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Immunology and Infection

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Abstract

Animales grandes (ganado y vida silvestre) sirven como importantes reservorios de patógenos, incluyendo Brucella, Salmonella, Mycobacterium bovisy e. coliy son útiles para el estudio de la patogenia y diseminación de las bacterias en hospederos naturales. Con la función clave de la respuesta inmune del huésped de los ganglios linfáticos, ganglios linfáticos tejidos sirven como una fuente potencial de RNA para análisis transcriptómico aguas abajo, para evaluar los cambios temporales en la expresión génica en las células en el transcurso de una infección. Este artículo presenta un resumen del proceso de la colección de nodos de linfa, tejido muestreo y posterior procesamiento del ARN en ganadería, con ganado bovino (Bos taurus) como un modelo, ejemplos adicionales de bisonte americano (bisonte del bisonte de ). El protocolo incluye información sobre la ubicación, identificación y extirpación de ganglios linfáticos de múltiples sitios claves en el cuerpo. Además, se presenta una metodología de toma de muestras de biopsia que permite una consistencia de muestreo a través de múltiples animales. Se discuten varias consideraciones para la preservación de la muestra, incluyendo la generación de ARN adecuado para aguas abajo metodologías como la secuencia de RNA y RT-PCR. Debido a los retrasos inherentes en grandes animales vs ratón tiempo estudia, se presentan los resultados representativos de bisonte y los tejidos bovinos del nodo de linfa para describir el curso temporal de la degradación en este tipo de tejido, en el contexto de una revisión de anterior trabajo metodológico en la degradación del RNA en otros tejidos. En general, este protocolo servirá a ambos investigadores veterinarios comenzando proyectos de transcriptoma en muestras de animales grandes y a biólogos moleculares interesados en aprender técnicas para el muestreo de tejido en vivo y en vitro procesamiento.

Introduction

Secuenciación del RNA análisis del transcriptoma de los ganglios linfáticos proporciona la oportunidad de caracterizar la respuesta inmune de los animales a una variedad de patógenos. Si bien esta metodología se ha utilizado extensivamente en ratones, análisis han ampliado recientemente en grandes mamíferos1,2. Ganadería y grandes ganglios animal puede utilizarse para caracterizar las respuestas de host a una infección, no sólo para su uso en vacunas o estudios de susceptibilidad genética y para la identificación de dianas para el desarrollo de fármacos, sino también como sistemas modelo para estudios en seres humanos en las enfermedades zoonóticas. Por ejemplo, en el caso de brucelosis (una enfermedad bacteriana zoonótica que impactos de medio millón personas alrededor del mundo cada año), a pesar de aumentó significativamente los costos de estudios en ovejas o cabras son más relevantes a la infección humana y vacunas humanas desarrollo de modelos animales de laboratorio. Modelos de infección del ratón recapitulan la infección del sistema reticuloendotelial, pero no los signos clínicos característicos3.

En experimentos con animales grandes en comparación con los estudios animales de laboratorio, el proceso de tejido recolección necesariamente implica un retraso largo entre la eutanasia y la colección de tejidos, que presenta un desafío potencial para la conservación de ARN de alta calidad. ARN intacto es esencial para la generación de datos transcriptómicos biológicamente relevantes. La generación de ARN de alta calidad de las muestras de tejido es particularmente crítica para estudios de patógeno animal grande llevó a cabo en las instalaciones de contención. Tales estudios son inherentemente más difíciles de realizar ya que no sólo requieren aprobado instalaciones y con personal altamente capacitado, sino también llevan costos financieros significativos, que, dependiendo de la obra, pueden variar desde decenas hasta cientos de miles de dólares. Este tipo de estudios también implica una colaboración interdisciplinaria y conocimiento interdisciplinario para su terminación, añadiendo a su complejidad. Por lo tanto, entrenamiento, desarrollo de y la adherencia a un sistema simplificado para la recogida de muestras y conservación proporciona ventajas significativas para posteriores estudios moleculares de los tejidos de animales infectados.

La colección más grandes de nodos de linfa presenta retos adicionales para la colección de tejido en comparación con la toma de muestras similar de ganglios murinos. La preparación para la supresión de la muestra requiere un entendimiento básico de la anatomía de los ganglios linfáticos, incluyendo las estructuras internas pertinentes. La estructura de un nodo de linfa se compone de lobulillos linfoides rodeados por senos llenados de linfa. Estas estructuras están encerradas dentro de una cápsula resistente, fibrosa. 4 un lóbulo linfoide es la "base anatómica y funcional unidad del ganglio linfático" y se compone de folículos, una unidad profunda cortical y cordones medulares y senos paranasales4 (figura 1A). Los linfocitos B y T son el hogar de los folículos y profundidad corticales unidades, respectivamente. Estas estructuras proporcionan un andamio 3D y facilitan la interacción entre los linfocitos y el antígeno o células presentadoras de antígeno.

Grueso, folículos y unidades de profundidad corticales pueden ser identificadas en superficie del corte ya que contienen una red reticular densa y aparecen más oscuros que los senos paranasales, que están compuestos por una red reticular más delicada y aparecen más ligeros (figura 1B). Por Convención, patólogos se refieren a las regiones de los ganglios linfáticos como la corteza superficial (folículos), el paracortex (unidades de profundidad corticales) y la médula (cordones medulares y los senos paranasales). Un examen adecuado de las tres regiones se ha considerado como la mejor práctica en pautas de rutina examinación patológica de ganglios5. Tenga en cuenta que existe una considerable variación en la consistencia, tamaño y color de los ganglios linfáticos, incluso dentro de un solo animal. Edad de los animales, sus nodos de linfa tenderá a disminuir en tamaño y ser más firme que los de animales más jóvenes, generalmente debido a un aumento en su tejido conectivo y una reducción del linfoide normal estructura6,7.

Figure 1
Figura 1. Anatomía de los ganglios linfáticos. (A) esta caricatura muestra la anatomía de los ganglios linfáticos, estructuras claves. (B) todavía la imagen muestra un nodo de linfa bovino cortado transversalmente. Se destacan las estructuras pertinentes/capas que son visibles a simple vista. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dependiendo de la pregunta experimental, diversos ganglios linfáticos será de interés para la recolección y análisis. Los ganglios linfáticos periféricos son los situados profundamente en el tejido subcutáneo. En el ganado, los ganglios linfáticos periféricos o superficiales de uso frecuente en la práctica clínica y experimental incluyen parótida, submaxilar, retrofaríngeo, preescapular, prefemoral (precrural) y superficial inguinal (supramamaria en escrotal en los machos de las hembras) () Figura 2). En la tabla 1, las propiedades de los principales ganglios linfáticos superficiales, como se describe en el sistema de ganados8, se describen. A continuación, se presentan algunas posibles planes de colección de nodo de linfa para enfermedades infecciosas bacterianas del ganado como punto de partida para la investigación.

Brucella abortus/Brucella melitensis: estándar de necropsias para B. abortus-infectado ganados y B. melitensis-cabras infectadas en el Centro Nacional de enfermedad Animal recuperan supramamaria prescapular y tejido ganglionar parotidea , tanto para la molienda para la enumeración bacteriana y para la preparación de RNA para los perfiles de expresión de RNA del anfitrión. B. abortus puede recuperarse regularmente en cada uno de estos nodos de linfa en bovinos experimentalmente infectados9. La presencia de bacterias en cada uno de estos tipos de nodo de linfa puede detectarse en B. melitensis-infectados cabras hasta infección posterior por lo menos nueve meses usando las metodologías basadas en RNA de nuestros estudios (Boggiatto et al., inédito). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), y nodos de linfa mesentéricos han sido útiles durante la elaboración de perfiles de las canales de ganado para una prevalencia de Salmonella 10,11,12 y sería de interés potencial para estudios transcriptómico. E. coli O157: H7: nodos de linfa mesentéricos (en el intestino medio e intestino delgado distal) pueden ser los sitios de una recuperación ocasional de la bacterias en terneros infectados (pero no en ganado adulto infectado)13. Leptospirosis (Leptospira SP.): una crónica persistencia de la bacteria se ha observado en los ganglios linfáticos que drenan la glándula mamaria14. Mycobacterium bovis : En el ganado, las bacterias han sido recuperada post experimental infección de los ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales de becerros15. Además, RNA del nodo de linfa se ha utilizado para examinar las respuestas de gran anfitrión animal al virus, como la del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino2. Figura 2 muestra la ubicación de un subconjunto de estos grandes nodos de linfa en el cuerpo del ganado.

Figure 2
Figura 2: Dibujos que representan lugares seleccionados del nodo de linfa en Bos taurus . Los nodos de linfa números anotados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este artículo y el video asociado, se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes ganglios animal para estudios de RNA, diseñados para ser informativa para biólogos moleculares involucrados en estudios transcriptómicos de infecciones animales grandes. En primer lugar, ofrecemos un resumen del procedimiento de aislamiento para los nodos de linfa, usando el muestreo de tejidos bovinos y Bisonte como ejemplos. Junto con esta demostración, como se muestra en el video, es un flujo de trabajo para una muestra de tejido reproductivo para el aislamiento de RNA. A continuación, se describen consideraciones importantes para el procesamiento de un ganglio infectado, con un enfoque en calidad de RNA, consistencia y seguridad.

La preparación del ARN del tejido con un reactivo de isotiocianato de guanidina de fenol acidificado se basa en el original método de Chomczynski y Sacchi16,17, con una purificación sobre columnas spin basados en sílice en presencia de caotrópico agentes basados en la obra original de Vogelstein y Gillespie18. También examinamos el potencial para la recuperación del ARN para transcriptómica de los ganglios linfáticos de vacas conservada por métodos alternativos. Finalmente, exploramos el impacto de la variable tiempo en la calidad del RNA en necropsias de animales grandes, incluyendo un experimento representativo que representa el efecto de un aumento en el tiempo entre la eutanasia y el muestreo del perfil de RNA recuperado de bisonte y bovina de los nodos de linfa. Este artículo será útil no sólo para biólogos moleculares, pero también para veterinarios investigadores comenzar estudios transcriptómico.

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Protocol

Los procedimientos de autopsia animal representados aquí están cubiertos bajo protocolos IACUC aprobados en el Centro Nacional de enfermedades animales, Ames, IA. Todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices aprobadas para el cuidado de los animales y el bienestar.

1. planificación previa antes de la autopsia

  1. Antes de la autopsia, prepare los siguientes materiales para su transporte a la suite de necropsia:
    1. tubos de microcentrífuga de 1.5 ó 2 mL llenan de ~ 1.0 mL de solución de preservación de RNA, en un contenedor de transporte o rack. Asegúrese de seguir las instrucciones del fabricante para el cociente del volumen de la solución de preservación para el volumen del tejido.
    2. Bisturís desechables y pinzas limpios y esterilizadas: un sistema para la disección de la piel y un conjunto diferente de recogida de los nodos de linfa (uno para cada nodo de linfa, por animal), evitando una contaminación cruzada de la piel y flora ambiental con el nodo de linfa tejidos.
    3. 3 mm perforar herramientas de biopsia, necropsia cuchillos, un contenedor para los bisturíes usados y herramientas de la biopsia y tablas de cortar o bandejas desechables para uso en la disección de ganglios linfáticos.
    4. Utilice equipo de protección personal, incluyendo el PPE requerido para el trabajo en el nivel BSL apropiado para el sistema.
    5. Autoclave metal herramientas reutilizables, como el fórceps, en bandejas de metal antes de la autopsia, con los bienes de utensilios/seco ajuste.

2. identificación y muestreo de ganglios linfáticos en el ganado vacuno y bisonte

Figure 3
Figura 3 . Los ganglios linfáticos del cuello y cabeza bovina. (A) esta caricatura muestra seleccionadas ganglios de cabeza y cuello de Bos taurus. (B) esta imagen muestra el nodo de linfa parótido en sección transversal (izquierda) en comparación con la glándula salival parótida en sección transversal (derecha). Tenga en cuenta la diferencia de texturas entre los tipos de dos tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Aislamiento de ganglios preescapular en ganado vacuno y bisonte
    1. Eutanasia del animal (ganado o bisonte de cualquier edad, como sea apropiado para el experimento) basado en el protocolo local de IACUC. Confirmar la muerte por métodos específicamente descritos en el protocolo institucional de IACUC, incluyendo la ausencia de un latido cardíaco, la falta de respiración y la ausencia de reflejo corneal. Mover el animal a la planta de necropsia.
      Nota: Existen diversos métodos de eutanasia humanitaria utilizados en la práctica de laboratorio de animales grandes. Sin embargo, la administración intravenosa de solución de sodio pentobarbital sódico y la fenitoína es el más comúnmente aprobado y utilizado de forma. Consulte las pautas de AVMA para la eutanasia de animales. 19
      PRECAUCIÓN: Siga todos los protocolos de bioseguridad pertinentes para una necropsia en la institución anfitriona, incluidas las directrices para la eliminación segura de objetos punzantes en un envase a prueba de punción y la descontaminación de cuchillos de metal reutilizables y fórceps. Este protocolo genera residuos de objetos punzantes por el uso de Bisturís desechables. Use equipo de protección personal según las directrices institucionales, incluyendo botas, batas, guantes y protección ocular.
    2. Identificar 3 participantes para trabajar en los tejidos animales.
      Nota: Aquí, disector de 1 se se a cargo de la gran sección de los tejidos animal deseados, disector 2 recuperará los ganglios linfáticos de las diferentes secciones de animales y disector 3 trabajará en una mesa separada para aislar secciones de cada nodo de linfa y transferirlas a tubos con una solución preservativa.
    3. Comience por colocar el animal en recumbency lateral.
    4. Extender los hombros moviendo la extremidad frontal hacia atrás en el nivel de la rodilla (carpo); Este movimiento se llevar el hombro hacia atrás y permitir una más fácil palpación de los ganglios linfáticos. Sentir la presencia del ganglio linfático "terrón".
      Nota: En las condiciones de enfermedad, linfadenopatía puede estar presente, que facilita la identificación de los ganglios linfáticos, pero este proceso también puede afectar la consistencia, composición y arquitectura del ganglio linfático.
    5. Una vez localizado y con el hombro todavía extendida, utilice una navaja de bisturí o necropsia para hacer una incisión en la piel a lo largo del contorno del hombro.
      Nota: No limitan el tamaño de la incisión, incluso si el nodo de linfa se ha situado a través de la palpación. Una incisión más grande proporciona más fácil acceso a los tejidos más profundos y facilita la extirpación de los ganglios linfáticos para el disector.
    6. Usando un par de pinzas, retrae la piel para revelar el punto del hombro y la musculatura del cuello.
      Nota: El ganglio preescapular a menudo se encuentra en la grasa subcutánea, especialmente en animales overconditioned.
    7. Palpar una vez más, la ubicación de los ganglios linfáticos (Figura 3A).
      Nota: A diferencia de la grasa subcutánea, el nodo de linfa se mantenga su forma cuando palpated. Además, los ganglios linfáticos no son contiguos con los tejidos circundantes, que están encerradas por una delgada cápsula fibrosa.
    8. Después de localizar el ganglio preescapular, cuidadosamente diseca la grasa subcutánea, con un bisturí y pinzas y aislar el nodo de linfa.
      1. Buscar la presencia de una cápsula fibrosa fina, como se muestra en la figura 1B, para distinguir entre el nodo de linfa y tejido adiposo; los ganglios linfáticos no son contiguos con los tejidos circundantes.
    9. Transferencia del nodo de linfa a la mesa de disección ganglionar, con una bandeja de plástico para la transferencia de tejido, para más secciones.
      Nota: La aparición de ganglios en bison es similar. El vídeo asociado representa el aspecto del ganglio linfático preescapular como disecado en el hombro derecho de un bisonte americano.
  2. Aislamiento de los nodos de linfa parótidos en ganado vacuno y bisonte
    1. Comience por colocar el animal en recumbency lateral en el piso de la necropsia. Localizar la articulación temporomandibular (ATM).
      1. Si esto es difícil de ubicar, mover la mandíbula lentamente y determinar la ubicación en la que la mandíbula se fija al cráneo; se trata de la ATM.
    2. Cuidadosamente usando un cuchillo, bisturí o autopsia, hacer una incisión en la piel. Comenzar la incisión dorsal a la articulación y se extiende ventralmente/verticalmente a lo largo de la línea de la mandíbula.
    3. Disecar la piel para revelar el tejido subcutáneo. La glándula salival parótida será visible en primer lugar, debido a su gran tamaño, aspecto de superficie lobulada y coloración roja.
    4. Utilizando pinzas y un bisturí, mueva la glándula salival parótida a un lado para encontrar el nodo de linfa parótido sentado justo craneal y medial a la glándula salival (Figura 3A). Examinar el tejido ganglionar parotidea de textura antes de proseguir.
      Nota: los ganglios linfáticos de la cara (parótida y submaxilar) están asociados con las glándulas salivales, que puede confundir el aislamiento del nodo de linfa. En comparación con los ganglios linfáticos, las glándulas salivales son mucho más grandes y tienen una apariencia de superficie lobulada. Por otra parte, en la superficie de corte, las glándulas salivales son homogéneas en la naturaleza y no muestran el clásico patrón arquitectónico cortical y medular de los ganglios linfáticos (figura 3B).
    5. Suprimir la glándula con un bisturí. Traslado a la mesa de disección ganglionar, con una bandeja de plástico para la transferencia de tejido, para más secciones.
  3. Aislamiento de ganglios linfáticos supramamaria bovinos hembras y bisonte
    1. Coloque el animal en recumbency lateral.
    2. Elevar la pierna para dejar expuesta la región inguinal y localizar la ubre.
      Nota: En un animal sano, no lactantes, palpación de ganglios no es posible. En un animal lactante, estos nodos de linfa puede ser palpables en el borde caudal de la base de la ubre.
    3. Con un bisturí, hacer una incisión justo dorsal a la ubre, a lo largo de la pierna superior, para exponer las glándulas supramamaria.
    4. Disecar el tejido subcutáneo y busque el nodo de linfa supramamaria embebido en una capa delgada de grasa subcutánea. Si no es visualmente distinguible, palpe el tejido expuesto de la presencia de una sólida estructura dentro de la grasa subcutánea.
    5. Cuidadosamente usando pinzas y un bisturí, disecar un ganglio linfático de la grasa. Traslado a la mesa de disección ganglionar, con una bandeja de plástico para la transferencia de tejido, para más secciones.

3. corte y almacenamiento de los ganglios linfáticos

  1. Pasar los ganglios aislados del disector 2 a dissector 3 en una mesa de disección adyacente al espacio principal de la autopsia. Coloque cada nodo de linfa en una sección fresca de una tabla de cortar. La etiqueta las tablas de cortar en secciones por ganglios linfáticos, para facilitar la recepción de los nodos de linfa múltiples en la sucesión. Para las muestras infecciosas, use bandejas desechables.
  2. Utilizando pinzas y una navaja de bisturí o necropsia disponible, retirar una sección del ganglio linfático. Usando un cuchillo afilado, hacer un corte sagital al abrir el nodo de linfa.
  3. Examinar el interior de los ganglios linfáticos, especialmente en muestras de animales infectados, en busca de asimetría, las lesiones, las diferencias de color, etc. grabar las observaciones.
  4. (Opción 1) Secciones de tejido pequeño
    1. Utilice Bisturís desechables para piezas de cada nodo de linfa que son menos de 5 mm de espesor y transferir cada pieza a un tubo con una solución de preservación de RNA con pinzas limpias.
  5. (Opción 2) Ganglios linfáticos biopsia o seccionamiento metodologías
    Nota: Las biopsias o metodologías de seccionamiento, cuando se aplica a las secciones paralelas del nodo de linfa a través de distintos nodos y animales, proporcionan consistencia de tejido muestreado para el análisis de RNA a granel.
    1. Método de seccionamiento de la cuña
      1. Después de examinar la sección sagital para capturar las células a través del perfil del ganglio linfático, suprimir una cuña en forma de pastel desde el nodo de linfa, del centro a la cápsula externa. Para un nodo de 2 cm de ancho (tamaño estándar; ver tabla 1), corte una cuña al centro que es de 4 mm de longitud de arco exterior y 5 mm de espesor tendrá un peso húmedo de ~ 100 mg.
      2. Con el bisturí, corte la cuña en trozos pequeños, no más gruesos que 5 mm y aproximadamente 50-100 mg en peso húmedo de tejido.
        Nota: Por consistencia, proceso de todas las piezas de la cuña de un solo nodo de linfa en un lote o en tubos separados seguido por RNA puesta en común para proporcionar un perfil representativo de RNA de los ganglios linfáticos de interés.
      3. Colocar las piezas de tejido con pinzas en los tubos que contiene al menos 10 volúmenes de solución de preservación de RNA, en comparación con el volumen del tejido.
    2. Método de biopsia de Punch
      1. Seleccione una herramienta de biopsia punch si el objetivo es recoger secciones específicas, como los folículos específicas del nodo. Seleccione una herramienta coherente con el tamaño de la muestra para la colección. Punch biopsia herramientas están disponibles en una gama de tamaños, desde 1 a 8 mm de diámetro.
      2. Localizar visualmente las regiones de interés a la muestra en el nodo de linfa.
      3. Utilice la herramienta de biopsia punch para suprimir las secciones de interés, presionando y girando la herramienta en el tejido para crear la base. Transferencia de la pieza de tejido con pinzas en un tubo que contenga al menos 10 volúmenes de solución de preservación de RNA. Si un grosor mayor de 5 mm, usar pinzas y un bisturí para además, dividir el tejido en trozos más pequeños.
  6. Una vez que las muestras han sido transferidas a la solución de preservación (e.g., RNALater), transporte hacia el laboratorio a temperatura ambiente.
  7. Almacenar las muestras a 4 ° C durante la noche para permitir la penetración del tejido.
  8. Al día siguiente, retirar de la solución conservante exceso de RNA y almacenar las muestras de tejido a-80 ° C. Quite tanto conservante como sea posible antes de congelar las muestras. Utilice una punta de micropipeta P1000 o P200 para una eficiente eliminación de solución conservante de RNA.
    PRECAUCIÓN: Deseche la solución de preservación decantados apropiadamente, basados en las propiedades infectivas del patógeno utilizado así como los riesgos químicos y ambientales de la solución conservante según se especifica en la hoja de datos de seguridad.
    Nota: Las directrices que aquí se proporcionan para la solución de preservación de RNA que se describe en la Tabla de materiales. Si utilizando las soluciones de conservación alternativos, consulte las instrucciones del fabricante.

4. tratamiento de los ganglios linfáticos de ARN

PRECAUCIÓN: Use una bata de laboratorio, guantes y protección ocular apropiada para las etapas de procesamiento.

Nota: El reactivo de fenol utilizado aquí se describe en la Tabla de materiales (y el protocolo se basa en las instrucciones del fabricante)20. El uso de reactivos alternativos basados en fenol puede requerir una modificación del procedimiento, basado en las recomendaciones del fabricante para el producto específico adquirido.

  1. Antes de acceder a las muestras, la alícuota el reactivo de fenol-basado refrigerada (4 ° C) a los tubos de homogeneización (1,5 mL/tubo), utilizando una pipeta.
    PRECAUCIÓN: El fenol es tóxico, corrosivo y un peligro para la salud. Cloroformo es tóxica y un peligro para la salud. Complete los pasos del proceso 4.1-4.9 en una campana de vapores químicos y usar guantes para evitar cualquier contacto con los productos químicos. En los Estados Unidos, el cloroformo es un desecho peligroso; dispone de tubos que contengan residuos peligrosos según las pautas locales e institucionales. Proceso las muestras de tejido de animales infectados con agentes patógenos en el correspondiente BSL-2, BSL-3 y BSL-4 pautas.
  2. Una vez que una muestra puede ser aflojada de los tubos de microcentrífuga con pinzas limpias, inmediatamente transferir aproximadamente 50-100 mg de tejido conservado al tubo de homogeneización que contiene el reactivo de fenol.
    1. Limitar la descongelación antes de la adición al reactivo de fenol. Utilizar almacenamiento en hielo seco cuando se quitan las muestras múltiples del congelador para su procesamiento.
  3. Firmemente la tapa del tubo, coloque en el homogeneizador y homogeneizar la muestra con un homogeneizador de tejidos de rotor-estator en el reactivo de fenol. Termina el tratamiento a temperatura ambiente. Cuando termine, compruebe para que una apariencia para que la muestra se homogeneizó con éxito; el tejido se debe dispersar en una suspensión turbia.
    Nota: Una configuración de extracción de 2 min RNA se utiliza (el ajuste preestablecido de RNA_02_1 para el homogeneizador se describe en la Tabla de materiales, diseñado para los tejidos congelados). El rotor-estator especificado en el presente Protocolo (véase la Tabla de materiales) es con dientes grandes y adaptados para la homogeneización de una gama de tipos de tejidos, incluyendo el material fibroso. El ajuste de RNA_02_01 está diseñado específicamente para congelado (en lugar fresco) los tejidos. Como los ganglios linfáticos tienen componentes de tejido conectivo fibroso, un homogeneizador de rotor-estator igualmente optimizado es recomendado para lograr una disociación efectiva. Ver Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental21 para obtener más información acerca de las recomendaciones de la homogeneización.
    1. Si grandes porciones de tejido permanecen después de la homogeneización, repita el procedimiento de homogeneización. Para recuperar eficientemente el ARN, el tejido debe ser bien disociado.
    2. Para piezas de nodo de linfa más fibrosos, utilice pinzas y tijeras para cortar previamente la pieza de nodo de linfa en varios trozos más pequeños antes de la transferencia al tubo de homogeneización. Como se describe en la introducción, nodo de linfa los tejidos de los animales más viejos pueden ser más fibrosos.
      Nota: Si se desea un análisis doble de la huésped y patógeno RNA, tratamiento adicional (por ejemplo, homogeneización del grano) puede ser necesario para la recuperación del ARN bacteriano, especialmente si hay patógenos gram-positivos presentes en los tejidos.
  4. Inmediatamente retire la muestra homogenizada de los tubos y transferir a tubos microcentrífuga libre de Rnasa (2,0 mL en tamaño) con una micropipeta P1000.
  5. Centrifugar la muestra durante 5 min a 12.000 x g a 4 ° C para eliminar cualquier residuo de la muestra. Usando una punta de micropipeta P1000, transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco, dejando el sedimento atrás.
  6. Incubar el sobrenadante 5 minutos a temperatura ambiente. Dividir cada muestra entre tubos de microcentrífuga de dos 1.5.
  7. Añadir 0,2 mL de cloroformo por 1 mL del reactivo de fenol-basado (es decir, 0,3 mL de una muestra de 1,5 mL); invertir a mano durante 1-2 minutos mezclar las fases, pero no agitar con vortex la muestra. Incubar por 2 min a temperatura ambiente.
  8. Centrifugar durante 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
  9. Retire con cuidado la fase superior, clara acuosa con una punta de micropipeta (P1000 o P200) que formará la capa superior, sin alterar la interfase o la capa de rojo fenol-cloroformo. Transferirlo a un tubo nuevo de microcentrífuga.
  10. Mezclar con un volumen igual de etanol al 100%; mezclar bien invirtiendo el tubo 4 - 5 veces. El tubo a menudo aparece nublado.
  11. Con una punta de micropipeta, transferir el líquido a una columna de giro comercial basado en silicona, para purificar y eluir el RNA, después de las instrucciones del fabricante de la22. Eluir el RNA generado a partir de ~ 50 mg de tejido en 50-100 μl de agua libre de ARNasa.
    Nota: Mientras que la extracción reactivo fenol-basado elimina el ADN en la fase orgánica, para el uso aguas abajo del ARN en qRT-PCR o aplicaciones de RNA-secuenciación, se recomienda un tratamiento adicional de las muestras de RNA con DNasa.
  12. Alícuota del RNA eluído a separar los tubos para el uso en una evaluación de calidad y cuantificación, para reducir cualquier hielo-deshielo de la principal muestra de RNA. Transferir los tubos a-80 ° C para el almacenamiento.
  13. En el caso de muestras de ganglios linfáticos derivadas animales infectados con agentes patógenos zoonóticos, especialmente en el nivel de contención BSL-3, validar la muestra de RNA resultante de la ausencia de agentes patógenos si la muestra se trasladará a un área menor de contención nivel de bioseguridad para análisis de calidad, RT-PCR, o de la preparación de biblioteca de secuencias de RNA.
    Nota: Es fundamental considerar las regulaciones locales, y en el caso de las CDC (centros para el Control y la prevención) inactivación de pautas para trabajo con agentes selectos, es necesario validar todos los procedimientos de inactivación en el sitio local del investigador.
    1. Quitar volumen delth de la 1/10 de cada muestra de RNA eluída de paso 4.12 (es decir, 5 μl de 50 μl del ARN total). Usando una técnica estéril, mezclar la muestra con 100 μl de caldo de crecimiento bacteriano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Usando un separador plástico estéril, Esparza la mezcla RNA-caldo a través de la superficie de una placa de agar.
      Nota: Seleccione una caldo tipo agar placa y consistente con el crecimiento del patógeno con el que los animales fueron desafiados.
    2. Incubar la placa de agar bajo condiciones específicas para el crecimiento del patógeno con el que los animales fueron desafiados. Comprobar la ausencia de bacterias recuperadas antes de retirar las muestras de la contención BSL-3.
      Nota: El ARN eluído resultante, después de la cuantificación y análisis de integridad, es conveniente para los usos aguas abajo, incluyendo un análisis de RT-PCR y secuenciación del RNA.
  14. Evaluar la recuperación de RNA y pureza utilizando un espectrofotómetro. Para evaluar la calidad del RNA, carga 1-2 μl de la muestra de RNA eluída con el espectrofotómetro para el análisis. Registrar un espectro de la muestra en el rango ultravioleta (UV).
    1. Del espectro UV, grabar un260/A280 ratio, un260/A230 ratio y el valor260 para la muestra (A = absorbancia).
    2. Como RNA monocatenario en una concentración de 40 μg/mL tiene una absorbancia de 1.0 a 260 nm, calcular la concentración de RNA (μg/mL) multiplicando la A260 x 40 para las muestras purificadas.
  15. Como un método rápido de evaluación de la integridad del RNA, para excluir las muestras degradadas de mayor análisis, mezclar 2 μl de cada muestra de RNA con 4 μL de colorante de 1,5 x formamide carga [formamida 95% desionizada, azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0,025% (p/v) de SDS] en 1,5 mL tubos de microcentrífuga de23,24.
  16. Calentar los tubos a 70 ° C por 1 min y luego transferir los tubos en hielo durante 1 minuto.
  17. Cargar las muestras en un gel de agarosa al 1% preparada en 1 x TBE (para una descripción completa de una electroforesis en agarosa nativo RNA, ver Rio, Jr. Ares, Hannon y Nilsen)24. Separar las muestras por métodos de electroforesis de gel estándar y confirmar la presencia de bandas de ARN ribosómico 28S y 18S.
  18. Seguimiento de la electroforesis del gel con los métodos de análisis cuantitativo para la determinación de la integridad del RNA [por ejemplo, un análisis de equipo Bioanalyzer y RIN (número de integridad del RNA)] como se describe en los Resultados de representante y Mueller, O. et al. 25 y Schroeder, a. et al. 26.

5. método de extracción alternativas de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) tejidos

Nota: Aunque la preservación de tejidos FFPE no representa el método más robusto de la preservación de los ácidos nucleicos, el protocolo que se presenta a continuación puede ser una manera para estudiar algunos cambios transcripcionales cuando otros tejidos conservados están disponibles.

  1. Preparar los reactivos de formalina para la preservación de tejido por distribución con formol en recipientes de plástico. Los tejidos deben conservarse en formol con una proporción de 20:1 con formol: tejido volumen/peso, respectivamente.
    PRECAUCIÓN: La formalina es un carcinógeno humano conocido y aunque no agudo tóxico, la exposición crónica (normalmente a través de los vapores inhalados) puede representar un peligro para la salud significativo. Ventilación adecuada y PPE (es decir, el uso de guantes de nitrilo, cambiarse dentro de 15 min después de la exposición inicial) son requeridos para minimizar los riesgos para la salud. Consulte la norma de formaldehido de OSHA (29 CFR 1910.1048) para obtener más información sobre evaluación de control y riesgo de la exposición.
    Nota: Utilizando formol muy poco puede afectar a la capacidad del tejido para ser conservado cuando se sumergió en el preservativo.
  2. Después del aislamiento de los tejidos de interés, recorte cuidadosamente el tejido de menos de 5 mm de espesor.
    1. Cuidadosamente con unas pinzas, sumerja el tejido cortado en formalina para reducir al mínimo cualquier salpicadura.
      Nota: Los tejidos deben estar completamente sumergidos en formol para permitir una fijación completa. Es fundamental que todas las superficies del tejido están completamente cubiertas con formalina.
  3. Una vez que los tejidos han sido sumergidos en formol, permiten la fijación de tejido ocurrir durante al menos 24 h a temperatura ambiente.
    Nota: Formol penetra en los tejidos poco a poco, a un ritmo de 1 mm por hora de todas las superficies27,28. Por lo tanto, mantener el grueso de las secciones de tejido a menos que los resultados de 5 mm en una fijación rápida del tejido entero.
  4. Después de la fijación, transferencia de los tejidos a un reactivo apropiado para la inclusión en parafina.
    Nota: por ejemplo, los tejidos examinados en este manuscrito fueron transferidos a etanol al 70% antes de la incorporación.
  5. Incorporar los tejidos en parafina. 29
  6. Sección el tejido de 10-80 μm de espesor (uso 10-20 μm si miRNA es desea extraerse)29.
  7. Con bisturí y pinzas, quite un pedazo de tejido de 40 mg de cada muestra a ser procesada y colóquelo en un tubo de microcentrífuga estéril, libre de nucleasas.
  8. Utilizar un kit comercial diseñado para recuperación de ácidos nucleicos de muestras de tejido FFPE y parafina para extraer RNA de las muestras conservadas.
    Nota: El kit que se hace referencia en la Tabla de materiales utiliza xileno y etanol se lava para quitar la parafina, un paso de tratamiento de la proteasa y un filtro de fibra de vidrio para purificar RNA.

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Representative Results

El uso de las consideraciones presentadas en este artículo (pasos 1-4 del Protocolo) ayudará a la recuperación del ARN de muestras animales grandes que es conveniente para un análisis posterior en estudios de expresión génica de host. Se evaluó la calidad de RNA para aplicaciones posteriores mediante varias medidas estándar. Para espectrofotometría, un260/A280 ratio proporciona una medida de la contaminación de la proteína, y un260/A230 ratio proporciona otra forma de evaluación de la pureza que detecta contaminantes químicos como fenol. En cada caso, razones de ~ 2.0 son pruebas de ARN de alta calidad, y disminución de ratios son evidencia de la contaminación. Importante, estos cocientes no proporcionan ninguna información sobre la degradación del RNA, que puede ser evaluada cualitativamente (pasos 4.15 4.17) y cuantitativamente (paso 4.18, como a través de un RNA anotar número de integridad o RIN).

Es importante que tenga en cuenta que el nivel de calidad esperada del ARN se recuperó de las secciones de tejido de ganglios linfáticos es, en promedio, inferiores a RNA recuperado de muestras de bovinos de glóbulos blancos. En una amplia serie de extracciones de RNA de líneas celulares y tejidos bovinos, Fleige y Pfaffl30 encontramos que la media RIN (RNA integridad los números medidos en un Bioanalyzer) varían entre < 5 para yeyuno y rumen el tejido y > 9 para blancos de la sangre las células y cuerpo lúteo, con puntuaciones RIN ganglio cayendo en el medio con un promedio de 6.9. En general, Fleige y Pfaffl30 nota que tejidos sólidos producen puntuaciones RIN que van desde los 6-8 y que tejidos con altas concentraciones de tejido conectivo muestran una degradación media superior. La densidad del tejido conectivo en los ganglios linfáticos, además el nivel intrínseco de RNasas en este tipo de tejido, puede ser responsable por la imposibilidad de constantemente recuperarse RNA con RIN puntuaciones > 9 de los ganglios linfáticos.

Sin embargo, un ejemplo de un perfil de Bioanalizador para el RNA de un nodo de linfa supramamaria bisonte utilizando la metodología presentada aquí se muestra en la Figura 4A, demostrando la recuperación del ARN con una puntuación de RIN de 8,6 (sobre todo intacto y adecuada para esencialmente todas las aplicaciones de bajada). RNA generado a partir de este procedimiento se ha utilizado con éxito generar bibliotecas para el uso en secuencia de RNA; Este protocolo permite el aislamiento regular de muestras de RNA de bisonte y nodos de linfa bovinos con valores > 8 RIN (y a menudo > 9). Para un conjunto de muestra de ocho muestras de RNA extraídos, la relación promedio de la absorbancia a 260 nm/280 nm era 2.1 y a 260 nm/230 nm fue de 2.1, lo que indica una contaminación baja en proteínas y una baja contaminación con productos químicos como el fenol, respectivamente. La recuperación promedio de ácido nucleico de cada extracción fue de 97 ± 10 μg por ~ 100 mg o una producción de ~ 1 μg RNA/mg de tejido ganglionar.

Figure 4
Figura 4 . Rastros de calidad representativa que representa calidad de RNA de metodologías de extracción. (A) este panel muestra un ARN total seguimiento del ARN de alta calidad generado desde un nodo de linfa del bisonte, utilizando el procedimiento presentado en este manuscrito. (B) este panel muestra un rastro de un bovino FFPE-muestra seleccionada del cuadro 4, RNA muy degradado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Debido a los retos asociados con el rápido aislamiento de los tejidos de grandes canales, especialmente en el caso de muestreo de especies de fauna silvestre, el impacto de la demora de tiempo entre la eutanasia y la colocación de las piezas de tejido en una preservación de RNA solución es de potencial interés en el análisis. La información en la literatura sobre la estabilidad del ARN en ganglios linfáticos los tejidos, en particular, es limitada. Por lo tanto, para proporcionar información acerca de los parámetros aceptables para la colección de tejidos, la estabilidad del RNA en la eutanasia de bisonte del nodo de linfa fue caracterizada.

Para este experimento, tiempo 0 era considerado como el tiempo que el animal fue pronunciado muerto por la falta de un latido cardíaco y la ausencia de reflejo corneal. Tras el transporte de la canal y el inicio de la autopsia, ~ transcurrido 15 min antes de la recuperación de la primera muestra de ganglio linfático (15-20 min era estándar en nuestras observaciones para la recuperación de los animales del campo; cursos de tiempo variará dependiendo de la ubicación ). El nodo de linfa supramamaria fue identificado, y una pequeña sección del tejido fue quitada y mantenida a temperatura ambiente. Las secciones fueron tomadas en intervalos de 15 min aproximadamente y transferidas del ARN preservativo; en el curso del tiempo, una segunda muestra del nodo de linfa fue obtenida del animal para el segundo grupo de 4 puntos de tiempo en la serie (figura 5A; círculos cerrados, figura 5). Se extrajo RNA en paralelo de los pedazos del nodo de linfa con el método arriba descrito. Este h 1 experimento revela que el nodo de linfa RNA retenidas la mayor parte de su integridad en el curso del tiempo, con sólo ligeras reducciones de la puntuación de RIN al finalizar el curso del tiempo (figura 5B y 5C). Asimismo, ARN de ganglios preescapular y parótidas bovinas conservó su integridad como es medido por la puntuación del RIN sobre ~ tiempo 1 h cursos post-mortem (figura 5, el animal se proporciona información en la tabla 2). Además, RNA fue extraída de secciones de nodo de linfa supramamaria recogidas 8 h después de la muerte, manteniendo secciones enteras en medios de cultivo celular a cualquier temperatura ambiente o a 37 ° C para simular el tiempo de mantenimiento en una caparazón animal. ARN ribosomal fue observable incluso después de 8 h celebración de tiempos (figura 5).

Figure 5
Figura 5 . Calidad de RNA en muestras de ganglios linfáticos bisonte recogidos a través de la muerte de tiempo cursos. (A) este panel muestra un resumen experimental de un procedimiento de curso de tiempo de 1 h. (B, C) Estos paneles presentan un examen de la calidad del RNA de las muestras tomadas a través de un curso de tiempo de 1 h de un nodo de linfa supramamaria aislado de un bisonte americano. Gel refleja las muestras de RNA desnaturalizado en formamida y separaron en un gel de no desnaturalizar el 1%. Panel (C) muestra los cambios en las puntuaciones de RIN para cada muestra. Los datos de experimentos adicionales en ganglios preescapular y parótidas bovinas es overlaid como se indica. (D) este panel muestra un ejemplo de gel de RNA, como se describe para el gel utilizado en el panel (B), para las muestras de ganglios linfáticos supramamaria procesadas después de 8 h de incubación a cualquier temperatura (carril 1) o a 37 ° C (carril 2) en medios de cultivo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estos resultados representativos son consistentes con los resultados de estabilidad del RNA para otros tipos de tejidos y fuentes. Tabla 3 proporciona un resumen de los resultados de una muestra de trabajos publicados que investigaron la estabilidad de RNA sobre cursos de preservación antes de tiempo. Nota que sólo tendencias de partituras RIN o rRNA gel observación (ARN total) están incluidos en la tabla, aunque algunos papeles proporcionan un análisis adicional de integridad ARNm, como a través de la determinación de ratios de 5' vs 3' segmentos de las RNAs (p. ej., Fajardy et al.) 31. sin embargo, es importante recordar que el tiempo entre la muerte y muestra la preservación puede resultar en cambios en los perfiles de expresión de RNA, como lo demuestra, por ejemplo, para el31del tejido placentario. Comparado con transcripciones estables, RNAs más inestables pueden ser agotados. Por lo tanto, es importante utilizar un flujo de trabajo rápido, optimizado para la recuperación de tejido para reducir demoras una vez que el animal está disponible para la necropsia, con el fin de lograr los perfiles de RNA biológicamente más válidos. Sería un error asumir que la presencia de ARN ribosómico intacta indica la ausencia de cualquier cambio en el perfil de transcriptoma. Todavía, los resultados representativos indican que incluso con el mayor procesamiento veces necesario para el muestreo de animales grandes, es posible preparar RNA que es conveniente para un análisis de expresión génica de muestras de ganglios linfáticos.

Además, se examinó el impacto de la variable post-descongelado de tiempo; durante este tiempo, ARN es susceptible a la degradación de las nucleasas presentes en el tejido. La calidad de las muestras de RNA procesados usando este protocolo con 0 o 64 min de tiempo de espera en temperatura ambiente post-descongelamiento en el paso 4.1 se midió por un marcador de RIN. Este experimento demuestra que el protocolo es absolutamente insensible a la época de deshielo, lo que es robusto para el procesamiento de las muestras múltiples (figura 6A).

Figure 6
Figura 6. Análisis adicional de los parámetros de calidad de RNA. (A) este panel muestra los resultados de la calidad del RNA para RNA purificado inmediatamente después de la descongelación (0 min) o después de la celebración de 64 min a temperatura ambiente antes de la transformación. Las barras representan la media de 3 piezas de tejido para cada condición, ± la desviación estándar. Todos los tejidos fueron almacenados en una solución conservante de RNA antes de descongelar, como se describe en el protocolo. (B) este panel muestra un rastro de Bioanalyzer de una muestra de un pedazo de mal homogeneizada del nodo de linfa que contiene gran parte del tejido conectivo. El pequeño tamaño de los picos de 28S y 18S, en comparación con los picos en la gama de 5S, es evidente. Esto también puede ocurrir debido a la degradación del RNA, aunque la base relativamente plana entre las 5S y el pico de 18 años es también sugestiva de extracción pobre; Ver Avraham, r. et al. 48 para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como punto de comparación con el aislamiento del ARN de los ganglios linfáticos, se llevó a cabo una ensayo recuperación de ARN de pedazos de nodo de linfa mesentérico FFPE de ganado. Como se describió anteriormente, las muestras se fijaban para 1 semana en formol antes de la parafina inclusión, seguido de 4 meses de almacenamiento en parafina a temperatura ambiente. Los tejidos se seccionaron en secciones de cinco de 10 μm, y mediante el procedimiento de extracción de FFPE, se recuperó aproximadamente 62 ng/μl de ARN por muestra (± 14 ng/μL). Las proporciones de absorbancia a 260 nm/280 nm promedio fue de 1.9, lo que indica un producto con bajos niveles de contaminación de la proteína, aunque las proporciones de230 A260/A fueron desfavorables (tabla 4). Tenga en cuenta que las puntuaciones RIN observaron para estas muestras eran muy baja (< 2), indicando una degradación de los productos de RNA (tabla 4; Figura 4B), consistente con la descripción de Srinivasan et al. 45. en ensayos utilizando qPCR, típicamente pequeñas secciones del ARN, o más concretamente del cDNA (< 200 bp), se amplifican. Por lo tanto, la amplificación de pequeños productos puede producirse de muestras degradadas, y se pueden realizar análisis de qPCR. Por ejemplo, fue posible amplificar un segmento de la proteína ribosomal S9 (RPS9) transcripción de estas muestras FFPE-recuperado por qPCR. Los valores de CT eran constantes a través de las muestras y un promedio de 19,2 ± 1.8. Tenga en cuenta las limitaciones que se presentan cuando se utilizan las muestras FFPE-preparado, sin embargo, como productos más grandes no están necesariamente presentes, y la degradación no pudo haber ocurrido a una tasa uniforme a través de todas las muestras. Por lo tanto, este material puede utilizarse para estudios con salvedades y limitaciones significativas están presentes para cualquier posteriores aplicaciones como secuenciación del RNA.

Tipo de nodo de linfa Ubicación Longitud Ancho Regiones drenadas por los nodos
Prescapular Justo medial a la articulación del hombro; embebidos en grasa subcutánea y bajo una capa de músculo 1-10 cm 1.5-2 cm Piel del cuello; hombro; y la piel, los músculos y las articulaciones de la extremidad torácica inferior (Ref. 8)
Prefemoral (también llamado precrural) Sólo dorsal y medial a la rodilla, aproximadamente 12-15 cm por encima de la rótula 8-10 cm 2,5 cm Piel de la extremidad pélvica, el abdomen y porciones caudales del tórax (Ref. 8)
Retrofaríngeo Encuentran en la línea media dorsal de la faringe 4-5 cm 2-3.5 cm Lengua, mucosas de la cavidad bucal, encías, labios, paladar duro, las glándulas salivales, la mayoría de los músculos del cuello
Parótida Por vía subcutánea situada ventral a la articulación temporomandibular, caudal al músculo masetero (Ref. 8) 6-9 cm 2-3 cm Piel, tejido subcutáneo, la mayoría de los músculos de la cabeza, los músculos de los ojos y oídos, párpados, glándula lagrimal, la porción rostral de la cavidad nasal
Submandibular (puede estar presente 1-3) Localizado por vía subcutánea en el aspecto medial del ángulo de la mandíbula, asociado con las glándulas salivales 3-4 cm 2-3 cm Hocico, labios, mejillas, paladar duro, parte rostral de la cavidad nasal, la punta de la lengua, piel y músculo de la cabeza (Ref. 8)
Supramamaria (mujer superficial inguinal, normalmente 2 actual) Encuentra caudal y dorsal en relación con las glándulas mamarias 6-10 cm Ubre, la vulva, el vestíbulo de la vagina, piel en los aspectos mediales y caudales del muslo, superficie medial de la pierna
Scrotal (versión masculina de superficial inguinal) Encuentran por debajo del tendón prepublic dentro de una capa de grasa alrededor del cuello del escroto 3-6 cm Escroto, prepucio y pene

Tabla 1. Resumen de ganglios superficiales bovinas.

Descripción animal Ubicación en manuscrito Edad Sexo Estado de salud
Videos del bisonte del bisonte Bisonte en video--recuperación de nodo de linfa 5-6 yo Mujer Saludable
Videos Bos taurus Bovinos en video--recuperación de nodo de linfa 7-8 yo Macho castrado Saludable
Bison bison para estudio de estabilidad del RNA Figura 5A-C 5-6 yo Mujer Saludable
Bos taurus Para estudio de estabilidad del RNA Fig. 5, Fig. 6A 7-8 yo Macho castrado Saludable
Bos taurus B para el estudio de estabilidad del RNA 5 Fig. 7-8 yo Macho castrado Saludable
Bos taurus para estudio de calidad FFPE Tabla 4, Fig. 4B 0.5 yo Macho castrado Sano (control de estudio de infección O157: H7)
Tenga en cuenta que la metodología se ha utilizado en múltiples adicionales ganados, bisonte y muestras de ganglios linfáticos de cabra, más allá de las que se destacan aquí.
Además, utilizamos la misma metodología en nodo de linfa de un terneras de 1,5 mes de edad.

Tabla 2. Características de los animales utilizados en estudios piloto.

Tipo de tejido Método de conservación Manteniendo las condiciones Conclusión de la degradación Referencia
Bovino músculo adiposo, esqueleto, hígado Snap de congelación (líquido N2) 4 º C, vacío empaquetado tejido Músculo RNA más estable (incluso hacia fuera a los 8 días de almacenamiento); adiposo y el hígado principalmente estable a 24 h. según lo determinado por la aparición de bandas de rRNA Bahar et al (2007)32
Colon humano, cáncer colorrectal Solución de preservación de RNA Temperatura ambiente. RIN preservado por 2 h., pero el subconjunto de genes muestran cambios en la expresión de 0.5-2 h. Yamagishi et al., (2014)33
Hígado de ratón, bazo Solución de preservación de RNA, o complemento de congelación (mezcla de hielo seco) Dentro de la carcasa del ratón (37 ° C) Las muestras de bazo fueron estables a 1,5 h; muestras de hígado expuesto anterior degradación (disminución del 24% en RIN en 105 min.) Choi et al., (2016)34
Hígado de ratón Ninguno (homogeneizadas en Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo) 25 ° C, 37 ° C Degradación limitada hacia fuera a 4 h. a 25 ° C, pero extensa degradación a 37 ° C por 4 h. (según lo observado utilizando puntajes RIN). Almeida et al (2004)35
Íleon humano Solución de preservación de RNA, o complemento de congelación 4 ° C, 37 ° C Generalmente estable en 1,5 h. a 37 º C; Salida estable de 6 h. a 4 º C (según lo observado utilizando puntajes RIN).  Tenga en cuenta que los autores disponen de un resumen de recursos seleccionados de estabilidad RNA S1 de tabla que puede servir como una referencia adicional para aquellos interesados en más revisión del literatura de RNA integridad del tejido. Lee et al., (2015)36
Hígado humano Snap de congelación (líquido N2 o isopentano) Temperatura ambiente. Degradación observada en 1 h. (hasta 0.85 ΔRIN); degradación más en muestras más pequeñas del hígado que en muestras más grandes. Kap et al., (2015)37
Cáncer colorrectal Snap de congelación (líquido N2/isopentano) 4 ° C Degradación observadas por 1 h.; Puntuación de RIN de sólo 4.2 después de 90 minutos de retraso en el tiempo de congelación Hong et al., (2010)38
Hígado humano Solución de preservación de RNA, también flash congelación (líquido N2) A la temperatura ambiente, 4 º C Las muestras eran estables incluso hacia fuera a 1 d. en hielo; degradación observadas después de 1 d. en la temperatura ambiente. (pero no después de 3 h; como observado usando partituras RIN) Lee et al., (2013)39
Músculo esquelético, grasa caballo Snap de congelación (líquido N2) 13 ° C Autores recomiendan que mejor integridad muscular era dentro de 2 h.; adiposo preservación dentro de 0,5 h. recomendadas por autores (según lo observado por la apariencia de gel rRNA) Morrison et al., (2014)40
Salmón cerebro, músculo del riñón, hígado, Solución de preservación de RNA Temperatura ambiente. Cerebro de RNA estable a exhbiit 4-8 h., riñón y músculo alguna degradación 8 h. (gel, RIN puntuación tanto utilizado) Seear & Sweeney (2008)41
Conejo del tejido conectivo (ligamento, tendón, cartílago) Snap de congelación (líquido N2) 4 ° C, la temperatura ambiente. No degradación "abierta" hacia fuera a post mortem, según lo observado por la apariencia de gel rRNA 96 h. Marchuk et al (1998)42
Cerebro de la rata, pulmón, corazón, hígado Parece ser extraído fresco Dentro de la caparazón de rata en incubadora de 20 ° C Mayor estabilidad del RNA observada en cerebro (podría observar bandas de rRNA hacia fuera a 7 días post mortem, aunque la degradación estaba presente), moderada estabilidad en pulmón y corazón, baja estabilidad en hígado; como se observa de aspecto de gel de rRNA Inoue et al., (2002)43
Amígdala humana, colon Con y sin solución de preservación de RNA, entonces complemento congelado Temperatura ambiente. 22 ° C, 4 ° C RNA preservación solución, solución salina fría o hielo (0 ° C) Estable a 16 h. en hielo o en la solución de preservación de RNA; degradación ligera en h. 6 o 16 en solución salina fría o a temperatura ambiente (medida por las cuentas RIN) Micke et al (2006)44

Tabla 3. Muestra de los resultados anteriores en la estabilidad del RNA en muestras de tejido post mortem. Las entradas representan manuscritos seleccionados de la literatura sobre la estabilidad del RNA, con una gama de tipos de tejidos representados, incluyendo murino, biopsia humana y veterinaria ejemplos. Los métodos de conservación, el modo de extracción previa de almacenamiento y un breve resumen de los resultados se proporcionan para cada ejemplo. A menos que se indique lo contrario, las muestras se almacenaron a condiciones que van desde hielo a 37 ° C, seguido de rápido congelamiento o una infusión con solución de preservación de RNA, curso post-tiempo (en otras palabras, estabilidad no se midió en presencia de un RNA solución de preservación durante la incubación, salvo indicación).

Identificación de la muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un /A de260280 1,96 1.98 1.98 1,91 1.98 1.89 1.89 1,91 1.9 1.84 1.84 1.97
Un /A de260230 0.67 0.14 0.19 0.26 0,61 0.69 1.33 0.11 0.21 0.39 0.1 0.44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabla 4. Representante resulta de RNA aislado de bovinos los nodos de linfa mesentéricos FFPE. La tabla muestra los resultados de lectura espectrofotométrica y análisis de calidad de una serie de muestras de bovinos del nodo de linfa FFPE procesaron utilizando el método descrito en este manuscrito. En cada caso, los resultados reflejan RNA muy degradada.

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Discussion

La mayoría de estudios transcriptómico y los protocolos asociados se centran en ratón, rata o post-mortem de muestras humanas. Sin embargo, investigaciones en ganadería y fauna proporcionan una amplia gama de oportunidades para la caracterización de la respuesta inmune a la enfermedad, como aplicable a la medicina veterinaria y, en relación con las enfermedades zoonóticas, de salud pública. Este protocolo proporciona un resumen de las más importantes consideraciones para la extracción de RNA de alta integridad de los tejidos de animales grandes, tales como ganados, bisonte, cabras y ovejas. El tamaño de los animales, así como las condiciones para la recolección de la muestra, realizar la recuperación de un proceso más extenso, con un tiempo mayor de proceso post-mortem que para la recuperación del nodo de linfa de ratón. Del mismo modo, el gran tamaño de estos ganglios linfáticos requiere protocolos que recuperan muestras paralelas de diferentes animales así como muestras representativas de los cambios inmunológicos/patológicos en el nodo de linfa. Las sugerencias para la recogida de la muestra en el presente Protocolo se proporcionan para la recuperación del ARN intacto así como perfiles representativos basados en el seccionamiento del ganglio linfático.

Como una demostración de la importancia de una estrategia de muestreo estandarizado y Protocolo, tal como se presenta aquí, Encuestamos 25 artículos de la base de datos PubMed Central que caracteriza los transcriptomas de nodos de linfa de ganado. Un papel indica el procesamiento de una sección del nodo de linfa grande a la vez, uno discute métodos de Microdisección láser específico captura, uno mencionó que una "muestra representativa" fue recogida desde el nodo de linfa y solamente un papel46 indicado que la pieza del nodo de linfa recogido (10 mm3 en tamaño) incluyó las regiones de la corteza y médula. Mientras que otros papeles señaló que las muestras pequeñas (generalmente 30-100 mg) se procesaron para el análisis de ARN, 84% de los documentos no mencionan una estrategia de muestreo para la recolección de estas piezas de tejido. Como secuenciación del RNA es todavía relativamente caro, el análisis de múltiples secciones por nodo de linfa es poco probable que sea económicamente viable en la mayoría de los casos, sobre todo porque muestras biológicas replicadas normalmente se priorizan para el análisis estadístico. Recogiendo una muestra a través de una cuña de un nodo de linfa sagittally seccionado, ARN de regiones del nodo de linfa ricas en diferentes tipos de células inmunes es capturado en todas las muestras. Este protocolo, por lo tanto, sirven como referencia para una estrategia de muestreo documentada y reproducible de transcriptómica del nodo de linfa.

En la preparación de ARN de tejidos, hay varios pasos claves para la toma de decisiones procesal. En primer lugar, se mezcla la literatura metodológica en cuanto a la utilización de soluciones de preservación contra el uso de muestras tejido congelado de flash (y posterior rectificado de temperatura fría). Especialmente en el caso de necropsias de animales grandes, hay múltiples beneficios procesales para el uso de una solución de preservación, incorporado en el presente Protocolo. En primer lugar, se pueden almacenar las muestras de tejido durante la necropsia en la solución de preservación sin necesidad de transferir inmediatamente los tubos en nitrógeno líquido. En segundo lugar, el uso de una solución de preservación proporciona una protección adicional antes del procesamiento de la muestra para la extracción de RNA, particularmente si la muestra brevemente o parcialmente deshiela antes de homogeneización. Los resultados en la figura 6A indican que este efecto protector se extiende al tejido ganglionar. En contraste, las muestras congeladas de flash deben mantenerse en el estado congelado hasta el momento de homogeneización en un búfer que contiene el fenol. Finalmente, para necropsias de campo de animales grandes, donde el nitrógeno líquido no está disponible, las muestras pueden almacenarse en la solución de preservación hasta que volvieron al laboratorio.

Ventajas adicionales de los componentes moleculares del procedimiento presentados aquí incluyen la presencia de fenol durante el proceso inicial del tejido, que sirve como un desinfectante durante el proceso de generación de aerosoles de homogeneización de las muestras de infectados de los animales y el uso del spin columna procedimiento para eliminar el fenol residual y el isotiocianato de guanidina de la muestra. Los resultados representativos demuestran que el procedimiento genera RNA de alta calidad evaluada con un /A de260280 y una relación de230 260/A gel electroforesis y puntuaciones RIN y es robusto frente a tiempo curso retos de ganado y vida silvestre. La Asociación de preservación de tejidos (por ejemplo, en RNALater), homogeneización de reactivos fenol-basado (e.g., TRIzol) y purificación de la columna de sílice ha sido utilizada con éxito en la literatura a los patrones de expresión de gene de perfil en ovinos abomasal ganglios infectados con nematodos gastrointestinales46 y en los ganglios linfáticos de vacas infectadas con herpesvirus47, con puntuaciones RIN mayores de 8 y mayores que 7 en todas las muestras, respectivamente.

En el caso de un ARN resultante con puntuaciones RIN inaceptables para el análisis de aguas abajo, deben evaluarse las siguientes variables, que son estándar para el procesamiento de RNA,: el tiempo de procesamiento total post mortem, la condición de los tejidos, el retardo de procesamiento la descongelación, la técnica durante la extracción de RNA y la RNA manejo post-extracción. Total tiempo post-mortem de procesamiento debe evaluarse especialmente en el caso de tejidos de animales encontrados muertos, a diferencia de los animales de sacrificio. Como se describió anteriormente, el ARN es relativamente estable en los ganglios linfáticos, pero retrasos en el proceso podrían conducir a la degradación, especialmente para las transcripciones inestables. Variable tiempo confusión podría estar presente si las muestras se comparan entre cadáveres que han permanecido en el campo para diferentes cantidades de tiempo. Debe evaluarse la condición de los tejidos, debido a la degradación de la integridad del tejido, debido a los cambios patológicos asociados a la infección, puede reducir la estabilidad del RNA. Por ejemplo, se ha observado menor calidad de RNA en el occipucio de Brucella-infectados los animales después de un aborto (Boggiatto et al., enviado). El deshielo después de retraso de tiempo procesamiento es mitigado por el uso de soluciones de preservación, como se describe en este protocolo. Asegúrese de que el grueso de las piezas de tejido es lo suficientemente bajo como para permitir una adecuada y rápida penetración de la solución conservante en el tejido (< 5 mm de espesor utilizando el preservativo en la Tabla de materiales). Durante la extracción de RNA, los buffers deben estar libre de ARNasas y contacto con guantes y otros artículos contaminados (RNasas están presentes en la piel) deben evitarse. Para la molienda del tejido del nodo de linfa, la mayor fuente de RNasas potencial será en el propio tejido, pero es beneficioso reducir la introducción de contaminantes en todas las etapas del procedimiento. Para manejar la post extracción de RNA, como se describe en el protocolo, alícuota del RNA muestras en los tubos antes de la congelación y almacenamiento a-80 ° C, para eliminar la necesidad de congelación y descongelación de las muestras para un análisis de la calidad y cantidad.

Bajo rendimiento en el procedimiento, además de que resulta de la degradación de las muestras de RNA, puede ser debido a un ineficiente homogeneización del tejido del nodo de linfa en el paso 4.3 en el protocolo. Tenga en cuenta que la incubación en una solución de preservación de RNA puede cambiar la textura del tejido (aumento de la firmeza), aunque la mayoría del nodo de linfa de los tejidos disociada con eficacia en pruebas piloto con los grandes dientes Disociador de rotor-estátor que se describe aquí. Como se indicó en el paso 4.3.1, la homogeneización de reactivo de fenol debe ser repetida si la disociación es incompleta. Mortero y Maja molienda, seguida de una resuspensión de la muestra de suelo en un reactivo de fenol, es otra alternativa para los laboratorios sin acceso a un homogeneizador con estas especificaciones. Sin embargo, una homogeneización en tubos desechables presenta varias ventajas potenciales sobre la molienda de tejido congelado en un mortero, incluyendo una más factible y menos flujo de trabajo para el procesamiento de las muestras múltiples, ausencia de pérdida de muestra cuando se , sin limpieza y sin potencial contacto con muestras de potencia, en el caso de tejidos de animales infectados.

Avraham et al. 48 describen que un pico de RNA 5S grandes en el producto final de RNA, con una baja recuperación de RNAs ribosomal 28S y 18S, puede ser un signo de una lisis incompleta de las células (que a su vez, para el proceso del nodo de linfa, puede ser debido a una disociación incompleta del tiss UE). Figura 6B es un ejemplo de un perfil de RNA generado a partir de un trozo de la bovina del nodo de linfa parótido que era muy alto en el tejido conectivo y no homogeniza con eficacia. Rendimientos de RNA deben ser calculados y monitoreados a través de las muestras en un conjunto de análisis confirmar que se obtienen recuperaciones similares por mg de tejido y muestras para comparación directa por secuenciación del RNA deben ser procesadas en lote, utilizando la misma homogeneización estrategia para todas las muestras. Tenga en cuenta que el enfoque de muestreo de cuña también ayuda en evitar una colección de una muestra que es exclusivamente una región de extensa del tejido conectivo.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar. Toda la investigación es financiada con fondos intramuros del Departamento de agricultura de Estados Unidos, servicio de investigación agrícola. Todas las referencias a productos específicos se proporcionan con el fin de reproducibilidad experimental y no representan ningún endoso de estos productos por el gobierno federal.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a James Fosse por su excelente trabajo sobre todo videografía y procesamiento de vídeo; Michael Marti por su excelente trabajo en la generación de imágenes digitalizadas de ganado; Lilia Walther por su ayuda con la extracción de RNA y Bioanalyzer funciona; Mitch Palmer y Carly Kanipe por su útil informe y comentarios en imágenes de nodo de linfa; y el cuidado de los animales y el personal veterinario del Centro Nacional de enfermedades animales por todo su trabajo duro y ayuda con la cría de animales y la preparación para necropsias.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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