto di280 A260/A, il rapporto di230 A260/A e il valore260 per il campione (A = assorbanza).
    2. Come singoli filamenti di RNA ad una concentrazione di 40 µ g/mL ha un'assorbanza di 1.0 a 260 nm, calcolare la concentrazione di RNA (µ g/mL) moltiplicando la A260 x 40 per i campioni purificati.
  15. Come un metodo rapido di valutazione dell'integrità di RNA, per escludere eventuali campioni degradati da un'ulteriore analisi, mescolare 2 µ l di ciascun campione di RNA con 4 µ l di colorante di 1,5 x formamide caricamento [95% deionizzata formammide, blu di bromofenolo 0.025% (p/v), 0.025% (p/v) xilene cianolo, 5mm EDTA (pH 8.0), 0.025% (p/v) SDS] in 1,5 mL microcentrifuga23,24.
  16. I tubi a 70 ° C per 1 min di calore e quindi trasferire le provette in ghiaccio per 1 min.
  17. Caricare i campioni ad un gel di agarosio 1% preparato in 1 x TBE (per una descrizione completa di un elettroforesi del gel dell'agarosi nativo per RNA, vedere Rio, Jr. Ares, Hannon e Nilsen)24. Separare i campioni con i metodi standard del gel di elettroforesi e confermare la presenza di bande di RNA ribosomiale 28S e 18S.
  18. Follow-up l'elettroforesi in gel con metodi di analisi quantitativa per la determinazione di integrità di RNA [ad esempio, un'analisi (RNA integrità numero) Bioanalyzer e RIN] come descritto nei Risultati rappresentante e in Mueller, O. et al. 25 e Schroeder, a. et al. 26.

5. metodo di estrazione alternativa da formalina-fisse, paraffina (FFPE) tessuti

Nota: Anche se la conservazione del tessuto FFPE non rappresenta il metodo più affidabile di conservazione di acido nucleico, il protocollo presentato di seguito può essere un modo per studiare alcune modifiche trascrizionali quando non sono disponibili altri tessuti conservati.

  1. Preparare i reagenti formalina per la conservazione del tessuto di erogazione formalina in contenitori di plastica. Tessuti dovrebbero essere conservati in formalina con un rapporto di 20:1 formalina: tessuto volume/peso, rispettivamente.
    Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno umano conosciuto e anche se non acutamente tossici, l'esposizione cronica (in genere tramite inalazione fumi) può rappresentare un rischio significativo per la salute. Un'adeguata ventilazione e PPE (cioè, l'uso di guanti di nitrile, essere cambiato entro 15 min dopo l'esposizione iniziale) sono necessari per ridurre al minimo i rischi per la salute. Fare riferimento alla formaldeide Standard OSHA (29 CFR 1910.1048) per ulteriori informazioni sull'esposizione di monitoraggio e valutazione dei rischi.
    Nota: Utilizzando troppo poco formalina possa avere un impatto la capacità del tessuto di diventare completamente conservato quando sommerso in conservante.
  2. Dopo l'isolamento del tessuto di interesse, tagliandolo accuratamente il tessuto a meno di 5 mm di spessore.
    1. Con attenzione usando il forcipe, immergere il tessuto tagliato in formalina per ridurre al minimo eventuali spruzzi.
      Nota: I tessuti devono essere completamente immersi in formalina per consentire una completa fissazione. È fondamentale che tutte le superfici del tessuto sono completamente coperti con formalina.
  3. Una volta che i tessuti sono stati sommersi in formalina, consentono il fissaggio del tessuto si verificano per almeno 24 ore a temperatura ambiente.
    Nota: Formalina penetra i tessuti lentamente, ad un tasso di 1 mm ogni ora da tutte le superfici27,28. Pertanto, per mantenere lo spessore delle sezioni del tessuto a meno risultati di 5 mm in una rapida fissazione del tessuto intero.
  4. Dopo la fissazione, trasferire i tessuti a un reagente appropriato per l'inclusione in paraffina.
    Nota: ad esempio, i tessuti esaminati in questo manoscritto sono stati trasferiti al 70% di etanolo prima l'incorporamento.
  5. Incorporare i tessuti in paraffina. 29
  6. Sezione del tessuto di 10-80 µm di spessore (uso 10-20 µm se miRNA è desiderato da estrarre)29.
  7. Utilizzo di bisturi e pinze, rimuovere un pezzo di tessuto di 40 mg di ogni campione deve essere elaborato e metterlo in una provetta sterile, privo di nucleasi microfuge.
  8. Utilizzare un kit commerciale progettato per Sparaffinatura e recupero di acidi nucleici dei campioni di tessuto FFPE per estrarre RNA dai campioni conservati.
    Nota: Il kit a cui fa riferimento la Tabella materiali utilizza xilene ed etanolo lava per rimuovere la paraffina, un passo di trattamento di proteasi e un filtro di fibra di vetro per purificare il RNA.

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Representative Results

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L'uso delle considerazioni presentate in questo articolo (passaggi da 1 a 4 del protocollo) sarà di aiuto nel recupero di RNA da grandi campioni di animali che è adatto per un'analisi a valle in studi di espressione genica di host. La qualità di RNA per applicazioni a valle è valutata di più misure standard. Per spettrofotometria, il rapporto di280 A260/A fornisce una misura della contaminazione della proteina ed il rapporto di230 A260/A fornisce un altro mezzo di valutazione di purezza che rileverà contaminanti chimici come il fenolo. In ogni caso, i rapporti di ~ 2.0 sono la prova di RNA di alta qualità, e rapporti di riduzione sono segni di contaminazione. D'importanza, questi rapporti non forniscono tutte le informazioni sulla degradazione del RNA, che può essere valutata qualitativamente (passi 4,15-4,17) e quantitativamente (passo 4,18, come attraverso un RNA integrità numero o RIN Punteggio).

È importante notare che il livello di qualità previsto di RNA recuperato da sezioni di tessuto di linfonodo è, in media, inferiore per RNA recuperato dai campioni di bovino globuli bianchi. In una serie completa di estrazioni di RNA da tessuti di origine bovina e linee cellulari, Fleige e Pfaffl30 trovare che la media RIN (numeri di integrità RNA come misurato su un Bioanalyzer) variano tra < 5 per tessuto di digiuno e rumine e > 9 per sangue bianco cellule e corpo luteo, con punteggi RIN di linfonodo che cade in mezzo a una media di 6,9. In generale, Fleige e Pfaffl Nota30 che tessuti solidi producano RIN punteggi che vanno da 6-8 e che i tessuti con le più alte concentrazioni del tessuto connettivo presenta un degrado di media superiore. La densità del tessuto connettivo nel linfonodo, più il livello intrinseco delle RNAsi in questo tipo di tessuto, può essere responsabile per l'incapacità di costantemente recupera RNA con RIN Spartiti > 9 dai linfonodi.

Tuttavia, un esempio di un profilo di Bioanalyzer per il RNA ha recuperato da un bisonte soprammammari linfonodo utilizzando la metodologia presentata qui è visualizzato nella Figura 4A, dimostrando il recupero di RNA con un punteggio di RIN 8.6 (principalmente intatto e adatto per essenzialmente tutte le applicazioni a valle). RNA generato da questa procedura è stato utilizzato per generare correttamente le librerie per l'uso in RNA-sequenziamento; Questo protocollo consente l'isolamento regolare dei campioni del RNA da bison e linfonodi bovina con valori > 8 RIN (e spesso > 9). Per un insieme di otto campioni di RNA estratti di esempio, il rapporto medio di assorbanza a 260 nm/280 nm era 2.1 e a 260 nm/230 nm era 2.1, che indica una contaminazione di povera in proteine e una bassa contaminazione con sostanze chimiche come fenolo, rispettivamente. Il recupero medio dell'acido nucleico da ogni estrazione era 97 ± 10 µ g / ~ 100 mg o un rendimento del ~ 1 µ g di RNA/mg di tessuto di linfonodo.

Figure 4
Figura 4 . Tracce di qualità rappresentative raffigurante qualità di RNA da metodologie di estrazione. (A) questa traccia di spettacoli un RNA totale pannello di RNA di alta qualità generato da un linfonodo di bisonte, utilizzando la procedura presentata in questo manoscritto. (B), questo pannello mostra una traccia di un bovino FFPE-campione selezionato dalla tabella 4, raffigurante RNA molto degradato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Dovuto le sfide associate con il rapido isolamento dei tessuti da grandi carcasse, soprattutto nel caso di campionamento da specie di fauna selvatica, l'impatto del tempo di ritardo tra l'eutanasia e il posizionamento dei pezzi di tessuto in una conservazione di RNA soluzione è potenzialmente problematiche nell'analisi. Le informazioni nella letteratura circa la stabilità del RNA nei tessuti di linfonodo, in particolare, sono limitate. Di conseguenza, per fornire informazioni sui parametri accettabili per la raccolta di tessuto, la stabilità del RNA in post-eutanasia di bisonte di linfonodo è stata caratterizzata.

Per questo esperimento, tempo 0 è stato considerato come il momento che l'animale è stato dichiarato morto la mancanza di un battito cardiaco e l'assenza di un riflesso corneale. Dopo il trasporto della carcassa e l'inizio dell'autopsia, ~ 15 min aveva trascorso prima il recupero del primo campione di linfonodo (15-20 min era standard nelle nostre osservazioni per il recupero di animali campo; corsi di tempo varierà a seconda della posizione ). Il linfonodo di soprammammari è stato identificato, e una piccola sezione del tessuto è stato rimosso e mantenuta a temperatura ambiente. Sezioni vennero successivamente presi a intervalli di circa 15 min e trasferiti al RNA conservante; nel mezzo il corso di tempo, un secondo campione di linfonodo è stato estratto dall'animale per il secondo set di 4 punti di tempo della serie (Figura 5A; chiusi cerchi, Figura 5). RNA è stato estratto in parallelo dai pezzi di linfonodo utilizzando il metodo sopra descritto. Questo 1h esperimento rivela che il linfonodo RNA mantenuta la maggior parte della sua integrità durante il corso di tempo, con solo lievi riduzioni della partitura RIN entro la fine del corso tempo (figura 5B e 5C). Allo stesso modo, RNA da bovini-prescapolari e parotidei linfonodi conservato la sua integrità come misurato dal punteggio di RIN sopra ~ 1 h tempo corsi post mortem (Figura 5; l'animale informazioni sono fornite nella tabella 2). Inoltre, RNA è stato Estratto da soprammammari di linfonodo sezioni che sono stati raccolti 8 h dopo la morte, che tiene intere sezioni in terreni di coltura cellulare a qualsiasi temperatura ambiente o a 37 ° C per simulare il tempo di tenuta in una carcassa di animale. RNA ribosomiale era osservabile anche dopo 8 h holding volte (Figura 5).

Figure 5
Figura 5 . Qualità di RNA in campioni di linfonodo di bisonte raccolti attraverso tempo corsi dopo la morte. (A), questo pannello mostra una panoramica sperimentale di una procedura di corso tempo di 1h. (B, C) Questi pannelli mostrano un'esame della qualità del RNA per campioni prelevati attraverso un corso di tempo di 1 h da un linfonodo soprammammari isolato da un bisonte americano. Gel riflette campioni di RNA denaturato in formammide e separati su gel 1% non-denaturante. Pannello (C) illustra i cambiamenti nei punteggi di RIN per ciascun campione. I dati da ulteriori esperimenti su linfonodi-prescapolari e parotidei bovina viene sovrapposto come indicato. (D) questo pannello mostra un esempio di gel del RNA, come descritto per il gel utilizzato nel pannello (B), per soprammammari di linfonodo campioni elaborati dopo 8 h di incubazione a temperatura ambiente o (Lane 1) o a 37 ° C (Lane 2) in terreni di coltura delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questi risultati rappresentativi sono coerenti con i risultati di stabilità di RNA per altri tipi di tessuto e fonti. La tabella 3 fornisce un riepilogo dei risultati di un campione di articoli pubblicati che hanno studiato la stabilità del RNA su corsi di pre-conservazione time. Nota che solo le tendenze da RIN punteggi e/o rRNA gel osservazione (RNA totale) sono inclusi nella tabella, anche se alcuni documenti forniscono un'ulteriore analisi di integrità di mRNA, come attraverso la determinazione dei rapporti di 5' vs 3' segmenti di RNA selezionato (ad es., Fajardy et al.) 31. Tuttavia, è importante ricordare che tempi più lunghi tra la morte e campione conservazione possono provocare i cambiamenti nei profili di espressione di RNA, come dimostrato, ad esempio, per il tessuto placentare31. Rispetto alle trascrizioni stabile, più instabile RNA possa essere esaurite. Pertanto, è importante utilizzare un flusso di lavoro rapido e semplificato per il recupero dei tessuti al fine di ridurre eventuali ritardi, una volta che l'animale è disponibile per l'autopsia, al fine di raggiungere i più biologicamente validi profili di RNA. Sarebbe un errore pensare che la presenza di RNA ribosomiale (rRNA) intatto indica l'assenza di eventuali cambiamenti nel profilo del trascrittoma. Ancora, i risultati rappresentativi suggeriscono che anche con la maggiore elaborazione volte necessaria per il campionamento degli animali grande, è possibile preparare il RNA che è adatto per un'analisi di espressione genica da campioni di linfonodo.

Inoltre, è stato esaminato l'impatto della variabile tempo post-scongelamento; Durante questo tempo, RNA è suscettibile di degradazione dalla nucleasi presente nel tessuto. La qualità dei campioni di RNA trattati con questo protocollo con 0 o 64 min di tempo di tenuta a temperatura ambiente post-scongelamento al punto 4.1 è stata misurata da un punteggio di RIN. Questo esperimento dimostra che il protocollo è abbastanza insensibile al tempo di disgelo, rendendolo robusto per la lavorazione dei campioni multipli (Figura 6A).

Figure 6
Nella figura 6. Ulteriore analisi dei parametri di qualità di RNA. (A), questo pannello mostra la qualità di RNA risultati per RNA purificato immediatamente dopo lo scongelamento (0 min) o dopo aver tenuto per 64 min a temperatura ambiente prima del trattamento. Le barre rappresentano la media di 3 pezzi di tessuto per ogni condizione, ± la deviazione standard. Tutti i tessuti sono stati memorizzati in una soluzione conservante RNA prima del disgelo, come descritto nel protocollo. (B), questo pannello mostra una traccia Bioanalyzer di un campione da un pezzo di linfonodo mal omogeneizzato contenente ampie sezioni del tessuto connettivo. Le piccole dimensioni delle cime 28S e 18S, rispetto ai picchi nell'intervallo 5S, sono evidente. Questo può verificarsi anche a causa della degradazione del RNA, anche se la linea di base relativamente pianeggiante tra la gamma di 5S e il picco di 18 anni è in alternativa indicativa di estrazione povera; vedere Avraham, r. et al. 48 per ulteriori dettagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come un punto di confronto per l'isolamento di RNA dai linfonodi, è stata condotta un prova recupero di RNA da pezzi di linfonodo mesenterico FFPE da bestiame. Come descritto in precedenza, i campioni sono stati fissati per 1 settimana in formalina prima la paraffina incorporamento, seguiti da 4 mesi di stoccaggio in paraffina a temperatura ambiente. I tessuti sono stati sezionati in sezioni di cinque 10 µm, e utilizzando la procedura di estrazione FFPE, circa 62 ng / µ l di RNA per campione (± 14 ng / µ l) è stato recuperato. I rapporti di assorbanza a 260 nm/280 nm una media di 1,9, che indica un prodotto con bassi livelli di contaminazione della proteina, anche se i rapporti di230 A260/A erano sfavorevoli (tabella 4). Nota che i punteggi RIN osservato per questi campioni erano molto bassa (< 2), che indica una degradazione dei prodotti RNA (tabella 4Figura 4B), coerente con la descrizione di Srinivasan et al. 45. in saggi che utilizzano qPCR, in genere piccole sezioni del RNA, o più precisamente del cDNA (< 200 bp), vengono amplificati. Pertanto, l'amplificazione di piccoli prodotti ancora può verificarsi da campioni degradati e analisi qPCR può essere eseguita. Ad esempio, era possibile amplificare un segmento della proteina ribosomale S9 (RPS9) trascrizione da questi campioni FFPE-recuperati da qPCR. I valori di CT erano coerenti tra i campioni e una media di 19,2 ± 1,8. Tenete a mente le limitazioni che sono presenti quando si utilizzano i campioni FFPE-preparato, tuttavia, come i prodotti più grandi non sono necessariamente presenti, e la degradazione non potrebbe essersi verificato un tasso uniforme attraverso tutti i campioni. Di conseguenza, questo materiale può essere utilizzato per gli studi con avvertimenti, ma significative limitazioni sono presenti per tutte le applicazioni a valle come sequenza di RNA.

Tipo di linfonodo Posizione Lunghezza Larghezza Regioni drenate dai nodi
Prescapular Appena mediale per l'articolazione della spalla; incorporato nel grasso sottocutaneo e sotto uno strato di muscolo 1-10 cm 1.5-2 cm Pelle del collo; spalla; e pelle, muscoli e articolazioni dell'arto toracico inferiore (Rif. 8)
Prefemorali (chiamato anche precrural) Basta dorsale e mediale per la soffocano, circa 12-15 cm sopra la rotula 8-10 cm 2,5 cm Pelle dell'arto pelvico, addome e le porzioni caudale del torace (Rif. 8)
Retropharyngeal Trovato nel midline dorsale alla faringe 4-5 cm 2-3,5 cm Lingua, mucose della cavità orale, delle gengive, labbra, palato duro, ghiandole salivari, la maggior parte dei muscoli del collo
Parotide Per via sottocutanea situato ventrale al giunto temporomandibular, caudale al muscolo massetere (Rif. 8) 6-9 cm 2-3 cm Pelle, tessuto sottocutaneo, la maggior parte dei muscoli della testa, i muscoli dell'occhio e dell'orecchio, palpebre, ghiandola lacrimale, porzione rostrale della cavità nasale
Sottomandibolare (può essere presente 1-3) Per via sottocutanea situato sul lato mediale dell'angolo della mandibola, associata a ghiandole salivari 3-4 cm 2-3 cm Muso, labbra, guance, palato duro, la parte rostrale della cavità nasale, la punta della lingua, della pelle e del muscolo della testa (Rif. 8)
Soprammammari (donna superficiale inguinale, in genere 2 presenti) Trovati caudalmente e dorsalmente rispetto le ghiandole mammarie 6-10 cm Mammella, vulva, vestibolo della vagina, pelle sugli aspetti mediale e caudale della coscia, superficie mediale della gamba
Scrotal (versione maschile di superficiale inguinale) Trovato sotto il tendine prepublic all'interno di uno strato di grasso intorno al collo dello scroto 3-6 cm Pene, prepuzio e scroto

Tabella 1. Panoramica dei linfonodi superficiali bovini.

Descrizione animale Posizione nel manoscritto Età Sesso Stato di salute
Videoregistrata Bison bison Bisonte in video - recupero di linfonodo 5-6 yo Donna Sano
Videoregistrata Bos taurus Bovino in video - recupero di linfonodo 7-8 yo Maschio castrato Sano
Bison bison per lo studio di stabilità del RNA Fig. 5A-C 5-6 yo Donna Sano
Bos taurus Per studio di stabilità del RNA Fig. 5, fig. 6A 7-8 yo Maschio castrato Sano
Bos taurus B per lo studio di stabilità del RNA Fig. 5 7-8 yo Maschio castrato Sano
Bos taurus per lo studio di qualità FFPE Tabella 4, fig. 4B 0,5 yo Maschio castrato Integro (controllo dallo studio di infezione O157: H7)
Si noti che la metodologia è stata utilizzata su più ulteriori bovini, bisonte e campioni di linfonodo di capra, di là di quelli che sono evidenziate qui.
Inoltre, abbiamo utilizzato la stessa metodologia su linfonodo raccolto da un 1,5 Mo-vecchia donna vitello.

Tabella 2. Caratteristiche degli animali utilizzati in studi pilota.

Tipo del tessuto Metodo di conservazione Condizioni di detenzione Conclusione di degradazione Riferimento
Bovina adiposo, muscolo scheletrico, fegato Scatto di congelamento (liquido N2) 4 ° C, vuoto confezionato tessuto Muscolo RNA più stabile (anche fuori a 8 giorni di deposito); adiposo e nel fegato principalmente stabile per 24 h., come valutato dalla comparsa di bande di rRNA Bahar et al (2007)32
Umano del colon, cancro del colon-retto Soluzione di conservazione di RNA Temperatura della camera. RIN conservato per 2 h., ma sottoinsieme dei geni mostrano cambiamenti nell'espressione da 0,5-2 h. Yamagishi et al (2014)33
Fegato di topo, milza Soluzione di conservazione di RNA, o snap congelamento (residui di ghiaccio secco) All'interno della carcassa del mouse (37 ° C) Campioni di milza erano stabili fuori a 1,5 h; i campioni di fegato ha esibito precedenti degradazione (diminuzione del 24% in RIN a 105 min.) Choi et al (2016)34
Fegato di topo Nessuno (omogeneizzato fresco in guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio) 25 ° C, 37 ° C Degrado limitato fuori per 4 ore a 25 ° C, ma vasto degrado a 37 ° C per 4 h. (come osservato utilizzando punteggi RIN). Almeida et al (2004)35
Ileo umano Soluzione di conservazione di RNA, o snap congelamento 4 ° C, 37 ° C Generalmente stabile ad 1,5 ore a 37 ° C; Out stabile per 6 ore a 4 ° C (come osservato utilizzando punteggi RIN).  Si noti che gli autori forniscono anche un riepilogo delle risorse di stabilità RNA selezionate nella tabella S1 che può servire come un ulteriore riferimento per coloro interessati a un'ulteriore revisione del tessuto letteratura di integrità di RNA. Lee et al (2015)36
Fegato umano Scatto di congelamento (liquido N2 o isopentano) Temperatura della camera. Degradazione osservato alle h. 1 (fino a 0,85 ΔRIN); maggiore degradazione nei più piccoli campioni di fegato rispetto in grandi campioni. Kap et al (2015)37
Cancro colorettale umano Scatto di congelamento (liquido N2/isopentano) 4 ° C Degradazione osservata di 1 h.; Punteggio di RIN di solo 4.2 dopo 90 min di ritardo nel tempo di congelamento Hong et al (2010)38
Fegato umano Soluzione di conservazione di RNA, anche flash congelamento (liquido N2) Temperatura della camera, 4 ° C I campioni sono stati stabili anche di fuori di 1 d. su ghiaccio; degradazione osservata dopo 1. d. presso camera temp. (ma non dopo le h. 3; come osservato con gol di RIN) Lee et al (2013)39
Cavallo adiposo, muscolo scheletrico Scatto di congelamento (liquido N2) 13 ° C Gli autori raccomandano che migliore integrità per muscolo era all'interno di 2 h.; adiposo conservazione entro 0,5 h. consigliato dagli autori (come rilevato dall'aspetto gel rRNA) Morrison et al (2014)40
Cervello di salmone, muscolo di rene, fegato, Soluzione di conservazione di RNA Temperatura della camera. RNA del cervello stabile per 4-8 h., rene e muscolo exhbiit qualche degradazione di 8 h. (gel, Punteggio di RIN sia utilizzato) Seear & Sweeney (2008)41
Coniglio del tessuto connettivo (legamento, tendini, cartilagine) Scatto di congelamento (liquido N2) 4 ° C, temperatura della camera. Nessuna degradazione "conclamata" fuori a post mortem, come rilevato dall'aspetto gel rRNA h. 96 Marchuk et al (1998)42
Cervello del ratto, del polmone, cuore, fegato Sembra di essere estratti freschi All'interno della carcassa di topo tenuta in incubatore a 20 ° C Massima stabilità di RNA osservata nel cervello (potrebbe osservare bande rRNA fuori a 7 giorni post mortem, sebbene degradazione era presente), moderata stabilità nel polmone e cuore, bassa stabilità nel fegato; come rilevato dall'aspetto gel rRNA Inoue et al (2002)43
Tonsilla umana, colon Con e senza soluzione di conservazione di RNA, quindi snap-congelati Temperatura della camera. (22 ° C), soluzione di conservazione 4 ° C RNA, soluzione salina fredda o ghiaccio (0 ° C) Stabile alle h. 16 su ghiaccio o in soluzione di conservazione di RNA; leggero degrado alle h. 6 o 16 in soluzione salina fredda o a temperatura ambiente (misurata dai punteggi RIN) MICKE et al (2006)44

Tabella 3. Esempio di risultati precedenti sulla stabilità di RNA in campioni di tessuto post mortem. Le voci rappresentano manoscritti selezionati dalla letteratura sulla stabilità del RNA, con una gamma di tipi di tessuto rappresentato, tra cui murino, biopsia umana e veterinari esempi. I metodi per la conservazione, la modalità di pre-estrazione deposito e un breve riassunto dei risultati sono forniti per ogni esempio. Salvo diversa indicazione, i campioni sono stati conservati a condizioni che vanno da ghiaccio a 37 ° C, seguita da snap congelamento o un'infusione con soluzione di conservazione di RNA, corso post-tempo (in altre parole, stabilità non era viene misurato in presenza di un RNA soluzione di conservazione durante l'incubazione, se non diversamente indicato).

ID del campione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un260/A280 1.96 1.98 1.98 1.91 1.98 1,89 1,89 1.91 1.9 1.84 1.84 1,97
Un260/A230 0,67 0,14 0,19 0,26 0.61 0,69 1.33 0,11 0.21 0.39 0.1 0,44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabella 4. Rappresentante risultati da RNA isolato da bovino FFPE linfonodi mesenterici. Nella tabella vengono illustrate i risultati da spettrofotometrica e analisi di qualità da una serie di campioni di linfonodo bovino FFPE trattati con il metodo descritto in questo manoscritto. In ogni caso, i risultati riflettono RNA altamente degradato.

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La maggior parte dei studi di trascrittomica e dei relativi protocolli concentrarsi su campioni umani, mouse, ratto o post mortem. Tuttavia, le indagini in bestiame e animali selvatici forniscono una vasta gamma di opportunità per la caratterizzazione della risposta immune alla malattia, sia come applicabile alla medicina veterinaria e, per quanto riguarda le malattie zoonotiche, per la salute umana. Questo protocollo prevedeva un contorno di considerazioni chiave per l'estrazione di RNA ad alta integrità dai tessuti di grandi animali, come bovini, bisonti, capre e pecore. La dimensione di animali, nonché le condizioni per la raccolta del campione, rendere il recupero di un processo più ampio, con un tempo di elaborazione post mortem maggiore che per il recupero di linfonodo del mouse. Allo stesso modo, le grandi dimensioni di questi linfonodi necessita di protocolli che recupero campioni paralleli da diversi animali come pure campioni rappresentativi dei cambiamenti immunologici/patologici all'interno del linfonodo. I suggerimenti per la raccolta del campione in questo protocollo prevedono il recupero di RNA intatto anche per quanto riguarda i profili rappresentativi in base il sezionamento del linfonodo.

Come una dimostrazione dell'importanza di una strategia di campionamento standardizzati e protocollo, come presentato qui, abbiamo esaminato 25 carte dal database PubMed Central che ha caratterizzato i trascrittomi dei linfonodi di bestiame. Una carta indicata l'elaborazione di una sezione di grande linfonodo in una sola volta, uno discusso metodi di specifici laser capture microdissection, uno ha detto che un "campione rappresentativo" è stato raccolto dal linfonodo e solo una carta46 indicato che il pezzo di linfonodo raccolti (10 mm3 dimensioni) incluse regioni sia corteccia e midollo. Mentre altre carte segnala che campioni di piccole dimensioni (in genere 30-100 mg) sono stati trattati per analisi di RNA, 84% delle carte non ha menzionato una strategia di campionamento per la raccolta di questi pezzi di tessuto. Come sequenza di RNA è ancora relativamente costoso, l'analisi di più sezioni al linfonodo è improbabile da essere finanziariamente sostenibili nella maggior parte dei casi, soprattutto perché campioni replicati biologici in genere sono le priorità per l'analisi statistica. Attraverso la raccolta di un campione attraverso un cuneo di un linfonodo sagittally sezionato, RNA da regioni linfonodali ricche di diversi tipi di cellule del sistema immunitario è catturato in tutti i campioni. Questo protocollo può, quindi, servire come riferimento per una strategia di campionamento documentati e riproducibili per trascrittomica di linfonodo.

Nella preparazione di RNA da tessuti, ci sono più passaggi chiave per il processo decisionale procedurali. In primo luogo, la letteratura metodologica è mescolata in termini di uso di conservazione soluzioni contro l'uso di campioni di tessuto congelato flash (e successiva macinazione di basse temperature). Soprattutto nel caso di autopsie animali grandi, ci sono più potenziali vantaggi procedurali per l'utilizzo di una soluzione di conservazione, come incorporati nel presente protocollo. In primo luogo, i campioni di tessuto possono essere memorizzati durante l'autopsia nella soluzione di conservazione senza la necessità di trasferire immediatamente i tubi di azoto liquido. In secondo luogo, l'uso di una soluzione di conservazione fornisce ulteriore protezione prima del trattamento del campione per l'estrazione di RNA, in particolare se il campione parzialmente o brevemente si scioglie prima di omogeneizzazione. I risultati in Figura 6A indicano che questo effetto protettivo si estende al tessuto di linfonodo. Al contrario, flash-congelati campioni devono essere mantenuti in stato congelato fino al momento di omogeneizzazione in un buffer che contiene fenolo. Infine, per autopsie di campo di grandi animali, dove l'azoto liquido non è prontamente disponibile, i campioni possono essere conservati in soluzione di conservazione fino a quando non possono essere restituiti al laboratorio.

Ulteriori vantaggi dei componenti molecolari della procedura qui presentati comprendono la presenza di fenolo durante l'elaborazione iniziale del tessuto, che serve come disinfettante durante il processo di generazione di aerosol di omogeneizzazione per campioni da infetta gli animali e il ricorso alla procedura di colonna di spin per rimuovere residuo fenolo e guanidina isotiocianato dal campione. I risultati rappresentativi dimostrano che la procedura genera alta qualità RNA come valutato da un260/A280 e un rapporti di230 260/A, gel elettroforesi e gol di RIN e robusto a fronte del tempo corso sfide di bestiame e prelievi di fauna selvatica. L'abbinamento di conservazione dei tessuti (ad es., in RNALater), omogeneizzazione in reagenti a base di fenolo (ad es., TRIzol) e la purificazione di colonna di silice è stata utilizzata con successo nella letteratura a pattern di espressione genica di profilo in ovini abomasal linfonodi infettati con nematodi gastrointestinali46 e nei linfonodi di bovini infettati con herpesvirus47, con gol di RIN maggiore di 8 e maggiore di 7 attraverso tutti i campioni, rispettivamente.

Nel caso di un RNA risultante con punteggi RIN inaccettabili per analisi a valle, le seguenti variabili, che sono standard per elaborazione del RNA, dovrebbero essere valutate: il tempo di elaborazione totale post mortem, la condizione dei tessuti, il tempo di elaborazione/ritardo post-scongelamento, la tecnica durante l'estrazione di RNA e post-l'estrazione di trattamento di RNA. Elaborazione post mortem tempo totale dovrebbe essere valutata soprattutto nel caso di tessuti recuperati da animali trovati morti, al contrario di animali di euthanized. Come descritto in precedenza, il RNA è relativamente stabile nei linfonodi, ma lunghi ritardi nell'elaborazione potrebbero portare alla degradazione, soprattutto per le trascrizioni instabili. Una variabile di tempo confusione potrebbe essere presente se i campioni vengono confrontati tra carcasse che sono rimasti nel campo per diversi periodi di tempo. La condizione dei tessuti deve essere valutata, perché la degradazione dell'integrità dei tessuti, a causa di mutazioni patologiche connesse con l'infezione, può ridurre la stabilità del RNA. Ad esempio, qualità di RNA inferiore è stata osservata in placentome di Brucella-infettati postabortiva animali (Boggiatto et al.submitted). Il post-disgelo ritardo di tempo di elaborazione è mitigato dall'uso di soluzioni di conservazione, come descritto in questo protocollo. Essere certi che lo spessore dei pezzi del tessuto è sufficientemente basso per permettere una corretta e rapida penetrazione della soluzione conservante nel tessuto (< 5 mm di spessore utilizzando il conservante menzionato nella Tabella materiali). Durante l'estrazione di RNA, il buffer deve essere privo di RNAsi e contatto con guanti e altri oggetti contaminati (RNasi sono presenti sulla pelle) devono essere evitati. Per la molatura del tessuto di linfonodo, la più grande fonte di potenziali RNasi sarà nel tessuto stesso, ma è utile per ridurre l'introduzione di contaminanti in tutte le fasi della procedura. Per gestire il post-estrazione di RNA, come descritto nel protocollo, aliquota il RNA i campioni in provette prima il congelamento e la conservazione a-80 ° C, per eliminare la necessità di gelo-disgelo i campioni per un'analisi di qualità e quantità.

Bassa resa nella procedura, oltre a derivanti dalla degradazione dei campioni del RNA, può essere dovuta a un'inefficiente omogeneizzazione del tessuto di linfonodo alla fase 4.3 nel protocollo. Si noti che l'incubazione in una soluzione di conservazione di RNA può cambiare la texture del tessuto (aumento fermezza), anche se la maggior parte dei tessuti di linfonodo dissociata efficacemente in pilota corre con il grande dentato dissociatore rotore-statore descritto qui. Come indicato al punto 4.3.1, l'omogeneizzazione nel reagente fenolo-basato dovrebbe essere ripetuto se la dissociazione è incompleta. Mortaio e pestello di macinazione, seguita da una risospensione del campione di terra in un reagente fenolo-basato, è un'altra alternativa per i laboratori senza accesso a un omogeneizzatore con queste specifiche. Tuttavia, un'omogeneizzazione in provette monouso presenta molteplici vantaggi potenziali di macinatura del tessuto congelato in un mortaio e pestello, tra cui un workflow più fattibile e più breve per trattare più campioni, un'assenza di perdita del campione durante la molatura , nessuna pulizia e nessun potenziale contatto con campioni alimentati, nel caso di tessuti di animali infetti.

Avraham et al. 48 descrivono che un picco di RNA 5S grande nel prodotto finale RNA, accoppiato con un basso recupero di RNA ribosomiale 28S e 18S, può essere un segno di un'incompleta lisi delle cellule (che a sua volta, per l'elaborazione di linfonodo, può essere dovuto una dissociazione incompleta del tiss UE). Figura 6B fornisce un esempio di un profilo di RNA generato da un pezzo di bovino linfonodo parotideo che era molto alta nel tessuto connettivo e non ha fatto omogeneizzare in modo efficace. RNA rendimenti dovrebbero essere calcolati e monitorati attraverso campioni in un kit per le analisi confermare che recuperi simili sono ottenuti per mg di tessuto, e campioni per confronto diretto dal RNA-ordinamento devono essere elaborati in batch, utilizzando la stessa omogeneizzazione strategia per tutti i campioni. Si noti che il metodo di campionamento cuneo aiuta anche nella evitando una raccolta di un campione che è esclusivamente una regione ampia del tessuto connettivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare. Tutte le ricerche sono finanziata con fondi intramurali da US Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Tutti i riferimenti a specifici prodotti sono forniti ai fini della riproducibilità sperimentale e non rappresentano alcuna approvazione di questi prodotti dal governo federale.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare James Fosse per il suo eccellente lavoro su tutti i Videografia ed elaborazione video; Michael Marti per il suo eccellente lavoro nella generazione di immagini digitalizzate bestiame; Lilia Walther per il suo aiuto con estrazione del RNA e Bioanalyzer viene eseguito; Mitch Palmer e Carly Kanipe per la loro recensione utile e feedback sulle immagini di linfonodo; e la cura degli animali e il personale veterinario presso il National Animal Disease Center per tutti i loro duro lavoro e assistenza con la zootecnia e la preparazione per autopsie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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