Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Innsamling og behandling av Lymph noder fra store dyr for RNA analyse: forbereder lymfeknute Transcriptomic studier av store dyrearter

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Denne protokollen gir en oversikt over prosedyrer for isolering av RNA for transcriptomic profilering av lymfeknute vev fra store dyr, inkludert trinnene i identifikasjon og excision av lymph noder fra husdyr og dyreliv, prøvetaking metoder å gi konsistens på tvers av flere dyr, og betraktninger pluss representant resultater for post samling bevaring og behandling for RNA analyse.

Abstract

Store dyr (husdyr og dyreliv) tjene som viktig reservoarer zoonotiske patogener, inkludert Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaog E. coli, og er nyttige for studiet av patogenesen og/eller spredning av bakterier i naturlige verter. Med funksjonen nøkkel av lymfeknuter i immunforsvaret vert tjene lymfeknute vev som en potensiell kilde til RNA for nedstrøms transcriptomic analyser, for å vurdere timelige endringene i genuttrykk i celler i løpet av en infeksjon. Denne artikkelen gir en oversikt over prosessen med lymfeknute innsamling, vev prøvetaking og nedstrøms RNA behandling i husdyr, med storfe (Bos taurus) som modell, med flere eksempler fra den amerikanske bison (Bison bison ). Protokollen inneholder informasjon om plasseringen, identifisering og fjerning av lymph noder fra flere viktige områder i kroppen. I tillegg presenteres en biopsi prøvetaking metodikk som tillater en konsistens av prøvetaking over flere dyr. Flere hensyn for eksempel bevaring diskuteres, inkludert generering av RNA egnet for nedstrøms metoder som RNA-sekvensering og RT PCR. På grunn av de lange forsinkelsene i store dyr vs mus tid kurs studier presenteres representant resultater fra bison og storfe lymfeknute vev for å beskrive time course of nedbrytning i denne vev, i forbindelse med en gjennomgang av tidligere metodologisk arbeid på RNA degradering av andre vev. Samlet vil denne protokollen være nyttig både veterinær forskerne begynner transcriptome prosjekter på store dyr prøver og molekylær biologer interessert i å lære teknikker for i vivo vev prøvetaking og i vitro behandling.

Introduction

RNA-sekvensering analyse av transcriptome av lymfeknuter gir deg mulighet å karakterisere immunrespons av dyr til en rekke patogener. Mens denne metodikken blitt benyttet mye i mus, har analyser nylig blitt utvide til større pattedyr1,2. Husdyr/store dyr lymfeknuter kan brukes til å karakterisere vert svar til en infeksjon, ikke bare for deres bruk i vaksine eller genetisk mottakelighet studier og identifisering av mål for narkotika utvikling, men også som modellsystemer for menneskelige studier på zoonotiske sykdommer. For eksempel ved brucellose (en zoonotiske bakteriell sykdom som påvirker en halv million mennesker rundt om i verden hvert år), til tross for betydelig økt kostnader, studier i sau eller geiter er mer relevante for menneske-smitte og menneskelige vaksine utvikling enn laboratorium dyremodeller. Musen infeksjon modeller recapitulate reticuloendothelial systemet infeksjonen men ikke karakteristiske klinisk underskriver3.

I store dyreforsøk i forhold til laboratoriet dyrestudier innebærer prosessen med vev høsting nødvendigvis en lengre forsinkelse mellom euthanasia og samlingen vev, som en potensiell utfordring for bevaring av høy kvalitet RNA. Intakt RNA er viktig for generering av biologisk relevante transcriptomic data. Generasjonen av høy kvalitet fra vevsprøver er spesielt viktig for store dyr patogen studier gjennomført i forvaring fasiliteter. Slike studier er iboende vanskeligere å utføre som de ikke bare krever godkjent fasiliteter og høyt utdannet personell men også gjennomføre betydelige finansielle kostnader, som, avhengig av arbeidet, kan variere fra titalls til hundrevis av dollar. Slike studier også innebære et tverrfaglig samarbeid og tverrfaglig kunnskap for sine ferdigstillelse, legge til kompleksitet. Derfor gir opplæring på, utviklingen av, og overholdelse av et strømlinjeformet system for eksempel innsamling og bevaring betydelige fordeler for nedstrøms molekylære studier av vev fra infiserte dyr.

Samlingen av større lymfeknuter gir ekstra utfordringer for vev samlingen sammenlignet med lignende prøvetaking av murine lymfeknuter. Forberedelse for eksempel excision nødvendiggjør en grunnleggende forståelse av anatomien i lymfeknute, inkludert de relevante interne strukturene. Strukturen i en lymph node består av lymfoide lobules former omgitt av bihulene fylt med lymfe. Disse strukturene er omsluttet av en tøff, fibrøs kapsel. 4 en lymfoide lobule er "anatomiske og funksjonelle basisenheten av lymfeknute" og består av hårsekkene, en dyp kortikale enhet, og medullær ledninger og bihulene4 (figur 1A). B- og T-lymfocytter er hjem til hårsekkene og dypt kortikale enheter, henholdsvis. Disse strukturene gir en 3D stillaset og gjøre interaksjon mellom lymfocytter og antigen eller antigen presentere celler.

Grovt, follicles og dypt kortikale enheter kan identifiseres på kutt overflate som de inneholder en tettere reticular meshwork og se mørkere ut enn bihulene, som består av en mer delikat reticular meshwork og virker lysere (figur 1B). Ved konvensjonen se patologer regionene i lymfeknutene overfladisk cortex (follikler), paracortex (dypt kortikale enheter) og medulla (medullær ledninger og bihulene). En skikkelig undersøkelse av alle tre regioner har vært ansett som beste praksis i rutinemessig patologisk undersøkelse retningslinjer for lymfeknuter5. Merk at det er en betydelig variasjon i konsistens, størrelsen og fargen på lymfeknuter, selv innenfor en enkelt dyr. Som dyr alder, deres lymfeknuter vil tendere til å redusere størrelsen og blir firmer enn yngre dyr, vanligvis skyldes en økning i connective vev og en reduksjon av normal lymfoide struktur6,7.

Figure 1
Figur 1. Anatomien til lymfeknute. (A) denne tegneserie bilde viser anatomi av lymfeknute, som viser viktige strukturer. (B) dette fortsatt bildet viser en storfe lymph node kutte tverrsnitt. Relevante strukturer/lag som er synlige for det blotte øye er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Avhengig av eksperimentelle spørsmålet, vil ulike lymfeknutene være av interesse for innsamling og analyse. Perifer lymph noder er dypt i subkutant vev. I storfe, ytre eller overfladisk lymfeknuter ofte brukt i klinisk og eksperimentell praksis omfatter Parodisk, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural) og overfladiske lysken (supramammary i kvinner, scrotal hos menn) () Figur 2). I tabell 1, er egenskapene til sentrale overfladisk lymfeknuter, som beskrevet i storfe systemet8, beskrevet. Nedenfor presenteres noen potensielle lymfeknute samling planer for bakteriell infeksjonssykdommer av storfe som et utgangspunkt for etterforskningen.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies for B. abortus-infisert storfe og B. melitensis-infiserte geiter ved National Animal sykdom Center gjenopprette supramammary, prescapular og parotid lymfeknute vev , både i sliping for bakteriell nummereringen og RNA forberedelse til verten RNA expression profilering. B. abortus kan gjenopprettes regelmessig i hver av disse lymfeknuter i eksperimentelt infiserte storfe9. Tilstedeværelse av bakterier i hver av disse lymfeknute kan påvises i B. melitensis-infisert geiter til minst ni måneder etter smitte ved hjelp av RNA-baserte metoder fra våre studier (Boggiatto et al., upublisert). Salmonella Sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), og hvem lymfeknuter vært nyttig under profilering av storfe skrotter til en Salmonella prevalens10,11,12 og ville være av interesse for transcriptomic studier. E. coli O157: H7: hvem lymfeknuter (på midten tynntarm og distale tynntarmen steder) kan nettstedene til en annen utvinning av bakterier i infiserte kalver (men ikke i infiserte voksen storfe)13. Leptospirosis (Leptospira sp.): kronisk utholdenhet av bakterier er observert i lymfeknutene drenering melkekjertlene14. Mycobacterium bovis : I storfe er bakterier gjenopprettet etter eksperimentelle infeksjon fra mediastinal og tracheobronchial lymfeknutene kalver15. I tillegg blitt lymfeknute RNA benyttet for å undersøke store dyr vert Svar å virus, som svin reproduktive og åndedretts syndrom virus2. Figur 2 viser plasseringen av et delsett av disse store lymfeknuter i storfe kroppen.

Figure 2
Figur 2: Karikaturtegning som viser valgte lymfeknute steder i BIM taurus . Nummererte lymfeknuter er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I dette papiret og tilhørende video presenterer vi en protokoll for isolering av store dyr lymfeknuter for RNA studier, designet for å være informativ for molekylær biologer involvert i transcriptomic studier av store dyre-infeksjoner. Først, vi gir en oversikt over isolasjon prosedyren for lymfeknutene, bruker utvalg fra storfe og bison vev som eksempler. Sammen med denne demonstrasjon, som vist i videoen, er en arbeidsflyt for en reproduserbar vev prøvetaking RNA isolering. Neste, vi beskriver viktige hensyn for behandling av en infisert lymfeknute, med fokus på sikkerhet og konsekvens RNA kvalitet.

Utarbeidelse av RNA fra vevet med en sur fenol-guanidine isothiocyanate reagens er basert på den opprinnelige metoden Chomczynski og Sacchi16,17, med en renselse over silisium-baserte spinn kolonner i nærvær av chaotropic agenter basert på det opprinnelige arbeidet i Vogelstein og Gillespie18. Vi undersøker også muligheten for utvinning av RNA for transcriptomics fra storfe lymfeknuter bevart av alternative metoder. Til slutt, vi utforsker virkningen av variabelen tid på RNA kvaliteten i store dyr necropsies, inkludert en representant eksperiment som viser effekten av en økning i tiden mellom euthanasia og prøvetaking i gjenopprettede RNA profilen fra bison og storfe lymfeknuter. Denne artikkelen vil være nyttig ikke bare til molekylær biologer men også til veterinær forskerne begynner transcriptomic studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr obduksjon prosedyrene avbildet her dekkes godkjent IACUC protokoller ved National Animal sykdom Center, Ames, IA. Alle eksperimentene ble utført i samsvar med de godkjente retningslinjene for dyr omsorg og velferd.

1. pre-planlegging før obduksjon

  1. Før obduksjon, klargjør følgende materialer for transport til obduksjon suite:
    1. 1.5 eller 2 mL microcentrifuge rør fylt med ~ 1,0 mL av RNA bevaring løsning, i en rack eller transport beholder. Sørg for å følge produsentens retningslinjer for forholdet mellom volumet av bevaring løsningen volumet av vev.
    2. Disponibel skalpeller og ren, autoklaveres tang: ett sett for dissekere huden og et annet sett for innsamling lymfeknuter (en for hver lymph node per dyr), dermed hindre en kryss-kontaminering av huden og miljømessige flora med lymfeknute vev.
    3. 3 punch mm biopsi verktøy, obduksjon kniver, en beholder for de brukte skalpeller og biopsi verktøy, og skjærebrett eller disponibel skuffene for bruk i lymfeknute dissection.
    4. Bruk personlig verneutstyr, inkludert PPE kreves for arbeid i riktig BSL nivå for systemet.
    5. Autoclave gjenbrukbare metall verktøy, inkludert tang, i metall panner før obduksjon, bruke bestikk/tørr varene innstilling.

2. identifikasjon og utvalg av lymfeknutene i storfe og Bison

Figure 3
Figur 3 . Lymfeknuter av bovin hodet. (A) denne tegneserie bilde viser valgte lymfeknuter på hodet og halsen av BIM taurus. (B) dette bildet viser parotid lymfeknute tverrsnitt (venstre) sammenlignet med det parotid salivary kjortelen tverrsnitt (høyre). Merk forskjellen i teksturer mellom de to vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Isolasjonen av prescapular lymfeknuter hos storfe og bison
    1. Euthanize dyret (storfe eller bison i alle aldre, avhengig av eksperimentet) basert på lokale IACUC protokollen. Bekreft at ved spesifikt beskrevet i den institusjonelle IACUC-protokollen, inkludert mangelen på et hjerteslag, mangel på åndedrett og fravær av en hornhinnen refleks. Flytt dyret til obduksjon gulvet.
      Merk: Det finnes ulike metoder for Human euthanasia brukes i laboratoriepraksis dyr. Intravenøs administrasjon av pentobarbital natrium og phenytoin natrium løsning er imidlertid de vanligvis godkjent og utnyttet skjemaet. Se AVMA retningslinjene for euthanasia dyr. 19
      Advarsel: Følg alle relevante biosikkerhet protokoller for en obduksjon på vertsinstitusjonen, inkludert retningslinjene for fjerning av kryss i en punktering-bevis beholder rensing av gjenbrukbare metall kniver og tang. Denne protokollen genererer sharps avfall fra bruk av disponibel skalpeller. Bruk personlig verneutstyr som diktert av institusjonelle retningslinjene, inkludert støvler, coveralls, hansker og vernebriller.
    2. Identifisere 3 deltakere å jobbe med dyr vev.
      Merk: Her dissector 1 vil være ansvarlig for den store snitting av ønsket dyr vev dissector 2 vil gjenopprette lymfeknutene fra de forskjellige dyr delene og dissector 3 fungerer på en egen tabell isolere deler fra hver lymfeknute og overføre dem til rør med en konserveringsmiddel løsning.
    3. Begynn med å plassere dyret i lateral recumbency.
    4. Utvide skulderen ved å flytte foran lem tilbake på nivået av kneet (carpus); denne bevegelsen vil bringe skulderen tilbake og gi en enklere palpasjon lymph node. Føle etter lymfeknute "lump".
      Merk: Under sykdom forhold, lymfadenopati kan finnes, som gjør identifisering av lymfeknuter enklere, men denne prosessen kan også påvirke konsekvent, komposisjon, og arkitekturen til lymfeknute.
    5. Når funnet, og med skulder fortsatt utvidet, kan du bruke en skalpell eller obduksjon kniv for å gjøre en huden snitt langs omrisset av skulderen.
      Merk: Ikke begrense størrelsen på snitt, selv om lymfeknute er plassert via palpasjon. En større snitt gir enklere tilgang til dypere vev og gjør excision av lymfeknute lettere for dissector.
    6. Med en tang, trekke huden til å avsløre poenget med skulder og nakke muskulaturen.
      Merk: Prescapular lymfeknute er ofte funnet i subkutant fett, spesielt i overconditioned dyr.
    7. Igjen, palpate plasseringen av lymfeknute (figur 3A).
      Merk: I motsetning til subkutant fett, lymfeknute vil holde formen når palpated. I tillegg er lymfeknuter ikke sammenhengende med alle omkringliggende vev, som de er omsluttet av en tynn fibrøs kapsel.
    8. Etter finne prescapular lymfeknute, nøye analysere ut av subkutant fett, ved hjelp av en skalpell og tang, og isolere lymfeknute.
      1. Se etter en tynn fibrøs kapsel, som vist i figur 1B, for å skille mellom lymfeknute og fettvev; lymfeknuter er ikke sammenhengende med alle omkringliggende vev.
    9. Overføre lymfeknute i tabellen lymfeknute disseksjon, bruker en plast brett for vev overføringen, videre snitting.
      Merk: Det ligner utseendet på disse lymfeknuter i bison. Tilknyttede videoen viser hvordan prescapular lymfeknute som dissekert av høyre skulderen av en amerikansk bison.
  2. Isolering av parotid lymfeknuter hos storfe og bison
    1. Begynn med å plassere dyret i laterale recumbency etasje obduksjon. Finn kjeveledd (TMJ).
      1. Hvis dette er vanskelig å finne, flytte mandible langsomt og avgjøre lokaliseringen der mandible festes til skallen; Dette er TMJ.
    2. Bruke en skalpell eller obduksjon kniv, nøye lage et snitt i huden. Start innsnitt dorsal leddet og utvide den ventrally/vertikalt langs jawline.
    3. Dissekere huden bort for å avsløre subkutan vev. Det parotid salivary kjortelen vises først på grunn av sin store størrelse, lobulated overflaten utseende og rød farge.
    4. Bruke tang og skalpell, flytte det parotid salivary kjortelen til side for å finne parotid lymfeknute sitter bare skallen og mediale til det salivary kjortelen (figur 3A). Undersøke parotid lymfeknute vev for tekstur før videre behandling.
      Merk: lymfeknuter i ansiktet (parotid og submandibular) er assosiert med spyttkjertler, som kan forvirre lymfeknute isolasjon. I forhold til lymfeknuter, spyttkjertler er mye større og har en lobulated modelloverflaten. Videre på kutt overflate, spyttkjertler er homogene i naturen og viser ikke det klassiske kortikale og medullær arkitektoniske mønsteret av lymfeknuter (figur 3B).
    5. Avgiftsdirektoratet kjertel med skalpell. Overføre det til tabellen lymfeknute disseksjon, bruker en plast brett for vev overføringen, videre snitting.
  3. Isolasjonen av supramammary lymfeknuter i kvinnelige storfe og bison
    1. Plassere dyret i lateral recumbency.
    2. Heve den bakben ben for å avdekke regionen lysken og finne juret.
      Merk: I en sunn, ikke-ammende dyr, palpasjon av disse lymfeknuter kan ikke være mulig. I en ammende dyr være disse lymfeknuter opplagt caudal grensen av base i juret.
    3. Bruke en skalpell, lage et snitt bare dorsal til juret, går langs øverste benet, å avsløre supramammary kjertel.
    4. Dissekere subkutant vev og finne supramammary lymfeknute innebygd i et tynt lag av subkutant fett. Hvis ikke visuelt skilles, palpate eksponert vevet etter fast struktur i subkutant fett.
    5. Bruke tang og skalpell, nøye analysere ut lymfeknute fra fett. Overføre det til tabellen lymfeknute disseksjon, bruker en plast brett for vev overføringen, videre snitting.

3. skjæring og lagring av Lymph noder

  1. Passere isolert lymfeknutene fra dissector 2 til dissector 3 på en disseksjon tabell tilstøtende til viktigste obduksjon plass. Plass hver lymfeknute på en ny del av et skjærebrett. Pre etiketten skjærebrett i deler av lymph node, å lette mottak av flere lymfeknuter i rekkefølge. Smittsomme datautvalg, bruke engangs skuffer.
  2. Bruke tang og en engangs skalpell eller obduksjon kniv, fjerne en del av lymfeknute. Bruke en skarp kniv, lage en sagittal kutt å åpne opp lymfeknute.
  3. Undersøke interiøret lymfeknute, spesielt i prøver fra infiserte dyr, leter asymmetri, lesjoner, fargeforskjeller, etc. posten observasjoner.
  4. (Alternativ 1) Liten vev deler
    1. Bruke engangs skalpeller for å avgiftsdirektoratet stykker hver lymph node som er mindre enn 5 mm tykkelse og overføre hver brikke til en rør med en RNA bevaring løsning med ren tang.
  5. (Alternativ 2) Lymfeknute biopsi eller snitting metoder
    Merk: Biopsies eller snitting metoder, når parallelle lymfeknute deler over forskjellige noder og dyr, gir konsistens av samplet vev for en bulk RNA analyse.
    1. Kile snitting metode
      1. Etter behandlingen delen sagittal å fange celler over profilen til lymfeknute, avgiftsdirektoratet en pai-formet kile fra lymfeknute, fra senteret til ytre kapselen. For en node 2 cm i bredde (standard størrelse, se tabell 1), en kile kuttet til sentrum som er 4 mm i ytre buelengde og 5 mm tykkelse vil ha en våt vekt på ~ 100 mg.
      2. Bruker skalpell, kuttet i kilen i små biter, ikke tykkere enn 5 mm, og ca 50-100 mg hver i papir vekt.
        Merk: For konsistens, behandle alle kile stykker fra en enkelt lymph node i én omgang eller separat rør etterfulgt av RNA pooling for å gi en representant RNA profil fra lymfeknute rundt.
      3. Plass vev bitene med tang i rør som inneholder minst 10 mengder RNA bevaring løsning, sammenlignet med volumet av vev.
    2. Punch biopsi metode
      1. Velg et slag biopsi hvis målet er å samle inn bestemte deler, for eksempel bestemte follikler fra noden. Velg et samsvar med størrelsen på utvalget ønsket for samlingen. Punch biopsi verktøyene er tilgjengelige i en rekke størrelser, fra 1 til 8 mm i diameter.
      2. Visuelt finne regionene rundt utvalg i lymfeknute.
      3. Bruk verktøyet punch biopsi for å avgiftsdirektoratet delene av interesse, trykk og snu verktøyet til vev lage kjernen. Overføre vev stykket med tang til et rør som inneholder minst 10 mengder RNA bevaring løsning. Hvis tykkere enn 5 mm, bruk tang og skalpell ytterligere dele vevet inn i mindre biter.
  6. Når prøvene er overført til bevaring løsning (f.eks., RNALater), transportere dem tilbake til laboratoriet ved romtemperatur.
  7. Lagre prøver på 4 ° C over natten å tillate vev penetrasjon.
  8. Neste dag, hell av overflødig RNA konserveringsmiddel løsningen og lagre vevsprøver på-80 ° C. Fjern så mye konserveringsmiddel som mulig før frysing prøvene. Bruk et P1000 og/eller P200 brønnene tips for en effektiv fjerning av RNA konserveringsmiddel løsning.
    Advarsel: Kast decanted bevaring løsningen hensiktsmessig, basert på infeksiøs egenskaper av patogen utnyttet samt kjemiske og miljømessige farer av konserveringsmiddel løsningen som angitt i sikkerhetsdatabladet.
    Merk: Retningslinjene gitt her tilbys for RNA bevaring løsningen beskrevet i Tabellen for materiale. Se produsentens retningslinjene hvis bruker alternative bevaring løsninger.

4. prosessering fra RNA lymfeknuter

FORSIKTIG: Bruk en labfrakk, hansker og riktig øyebeskyttelse for behandlingstrinnene.

Merk: Den fenol-baserte reagensen som brukes her er beskrevet i Tabellen for materiale (og protokollen er basert på produsentens retningslinjer)20. Bruk av alternative fenol-baserte reagenser kan nødvendiggjøre en endring av prosedyren, basert på produsentens anbefalinger for det bestemte produktet kjøpt.

  1. Før tilgang til prøvene, pre aliquot kjølt (4 ° C) fenol-baserte reagensen som skal homogenisering rør (1,5 mL/rør), bruker du en pipette.
    FORSIKTIG: Fenol er giftig og etsende helsefarlig. Kloroform er giftig og helsefarlig. Fullfør behandlingstrinnene 4.1-4,9 i kjemisk avtrekksvifte, og bruke hansker for å unngå enhver kontakt med kjemikalier. I USA er kloroform en farlig avfall; Kast rør som inneholder farlig avfall i henhold til lokale og institusjonelle retningslinjer. Prosessen vevsprøver fra dyr infisert med patogener under den tilsvarende BSL-2, BSL-3 eller BSL-4 retningslinjer.
  2. Når et eksempel kan være frigjort fra microcentrifuge rør med ren tang, umiddelbart overføre ca 50-100 mg av bevarte vev til homogenisering røret med fenol-baserte reagensen.
    1. Begrense tining før tillegg til fenol-baserte reagensen. Bruke lagringsplass på tørris når flere eksempler fjernes fra fryseren for behandling.
  3. Tett cap røret, plassere den på homogenizer og homogenize prøven med en rotor-stator vev homogenizer i fenol-baserte reagensen. Fullføre behandlingen ved romtemperatur. Når fullført, sjekk for en skyet utseende slik utvalget var vellykket homogenisert; vevet skal spres til en skyet suspensjon.
    Merk: 2 min RNA utvinning innstillingen brukes (forhåndsinnstilt RNA_02_1 innstillingen for homogenizer beskrives i Tabellen for materiale, designet for frosne vev). Rotor-stator angitt i denne protokollen (se Tabell for materiale) er stor-toothed og tilpasset homogenisering av en rekke vev typer, inkludert fibrøst materiale. Innstillingen for RNA_02_01 er utviklet spesielt for frosset (i motsetning til frisk) vev. Som lymfeknuter har fibrøs bindevev komponenter, anbefales en tilsvarende optimalisert rotoren-stator homogenizer å oppnå en effektiv dissosiasjon. Se National Institute of Environmental Health Sciences21 for ytterligere informasjon om homogenisering anbefalinger.
    1. Hvis store biter av vev forblir etter homogenisering, gjenta homogenisering. For å effektivt gjenopprette RNA, må vevet bli godt atskilt.
    2. For mer fibrøs lymfeknute stykker, bruk tang og saks til å pre hogge lymfeknute stykket i flere mindre deler før overføringen til homogenisering røret. Som beskrevet i innledningen, kan det hende at lymfeknute vev fra eldre dyr mer fibrøs.
      Merk: Hvis en dobbel analyse av verten og patogen RNA, ekstra behandling (for eksempel perle homogenisering) kan være nødvendig for gjenvinning av bakteriell spesielt hvis Gram-positive patogener finnes i vev.
  4. Umiddelbart fjerne homogenisert prøven fra rørene og overføre den til RNase gratis microcentrifuge rør (2.0 mL i størrelse) med P1000 brønnene.
  5. Sentrifuge utvalget for 5 min på 12.000 x g på 4 ° C til fjern eksempel rusk. Bruke et P1000 brønnene tips, overføre nedbryting til en frisk microcentrifuge tube, etterlot pellet.
  6. Inkuber nedbryting for 5 min ved romtemperatur. Delt hvert utvalg mellom to 1,5 microcentrifuge rør.
  7. Legge til 0,2 mL kloroform per 1 mL av fenol-baserte reagensen (dvs., 0,3 mL et 1,5 mL eksempel); invertere den for hånd i 1-2 min å blande fasene, men gjør ikke vortex prøven. Inkuber det i 2 minutter ved romtemperatur.
  8. Sentrifuge det i 15 min 12 000 x g på 4 ° C.
  9. Forsiktig fjerne øvre, klart vandige fasen med brønnene tips (P1000 eller P200) som vil danne det øverste laget, uten å forstyrre interphase eller rød fenol-kloroform laget. Overføre det til en ny microcentrifuge tube.
  10. Bland det med en like volum av 100% etanol; Bland det godt ved å snu røret 4 - 5 ganger. Røret vises ofte skyet.
  11. Med brønnene tips, overføre væske til en silisium-baserte kommersielle spinn kolonne, å rense og elute RNA, følger produsentens instruksjoner22. Elute RNA generert fra ~ 50 mg vev i 50-100 µl RNase uten vann.
    Merk: Mens fenol-baserte reagens utvinning fjerner DNA i organisk fase, for nedstrøms bruk av RNA i qRT PCR og/eller RNA-sekvensering programmer, anbefales en ekstra behandling av RNA prøver med DNase.
  12. Aliquot den eluted RNA skille rør for bruk i en kvantifisering og kvalitet vurdering, å redusere noen fryse-tiner viktigste RNA prøven. Overføre rør-80 ° c for lagring.
  13. Ved lymfeknute prøver fra dyr infisert med zoonotiske patogener, spesielt på BSL-3 containment nivå, validere resulterende RNA prøven for fraværet av patogener hvis prøven vil bli flyttet til et lavere biosikkerhet nivå forvaring for kvalitet analyse, RT PCR eller RNA-sekvensering biblioteket forberedelse.
    Merk: Det er viktig å vurdere lokale forskrifter, og ved CDC (Centers for Disease Control og Prevention) inaktivering retningslinjene for arbeid med Velg agenter, er det nødvendig å validere alle inaktivering prosedyrer på forskerens lokale området.
    1. Fjerne 1/10th volumet av hver eluted RNA prøve fra trinn 4,12 (dvs., 5 µl fra 50 µl av den totale). Bruker en steril teknikk, bland prøven med 100 µl av bakterievekst kjøttkraft i en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube. Bruker en steril plast sprederen, spre RNA-kjøttkraft blandingen over overflaten på en agar plate.
      Merk: Velg en buljong type og agar plate samsvar med veksten av patogen som dyrene ble utfordret.
    2. Inkuber agar platen under betingelser gjelder for veksten av patogen som dyrene ble utfordret. Sjekk for fraværet av gjenopprettede bakterier før du fjerner prøvene fra BSL-3 kontroll.
      Merk: Den resulterende eluted RNA, etter kvantifisering og tester av integritet, er egnet for nedstrøms programmer, inkludert en RNA-sekvensering og RT PCR analyse.
  14. Vurdere RNA utvinning og renhet bruker et spektrofotometer. For å vurdere RNA kvaliteten, laste 1-2 µl av eluted RNA utvalget til spektrofotometer for en analyse. Registrere et spekter av prøven i området for ultrafiolett (UV).
    1. Fra UV spekteret, registrere A260/A280 forholdet, A260/A230 forholdet og A260 -verdien for prøven (A = absorbans).
    2. Som single-strandet RNA i en konsentrasjon av 40 µg/mL har en absorbansen 1,0 på 260 nm, beregne RNA konsentrasjon (µg/mL) ved å multiplisere den A260 x 40 for renset prøvene.
  15. Som en rask vurdering av RNA integritet, for å utelukke noen degradert eksempler fra videre analyse, bland 2 µl av hver RNA prøve med 4 µl 1,5 x formamide lasting fargestoff [95% vaskebuffer formamide, 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% (w/v) SDS] i 1,5 mL microcentrifuge rør23,24.
  16. Varme rør på 70 ° C for 1 min, og deretter overføre rør til is for 1 min.
  17. Laste prøvene å en 1% agarose gel i 1 x TBE (for en fullstendig beskrivelse av en innfødt agarose gel geleelektroforese for RNA, se Rio, Ares Jr, Hannon og Nilsen)24. Separate prøvene av standard gel geleelektroforese metoder og påvise 28S og 18S ribosomal RNA band.
  18. Følge opp gel geleelektroforese kvantitativ analyse metoder for RNA integritet fastsettelse [f.eks, en Bioanalyzer og RIN (RNA integritet nummer) analyse] som beskrevet i Representant resultater og Mueller, O. et al. 25 og Schroeder, A. et al. 26.

5. alternativ utvinning metoden fra Formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) vev

Merk: Selv om FFPE vev bevaring ikke representerer den mest robuste metoden av nukleinsyre bevaring, protokollen nedenfor kan være en måte å studere noen transcriptional endringer når andre bevarte vev er utilgjengelig.

  1. Forberede formalin reagenser vev bevaring av dispenser formalin i plastbeholdere. Vev bør bevares i formalin med forholdet mellom 20:1 formalin: vev volumet/vekten, henholdsvis.
    FORSIKTIG: Formalin er et kjent menneskelig karsinogen, og selv om ikke absolutt giftig, kronisk eksponering (vanligvis gjennom inhalert røyk) kan representere en betydelig helsefare. Tilstrekkelig ventilasjon og PPE (dvs., bruk av nitrilhansker, endres innen 15 min etter den første eksponeringen) er nødvendig å redusere helserisikoen. Se OSHA formaldehyd standard (29 CFR 1910.1048) for mer informasjon om eksponering overvåking og risiko vurdering.
    Merk: Bruke for lite formalin kan påvirke muligheten for vevet å bli fullstendig bevart når neddykket i konserveringsmiddel.
  2. Etter isolering av vevet rundt, nøye klippe vevet til mindre enn 5 mm tykkelse.
    1. Ved hjelp av pinsett, nøye dykke trimmet vevet i formalin å minimere eventuelle sprut.
      Merk: Vev bør være helt neddykket i formalin å ha en komplett fiksering. Det er viktig at alle overflater av vev er helt dekket med formalin.
  3. Når vev har vært nedsenket i formalin, tillate vev fiksering oppstår for minst 24 timer ved romtemperatur.
    Merk: Formalin trenger vev sakte, med en hastighet på 1 mm per time fra alle overflater27,28. Derfor holde tykkelsen på delene vev til mindre enn 5 mm resultater i en rask fiksering av hele vev.
  4. Etter fiksering, overføre vev til en riktig reagens for parafin innebygging.
    Merk: For eksempel vev undersøkt i dette manuskriptet ble overført til 70% etanol før innebygging.
  5. Bygge inn vev i parafin. 29
  6. Seksjon vevet til 10-80 µm tykkelse (bruk 10-20 µm hvis miRNA pakkes)29.
  7. Bruker skalpell og tang, fjerne en 40 mg vev stykke fra hver prøve å bli behandlet og plassere den i et sterilt, nuclease-fri microfuge rør.
  8. Benytte en kommersiell kit designet for deparaffinization og nukleinsyre utvinning av FFPE for ekstra RNA fra bevarte eksemplene.
    Merk: Utstyret i Tabellen for materiale utnytter xylen og etanol vasker for å fjerne parafin, et protease behandling skritt og et glassfiber filter for å rense RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruk av hensyn som presenteres i denne artikkelen (trinn 1-4 av protokollen) vil hjelpe i utvinningen av fra store dyr prøver som passer for en nedstrøms analyse i vert gene expression studier. RNA kvaliteten for nedstrøms programmer vurderes av flere standard tiltak. Spectrophotometry, A260/A280 forholdet gir et mål på protein forurensning og A260/A230 forholdet er en annen renhet vurdering som vil oppdage kjemiske forurensninger som fenol. I hvert tilfelle, prosenter av ~ 2.0 er bevis av høy kvalitet, og redusert er bevis på forurensning. Viktigere, disse forholdene gir ikke informasjon om RNA fornedrelse, som kan bli vurdert kvalitativt (trinn 4.15-4.17) og kvantitativt (trinn 4.18, som gjennom en RNA integritet nummer eller RIN score).

Det er viktig å merke at forventet kvalitetsnivået RNA utvinnes fra lymfeknute vev deler er i gjennomsnitt, lavere enn for RNA utvinnes fra storfe hvite blodlegemer prøver. I en omfattende rekke RNA utdrag fra storfe vev og linjer finner Fleige og Pfaffl30 at gjennomsnittlige RIN (RNA integritet tall målt på en Bioanalyzer) varierer mellom < 5 for jejunum og rumen vev og > 9 for hvit blod celler og corpus luteum, med lymfeknute RIN score falle i midten på gjennomsnittlig 6,9. Generelt, Fleige og Pfaffl30 Merk at solid vev produsere RIN score fra 6-8, og at vev med høyere konsentrasjoner av bindevev forevise en høyere gjennomsnittlig degradering. Tettheten av bindevev i lymfeknute, samt iboende nivået av RNases i denne vev, kan være ansvarlig for manglende evne å konsekvent gjenopprette RNA med RIN score > 9 fra lymfeknuter.

Et eksempel på en Bioanalyzer profil for RNA utvinnes fra en bison supramammary lymph node ved hjelp av metode presenteres her vises imidlertid i figur 4A, demonstrere utvinning av RNA med RIN score på 8,6 (hovedsakelig intakt og egnet for i hovedsak alle nedstrøms programmer). RNA generert fra denne prosedyren er brukt til å kunne generere biblioteker for bruk i RNA-sekvensering; denne protokollen gir vanlige isolering av RNA prøver fra bison og storfe lymfeknuter med RIN verdier > 8 (og ofte > 9). For Prøvesett av åtte utdraget RNA prøver gjennomsnittlig absorbansen forholdet på 260 nm/280 nm var 2.1 og 260 nm/230 nm var 2.1, som indikerer en lav protein forurensning og en lav forurensning med kjemikalier som fenol, henholdsvis. Gjennomsnittlig nukleinsyre utvinning fra hver utvinning var 97 ± 10 µg per ~ 100 mg eller en avkastning av ~ 1 µg RNA/mg av lymfeknute vev.

Figure 4
Figur 4 . Representant kvalitet spor viser RNA kvalitet fra utvinning metoder. (A) dette panelet viser en total RNA spor av høy kvalitet RNA generert fra en bison lymph node, bruke fremgangsmåten i dette manuskriptet. (B) dette panelet viser spor av en bovin FFPE utvalg valgt fra Tabell 4, viser svært degradert RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

På grunn av utfordringene knyttet rask isolering av vev fra store skrotter, spesielt i tilfellet utvalg fra wildlife Art, virkningen av tidsforsinkelsen mellom euthanasia og plassering av vev bitene i en RNA bevaring løsningen er potensielle bekymring i analysen. Informasjon i litteraturen om stabiliteten av RNA i lymfeknute vev, spesielt er begrenset. Derfor gir informasjon om akseptabel parametere for vev samling, var stabiliteten av RNA i bison lymfeknute etter euthanasia preget.

For dette eksperimentet, ble tid 0 ansett som dyret ble erklært død av mangel på et hjerteslag og fravær av en hornhinnen refleks. Etter transport av carcass og begynnelsen av obduksjon, ~ 15 min hadde gått før henting av første lymfeknute prøven (15-20 min var standard i våre observasjoner for gjenvinning av feltet dyr, tiden kurs vil varierer avhengig ). Lymfeknute supramammary ble identifisert, og en liten del av vev ble fjernet og vedlikeholdt ved romtemperatur. Delene ble senere tatt i ca 15 min intervaller og overført til RNA konserveringsmiddel; i time course, ble en andre eksemplar lymph node Hentet fra dyr for det andre settet med 4 tidspunkt i serien (figur 5A, lukket sirkler, figur 5C). RNA ble pakket ut parallelt fra lymfeknute bitene med metoden beskrevet ovenfor. Denne 1t eksperiment avslører at lymfeknute RNA beholdt meste av sin integritet over gang løpet, med bare små reduksjoner av RIN score på slutten av time course (figur 5B og 5 C). Tilsvarende RNA fra bovin prescapular og parotid lymfeknuter beholdt sin integritet målt ved RIN score over ~ 1 h klokkeslett kurs evaluering (figur 5C; dyret informasjonen finnes i tabell 2). I tillegg ble RNA Hentet fra supramammary lymfeknute deler som ble samlet inn 8t etter døden, holder hele seksjoner i celle kultur medier på enten romtemperatur eller på 37 ° C å simulere holder tiden i en dyr carcass. Ribosomal RNA var observerbare selv etter 8 timer holder ganger (figur 5 d).

Figure 5
Figur 5 . RNA kvalitet i bison lymfeknute prøver samlet over tid kurs etter døden. (A) dette panelet viser en eksperimentell oversikt over en 1 h klokkeslett kurs prosedyre. (B, C) Disse skjermbildene viser en undersøkelse av RNA kvalitet for prøver tatt over et 1t tid kurs fra en supramammary lymfeknute isolert fra en amerikansk bison. Gel gjenspeiler RNA denaturert i formamide og skilt på en 1% ikke-denaturing gel. Panel (C) viser endringene i RIN score for hvert utvalg. Data fra flere eksperimenter på bovin prescapular og parotid lymfeknuter er kledde som angitt. (D) dette panelet viser et eksempel på RNA gel, som gel brukes i panelet (B), for supramammary lymfeknute prøver behandlet etter 8 timer med inkubering på enten romtemperatur (Lane 1) eller på 37 ° C (Lane 2) i celle kultur medier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Disse representant funnene er konsekvent RNA stabilitet resultater for andre vev typer og kilder. Tabell 3 viser et sammendrag av resultatene av publiserte artikler som har undersøkt RNA stabilitet over pre bevaring tiden kurs. Merk at bare trender fra RIN score og/eller rRNA gel observasjon (totalt RNA) er inkludert i tabellen selv om noen papirer gir en ytterligere analyse av mRNA integritet, som gjennom bestemmelse av forholdstall på 5 vs 3 segmenter av valgte RNAs (f.eksFajardy et al.) 31. det er imidlertid viktig å huske at lengre tid mellom død og prøve bevaring kan resultere i endringer i RNA uttrykket profiler, som vist, for eksempel for placental vev31. Sammenlignet med stabil transkripsjoner, kan mer ustabile RNAs bli tømt. Derfor er det viktig å benytte en rask, strømlinjeformet arbeidsflyt for vev utvinning for å redusere forsinkelser når dyret er tilgjengelig for obduksjon, for å oppnå biologisk gyldig RNA profilene. Det ville være feil å anta at tilstedeværelsen av intakt ribosomal RNA viser fraværet av endringer i transcriptome profilen. Likevel, representant resultatene tyder på at selv med økt behandling ganger nødvendig for store dyr prøvetaking, er det mulig å forberede RNA som passer for en gene expression analyse fra lymfeknute prøver.

I tillegg ble virkningen av variabelen etter tiner tid undersøkt; samtidig er RNA utsatt for degradering fra nucleases i vevet. Kvaliteten på RNA prøvene behandlet med denne protokollen med enten 0 eller 64 min holder tid ved romtemperatur etter tining på trinn 4.1 ble målt ved en RIN resultat. Dette eksperimentet demonstrerer at protokollen er svært lite følsom for tine tiden, gjør det robust for behandling av flere eksempler (figur 6A).

Figure 6
Figur 6. Ytterligere analyse av RNA kvalitet parameterene. (A) dette panelet viser RNA kvaliteten resultater for RNA renset enten umiddelbart etter tining (0 minutter) eller holder i 64 minutter ved romtemperatur før behandling. Bars forestiller gjennomsnittet 3 vev enheter for hver tilstand, ± standardavviket. Alle vev ble lagret i en RNA konserveringsmiddel løsning før tining, som beskrevet i protokollen. (B) dette panelet viser Bioanalyzer spor av et utvalg av dårlig homogenisert lymfeknute inneholder store deler av bindevev. Den lille størrelsen på 28S og 18S toppene, i forhold til toppene i området 5-ere er tydelig. Dette kan også skyldes nedbrytning av den selv om relativt flat grunnlinjen mellom 5S området og 18S toppen er også tankevekkende dårlig utvinning; se Avraham, R. et al. 48 for ytterligere informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som en sammenligning til isolering av RNA fra lymfeknuter, ble en prøve utvinning av RNA fra FFPE hvem lymfeknute stykker fra storfe utført. Som beskrevet ovenfor, var prøvene fast for 1 uke i formalin før parafinen embedding, etterfulgt av 4 måneder av lagring i parafin ved romtemperatur. Vev ble delt inn i fem 10 µm seksjoner, og bruker FFPE utvinning prosedyren, ca 62 ng/µL av per prøve (± 14 ng/µL) ble gjenopprettet. Absorbansen forholdstall på 260 nm/280 nm gjennomsnitt 1.9, indikerer et produkt med lave nivåer av protein forurensning, selv om A260/A230 forholdstall var ugunstige (Tabell 4). Merk at RIN score observert for disse prøvene var svært lav (< 2), som indikerer en nedbrytning av RNA produktene (Tabell 4; Figur 4B), samsvar med beskrivelse av Srinivasan et al. 45. i analyser utnytte qPCR, vanligvis små seksjoner av RNA, eller mer spesifikt cDNA (< 200 bp), er forsterket. Derfor forsterkning av små produkter kan fortsatt oppstå fra degradert prøver og qPCR analyse kan utføres. For eksempel var det mulig å forsterke et segment av ribosomal protein S9 (RPS9) utskrift fra prøvene FFPE-utvinnes av qPCR. CT verdiene var konsekvent over prøvene og gjennomsnitt 19,2 ± 1.8. Holde inne sinn begrensningene som finnes når benytter FFPE forberedt utvalgene, men, som større produkter, ikke nødvendigvis finnes, og nedbrytning ikke har oppstått på en jevn hastighet over alle prøvene. Derfor dette materialet kan brukes til studier med advarsler, men betydelig begrensninger finnes for nedstrøms programmer som RNA-sekvensering.

Lymph nodetype Beliggenhet Lengde Bredde Regioner drenert av noder
Prescapular Bare medialt til skulderleddet; innebygd i subkutant fett og under et lag av muskler 1-10 cm 1,5-2 cm Huden på halsen, skulder; og hud, muskler og ledd av lavere thorax lem (ref. 8)
Prefemoral (også kalt precrural) Bare dorsal og mediale til kveler, ca 12-15 cm over patella 8-10 cm 2,5 cm Huden av bekken lem, magen og caudal deler av thorax (ref. 8)
Retropharyngeal Funnet i midtlinjen dorsal til pharynx 4-5 cm 2-3.5 cm Tungen, slimhinner munnhulen, tannkjøtt, lepper, harde ganen, spyttkjertler, de fleste musklene i nakken
Parodisk Ligger subcutaneously ventrale til kjeveledd, caudal til masseter muskel (ref. 8) 6-9 cm 2-3 cm Hud, subcutis, de fleste musklene i hodet, musklene i øyet og øret, øyelokk, lacrimal kjertel, rostral del av nesehulen
Submandibular (kan være 1-3 dag) Ligger subcutaneously på den mediale delen av vinkelen på mandible, forbundet med spyttkjertler 3-4 cm 2-3 cm Snuten, lepper, kinn, harde ganen, rostral del av nesehulen, spissen av tungen, hud og muskel av hodet (ref. 8)
Supramammary (kvinnelige overfladisk lysken, vanligvis 2 tilstede) Fant caudally og ytterst i forhold til brystkjertlene 6 til 10 cm Udder, vulva, vestibylen i skjeden, hud på medial og caudal aspekter av låret, mediale overflaten av beinet
Scrotal (mannlig versjon av overfladiske lysken) Nedenfor prepublic sene i et lag av fett rundt halsen på pungen 3-6 cm Scrotum og prepuce penis

Tabell 1. Oversikt over bovin overfladisk lymfeknuter.

Dyr beskrivelse Beliggenhet i manuskript Alder sex Helsetilstand
Filmet Bison bison Bison i video - lymfeknute utvinning 5-6 yo Kvinne Sunn
Filmet Bos taurus Storfe i video - lymfeknute utvinning 7-8 yo Kastrert mann Sunn
Bison bison for RNA stabilitet studier Fig. 5A-C 5-6 yo Kvinne Sunn
BIM taurus A for RNA stabilitet studier Fig. 5C, Fig. 6A 7-8 yo Kastrert mann Sunn
BIM taurus B for RNA stabilitet studier Fig. 5C 7-8 yo Kastrert mann Sunn
BIM taurus for FFPE kvalitet studie Tabell 4, Fig. 4B 0,5 yo Kastrert mann Sunn (kontroll fra O157: H7 infeksjon studie)
Merk at metodene som er brukt på flere ekstra storfe, bison og geit lymfeknute prøver, utover de som er uthevet her.
I tillegg vi brukte den samme metodikken på lymfeknute fra en 1,5 Mo gamle kvinnelige kalv.

Tabell 2. Egenskaper av dyr i pilotstudier.

Vev Type Bevaring metoden Holde forhold Fornedrelse konklusjon Referanse
Storfe adipose, skjelettlidelser muskler, lever Fest frysing (flytende N2) 4 ° C, vakuum pakket vev Muskel RNA mer stabil (selv til åtte dager lagringsplass); Liggende under adipose og lever stabil hovedsakelig til 24 h. som vurdert ved rRNA band Bahar et al. (2007)32
Menneskelige kolon, tykktarmskreft RNA bevaring løsning Romtemp. RIN bevart for 2 h., men delsett av gener Vis endringer i uttrykk fra 0,5-2 h. Yamagishi et al. (2014)33
Musen leveren, milt RNA bevaring løsning eller snapin frysing (tørris slurry) Inne i musen carcass (37 ° C) Milt prøvene var stabil ut til 1,5 t; leveren eksempler vist tidligere degradering (24% reduksjon i RIN 105 minutter.) Choi et al. (2016)34
Musen leveren Ingen (Homogenized friskt i guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform) 25 ° C, 37 ° C Begrenset fornedrelse ut til 4 h. ved 25 ° C, men omfattende fornedrelse ved 37 ° C i 4 h. (som observert bruker RIN score). Almeida et al. (2004)35
Menneskets ileum RNA bevaring løsning eller fest fryse 4 ° C, 37 ° C Generelt stabil på 1,5 h. på 37 ° C; Stabil ut til 6 h. på 4 ° C (som observert bruker RIN score).  Merk at forfatterne gir også et sammendrag av valgte RNA stabilitet i tabellen S1 som kan tjene som en ekstra referanse for dem interessert i videre vurdering av vev RNA integritet litteratur. Lee et al. (2015)36
Menneskelige leveren Fest (flytende N2 eller isopentane) Romtemp. Fornedrelse observert på 1 h. (opptil 0,85 ΔRIN); mer fornedrelse i mindre utvalg av leveren enn i større prøver. Kap et al. (2015)37
Menneskelige tykktarmskreft Fest frysing (flytende N2/isopentane) 4 ° C Fornedrelse observert av 1t.; RIN score på bare 4,2 etter 90 min. forsinkelse i iskaldt tid Hong et al. (2010)38
Menneskelige leveren RNA bevaring løsning, også flash fryse (væske N2) Romtemp, 4 ° C Prøvene var stabile selv ut 1 d. på is; fornedrelse observert etter 1 d. ved romtemperatur. (men ikke etter 3 h.; som observert bruker RIN score) Lee et al. (2013)39
Hest adipose, skjelettlidelser muskel Fest frysing (flytende N2) 13 ° C Forfattere anbefaler at beste integritet for muskel var innen 2 t.; adipose bevaring i 0,5 h. anbefalt av forfattere (som observert av rRNA gel utseende) Morrison et al. (2014)40
Laks hjerne, nyre, lever, muskel RNA bevaring løsning Romtemp. Hjernen RNA stabil til 4-8 h., nyre og muskel exhbiit dårligere av 8 h. (gel, RIN stillingen begge brukes) Seear & Sweeney (2008)41
Kanin bindevev (leddbånd, sene, brusk) Fest frysing (flytende N2) 4 ° C, romtemp. Ingen "åpen" fornedrelse ut til 96 h. postmortem, som observert av rRNA gel utseende Martsjuk et al. (1998)42
Rotte hjernen, lungene, hjertet, lever Vises pakkes fersk I rotte carcass holdt i 20 ° C inkubator Høyeste RNA stabilitet observert i hjernen (kunne observere rRNA bandene ut 7 dager postmortem, selv om fornedrelse var til stede), moderat stabilitet i lungene og hjertet, lav stabilitet i leveren; som observert av rRNA gel utseende Inoue et al. (2002)43
Menneskelige mandel, kolon Med og uten RNA bevaring løsning, deretter snapin-frosset Romtemp. (22 ° C), 4 ° C RNA bevaring løsning, kaldt saltvann eller is (0 ° C) Stabil til 16 h. på isen eller i RNA bevaring løsning; liten nedbrytning på 6 eller 16 h. i kalde saltvann eller RT (målt ved RIN score) Micke et al. (2006)44

Tabell 3. Utvalg av tidligere funn på RNA stabilitet i evaluering av vevsprøver. Oppføringene representerer valgte manuskripter fra litteraturen om RNA stabilitet, med en rekke vev typer representert, inkludert Trouble, menneskelige biopsi, og veterinary eksempler. Det finnes metoder for bevaring, lagring før utvinning modus og en kort oppsummering av resultatene for hvert eksempel. Medmindre annet er opplyst, prøvene ble lagret på forhold mellom is 37 ° C, etterfulgt av snapin frysing eller en infusjon med RNA bevaring løsning, etter tid kurs (med andre ord, stabilitet var ikke blir målt i nærvær av en RNA bevaring løsning under incubation, medmindre).

Prøve-ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
En260/A280 1.96 1,98 1,98 1.91 1,98 1.89 1.89 1.91 1.9 1.84 1.84 1.97
En260/A230 0,67 0.14 0,19 0.26 0,61 0.69 1.33 0,11 0,21 0,39 0,1 0.44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabell 4. Representant resultat RNA isolert fra bovin FFPE hvem lymfeknuter. Tabellen viser resultatene fra Spektrofotometri og kvalitets analyser av FFPE bovin lymfeknute prøver behandles ved hjelp av metoden beskrevet i dette manuskriptet. I hvert tilfelle gjenspeiler resultatene sterkt forringet RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fleste transcriptomic studier og de tilknyttede protokollene som fokuserer på mus, rotte eller evaluering prøver fra mennesker. Men gi undersøkelser i husdyr og ville dyr en rekke muligheter for karakterisering av immun respons på sykdom, både som gjeldende veterinærmedisin og, i forhold til zoonotiske sykdommer, menneskelige offentlig helse. Denne protokollen gitt en disposisjon av nøkkelfaktorer for høy integritet RNA utvinning fra vev fra store dyr, som storfe, bison, geiter og sauer. Størrelsen på dyr, i tillegg til betingelsene for prøvetaking, gjør utvinning en mer omfattende prosess, med en lengre post mortem saksbehandlingstid enn for musen lymfeknute utvinning. Tilsvarende er nødvendiggjør den store størrelsen på disse lymfeknuter protokoller som gjenopprette parallelle prøver fra forskjellige dyr samt eksempler som representant for de immunologiske/patologiske forandringene i lymfeknute. Forslag til prøvetaking i denne protokollen gir utvinning av intakt RNA så vel som for representant profiler basert inndeling av lymfeknute.

Som en demonstrasjon av betydningen av en standardisert utvalg strategi og protokollen, som presenteres her, undersøkte vi 25 papirer fra PubMed sentral database som preget transcriptomes av husdyr lymfeknuter. En papir angitt av behandling av en stor lymfeknute del samtidig, en diskutert bestemt laser fange microdissection metoder, en nevnt at en "representativt utvalg" ble samlet inn fra lymfeknute, og bare ett av papirene46 angitt at stykke lymfeknute samlet (10 mm3 i størrelse) inkludert både cortex og forlengede. Mens andre papirer bemerket at små utvalg (vanligvis 30-100 mg) ble behandlet for RNA analyse, nevner 84% av avisene ikke en prøvetaking strategi for samlingen av brikkene vev. Som RNA-sekvensering er fortsatt relativt dyrt, analyse av inndelingene per lymfeknute er usannsynlig å bli økonomisk levedyktige i de fleste tilfeller, spesielt siden biologiske Repliker prøver vanligvis prioriteres for statistisk analyse. Ved å samle et utvalg over en kile en sagittally inndelt lymph node, fanges RNA fra lymfeknute regioner rik på ulike immunceller i alle prøvene. Denne protokollen kan derfor tjene som en referanse for en dokumentert og reproduserbar prøvetaking strategi for lymfeknute transcriptomics.

I utarbeidelsen av RNA fra vev er det flere viktige trinnene for fremgangsmåter for beslutningstaking. Først er metodologiske litteratur blandet bruk av bevaring løsninger vs bruk av flash-frosne vev eksempler (og påfølgende kald temperatur sliping). Spesielt ved store dyr necropsies er det flere fremgangsmåter for fordeler til bruk av en bevaring løsning, som innlemmet i denne protokollen. Først kan vevsprøver lagres under obduksjon i bevaring løsning uten å måtte øyeblikkelig overføre rør til flytende nitrogen. Andre, bruk av en bevaring løsning gir ekstra beskyttelse før prøve behandling for RNA utvinning, spesielt hvis prøven kort eller delvis thaws før homogenisering. Resultatene i figur 6A indikerer at denne beskyttende effekten strekker til lymfeknute vev. I kontrast, må flash-frosne prøvene opprettholdes i frosne staten inntil øyeblikk homogenisering i en fenol inneholder buffer. Til slutt, for feltet necropsies dyr, hvor flytende nitrogen ikke er lett tilgjengelig, prøver kan lagres i bevaring løsning før de kan returneres til laboratoriet.

Flere fordeler av molekylære komponentene i prosedyren presenteres her inkluderer tilstedeværelsen av fenol under første vev behandling, som fungerer som et desinfeksjonsmiddel under aerosol-generering av homogenisering for prøver fra infiserte dyr og bruk av spin kolonnen prosedyren for å fjerne gjenværende fenol og guanidine isothiocyanate fra utvalget. Representant resultatene viser at fremgangsmåten genererer høy kvalitet RNA som vurdert av en260/A280 og en260/A230 prosenter, gel geleelektroforese og RIN score og er robuste mot tiden kurs utfordringer husdyr og dyreliv prøvetaking. Sammenkoblingen av vev bevaring (f.eksi RNALater), homogenisering fenol-baserte reagenser (f.eksTRIzol), og silica kolonnen rensing har blitt vellykket benyttet i litteraturen til profil gene expression mønstre i ovine abomasal lymfeknuter infisert med gastrointestinal nematoder46 og storfe lymfeknuter infisert med en herpesvirus47, med RIN score større enn 8 og større enn 7 over alle prøver, henholdsvis.

Følgende variabler, som er standard for RNA behandling, bør vurderes i en resulterende RNA med uakseptabelt RIN score for nedstrøms,: den samlede tiden obduksjon, tilstanden av vev, behandling/tidsforsinkelsen etter tine, teknikken under RNA utvinning og RNA håndtering etter utvinning. Totalen behandling tid evaluering bør vurderes spesielt i tilfellet vev fra dyr funnet død, i motsetning til euthanized dyr. Som beskrevet ovenfor, RNA er relativt stabil i lymfeknuter, men forsinkelser i behandling kan føre til fornedrelse, spesielt for ustabil transkripsjoner. En forvirrende tid variabel kan finnes hvis prøver sammenlignes mellom skrotter som har vært i feltet for ulike mengder tid. Tilstanden til vev bør vurderes, fordi nedbrytning av vev integritet, på grunn av patologisk endringer forbundet med infeksjon, kan redusere RNA stabiliteten. For eksempel lavere RNA kvalitet er observert i placentome av Brucella-infisert dyr etter abort (Boggiatto et al., innsendt). Behandling/forsinkelse etter Tin dempet ved bruk av bevaring løsninger, som beskrevet i denne protokollen. Være sikker på at tykkelsen på vev bitene er lavt nok til at en riktig og rask gjennomtrengning av konserveringsmiddel løsningen i vev (< 5 mm tykkelse bruker konserveringsmiddel nevnt i Tabellen for materiale). Under RNA utvinning, bufferne skal RNase-fri og kontakt med hansker og andre forurenset elementer (RNases finnes på huden) må unngås. For sliping av lymfeknute vev, den største kilden til potensielle RNases vil være i vevet seg, men det er fordelaktig å redusere innføring av miljøgifter i alle stadier av prosedyren. For å håndtere RNA etter utvinning, som beskrevet i protokollen, aliquot RNA eksempler i rør før frysing og lagring ved-80° C, eliminere behovet for å fryse-Tin prøvene for en kvalitet og kvantitet analyse.

Lav avkastning i prosedyren, i tillegg til skyldes nedbrytning av RNA prøver, kan skyldes en ineffektiv homogenisering lymfeknute vev på trinn 4,3 i protokollen. Merk at inkubering i en RNA bevaring kan endre strukturen av vev (økning fasthet), selv om de fleste lymfeknute vev dissosiert effektivt i piloten går med den store toothed rotor-stator dissociator beskrevet her. Som nevnt i trinn 4.3.1, homogenisering i fenol-baserte reagens skal gjentas hvis dissosiasjon er ufullstendig. Morter og pistil sliping, er etterfulgt av en rørets på bakken utvalget i en fenol-baserte reagens, et annet alternativ for laboratorier uten tilgang til en homogenizer med disse spesifikasjonene. Men presenterer en homogenisering i disponibel rør flere potensielle fordeler over sliping av frossent i en morter, inkludert en mer gjennomførbart og kortere arbeidsflyt for å behandle flere eksempler, et fravær av prøven tap ved sliping , nei rengjøring og noen potensielle kontakt med drevet prøver, i vev fra infiserte dyr.

Avraham et al. 48 beskriver at en stor 5S RNA topp i det endelige RNA produktet, sammen med en lav utvinning av 28S og 18S ribosomal RNAs, kan være et tegn på en ufullstendig lysis av celler (som i sin tur for lymfeknute behandling, kan være på grunn av en ufullstendig avstandtagen for tiss UE). Figur 6B gir et eksempel på en RNA-profil generert av bovin parotid lymfeknute som var veldig høyt i bindevev og ikke homogenize effektivt. RNA gir bør beregnes og overvåket over prøver et sett for analyse for å bekrefte at analog inngang hentes per mg av vev og eksempler for direkte sammenligning av RNA-sekvensering skal behandles i kjørselen, bruker samme homogenisering strategi for alle prøvene. Merk at kile prøvetaking tilnærmingen også hjelpemidler unngå en samling av et utvalg som er utelukkende et område av omfattende bindevev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre. All forskning er finansiert med intramural midler fra det amerikanske Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Alle referanser til bestemte produkter tilbys for eksperimentell reproduserbarhet og representerer ikke godkjenning av disse produktene av den føderale regjeringen.

Acknowledgments

Forfatterne gjerne takke James Fosse for sitt utmerkede arbeid på alle musikkvideoer og videobehandling; Michael Marti for sitt gode arbeid i generasjon digitalisert storfe bilder; Lilia Walther hennes hjelp med RNA utvinning og Bioanalyzer kjører; Mitch Palmer og Carly Kanipe for nyttig gjennomgang og tilbakemelding på lymfeknute bilder; og dyr omsorg og veterinary stab på National Animal sykdom Center for alle sine hardt arbeid og hjelp med husdyrhold og forberedelse til necropsies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459 (2015).
  2. Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
  3. Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
  4. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  5. Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
  6. Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
  7. Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
  8. Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
  9. Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
  10. Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
  11. Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
  12. Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
  13. Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
  14. Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
  15. Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
  16. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  18. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
  19. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
  20. TRIzol Reagent Manual. , ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
  21. Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
  22. PureLink RNA Mini Kit Protocol . , Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
  23. RNA Gel-loading Buffer. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
  24. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  25. Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
  26. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  27. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. China. (2012).
  28. Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
  29. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  30. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
  31. Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
  32. Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
  33. Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
  34. Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391 (2016).
  35. Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
  36. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214 (2015).
  37. Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
  38. Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
  39. Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
  40. Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810 (2014).
  41. Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
  42. Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
  43. Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
  44. Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
  45. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  46. Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823 (2015).
  47. Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
  48. Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 135 RNA lymfeknute storfe bison transcriptome RNA kvalitet Husdyr
Innsamling og behandling av Lymph noder fra store dyr for RNA analyse: forbereder lymfeknute Transcriptomic studier av store dyrearter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M.,… More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter