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Immunology and Infection

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

Abstract

큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.

Introduction

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림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상3.

실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RNA 그대로 RNA 생물학 관련 transcriptomic 데이터의 생성을 위해 필수적 이다. 조직 샘플에서 높은-품질 RNA의 생성은 특히 큰 동물 병원 체 연구에 대 한 중요 한 실시 제약 시설에서. 이러한 연구는 본질적으로 더 그들은 뿐만 아니라 시설 승인 및 고도로 훈련 직원 필요 하지만 상당한 금융 비용을 작업에 따라 수백 수천 달러의 수만에서 배열할 수 있다 수행를 수행 하기 어렵다. 이러한 유형의 연구는 또한 크로스-징계 협업 및 그들의 복잡성을 추가 하는 그들의 완성에 대 한 크로스-징계 지식을 포함 한다. 따라서,에 대 한 교육, 개발, 샘플 수집 및 보존에 대 한 효율적인된 시스템을 준수 하는 이득을 제공 한다 중요 한 조직의 다운스트림 분자 연구에 대 한 감염 된 동물에서.

큰 림프 노드의 컬렉션 murine 림프절의 유사한 샘플링에 비해 조직 컬렉션에 대 한 추가적인 도전을 선물 한다. 샘플 절단에 대 한 준비 관련 내부 구조를 포함 한 림프절의 해부학에 대 한 기본적인 이해를 필요로 합니다. 림프 노드의 구조는 림프 lobules sinuses 림프로 가득 둘러싸인 구성 됩니다. 이러한 구조는 거친, 섬유질 캡슐 포함. 4 림프 lobule "기본 해 부와 기능적인 단위 림프 노드의" 이며 낭, 깊은 외피 단위 및 골 수 코드와 sinuses4 (그림 1A)로 구성 됩니다. B와 T 세포는 각각 낭과 깊은 외피 단위에 가정. 이러한 구조 3D 비 계를 제공 하 고 있는 림프 톨 항 원 또는 항 원 제시 세포 사이 상호 작용 촉진.

조잡 한, 낭과 깊은 대뇌 피 질의 단위 확인할 수 있습니다 잘라 표면에 그들은 빽으로 채널을 포함 하 고 보다 더 섬세 한 망상 채널의 구성 되어 나타나고 라이터는 sinuses 표시 (그림 1B). 규칙에 따라 병리학 표면 피 질 (낭), paracortex (깊은 외피 단위)와 골 수 (골 수 코드와 sinuses) 림프절의 영역을 참조 하십시오. 모든 3 개의 영역의 적절 한 시험 간주 되었습니다 최고로 림프절5에 대 한 일상적인 병 적인 시험 지침에 연습. 참고 일관성, 크기, 및 단일 동물 내 에서도 림프절의 색상에 상당한 변이가 있다. 동물 나이, 그들의 림프절 크기 감소와 젊은 동물의 그들 보다는 더 확고 한 되, 일반적으로 그들의 결합 조직 및 림프 정상의 감소에서 증가로 인해6,7을 구조 하는 경향이 됩니다.

Figure 1
그림 1. 림프절의 해부학. (A)이 만화 이미지 표시, 림프절의 해부학 키 구조를 묘사. (B)이 여전히이 이미지 횡단면으로 잘라 소 림프 노드를 보여 줍니다. 육안으로 볼 수 있습니다 관련 구조/레이어 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

실험적인 질문에 따라 다른 림프절 수집 및 분석에 대 한 관심이 될 것입니다. 주변 림프절은 피하 조직에 깊이 있는. 가축, 주변 또는 표면 림프절 임상 및 실험 연습에서 자주 사용 한다 포함 귀 밑, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural)와 표면 사 타 구니 (supramammary 여성, 남성에서 음 낭에서) ( 그림 2)입니다. 표 1주요 표면 림프절의 속성 가축 시스템8에 설명 된 대로 설명 되어 있습니다. 아래 소의 세균성 전염병에 대 한 몇 가지 잠재적인 림프 노드 컬렉션 계획 조사에 대 한 시작 지점으로 제공 됩니다.

세라 abortus/세라 melitensis: 표준을 B. abortus위한 necropsies-가축 및 B. melitensis감염-감염 된 염소 국립 동물 질병 센터에서 supramammary, prescapular, 및 선 림프절 조직 복구 모두 호스트 RNA 식 프로 파일링에 대 한 RNA 준비를 위한 세균성 열거형에 대 한 분쇄. B. abortus 정기적으로 실험적으로 감염 된 가축9. 에 이러한 림프절의 각 재기 될 수 있다 B. melitensis에 이러한 림프 노드 형식 각각에 있는 박테리아의 존재를 검출 될 수 있다-우리의 연구 (Boggiatto 그 외 여러분, 미 출판)에서 RNA 기반 방법론을 사용 하 여 감염 된 후 적어도 9 개월까지 염소를 감염. 살 모 넬 라 sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), 그리고 mesenteric 림프절 살 모 넬 라 보급10,,1112 에 대 한 가축 시체를 프로 파일링 하는 동안 유용 하 게 되었습니다, transcriptomic 연구에 대 한 잠재적인 관심의 것입니다. E. 콜라이 O157:H7: (중간 소장 원심 소장 위치에서) Mesenteric 림프절 박테리아 감염 된 송아지 (에 감염 된 성인 가축)13의 가끔 회복의 사이트 수 있습니다. 렙 (Leptospira sp.): 박테리아의 만성 지 속성 유선14배출 림프절에서 관찰 되었습니다. 진 균 bovis : 가축, 박테리아 종 아리15의 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절에서 복구 된 후 실험 감염 되었습니다. 또한, 림프절 RNA 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스2등 큰 동물 호스트 응답을 검사 하 이용 되어 있다. 그림 2 는 가축 시체에서 이러한 주요 림프절의 하위 집합의 위치를 보여 줍니다.

Figure 2
그림 2: 선택 된 림프 노드 위치를 묘사 하는 만화 보스 토 러 스 . 번호가 매겨진된 림프절은 주석 처리 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 문서와 관련 된 비디오, 선물이 큰 동물 감염의 transcriptomic 연구에 관련 된 분자 생물학에 대 한 유익 하도록 설계 된 RNA 연구에 대 한 큰 동물 림프절의 격리에 대 한 프로토콜. 먼저, 우리 제공 격리 절차의 개요, 림프절에 대 한 예제로 소과 들소 조직에서 샘플링을 사용 하 여. 와 결합 하 여이 데모 비디오에 표시 된 대로, RNA 격리에 대 한 재현 조직 샘플링에 대 한 워크플로우가 이다. 다음, 우리는 감염 된 림프절, 안전, 일관성, 그리고 RNA 품질에 초점을 맞춘의 처리에 대 한 중요 한 고려 사항을 설명합니다.

산성화 페 놀 guanidine isothiocyanate 시와 조직에서 RNA의 준비 Chomczynski 및 Sacchi16,17, 실리 카 기반 스핀 열의 존재에 대해 정화의 원래 방법에 따라 Vogelstein 길18의 원래의 작품에 따라 chaotropic 대리인. 우리는 또한 transcriptomics에 대 한 대체 방법으로 보존 하는 가축 림프절에서 RNA의 복구에 대 한 가능성을 검사 합니다. 마지막으로, 우리는 안락사와 들소에서 복구 된 RNA 프로 파일에 샘플링 사이의 시간 증가의 효과 묘사 하는 대표적인 실험을 포함 하 여 큰 동물 necropsies에서 RNA 품질에 시간 변수의 영향을 탐구 하 고 소 림프 노드입니다. 이 문서 뿐만 아니라 분자 생물학 하지만 transcriptomic 연구를 개시 하는 또한 하 수의 연구자에 유용할 것 이다.

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Protocol

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여기에 묘사 된 동물 검 시 절차 국립 동물 질병 센터, Ames, 아이오와에 승인된 IACUC 프로토콜 적용 모든 실험 동물 보호 및 복지에 대 한 승인 된 지침에 따라 실시 했다.

1. 미리 검 시 전에 계획

  1. 전에 검 시 검 시 스위트 전송에 대 한 다음 자료 준비:
    1. 1.5 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 가득 ~ 1.0 mL 랙 또는 수송 컨테이너에 RNA 보존 솔루션의. 조직의 볼륨을 보존 솔루션의 볼륨의 비율에 대 한 제조업체의 지침에 따라 해야 합니다.
    2. 일회용 scalpels와 깨끗 한, 압력가 마로 소독 집게: 피부와 림프절 (한 동물 당 각 림프절), 수집 하기 위한 다른 세트를 해 부에 대 한 설정 하나 피부와 림프 노드 환경 식물의 교차 오염을 방지 조직입니다.
    3. 3 m m 사용된 scalpels와 생 검 도구 및 절단 보드와 sharps 컨테이너 또는 림프절 절 개에 사용 하기 위해 일회용 쟁반 생 검 도구, 검 시 칼을 펀치.
    4. PPE는 시스템에 대 한 적절 한 BSL 수준 작업에 필요한을 포함 한 개인 보호 장비를 사용 합니다.
    5. 압력솥 재사용 가능한 금속 도구, 설정 기구/드라이 제품을 사용 하 여 검 시 전에 금속 팬에 집게를 포함 하 여.

2. 식별 및 가축과 들소에서 림프절의 샘플링

Figure 3
그림 3 . 소 머리와 목의 림프절. (A)이 만화 이미지 쇼 선택한 림프 노드 머리와 보스 토 러 스의 목의. (B)이이 이미지는 단면 (오른쪽)에 단면 (왼쪽)에 비해 선 침 샘에에서 선 림프 노드를 보여 줍니다. 두 조직 종류 텍스처 차이 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 가축과 들소 prescapular 림프절의 절연
    1. 현지 IACUC 프로토콜에 따라 동물 (가축 또는 모든 나이의 실험에 대 한 적절 한 들소) 안락사 특히 심장 박동, 호흡, 부족 부족과 각 막 반사의 부재를 포함 하 여 기관 IACUC 프로토콜에서 설명 하는 방법으로 죽음을 확인 합니다. 검 시 바닥에 동물을 이동 합니다.
      참고: 큰 동물의 실험실 연습에 사용 하는 자비 롭 안락사의 다양 한 방법이 있습니다. 그러나, pentobarbital 나트륨과 phenytoin 나트륨 솔루션의 정 맥 행정은 가장 일반적으로 승인 하 고 활용 하는 형태. 동물의 안락사에 AVMA 지침을 문의 하십시오. 19
      주의: 펑크-증거 컨테이너와 재사용 가능한 금속 칼 및 집게 정화 sharps의 안전한 처리에 대 한 지침을 포함 하 여 호스트 기관에 검 시에 대 한 모든 관련 biosafety 프로토콜을 따르십시오. 이 프로토콜은 일회용 scalpels의 사용에서 sharps 낭비를 생성합니다. 부츠, 작업복, 장갑, 눈 보호를 포함 하 여 기관 지침에 의해 규정 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
    2. 3 참가자는 동물의 조직에서 작동을 식별 합니다.
      참고: 여기, 것 1 것입니다 수는 대규모 담당 단면 원하는 동물의 조직의 것 2 다른 동물 섹션에서 림프절을 복구할 것 이다, 것 3 각 림프절에서 섹션을 별도 테이블에 작동 하 고 방부 제 솔루션 튜브에 그들을 전송.
    3. 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다.
    4. 어깨 무릎 (손목);의 수준에서 앞 다리를 다시 이동 하 여 확장 이 모션 다시 어깨를가지고 하 고는 림프절의 쉽게 촉진에 대 한 허용 합니다. 림프 노드 "덩어리"의 존재에 대 한 느낌.
      참고: 질병 상태, lymphadenopathy 존재할 수 있습니다, 쉽게 림프절의 식별, 하지만이 과정 또한 영향을 미칠 수 일관성, 구성, 및 림프 노드 아키텍처.
    5. 일단, 그리고 여전히 확장 어깨, 어깨의 윤곽선을 따라 피부 절 개를 만들기 위해 메스 또는 검 시 칼을 사용 합니다.
      참고: 림프 노드 위치 를 통해 촉진 되었습니다 경우에 절 개의 크기를 제한 하지 않습니다. 더 큰 절 개 깊은 조직에 쉽게 액세스를 제공 하 고 쉽게는 림프절의 절제는 것.
    6. 집게의 쌍을 사용 하 여, 어깨의 포인트를 공개와 목 근육을 피부 철회.
      참고: prescapular 림프 노드는 overconditioned 동물에 (서) 특히 피하 지방에서 자주 발견 된다.
    7. (그림 3A) 림프절의 위치를 다시 한번 만져.
      참고: 달리 피하 지방, 림프 노드 모양을 palpated 때를 개최 한다. 또한, 그들은 얇은 섬유 캡슐을 둘러싸인으로 림프절 어떤 주변 조직으로 인접 하지 않습니다.
    8. Prescapular 림프 노드를 찾는 후 신중 하 게 피하 지방, 메스와 집게를 사용 하 여 밖으로 해 부하 고 림프 노드를 분리.
      1. 같이 그림 1B, 림프절 및 지방 조직; 사이 구별 하는 얇은 섬유질 캡슐의 존재에 대 한 보고 림프절은 어떤 주변 조직으로 연속.
    9. 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 림프 노드를 전송.
      참고: bison에 이러한 림프절의 모양이 비슷합니다. 관련된 비디오는 아메리카 들소의 오른쪽 어깨에서 해 부로 prescapular 림프절의 모양을 보여 줍니다.
  2. 가축과 들소에 선 림프절의 절연
    1. 검 시 바닥에 측면 recumbency에 동물을 배치 하 여 시작 합니다. 턱 관절을 (TMJ)를 찾습니다.
      1. 이 찾을 어려운 경우는 mandible를 천천히 이동 하 고는 mandible 두개골;을 연결 하는 위치를 결정 이것은 TMJ 이다.
    2. 신중 하 게 메스 또는 검 시 칼을 사용 하 여, 피부에 절 개를 확인 합니다. 공동으로 지 절 개를 시작 하 고 그것 ventrally/수직으로 연장 jawline 따라.
    3. 피하 조직을 떨어져 피부를 해 부. 선 침 샘 표시 됩니다 처음, 그것의 큰 크기, lobulated 표면 외관, 및 빨간 채색 때문.
    4. 사용 하 여 집게와 메스, 선 침 샘을 이동 제쳐두고 그냥 두개골 및 침 샘 (그림 3A)에 중간 앉아 선 림프 노드를 찾을. 추가 처리 전에 텍스처에 대 한 선 림프절 조직을 검사 합니다.
      참고: (선, submandibular) 얼굴의 림프절은 림프 노드 격리를 혼동 수 있습니다 침 샘, 연관. 비해 림프절, 침 샘 훨씬 더 큰 이며 lobulated 표면 모습. 또한, 절단된 표면에 침 샘 자연에 균질 이며 림프절 (그림 3B)의 고전적인 대뇌 피 질과 골 수 건축 패턴을 전시 하지 않습니다.
    5. 메스와 선을 삭제하시오 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.
  3. Supramammary 림프절 여성 가축과 들소의 격리
    1. 측면 recumbency에 동물을 배치 합니다.
    2. 사 타 구니 영역을 노출 하 고 젖 통을 찾아 뒷 다리를 상승 합니다.
      참고: 건강 하 고, 젖을 비 동물에서 이러한 림프절의 촉진 하지 가능. 젖이 동물에서 이러한 림프절 젖 통의 기지의 꼬리 테두리에 만져 서 있을 수 있습니다.
    3. 메스를 사용 하 게 절 개 단지 등 위쪽 다리 노출 supramammary 동맥을 따라 젖 통.
    4. 피하 조직 해 부 고 피하 지방에의 얇은 계층에 포함 된 supramammary 림프 노드. 시각적으로 구별할 수, 경우 피하 지방 내에서 확고 한 구조의 존재에 대 한 노출된 조직 만져.
    5. 포 셉, 메스 using, 신중 하 게 지방에서 림프 노드 밖으로 해 부. 추가 단면에 대 한 조직 전송을 위한 플라스틱 트레이 사용 하 여 림프 노드 해 부 테이블에 그것을 전송.

3. 단면 및 림프절의 저장

  1. 주 검 시 공간에 인접 한 해 부 테이블에 3 dissector에 것 2에서에서 격리 된 림프절을 전달 합니다. 마의 신선한 섹션에 각 림프 노드를 배치 합니다. 미리 림프 노드를 연속적으로 여러 개의 림프절의 영수증을 촉진 하 여 절단 보드 섹션에 레이블을 지정 합니다. 감염 샘플에 대 한 일회용 트레이 사용 합니다.
  2. 집게와 일회용 메스 또는 검 시 칼을 사용 하면, 림프 노드의 섹션 제거할. 날카로운 칼을 사용 하 여 림프 노드를 열어 화살 컷을 확인 합니다.
  3. 특히 감염 된 동물 표본에서에서 림프절의 내부 검사, 비대칭을 찾고, 병 변, 색상 차이, 기록 관측.
  4. (옵션 1) 작은 조직 단면도
    1. 일회용 scalpels를 사용 하 여 삭제할 두께에서 5 m m 미만 하 고 깨끗 한 집게와 RNA 보존 솔루션 튜브 각 조각을 전송 각 림프절의 조각.
  5. (옵션 2) 림프절 생 검 또는 단면 방법론
    참고: 생 검 또는 단면 방법론, 다른 노드 및 동물, 병렬 림프 노드 섹션에 적용 하는 경우 대량 RNA 분석을 위한 샘플링 조직의 일관성을 제공 합니다.
    1. 웨지 단면 메서드
      1. 후 세포 림프 노드의 프로필 전체를 삭제할 외부 캡슐에 센터에서 림프절에서 파이 모양 쐐기를 화살 섹션 검토. 노드 2 cm 폭 (표준 크기; 표 1참조), 쐐기 외부 아크 길이 4 m m 센터에 자르고 5mm 두께에서 젖은 무게 해야한다 ~ 100mg.
      2. 메스를 사용 하 여, 작은 조각, 5 밀리미터, 그리고 약 50-100 mg 각 젖은 조직 무게에서 보다 두꺼운 쐐기 잘라.
        참고: 일관성을 위해 모든 웨지 조각 또는 별도 튜브에 하나의 일괄 처리에서 다음 RNA 풀링 관심의 림프절에서 대표적인 RNA 프로 파일을 제공 하는 단일 림프절에서 처리 합니다.
      3. 조직의 볼륨에 비해 RNA 보존 솔루션의 적어도 10 볼륨 포함 된 튜브에 집게와 조직 조각을 놓습니다.
    2. 펀치 생 검 방법
      1. 목표는 노드에서 특정 낭 등 특정 섹션을 수집 하는 경우 펀치 생 검 도구를 선택 합니다. 컬렉션에 대 한 원하는 샘플의 크기와 일치 하는 도구를 선택 합니다. 펀치 생 검 도구 직경 8 m m 1에서 크기의 범위에서 사용할 수 있습니다.
      2. 시각적으로 림프절에 샘플에 대 한 관심의 영역을 찾습니다.
      3. 펀치 생 검 도구를 사용 하 여 관심, 누르고 도구를 만드는 핵심 조직으로 선회의 섹션을 삭제할. 집게와 RNA 보존 솔루션의 적어도 10의 볼륨을 포함 하는 관 조직 조각을 전송. 5 m m 보다 두꺼운 경우 추가 조직 더 작은 조각으로 분할 하 포 셉, 메스를 사용 합니다.
  6. 일단 샘플 보존 솔루션에 전송 (., RNALater), 실 온에서 실험실 등을 맞댄 그들을 수송.
  7. 4 ° C 하룻밤 조직 침투 수 있도록에서 샘플을 저장 합니다.
  8. 다음 날, 과잉 RNA 방부 제 솔루션을 부 어 고-80 ° c.에서 조직 샘플을 저장 샘플을 동결 하기 전에 가능한 많은 방부 제를 제거 합니다. P1000 / P200 micropipette 팁을 사용 하 여 효율적인 RNA 방부 제 솔루션 제거를 위한.
    주의: 폐기 decanted 보존 솔루션 적절 하 게, 안전 데이터 시트에 지정 된 대로 방부 제 솔루션의 화학 및 환경 위험 뿐만 아니라 활용 하는 병원 체의 감염 속성에 따라.
    참고: 여기에 제공 된 지침 자료의 테이블에서에서 설명 하는 RNA 보존 솔루션에 대 한 제공 됩니다. 대체 보존 솔루션을 사용 하는 경우 제조업체의 지침을 참조 하십시오.

4. RNA 림프절에서 처리

주의: 실험실 외 투, 장갑, 그리고 처리 단계에 대 한 적절 한 눈 보호를 착용 하십시오.

참고: 여기에 사용 되는 페 놀 기반 시 약 재료의 테이블에서 에서 설명 하는 (그리고 프로토콜 제조업체의 지침에 따라)20. 다른 페 놀 기반 시 약의 사용에는 구입한 특정 제품에 대 한 제조업체의 권장 사항에 따라 절차의 수정 할 거 수 있습니다.

  1. 샘플, 사전 약 균질 튜브 (1.5 mL/튜브), 냉장된 (4 ° C) 페 놀 기반 시 약 수에 액세스 하기 전에 피 펫을 사용 하 여.
    주의: 페 놀은 독성, 부식성, 및 건강 위험. 클로 프롬은 독성과 건강 위험. 화학 증기 두건 4.1 4.9 처리 단계를 완료 하 고 화학 물질과 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용. 미국에서는, 클로 프롬은 위험한 폐기물; 튜브를 포함 하는 지역 및 기관 지침에 따라 유해 폐기물의 처분. 프로세스 조직 샘플 해당 BSL-2, BSL-3, 또는 BSL-4 지침 아래 병원 체 감염 동물에서.
  2. 일단 샘플 깨끗 한 집게와 microcentrifuge 튜브에서 느슨하게 될 수 있습니다, 즉시 페 놀 기반 시 약을 포함 하는 균질 튜브 보존된 조직의 약 50-100 mg 전송.
    1. 페 놀 기반 시 약을 추가 하기 전에 녹고 제한 합니다. 드라이 아이스에 스토리지를 사용 하 여 여러 샘플 처리에 대 한 냉동 고에서 제거 됩니다 때.
  3. 단단히 튜브 캡, 균질 화기에 배치 하 고 페 놀 기반 시 약에서 회전자-stator 조직 균질 화기와 샘플을 균질. 실 온에서 처리를 완료 합니다. 언제 완료, 검사 샘플은 성공적으로 무 균; 되도록 흐린 외관에 대 한 조직 흐린 현 탁 액에 분산 한다.
    참고: 2 분 RNA 추출 설정이 사용 됩니다 (는 균질 화기에 대 한 사전 설정된 RNA_02_1 설정 테이블의 자료에서 설명, 냉동된 조직에 대 한 설계). 이 프로토콜에 지정 된 회전자 고정자 (참조 테이블의 자료) 이며 큰 이빨 균질 섬유 소재를 포함 하 여 조직 유형의 범위에 대 한 적응. RNA_02_01 설정은 설계 구체적으로 (반대로 신선한) 냉동 조직. 림프절 섬유질 결합 조직 구성으로, 마찬가지로 최적화 된 회전자-stator 균질 화기는 효과적인 분리를 달성 하기 것이 좋습니다. 국립 연구소의 환경 건강 과학21 균질 권장 사항에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.
    1. 직물의 큰 덩어리는 균질 후 유지, 균질 절차를 반복 합니다. 효율적으로 RNA를 복구, 조직 해야 합니다 수 잘 해리 했다.
    2. 더 섬유 림프 노드 조각에 대 한 사전 림프 노드 조각 균질 튜브를 전송 전에 여러 작은 조각으로 잘라 집게와가 위를 사용 합니다. 소개에 설명 된 대로 더 오래 된 동물에서 림프절 조직 섬유 더 있을 수 있습니다.
      참고: 호스트와 병원 체 RNA의 이중 분석을 원하는 경우 (예: 구슬 균질) 추가 치료 필요할 수 있습니다 세균 RNA의 복구에 대 한 그람 양성 균은 조직에 존재 하는 경우에 특히.
  4. 즉시 무 균된 샘플 튜브에서 제거 하 고 RNase 무료 microcentrifuge (2.0 mL 크기에서)와 함께 튜브 P1000 micropipette 전송.
  5. 어떤 샘플 파편 든 지 제거 하 4 ° C에서 12000 x g에 5 분에 대 한 샘플 원심 P1000 micropipette 팁을 사용 하는 펠 릿을 남겨두고 신선한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
  6. 실 온에서 5 분 동안 상쾌한 품 어. 두 개의 1.5 microcentrifuge 튜브 사이의 각 샘플 분할.
  7. 페 놀 기반 시 약 (, 1.5 mL 샘플 0.3 mL);의 1 mL 당 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 혼합 단계, 하지만 하지 소용돌이 샘플 1-2 분이 손으로 반전. 실 온에서 2 분 동안 그것을 품 어.
  8. 4 ° c.에 12000 x g에서 15 분 동안 원심
  9. 조심 스럽게 제거는 interphase 또는 빨간색 페 놀-클로 프롬 레이어를 방해 하지 않고 상위 계층을 형성 하는 micropipette 팁 P1000 (P200) 위, 명확한 수성 단계. 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
  10. 100% 에탄올;의 동등한 양으로 혼합 반전 튜브 4-5 배 하 여 철저 하 게 믹스. 튜브는 흐린 자주 표시 됩니다.
  11. Micropipette 팁을 더 정화 하 고 RNA, 다음 제조 업체의 지침22elute 상업 스핀 실리 카 기반 열에 액체를 전송. 생성 된 RNA elute ~ 50mg RNase 무료 물 50-100 µ l로 조직.
    참고: 페 놀 기반 시 약 추출 qRT-PCR 그리고/또한 RNA 시퀀싱 응용 프로그램에 RNA의 다운스트림 사용을 위해 유기 단계에서 DNA를 제거 하는 동안 DNase RNA 샘플의 추가 치료를 것이 좋습니다.
  12. 약 수를 줄이기 위해 어떤 동결 해빙 주요 RNA 샘플의 정량화 및 품질 평가에 사용 하기 위해 튜브를 분리 하는 eluted RNA. 저장용-80 ° C에 튜브를 전송 합니다.
  13. 샘플 낮은 biosafety 수준 포함 영역으로 이동 됩니다 병원 체의 부재에 대 한 결과 RNA 샘플 확인 림프절 샘플 BSL-3 견제 수준에서 특히 zoonotic 병원 체 감염 동물에서 파생 된 경우 품질 분석, RT-PCR 및 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비
    참고: 그것은 중요 한 현지 규정을 고려 하 고 CDC (질병 통제 예방 센터) 비활성화 선택 에이전트와 작업에 대 한 지침, 경우 그것은 연구자의 로컬 사이트에 모든 비활성화 절차의 유효성을 검사 하는 데 필요한.
    1. 1/10번째 볼륨 단계 4.12에서에서 각 eluted RNA 샘플의 (, 총 RNA의 50 µ l에서 5 µ l)를 제거 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 샘플 100 µ l 세균성 성장 국물 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서의 혼합. 살 균 플라스틱 분산기를 사용 하 여 한 천 배지 표면 RNA 국물 혼합 분산.
      참고: 국물 종류와 한 접시는 동물 도전 하는 병원 체의 성장을 일치를 선택 합니다.
    2. 병원 체는 동물도 전했다의 성장에 특정 조건 하에서 한 천 배지를 품 어. BSL-3 봉쇄에서 샘플을 제거 하기 전에 복구 된 박테리아의 부재를 확인 합니다.
      참고: 결과 eluted RNA, 정량화 및 무결성, 테스트 후는 RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램에 적합.
  14. RNA 복구 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 평가 합니다. RNA 품질을 평가 하는 분석을 위한 분 광 광도 계에 eluted RNA 샘플의 1-2 µ l을 로드 합니다. 자외선 (UV) 범위에 샘플의 스펙트럼을 기록 합니다.
    1. UV 스펙트럼에서 A260/A280 비율, A260/A230 비율, 그리고 샘플 A260 값 기록 (A = 흡 광도).
    2. 40 µ g/mL의 농도에서 단일 가닥 RNA 260에서 1.0의 흡 광도 nm A260 x 40 정화 샘플을 곱하여 RNA 농도 (µ g/mL)을 계산.
  15. RNA 무결성의 평가의 빠른 방법으로 어떤 저하 샘플 추가 분석에서 제외, 혼합 각 RNA 샘플의 2 µ l과 1.5 x formamide 로드 염료 [95% 이온된 formamide, 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol, 5 mM EDTA (pH 4 µ l 8.0), 0.025% (w/v) SDS] 1.5 ml에서 microcentrifuge23,24튜브.
  16. 1 분에 70 ° C에서 튜브가 열 하 고 1 분 동안 얼음에 튜브를 전송.
  17. 1에서 준비 1 %agarose 젤에 샘플 로드 x TBE (RNA에 대 한 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법의 전체 설명에 대 한 리오, Ares 주니어, Hannon, 및 참조 Nilsen)24. 표준 젤 전기 이동 법 방법으로 샘플 고 28S와 18S 리보솜 RNA 밴드의 존재를 확인 합니다.
  18. 젤 전기 이동 법 [예를 들어, Bioanalyzer 및 린 (RNA 무결성 번호) 분석] RNA 무결성 확인에 대 한 정량 분석 방법 대표 결과 뮬러, O. 에에서 설명 된 대로 따라 외. 25 와 슈뢰더, A. 외. 26.

5. 대체 추출 방법에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직

참고: FFPE 직물 보존 팬 들은 핵 산 보존의 가장 강력한 방법의 정보를 대표 하지 않는다, 하지만 아래 제시 하는 프로토콜 수 다른 보존된 조직에 사용할 수 없는 경우 일부 transcriptional 변화를 공부 하는 방법을.

  1. 플라스틱 용기에 포 르 말린을 분배 하 여 조직 보존을 위한 포 르 말린 시 약을 준비 합니다. 조직 말린 포 르 말린: 조직 볼륨/무게 20: 1의 비율에 각각 유지 한다.
    주의: 말린 알려진된 인간 발암 물질 이며 비록 심하게 독성, (일반적으로 흡입된 가스)를 통해 만성 노출 중요 한 건강 위험을 나타낼 수 있습니다. 적절 한 환기 및 PPE (, 니트 릴 장갑, 초기 노출 후 15 분 이내에 변경할 수 사용) 건강 위험을 최소화 하기 위해 필요 합니다. OSHA 포름알데히드 표준 참조 (29 CFR 1910.1048) 노출 모니터링 및 위험 평가 대 한 자세한 내용은.
    참고: 너무 작은 포 르 말린을 사용 하 여 방부에 빠져들 때 완벽 하 게 보존 되는 조직 수에 영향을 수 있습니다.
  2. 관심의 조직 분리 후 신중 하 게 두께에서 5mm 미만 조직을 정돈 한다.
    1. 트림 된 조직 어떤 splashing을 최소화 하기 위해 포 르 말린으로 잠수함 신중 하 게 집게를 사용 하 여.
      참고: 조직 해야 합니다 수 완전히 침수 말린 완전 한 고정에 대 한 허용에. 그것은 중요 한 조직의 모든 서피스는 완전히 말린 덮여입니다.
  3. 일단 조직 포 르 말린에 빠져들 되었습니다가지고, 실 온에서 24 시간 이상 발생 조직 고정 하실 수 있습니다.
    참고: 말린 침투 조직 천천히, 모든 표면27,28에서 시간당 1 m m의 속도로. 따라서, 유지 조직 단면도의 두께 5mm 결과 보다는 더 적은 전체 조직의 빠른 정착에.
  4. 고정, 후 조직 파라핀 포함에 대 한 적절 한 시 약으로 전송.
    참고: 예를 들어 조직 검사이 원고에 포함 하기 전에 70% 에탄올으로 옮겨 졌다.
  5. 파라핀으로 조직을 포함 합니다. 29
  6. 10-80 µ m 조직 두께 (사용 10-20 µ m 미르를 원하는 경우)에 섹션29.
  7. 메스와 집게를 사용 하면, 처리 하는 살 균, nuclease 무료 microfuge 관으로 각 샘플에서 40 mg 조직 조각을 제거할.
  8. Deparaffinization 및 핵 산 복구 FFPE 조직 샘플의 보존된 샘플에서 RNA를 추출 하기 위한 상업 키트를 활용.
    참고: 재료의 테이블에서 에서 참조 하는 키트 활용 크 실 렌 그리고 파라핀, 효소 치료 단계 및 RNA를 정화 하는 유리 섬유 필터를 제거 하 에탄올 세척.

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이 문서 (프로토콜의 단계 1-4)에서 제공 하는 고려를 사용 하 여 호스트 유전자 표현 연구에 다운스트림 분석 적합 큰 동물 샘플에서 RNA의 회복에 도움이 됩니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA 품질은 여러 표준 측정에 의해 평가 됩니다. 분 광 광도 학, 단백질 오염 물질의 측정을 제공 하는 A260/A280 비율 및 A260/A230 비율 순수성 평가 페 놀 등 화학 오염 물질 감지의 다른 수단을 제공 합니다. 각각의 경우의 비율 ~ 2.0 높은-품질 RNA의 증거 이며 감소 비율 오염의 증거. 중요 한 것은, 이러한 비율 질적으로 평가 될 수 있다 RNA 저하에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 (4.15-4.17 단계) 및 양적 (4.18를 단계는 RNA를 통해 무결성 번호 또는 린 점수와 같은).

그것은 림프절 조직 섹션에서 복구 하는 RNA의 예상된 품질 수준은, 평균에, 소과 흰색 혈액 세포 샘플에서 발견 하는 RNA에 대 한 보다 낮은 해야 합니다. 소 조직 및 세포에서 RNA 추출의 포괄적인 시리즈, Fleige 및 Pfaffl30 는 평균 린 (RNA 무결성 숫자는 Bioanalyzer에서 측정) 다릅니다 < 5 공장 및 제일 위 조직에 대 한 > 백혈구에 대 한 9를 찾아 세포와 림프 노드 린 점수 6.9의 평균 중간에 빠지는 luteum. 일반적으로, Fleige 및 Pfaffl30 노트 단단한 조직 결합 조직의 높은 농도 가진 6-8, 그리고 그 조직에서 배열 하는 린 점수 생산 높은 뜻 저하 전시. 린와 일관 되 게 복구 RNA 점수 > 림프절에서 9에 대 한 결합 조직에 림프 노드 밀도 플러스이 조직 유형에 RNases의 본질적인 수준 책임 있을 수 있습니다.

그러나, 여기에 제시 된 방법론을 사용 하 여 들소 supramammary 림프 노드를 복구 하는 RNA에 대 한 Bioanalyzer 프로필의 예 그림 4A, 8.6 (주로 그대로 및 적당 한의 린 점수 RNA의 회복을 보여주는 표시 됩니다. 기본적으로 모든 다운스트림 응용 프로그램) 합니다. 이 절차에서 생성 된 RNA 성공적으로 RNA 시퀀싱;에 사용 하기 위해 라이브러리를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이 프로토콜 들소와 린 값 > 8 (그리고 종종 > 9) 소 림프절에서 RNA 샘플의 일반 격리에 대 한 수 있습니다. 8 추출 된 RNA 샘플의 샘플 집합에 대 한 평균 흡 광도 비율 260 nm/280 nm에는 2.1와 260 nm/230 nm 2.1, 낮은 단백질 오염 및 낮은 오염 화학 물질 페 놀, 같은를 각각 나타내는 했다. 각 추출에서 평균 핵 산 복구 했다 당 97 ± 10 µ g ~ 100 mg 또는의 항복 ~ 1 µ g 림프절 조직의 RNA/mg.

Figure 4
그림 4 . RNA 추출 방법론에서 품질을 묘사한 대표적인 품질 추적. (A) 높은-품질 RNA 들소 림프절에서 생성 된이 원고에 제시 하는 절차를 사용 하 여이 패널 쇼 총 RNA 흔적. (B)이이 패널 매우 저하 RNA를 묘사한 소 FFPE 샘플 표 4에서 선택한 추적을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

도전 때문에 연결 된 야생 동물 종에서 샘플링의 경우 특히 큰 시체에서 조직의 급속 한 격리는 안락사와는 RNA 보존 조직 조각의 사이의 시간 지연의 영향 해결책은 분석에서 잠재적인 관심사의 이다. 정보 문학에서 안정성에 대 한 RNA의 림프절 조직, 특히, 제한 됩니다. 따라서, 조직 컬렉션에 대 한 적절 한 매개 변수에 대 한 정보를 제공 하도록 들소 림프 노드 후 안락사에 RNA의 안정성 특징 이었다.

이 실험에 대 한 시간 0는 심장 박동의 부족 및 각 막 반사의 결핍으로 죽은 동물 였으며 시간으로 고려 되었다. 시체 검 시의 시작의 전송 다음 ~ 15 분 첫 번째 림프절 샘플을 검색 하기 전에 경과 했다 (15-20 분 필드 동물의 복구에 대 한 우리의 관찰에 표준; 시간 코스 위치에 따라 달라 집니다 ). Supramammary 림프 노드를 식별 하 고 조직의 작은 부분 제거 되 고 실내 온도에 유지. 섹션 이후 약 15 분 간격으로 고로 RNA 방부 제; 시간 코스 중간 림프절의 두 번째 샘플은 4 시간 포인트 (그림 5A; 닫힌된 원, 그림 5C) 시리즈에서의 두 번째 집합에 대 한 동물에서 검색 됩니다. RNA는 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 림프 노드 조각에서 동시에 추출 되었다. 이 1 시간 실험 림프절 RNA 시간 과정, 시간 과정 (그림 5B5c)의 끝에 의해 린 점수의 단지 약간의 감소에 걸쳐 대부분의 무결성의 유지 보여. 소 prescapular 고 선 림프절에서 RNA에 린 점수에 의해 측정 된 그것의 무결성을 유지 하는 유사 하 게, ~ 1 h 시간 코스 사후 (그림 5C, 동물 정보 2에서). 또한, RNA 세포 배양 중 실내 온도에 또는 동물 시체의 처리 시간을 시뮬레이션 하기 위해 37 ° C에서에 전체 섹션을 잡고 죽음 후에, 8 h 수집 된 supramammary 림프 노드 섹션에서 추출 했다. 리보솜 RNA (그림 5D) 시간 잡고 8 h 후에 관찰 했다.

Figure 5
그림 5 . Bison 림프절 샘플에서 RNA 품질 시간 코스 후 죽음에 걸쳐 수집한. (A)이이 패널 1 h 시간 과정 절차의 실험 개요를 보여 줍니다. (B, C) 이러한 패널 표시 미국 들소에서 격리 supramammary 림프절에서 1 h 시간 과정에 걸쳐 샘플에 대 한 RNA 품질의 검사. 젤 반영 formamide에 변성 RNA 샘플 1% 비 변성 시키기 젤에서 분리 합니다. 패널 (C) 린 점수 각 샘플에 대 한 변경 내용을 보여 줍니다. 소 prescapular 고 선 림프절에 대 한 추가 실험에서 데이터 표시 된 대로 중첩 됩니다. (D)이이 패널 예가 나와 RNA 젤의 패널 (B)에서 사용 하는 젤에 대 한 설명 된 대로 supramammary 림프절 샘플 8 h 부 화 하거나 실 온 (1 레인)에서 또는 세포 배양에서 37 ° C (2 차선)에서 후 처리에 대 한 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이러한 대표적인 연구 결과 다른 조직 유형 및 소스에 대 한 RNA 안정성 결과와 일치 하는. 표 3 사전 보존 시간 과정을 통해 RNA 안정성 조사 게시 된 논문의 샘플의 결과의 요약을 제공 합니다. 몇 가지 서류와 같은 5' 의 비율의 결정을 통해 3' 선택 된 RNAs의 세그먼트에 mRNA 무결성의 추가 분석 제공 린 점수 또는 rRNA만 동향 관찰 (총 RNA) 젤 참고 테이블에 포함 (예를 들어, Fajardy 그 외 여러분) 그러나 31., 그것은 같이, 예를 들어31태 반 조직 대 한 죽음 및 샘플 보존 사이 긴 시간 RNA 식 프로필에 변경 될 수 있습니다 기억 하는 것이 중요. 안정적인 성적에 비해, 더 불안정 RNAs 고갈 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 생물학적으로 가장 유효한 RNA 프로필을 달성 하기 위하여 동물 검 시를 위해 제공 되 면 어떤 지연 줄이기 위해 조직 복구에 대 한 신속 하 고 효율적인 워크플로 활용 하는 것이 중요. 그것은 그대로 ribosomal RNA의 존재 transcriptome 프로필에서 변경 부재 가정 하 실수일 것 이다. 아직도, 대표적인 결과 큰 동물 샘플링의 증가 처리 시간 필요와도 가능 하다는 것 준비 RNA 유전자 표정 분석 림프절 샘플에서 적합 하 것이 좋습니다.

또한, 후 녹고 시간 변수의 영향 조사 되었다; 이 시간 동안 RNA는 조직에 존재 nucleases에서 저하를 받기 쉽습니다. 0 또는 64 분이이 프로토콜을 사용 하 여 처리 유지 시간 단계 4.1에서 녹고 후 실 온에서 RNA 샘플의 품질 린 점수를 측정 했다. 이 실험에서는 프로토콜 아니다는 것을 확실히 해 동 시간에 민감한 여러 샘플 (그림 6A)의 처리에 대 한 강력한 만들기 보여 줍니다.

Figure 6
그림 6입니다. RNA 품질 매개 변수의 추가 분석. (A)이이 패널 (0 분) 녹고 후 즉시 또는 처리 하기 전에 실내 온도에 64 분 후 정화 RNA RNA 품질 결과 보여줍니다. 막대 3 조직 조각 각 조건, ± 표준 편차에 대 한 평균을 나타냅니다. 모든 조직 프로토콜에 설명 된 대로 이전에 녹고, RNA 방부 제 솔루션에 저장 되었습니다. (B)이이 패널 결합 조직의 큰 부분을 포함 하는 제대로 무 균된 림프 노드 조각에서 샘플의 Bioanalyzer 추적을 보여 줍니다. 5S 범위에 봉우리에 비해 28S와 18S 봉우리의 소형은 분명 하다. 5S 범위와 18S 피크 사이의 비교적 평탄한 기준선 또는 가난한 추출;의 암시 이지만이 또한, RNA의 저하로 인해 발생할 수 있습니다. 아브라함, R. 그 외 참조 48 자세한 내용은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

림프절에서 RNA의 격리에 비교의 시점으로 가축에서 FFPE mesenteric 림프 노드 조각에서 RNA의 시험 복구를 실시 했다. 위에서 설명한 것 처럼 샘플 파라핀 포함, 실 온에서 파라핀에 스토리지의 4 개월 전에 포 르 말린에 1 주에 대 한 고정 했다. 조직 되었다 5 10 µ m 섹션으로 구분 하 고 약 62 ng / µ L의 RNA 샘플 (± 14 ng / µ L) 당 복구 FFPE 추출 절차를 사용 하 여. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 비율 평균 1.9 A260/A230 비율 불리 (표 4) 비록 단백질 오염, 낮은 수준의 제품을 나타내는. 참고 린 점수 관찰이 샘플 했다 매우 낮은 (< 2), RNA 제품 (표 4;의 저하를 나타내는 그림 4B), 산 의 묘사와 일치. 45. 분석 정량, RNA, 또는 좀 더 구체적으로 cDNA (< 200 bp)의 일반적으로 작은 부분을 활용 하 여, 증폭 됩니다. 따라서, 작은 제품의 증폭 저하 샘플에서 여전히 발생할 수 있습니다 및 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 S9 ribosomal 단백질 (RPS9) 세그먼트를 증폭 수 정량에 의해 이러한 FFPE 복구 샘플 증명서. CT 값 샘플 걸쳐 일관 했다 고 평균 19.2 ± 1.8. 그러나 FFPE 준비 샘플을 활용 하 여, 더 큰 제품 반드시 존재 하지 않습니다 그리고 저하 하지 발생 한 균일 한 속도로 모든 샘플에서 존재 하는 제한 사항을 명심에서 하십시오. 따라서,이 자료, 경고와 더불어 연구에 사용할 수 있습니다 하지만 중요 한 한계는 RNA 시퀀싱 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.

림프 노드 형식 위치 길이 너비 노드에 의해 배수 지역
Prescapular 그냥 중간에 어깨 관절; 피하 지방에서 및 근육의 계층에서 포함 된 1-10 cm 1.5-2 c m 피부의 목; 어깨; 그리고 피부, 근육, 그리고 낮은 흉부 사지 (참고. 8)의 관절
Prefemoral (또한 precrural 이라고) 그냥 지 하 고 억압, 슬 개 골 위에 약 12-15 cm에 중간 8-10 cm 2.5 c m 다리를 골반, 복 부, 흉부 (참고. 8)의 꼬리 부분의 피부
Retropharyngeal 중간 선 인 두에 지 있습니다 4-5 cm 2-3.5 cm 혀, 구강, 잇 몸, 입술, 하드 미각, 침 샘, 목의 근육의 대부분의 점 막
귀 밑 턱 관절, 저작 근육 (참고. 8) 꼬리에 복 부 피하 위치 6-9 cm 2-3 cm 피부, subcutis, 머리, 눈, 귀, 눈 꺼 풀, 눈물 동맥의 근육, 비 강의 rostral 부분 근육의 대부분
Submandibular (1-3 현재 수 있습니다) 피하 mandible, 침 샘과 관련 된의 각도의 중간 부분에 위치한 3-4 cm 2-3 cm 총구, 입술, 뺨, 하드 미각, rostral 부분의 비 강, 혀, 피부와 근육 머리 (참고. 8)의 팁
Supramammary (천박한 여자 사 타 구니, 일반적으로 2 현재) 유 방 땀 샘을 기준으로 caudally dorsally 발견 6-10 cm 젖 통, 외 음부, 질, 허벅지, 다리의 중간 표면의 중간과 꼬리 측면에 피부의 현관
(남성 버전 표면의 사 타 구니) 음 낭 음 낭의 목에 지방 층 내에서 prepublic 힘 줄 아래 3-6 cm 음 낭, 포 피, 음 경

표 1입니다. 소 표면 림프절의 개요.

동물 설명 원고에 위치 나이 섹스 건강 상태
Videoed 들소 들소 비디오-림프 노드 복구 들소 5-6 요 여성 건강 한
Videoed 보스 토 러 스 비디오-림프 노드 복구에 소 7-8 요 거세 남성 건강 한
Bison에 bison RNA 안정성 연구 그림 5A-C 5-6 요 여성 건강 한
보스 토 러 스 RNA 안정성 연구에 대 한 A 그림 5C, 그림 6A 7-8 요 거세 남성 건강 한
보스 토 러 스 RNA 안정성 연구에 대 한 B 그림 5C 7-8 요 거세 남성 건강 한
보스 황소 FFPE 품질 연구 표 4, 그림 4B 0.5 요 거세 남성 정상 (O157:H7 감염 연구에서 제어)
참고 여러 추가, 들소, 소와 염소 림프절 샘플, 사람 여기에 강조는에 방법론 사용 되었습니다.
또한, 우리는 림프절에서 수집 된 동일한 방법론을 사용는 1.5 미주리-오래 된 여성 송아지.

표 2입니다. 파일럿 연구에서 사용 하는 동물의 특성.

조직 유형 보존 방법 조건 보유 저하 결론 참조
소 해 지방, 골격 근육, 간 동결 (액체 N2) 스냅 4 ° C, 진공 포장 조직 근육 보다 안정적인 RNA (심지어 스토리지의 8 일); 지방 및 간 주로 안정적인 24 h. 하 rRNA 밴드의 외모로 평가 Bahar 외. (2007 년)32
인간의 대 장, 대 장 암 RNA 보존 솔루션 방 온도 린 2 헤에 대 한 보존 하지만 유전자의 하위 집합 표시 변경 0.5-2에서 h. Yamagishi 외. (2014)33
마우스 간, 비장 RNA 보존 솔루션, 또는 동결 (드라이 아이스 슬러리) 스냅 마우스 시체 (37 ° C) 내부 비장 샘플은 1.5 h; 밖으로 안정 간 샘플 전시 이전 저하 (24% 감소 린에서 105 분.) 최 외. (2016)34
마우스 간 없음 (Homogenized guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬에 신선한) 25 ° C, 37 ° C 25 ° C에서 4 헤에 개 제한 저하 하지만 4 헤 (때 린 점수를 사용 하 여 관찰) 37 ° C에서 광범위 한 저하. 알 메 이다 외. (2004)35
인간의 회장 RNA 보존 솔루션, 또는 동결 스냅 4 ° C, 37 ° C 37 ° C에서 1.5 헤 일반적으로 안정적인 (때 린 점수를 사용 하 여 관찰) 4 ° C에서 6 헤에 안정적인 밖으로.  으로 사용할 수 있는 추가 참조를 그에 대 한 추가 검토 조직의 RNA 무결성 문학에에서 관심이 테이블 s 1에 선택 된 RNA 안정성 리소스에 대 한 요약을 제공 하는 저자 note. 이 외. (2015)36
인간의 간 (액체 N2 또는 isopentane) 스냅 방 온도 (최대 0.85 ΔRIN); 1 헤에서 저하 간 보다 큰 샘플의 작은 샘플에 더 저하 갑 외. (2015)37
인간의 대 장 암 동결 (액체 n 2/isopentane) 스냅 4 ° C 1 시간에 의해 저하 관찰.; 지연 시간에 90 분 후 4.2만의 린 점수 홍 외 (2010)38
인간의 간 또한 플래시 동결 (액체 N2) RNA 보존 솔루션 객실 온도, 4 ° C 샘플 1 개도 안정 했다 d. 얼음; 1 후 저하 관찰 방 온도에서 디. (하지만 3 헤; 후로 관찰 린 점수를 사용 하 여) 이 외. (2013)39
말 많은, 골격 근육 동결 (액체 N2) 스냅 13 ° C 저자는 최고의 무결성 추천 근육 2 h 이내 했다.; 권장 작성자 (rRNA 젤 모양에 의해 관찰) 0.5 헤 내 지방 보존 모리슨 외. (2014)40
연어 두뇌, 신장, 간, 근육 RNA 보존 솔루션 방 온도 8. (젤, 린 점수 모두 사용) 일부 저하 4-8 헤, 신장 및 근육 exhbiit에 안정적인 뇌 RNA Seear & 스 위 니 (2008)41
토끼 결합 조직 (인 대, 힘 줄, 연골) 동결 (액체 N2) 스냅 4 ° C, 방 온도. 96 h. 사후, rRNA 젤 모양에 의해 관찰로를 밖으로 "명백한" 저하 없음 Marchuk 외. (1998)42
쥐 두뇌, 폐, 심장, 간 신선한 추출 될 것으로 보인다 20 ° C 배양 기에서 개최 하는 쥐 시체 내부 뇌 (관찰할 수 있었다 rRNA 밴드 밖으로 7 일 사후, 저하는 존재 하지만), 폐와 심장, 간; 낮은 안정성에 적당 한 안정성을 관찰 하는 가장 높은 RNA 안정성 rRNA 젤 외모로 관찰 이노우에 외. (2002)43
인간의 편도 선, 콜론 와 없이 RNA 보존 솔루션, 다음 스냅인-냉동 방 온도 (22 ° C), 4 ° C RNA 보존 솔루션, 차가운 식 염 수, 또는 얼음 (0 ° C) 얼음에 또는 RNA 보존 솔루션; 16 헤에 안정 RT (린 점수에 의해 측정 되는) 또는 차가운 식 염 수에 6 또는 16 헤에서 약간의 저하 Micke 외. (2006)44

테이블 3입니다. 사후 조직 샘플에서 RNA 안정성에 이전 결과의 샘플. 다양 한 조직, 대표를 포함 한 유형 murine, RNA 안정성에 문학에서 선택 된 원고를 대표 하는 항목 인간의 생 검 및 수의 예. 각 예제에 대 한 보존, 저장 사전 추출의 모드와 결과의 간단한 요약에 대 한 방법은 제공 됩니다. 달리 명시 하지 않는 한 샘플 얼음에서 스냅 동결 또는 RNA 보존 솔루션, 포스트 시간 코스와 주입 다음 37 ° C에 배열 하는 상태에서 저장 된 (즉, 안정성은 하지 측정 되는 RNA의 존재 부 화, 동안 보존 솔루션 명시 되지 않는 한).

샘플 ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
260/A280 1.96 1.98 1.98 1.91 1.98 1.89 1.89 1.91 1.9 1.84 1.84 1.97
230 260/A 0.67 0.14 0.19 0.26 0.61 0.69 1.33 0.11 0.21 0.39 0.1 0.44
  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

표 4입니다. 대표 소 FFPE mesenteric 림프절에서 격리 하는 RNA에서 결과. 테이블 spectrophotometric에서 결과 묘사 하 고 품질 분석 FFPE 소 림프절 샘플의 시리즈에서이 원고에 설명 된 메서드를 사용 하 여 처리. 각각의 경우에 결과 매우 저하 RNA를 반영합니다.

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Discussion

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마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항에 대 한 개요를 제공합니다. 샘플 컬렉션에 대 한 조건 및 동물의 크기는 복구 마우스 림프 노드 복구에 대 한 보다 긴 사후 처리 시간으로 더 광범위 한 프로세스를 확인 합니다. 마찬가지로, 이러한 림프절의 대형 샘플을 대표 림프 노드 내에서 면역/병리학 변화 뿐만 아니라 다른 동물에서 병렬 샘플을 복구 하는 프로토콜을 필요로 합니다. 림프 노드의 단면에 따라 대표 프로필 뿐만 아니라 그대로 RNA의 복구에 대 한 샘플 컬렉션이이 프로토콜에 대 한 제안을 제공 합니다.

표준화 된 샘플링 전략 및 프로토콜의 중요성의 데모로 서, 여기에 제시 된으로 우리 가축 림프절의 transcriptomes 특징 PubMed 중앙 데이터베이스에서 25 종이 조사. 한 종이 큰 림프 노드 섹션의 처리를 한 번에 표시, 하나 특정 레이저 캡처 서 방법, 하나는 "견본" 림프 노드에서 수집 된 언급 고만 하나의 종이46 표시 그 림프절의 조각을 수집 (10 m m3 크기에서) 피 질과 수 질 지역 포함. 다른 논문 지적 작은 샘플 (일반적으로 30-100 mg) RNA 분석에 대 한 처리 했다, 그러나의 84%는 이러한 조직 조각 모음에 대 한 샘플링 전략을 언급 하지 않았다. 로 RNA 시퀀싱은 여전히 상대적으로 비싼, 림프 노드 당 여러 섹션의 분석은 생물 복제 샘플은 일반적으로 통계 분석에 대 한 우선 순위를 때문에 특히 대부분의 경우, 재정적으로 가능한 것 같다. Sagittally sectioned 림프절의 걸쳐 샘플을 수집 하 여 면역 세포의 종류에 풍부한 림프 노드 지구에서 RNA는 모든 샘플에서 캡처됩니다. 이 프로토콜 수 있습니다, 따라서, 림프 노드 transcriptomics에 대 한 문서화 및 재현성 샘플링 전략에 대 한 참조 역할을 합니다.

조직에서 RNA의 준비, 절차 상의 의사 결정에 대 한 여러 주요 단계가 있습니다. 첫째, 플래시 동결 조직 샘플 (및 후속 냉 온도 연 삭)의 사용 방법 론 적 문학 보존 솔루션 의 사용 측면에서 혼합입니다. 특히 큰 동물 necropsies 경우이 프로토콜 통합 보존 솔루션의 사용에 여러 잠재적인 절차 이점이 있습니다. 첫째, 조직 샘플을 액체 질소에 튜브를 즉시 전송 하지 않고도 보존 솔루션에 검 시 동안 저장할 수 있습니다. 둘째, 보존 솔루션 사용 샘플 또는 짧게 부분적으로 녹아서 균질 하기 전에 하는 경우에 특히 RNA 추출 위한 샘플 처리 하기 전에 추가 보호를 제공 됩니다. 그림 6A 에 결과이 보호 효과 림프절 조직에 확장을 나타냅니다. 반면, 플래시 동결 샘플 페 놀을 포함 하는 버퍼에 균질의 순간까지 냉동된 상태에서 유지 되어야 합니다. 마지막으로, 여기서 액체 질소는 쉽게 사용할 수, 큰 동물의 필드 차례의 샘플 수 수에 저장 보존 솔루션 실험실에 반환 될 수 있습니다 때까지.

여기에 제시 된 절차의 분자 분 대의 추가 이점은 초기 조직 처리, 살 균 제에서 샘플에 대 한 균질의에 어로 졸 생성 과정 역할 중 페 놀의 존재를 포함 감염 동물, 그리고 샘플에서 잔여 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 제거 하려면 스핀 열 절차의 사용. 대표 결과 입증 절차260/A280 260/A230 비율 평가 높은-품질 RNA 생성 젤 전기 이동 법, 그리고 린 점수, 그리고 코스에 도전 하는 시간에 얼굴에 강력 가축 및 야생 동물 샘플링. 시는 페 놀 기반 약 (예를 들어, TRIzol), 그리고 실리 카 열 정화에 균질 조직 보존 (예를 들어, RNALater에), 쌍은 성공적으로 이용 되어 프로필에 양 진 식 패턴을 문학에 abomasal 임 파선 감염 위장 nematodes46 와 가축 림프절에는 herpesvirus47, 린 점수 8 보다 큰 및 모든 샘플에 걸쳐 7 보다 큰 각각 감염.

다운스트림 분석에 대 한 용납할 수 없는 린 점수 결과 RNA의 경우는 RNA 처리에 대 한 표준, 다음 변수를 평가 합니다: 총 처리 시간 게시물-부검, 조직, 처리 시간 지연의 상태 후, RNA 추출 및 RNA 처리 후 추출 하는 동안 기술 해 동. 총 처리 시간 사후 조직 발견 죽은 동물을 안락사에 반대 하는 동물에서 발견 한 경우 특히 평가 한다. 위에서 설명한 대로 RNA 림프절, 상대적으로 안정 하지만 처리에서 긴 지연 저하, 특히 불안정 한 녹취 록에 대 한 발생할 수 있습니다. 샘플은 서로 다른 양의 시간에 대 한 필드에 남아 있는 시체 사이 비교 하는 경우 혼란 시간 변수는 있을 수 있습니다. 조직의 조건 pathologic 변경 관련 감염 된 조직의 무결성의 저하는 RNA 안정성을 줄일 수 있기 때문에 평가 한다. 예를 들어 낮은 RNA 품질 세라의 placentome에서 관찰 되었습니다-감염 된 동물-낙태 (Boggiatto 그 외 여러분, 제출). 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 시간/지연 후 재개 보존 솔루션의 사용에 의해 완화 됩니다. 조직 조각의 두께 적절 하 고 신속한 조직 ( 테이블의 자료에 언급 된 방부 제를 사용 하 여 < 5 m m 두께)으로 방부 제 솔루션의 침투를 허용 하도록 충분히 낮은 수 있습니다. RNA 추출 하는 동안 버퍼 RNase 무료 고 장갑 및 기타 연락처 오염된 항목 (RNases 피부에는) 피해 야 한다. 림프절 조직의 연 삭, 잠재적인 RNases의 가장 큰 원천, 조직에 있을 것입니다 하지만 절차의 모든 단계에서 오염 물질의 도입을 줄이기 위해 도움이 됩니다. 프로토콜에 설명 된 대로 RNA 게시물 추출, 처리, 약 RNA 수 샘플링 튜브로 냉동 고-80 ° C에서 저장 하기 전에 동결-해 동 품질 및 수량 분석을 위한 샘플을 필요에.

RNA 샘플의 저하에서 유래 뿐만 아니라 절차에 있는 수확량을 낮은, 림프절 조직 단계 4.3 프로토콜에서의 비효율적인 균질 때문일 수 있습니다. 비록 큰 파일럿 실행에서 효과적으로 해리 대부분 림프절 조직 이빨 회전자-stator dissociator 여기에 설명 된 RNA 보존 솔루션에서 외피 조직 (증가 딱딱한)의 질감을 변경할 수 있습니다 note. 페 놀 기반 시 약에 균질 이어야 한다 단계 4.3.1에서에서 설명 했 듯이, 분리 완료 되는 경우 반복. 박격포와 유 봉 연 삭,이 사양으로 균질 화기에 액세스 하지 않고 실험실에 대 한 또 다른 대안 이다 지상 샘플 페 놀 기반 시 약에의 한 물의 resuspension 다음. 그러나, 일회용 튜브에 균질 박격포와 유 봉, 더 가능 하 고 짧은 워크플로 여러 샘플 처리에 대 한 샘플 손실 연 삭 때의 부재를 포함 하 여 냉동된 조직을 분쇄 하는 데 여러 잠재적인 이점을 선물합니다 정리, 그리고 잠재적인 접촉 감염 된 동물에서 직물의 경우 전원 샘플.

아브라함 외. 48 28S와 18S 리보솜 RNAs의 낮은 복구와 마지막 RNA 제품에 큰 5S RNA 피크 (차례로, 림프 노드 처리에 대 한 수는 tiss의 불완전 한 분리로 인해 세포의 불완전 한 세포의 징조 수 있습니다 설명 ue)입니다. 그림 6B 소 선 림프 노드를 결합 조직에 매우 높은 효과적으로 균질 하지 않았다의 조각에서 생성 된 RNA 프로 파일의 예를 제공 합니다. RNA 수익률 계산 해야 하 고 샘플 분석 비슷한 복구 조직의 밀리 그램 당 가져온 RNA 시퀀싱에 의해 직접 비교를 위한 샘플 같은 균질을 사용 하 여 일괄 처리에서 처리 확인을 위해 집합에 걸쳐 모니터링 모든 샘플에 대 한 전략입니다. Note 쐐기 샘플링 접근도 피하는 광범위 한 결합 조직의 지역에 독점적으로 하는 샘플의 컬렉션에서 에이즈.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다. 모든 연구는 농업의 미국 학과, 농업 연구 서비스에서 교내 자금 투자입니다. 특정 제품에 대 한 모든 참조 실험의 재현성을 위해 제공 되 고 연방 정부에 의해이 제품의 모든 지지를 대표 하지 않는다.

Acknowledgments

저자는 제임스 포 세 모든 videography 및 비디오 처리; 그의 뛰어난 작품에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 디지털된 가축 이미지;의 세대에 그의 뛰어난 작품에 대 한 마이클 마티 릴리 아는 발터에 대 한 그녀의 RNA 추출 및 Bioanalyzer 실행; 미치 파머와 도움이 검토 및 림프 노드 이미지;에 대 한 피드백에 대 한 칼 리 Kanipe 동물 보호 그리고 그들의 노력 및 축산 지원의 모든 국립 동물 질병 센터와 차례의 준비에서 수의 직원 들.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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