Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Abstract

Büyük hayvanlar (hayvancılık ve yaban hayatının) Hayvansal patojenler, brusella, Mycobacterium bovis, Salmonellave E. coli, dahil olmak üzere önemli rezervuar hizmet ve Patogenez çalışma için yararlıdır ve/veya doğal ana bakteri yayılmasını. Lenf düğümleri konak immün yanıt anahtar işlevi ile gen ekspresyonu hücrelerdeki zamansal değişimler enfeksiyon boyunca değerlendirmek için aşağı akım transcriptomic analizleri, RNA'ın potansiyel bir kaynak olarak lenf nodu doku hizmet. Bu makale işlemi lenf nodu koleksiyonu, doku örnekleme ve aşağı akım RNA ve Hayvancılık, işleme sığır (Bos Toros) Amerikan bizonu (bizon bizon sağlanan ek örnekler ile bir model olarak kullanarak genel bir bakış sunar ). Protokol vücutta konumunu, kimlik ve lenf nodlarının birden çok anahtar site kaldırma hakkında bilgi içerir. Ayrıca, bir biyopsi örnekleme yöntem örnekleme bir tutarlılık için birden çok hayvanlar arasında sağlayan sunulur. RNA RNA-sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım yöntemleri için uygun üretimi dahil olmak üzere örnek korunması için birkaç önemli noktalar ele alınmaktadır. Büyük hayvan vs fare saat ders çalışmalarında doğal uzun gecikmeler nedeniyle bozulması bağlamında incelenmesi, bu doku türü zaman tabii açıklamak için bizon ve sığır lenf nodu doku temsilcisi sonuçları sunulmuştur RNA bozulması diğer dokularda önceki metodolojik çalışma. Genel olarak, bu iletişim kuralı transcriptome projeler büyük hayvan örnekleri üzerinde başlayan her iki veteriner araştırmacılar ve moleküler biyologlar vivo içinde doku örnekleme ve vitro işleme teknikleri öğrenmeye ilgi için faydalı olacaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transcriptome lenf nodlarının analizini RNA-sıralama patojenler çeşitli hayvanların bağışıklık yanıtı karakterize etmek için fırsat sunuyor. Bu yöntemi yaygın olarak fareler kullanılmıştır iken, analizleri daha büyük memeliler1,2son zamanlarda genişleyen. Hayvancılık/büyük hayvan lenf düğümleri bir enfeksiyon, sadece aşı veya genetik yatkınlık çalışmaları onların kullanım için ve hedefleri için ilaç geliştirme, aynı zamanda insan çalışmaları için model sistemleri olarak tanımlanması için ana bilgisayar yanıt karakterize için kullanılabilir Hayvansal hastalıklar. Örneğin, brusella (etkileri dünya çapında her yıl yarım milyon kişi bir Hayvansal bakteriyel hastalığı) olması durumunda, artmasına rağmen önemli ölçüde maliyeti, çalışmalarda koyun veya keçi insan enfeksiyonu ve insan aşı daha alakalı vardır gelişme laboratuvar hayvan modellere kıyasla. Retiküloendotelyal sistem enfeksiyonu ama değil karakteristik klinik belirtiler3. fare enfeksiyon modelleri özetlemek

Laboratuvar hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük hayvan deneyleri içinde işlemi mutlaka hasat doku ötenazi korunması için potansiyel bir meydan okuma sunuyor doku koleksiyonu arasında daha uzun bir gecikme oluşur. yüksek kaliteli RNA. Sağlam RNA biyolojik ilgili transcriptomic veri üretimi için önemlidir. Yüksek kaliteli RNA doku örneklerinden nesil koruma tesislerinde özellikle kritik büyük hayvan patojen araştırmalar yapılır. Bu tür çalışmalar sadece onaylı imkanları ve yüksek eğitimli personel gerektirir ama hangi iş bağlı olarak, on binlerce dolar yüzlerce arasında olabilir önemli finansal maliyetler de taşımak gerçekleştirmek doğal olarak daha zordur. Bu tür çalışmalar da bir disiplinler arası işbirliği ve onların karmaşıklık ekleyerek onların tamamlanması için disiplinler arası bilgi içerir. Bu nedenle, üzerinde eğitim, geliştirilmesi ve bağlılık bir aerodinamik sistemi örnek toplanması ve korunması için önemli yararları sağlar dokulara aşağı akım Moleküler çalışmalar için enfekte hayvan--dan.

Daha büyük lenf düğümleri topluluğu için fare lenf nodlarının örnekleme benzer karşılaştırıldığında doku koleksiyonu için ek sorunlar sunar. Örnek eksizyon için hazırlık ilgili iç yapılarını da içeren lenf nodu anatomisi temel bir anlayış gerektirir. Bir lenf nodu yapısını lenfoid lobules lenf ile dolu sinüsler çevrili oluşmaktadır. Bu yapılar içinde sert, fibröz kapsül içine alınır. 4 bir lenfoid kulak "temel anatomik ve fonksiyonel lenf nodu" birimidir ve köklerinin, derin kortikal bir birim ve medüller kordlar ve sinüsler4 (resim 1A) oluşur. B ve T lenfositler ev köklerinin ve derin kortikal birimleri, sırasıyla. Bu yapıların bir 3D iskele sağlamak ve lenfositler ve antijen veya antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak.

Onlar daha yoğun bir retiküler meshwork içeren ve daha hassas bir retiküler meshwork oluşmaktadır ve hafif görünür sinüsler daha koyu görünmesini fena halde, köklerinin ve derin kortikal birimler kesilmiş yüzeyine belirlenebilir (Şekil 1B). Geleneksel olarak, patologlar lenf düğümleri olarak yüzeysel korteks (folikül), paracortex (derin kortikal adet) ve medulla (medüller kordlar ve sinüsler) bölgelerinde bakın. Uygun bir inceleme, tüm üç bölgeler olarak en iyi uygulama rutin patolojik muayene yönergeler lenf düğümleri5için kabul edilmiştir. Tutarlılık, boyutu ve rengi tek bir hayvan içinde bile lenf nodlarının önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Hayvan yaşlandıkça, onların lenf düğümleri boyutu küçülür ve bu genç hayvanlar daha sıkı hale, genellikle kendi bağ dokusu ve lenfoid normal bir azalma artış nedeniyle6,7yapısı için eğiliminde olacaktır.

Figure 1
Şekil 1. Lenf nodu anatomisi. (A) Bu çizgi film görüntü anahtar yapıları betimleyen lenf nodu anatomisi gösterir. (B) bu hala görüntü kesit içinde kesilmiş sığır bir lenf nodu gösterir. Çıplak gözle görülebilir ilgili yapılar/katmanları vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Deneysel soru bağlı olarak farklı lenf düğümleri toplama ve analiz için ilgi olacaktır. Periferik lenf düğümleri derin subkutan dokuda bulunan bunlar. Sığır, periferik veya yüzeysel lenf düğümleri genellikle klinik ve deneysel uygulamada kullanılan parotid, çene, retropharyngeal, prescapular, prefemoral dahil (precrural) ve yüzeysel kasık (supramammary içinde dişi, erkeklerde testis) () Şekil 2). Tablo 1' de, anahtar yüzeysel lenf düğümleri, özelliklerini sığır sistem8' de açıklandığı gibi özetlenmiştir. Aşağıda, bazı potansiyel lenf nodu toplama planları sığır bulaşıcı bakteriyel hastalıklar için soruşturma için bir başlangıç noktası olarak sunulmuştur.

Brusella abortus/brusella melitensis: Standart necropsies B. abortusiçin-enfekte sığır ve B. melitensis-virüslü keçi ulusal hayvan hastalığı Merkezi kurtarmak supramammary, prescapular ve parotid lenf nodu doku , hem ana bilgisayar RNA ifade profil oluşturma için RNA hazırlık ve bakteriyel numaralandırma için dövmek icin. B. abortus düzenli olarak her deneysel olarak enfekte sığır9. bu lenf düğümlerinin elde edilebilir Bu lenf nodu türlerinin her biri bakteri varlığı içinde B. melitensistespit edilebilir-enfekte keçi kadar düşük çalışmalarımız (yayınlanmamış Boggiatto vd.,) RNA tabanlı yöntemlerini kullanarak en az dokuz ay sonrası enfeksiyon. Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), ve mezenterik lenf düğümleri-si olmak be yararlı sığır karkas Salmonella yaygınlık10,11,12 profilleme sırasında ve transcriptomic çalışmalar için potansiyel ilgi olacak. E. coli O157: H7: mezenterik lenf düğümleri (at orta ince bağırsak ve distal ince bağırsak mekanlar) bakteriler enfekte buzağı (ancak değil enfekte yetişkin sığır)13ara sıra bir kurtarma siteleri olabilir. Leptospirosis (Leptospira sp.): bakterilerin kronik bir sebat meme bezi14drenaj lenf düğümleri gözlenmiştir. Mycobacterium bovis : Sığır, bakteri trakeobronşiyal ve mediastinal lenf düğümleri kurtarılan sonrası deneysel enfeksiyondan buzağı15olmuştur. Ayrıca, lenf nodu RNA virüsleri, domuz üreme ve solunum Sendromu virüs2gibi büyük hayvan ana bilgisayar yanıt incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 bir alt sığır vücuttaki bu büyük lenf düğümlerinin konumunu gösteriyor.

Figure 2
Resim 2: Çizgi film seçilen lenf nodu yerlerde tasvir Bos Toros . Numaralandırılmış lenf düğümleri açıklamalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu kağıt ve ilişkili video, biz büyük hayvan lenf düğümleri moleküler biyologlar büyük hayvan enfeksiyonları transcriptomic çalışmalarda yer için bilgilendirici olacak şekilde RNA etütler yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. İlk olarak, biz genel bir bilgi yalıtım yordamı lenf düğümleri için örnekleme sığır ve bizon dokulara gelen örnek olarak kullanarak sağlar. Bu gösteri ile videoda gösterildiği eşleştirilmiş, RNA izolasyonu için tekrarlanabilir doku örnekleme için iş akışı olduğunu. Ardından, güvenlik, tutarlılık ve RNA kalite odaklı bir virüslü bir lenf düğümünün işlenmesi için önemli hususlar açıklanmaktadır.

RNA hazırlanması ile bir acidified fenol-guanidin isothiocyanate reaktif dokusundan Chomczynski ve Sacchi16,17, silis tabanlı spin sütunlar varlığı üzerinde bir arıtma ile orijinal yöntemine dayalı chaotropic ajanlar Vogelstein ve Gillespie18özgün çalışmasına dayanmaktadır. Biz de sığır lenf bezleri alternatif yöntemler tarafından korunmuş transcriptomics için RNA'ın kurtarma için potansiyel incelemek. Son olarak, biz ötenazi ve örnekleme bizon kurtarılan RNA profilden üzerinde arasında bir artış etkisini gösteren temsili bir deney dahil olmak üzere büyük hayvan Nekropsi RNA kalitesinde zaman değişken etkisini keşfedebilirsiniz ve sığır lenf bezleri. Bu makalede sadece moleküler biyologlar ama da için veteriner araştırmacılar transcriptomic çalışmalar başlıyor işe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada tasvir hayvan Nekropsi yordamlar ulusal hayvan hastalığı Merkezi, Ames, İçişleri onaylı IACUC protokolleri altında kaplıdır Tüm deneylerin hayvan bakımı ve refah için onaylanmış yönergelere uygun olarak yapılmıştır.

1. önce Nekropsi ön planlama

  1. Nekropsi önce taşınmaya Nekropsi suite aşağıdaki belgeleri hazırlayın:
    1. 1.5 veya 2 mL microcentrifuge tüpler ile dolu ~ 1.0 mL RNA koruma çözeltisi, bir raf veya taşıma kap. Doku hacmi koruma çözümü hacmi oranı için üreticinin yönergeleri izleyin emin olun.
    2. Tek kullanımlık neşter ve forseps temiz, autoclaved: bir set deri ve lenf düğümleri (bir hayvan başına her lenf nodu), toplamak için farklı bir küme dissekan için böylece çapraz bulaşma deri ve çevre lenf nodu Flora'yla önleme doku.
    3. 3 mm kullanılan neşter ve biyopsi araçları ve kesme tahtaları "Sharps" kapsayıcısı veya tek kullanımlık kanalları lenf nodu diseksiyonu kullanımda için biyopsi araçları, Nekropsi bıçaklar, yumruk.
    4. PPE sistemi için uygun BSL düzeyde çalışması için gerekli dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    5. Forseps, ayarlama aletleri/kuru mallar kullanarak Nekropsi önce tavada metal otoklav yeniden kullanılabilir metal araçlar içerir.

2. kimlik ve örnekleme sığır ve Bison lenf düğümlerinin

Figure 3
Şekil 3 . Sığır baş ve boyun lenf düğümlerinin. Baş ve boyun BosToroslar (A) Bu çizgi film görüntü gösterir seçili lenf düğümleri. (B) bu (sağda) kesit kesit (parotid tükrük bezi ile karşılaştırıldığında sol) parotid lenf düğümünde gösterilir. Dokular iki doku türleri arasındaki farka dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Yalıtım sığır ve bizon prescapular lenf düğümlerinin
    1. Ötenazi yerel IACUC protokolüne dayanan hayvan (sığır veya bison deney için uygun herhangi bir yaş). Özellikle bir kalp atışı eksikliği, solunum yetersizliği ve Korneal refleks yokluğu da dahil olmak üzere kurumsal IACUC protokolünde açıklanan yöntemler tarafından ölüm onaylayın. Hayvan Nekropsi yere taşıyın.
      Not: İnsancıl ötenazi büyük hayvanlar laboratuvar uygulamada kullanılan çeşitli yöntemleri vardır. Ancak, intravenöz Fentobarbital sodyum ve Fenitoin Sodyum çözüm en yaygın olarak onaylanmış ve formu kullanılan bir ilçedir. Travma yönergelere hayvanlara ötenazi için başvurun. 19
      Uyarı: tüm ilgili Biyogüvenlik iletişim kuralları için bir delik geçirmez konteyner ve yeniden kullanılabilir metal bıçak ve forseps dekontaminasyonu "Sharps" güvenli bertarafı için yönergeleri de dahil olmak üzere ana bilgisayar Kurumu Nekropsi izleyin. Bu iletişim kuralı tek kullanımlık neşter kullanımından "Sharps" atık üretir. Kişisel koruyucu donanım çizme, Tulum, eldiven ve göz koruma da dahil olmak üzere kurumsal kurallar tarafından dikte edildiği gibi giyin.
    2. Hayvan dokuları üzerinde çalışmak için 3 katılımcıları tanımlayın.
      Not: Burada, tetkik 1 sorumlu büyük ölçekli istenen hayvan dokuları kesit, tetkik 2 farklı hayvan bölümlerden lenf düğümleri kurtarmak ve tetkik 3 ayrı bir masada her lenf nodu bölümlerinden ayırmak için çalışacak ve Onları tüpler koruyucu bir çözüm ile aktarın.
    3. Yanal recumbency hayvan yerleştirerek başlayın.
    4. Açık bacak diz (carpus); düzeyinde geri hareket ettirerek omuz genişletme Bu hareket omuz geri getirmek ve lenf nodu daha kolay bir palpasyonla için izin verir. Lenf nodu "yumru" varlığı için hissediyorum.
      Not: hastalık koşullarında lenfadenopati lenf düğümleri tanımlaması daha kolay kılan mevcut, olabilir, ama bu işlem tutarlılık, kompozisyon ve lenf nodu mimarisini de etkileyebilir.
    5. Yer alan bir kez ve hala genişletilmiş omuz ile bir neşter ya da Nekropsi bıçak anahat omuz boyunca bir cilt kesi yapmak için kullanın.
      Not: lenf nodu bulunduğu via palpasyonla olmuşsa bile belgili tanımlık kesme boyutu kısıtlamaz. Daha büyük bir kesi daha derin dokulara daha kolay erişim sağlar ve lenf nodu eksizyon tetkik için kolaylaştırır.
    6. Forseps bir çift kullanarak, omuz amacı ortaya çıkarmak ve kas boyun için cilt geri çek.
      Not: Prescapular lenf nodu kez özellikle overconditioned hayvanlarda deri altı yağ bulunur.
    7. Bir kez daha, lenf nodu (Şekil 3A) konumunu muayene et.
      Not: subkutan yag, lenf nodu şeklini palpe zaman yapacak. Ayrıca, onlar tarafından ince bir fibröz kapsül içine alınır gibi lenf düğümleri herhangi bir çevreleyen doku ile bitişik değildir.
    8. Prescapular lenf nodu bulmak sonra dikkatlice bir neşter ve forseps, kullanarak subkutan yağ dışarı teşrih ve lenf nodu yalıtır.
      1. İnce bir fibröz kapsül varlığı için Şekil 1Badımında, lenf nodu ve yağ dokusu arasında ayrım yapmak için tasvir bakın; lenf düğümleri herhangi bir çevreleyen doku ile bitişik değildir.
    9. Lenf nodu daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarın.
      Not: Bu lenf düğümleri bizon görünümünü benzer. İlişkili video prescapular lenf düğümü olarak bir Amerikan bizonu sağ omuz dışında disseke görünümünü gösterir.
  2. Yalıtım sığır ve bizon parotid lenf düğümlerinin
    1. Nekropsi yerdeki yanal recumbency hayvan yerleştirerek başlayın. Temporomandibuler eklem (TME) bulun.
      1. Bu bulmak zor ise, alt çene yavaş hareket ve hangi kafatası çene verdiği konumunu belirlemek; TME bu.
    2. Bir neşter ya da Nekropsi bıçak kullanarak, deride bir kesi dikkatli olun. Belgili tanımlık kesme ortak dorsal başlatın ve ventrally/dikey Çenemdeki boyunca uzatmak.
    3. Subkutan doku açıklamaya cilt incelemek. Parotid tükrük bezi ilk, büyük boy, loblu yüzey görünümünü ve kırmızı rengi nedeniyle görünür.
    4. Bir neşter ve forseps parotid tükrük bezi taşı bir kenara oturup parotid lenf nodu sadece kafatası ve tükürük bezi (Şekil 3A) medial bulmak için kullanma. Parotid lenf nodu doku doku için daha fazla alay önce inceleyin.
      Not: yüz (parotid ve çene) lenf düğümleri lenf nodu yalıtım yıkmak tükürük bezleri ile ilişkilidir. Lenf düğümleri, ile karşılaştırıldığında tükürük bezleri çok daha büyük ve loblu bir yüzey görünümü vardır. Ayrıca, kesme yüzeyi, tükrük bezleri doğada homojen ve lenf nodlarının (Şekil 3B) klasik kortikal ve medüller mimari desen Sergisi değil.
    5. Bezinin bir neşter ile tüketim. Daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarmak.
  3. Yalıtım dişi sığır ve bizon supramammary lenf düğümlerinin
    1. Hayvan yanal recumbency yerleştirin.
    2. İnguinal bölge ortaya çıkarmak ve meme bulmak için arka bacak yükseltmek.
      Not: bir sağlıklı, süt hayvan, bu lenf nodlarının palpasyonla mümkün olmayabilir. Emzikli bir hayvan bu lenf düğümleri meme tabanının kaudal sınırda aşikar olabilir.
    3. Bir neşter kullanmadan, bir kesik sadece dorsal supramammary bezleri açığa üst bacak çalışan meme için olun.
    4. Subkutan doku teşrih ve supramammary lenf nodu subcutaneous yağlı ince bir tabaka içinde gömülü bulmak. Eğer görsel olarak ayırt edilebilir, firma bünyesinde subcutaneous yağlı varlığı için maruz kalan doku muayene et.
    5. Bir neşter ve forseps kullanarak, dikkatle lenf nodu fat dosya sisteminden dışarı incelemek. Daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarmak.

3. kesit ve lenf nodlarının depolama

  1. İzole lenf düğümleri tetkik 2 3 ana Nekropsi alanı bitişik bir diseksiyon masada dissector üzerinden geçmek. Her lenf nodu bir kesme tahtası taze bir bölüm üzerinde yerleştirin. Kesme tahtaları bölümlerde tarafından lenf nodu art arda birden fazla lenf düğümleri alınmasını kolaylaştırmak için önceden etiket. Bulaşıcı örnekleri için tek kullanımlık tepsileri kullanın.
  2. Forseps ve tek kullanımlık bir neşter ya da Nekropsi bıçak kullanarak, lenf nodu bir bölümünü kaldırın. Keskin bir bıçak kullanarak, lenf düğümü açmak için sagittal bir kesim yapmak.
  3. Lenf düğümünde, hastalıklı hayvanlardan numune özellikle iç incelemek, asimetri için arıyorum, lezyonlar, renk farklılıkları, vb kaydetmek gözlemler.
  4. (1. seçenek) Küçük doku bölümleri
    1. Daha az 5 mm kalınlıkta ve her parça bir tüp bir RNA koruma çözümü ile temiz forseps ile transfer her lenf nodu adet tüketim için tek kullanımlık neşter kullanın.
  5. (Seçenek 2) Lenf nodu biyopsisi veya kesit metodolojisi
    Not: Biyopsi veya paralel lenf nodu bölümlerine farklı düğümleri ve hayvanlar, uygulandığında parça metodolojileri, toplu RNA analizi için örneklenen doku tutarlılığını sağlar.
    1. Kama kesit yöntemi
      1. Yakalamak için sagittal bölüm inceledikten sonra hücreler lenf nodu profil boyunca lenf düğümü, dış kapsül Merkezi'nden gelen bir turta şekilli kama tüketim. İçin bir düğüm 2 cm genişliğinde (Standart ölçü; bkz: Tablo 1), bir kama kesmek için dış yay uzunluğu 4 mm boyundadır merkezi ve 5 mm kalınlıkta ıslak bir ağırlığı olacak ~ 100 mg.
      2. Neşteri kullanarak, kama küçük parçalar, 5 mm ve yaklaşık 50-100 mg her ıslak mendil kilo daha daha kalın kesilmiş.
        Not: tutarlılık sağlamak için bir toplu iş veya ayrı tüpler lenf nodu ilgi bir temsilcisi RNA profilden sağlamak için havuzu RNA ardından tek bir lenf düğümü tüm kama parçalarıyla işlemek.
      3. Doku parçaları forseps ile doku hacmi ile karşılaştırıldığında RNA koruma çözümünün en az 10 birimlerini içeren tüpler içine koyun.
    2. Punch Biyopsi yöntemi
      1. Eğer amaç düğümden belirli köklerinin gibi belirli bölümlerini toplamak için punch biyopsi aracını seçin. Koleksiyon için istenen örnek boyutu ile tutarlı bir araç seçin. Punch Biyopsi araçları 1-8 mm çapında boyutlarda bir dizi kullanılabilir.
      2. Görsel olarak ilgi örnek için bölgelerinde lenf düğümü bulun.
      3. Tuşuna basarak ve aracı çekirdek oluşturmak için doku dönüm faiz, bölümlerini tüketim için punch biyopsi aracını kullanın. Doku parça RNA koruma çözümünün en az 10 birimlerini içeren bir tüp forseps ile aktarın. 5 mm daha kalın ise bir neşter ve forseps daha fazla doku daha küçük parçalara bölmek için kullanın.
  6. Örnekleri koruma çözümü için transfer edilmiş bir kez (Örn., RNALater), onları geri oda sıcaklığında laboratuvar için taşıma.
  7. 4 ° C'de doku penetrasyon için izin vermek için bir gecede örnekleri saklayın.
  8. Ertesi gün, aşırı RNA koruyucu solüsyonu dökün ve doku örnekleri-80 ° C'de depolayın Örnekleri dondurma daha önce mümkün olduğu kadar koruyucu kaldırın. P1000 ve/veya P200 micropipette ipucu etkili bir RNA koruyucu çözüm kaldırma için kullanın.
    Dikkat: çıkarmak koruma çözümü uygun şekilde, koruyucu çözüm olarak belirtilen güvenlik bilgi formu üzerinde kimyasal ve çevresel tehlikeleri yanı sıra kullanılan patojen infektif özelliklerini temel atma.
    Not: Tablo reçetesiaçıklanan RNA koruma çözümü için burada sağlanan yönergeler sağlanır. Eğer alternatif koruma çözümleri kullanarak üreticinin yönergelere başvurun.

4. RNA lenf düğümlerinden işleme

Dikkat: bir önlük, eldiven ve işlem adımları için uygun göz koruma giymek.

Not: burada kullanılan fenol-esaslı reaktif Malzemeler tablo anlatılan (ve protokol üzerinde üreticinin yönergeleri dayalı)20. Alternatif fenol tabanlı reaktifler kullanımı belirli ürün satın almak için üreticinin önerilerini temel yordamı, bir değişiklik gerekli.

  1. Örnekleri, ön aliquot soğutulmuş (4 ° C) fenol-esaslı reaktif homojenizasyon tüpler (1,5 mL/tüp), için erişim önce bir pipet kullanarak.
    Dikkat: Fenol toksik, aşındırıcı ve bir sağlık tehlikesi var. Kloroform toksik ve bir sağlık tehlikesi var. İşlem adımları 4.1-4,9 kimyasal duman başlıklı tamamlamak ve kimyasallar ile herhangi bir temas önlemek için eldiven giymek. Amerika Birleşik Devletleri'nde, kloroform tehlikeli atık olduğunu; tehlikeli atık yerel ve kurumsal esaslarına göre içeren tüpler atmayın. Karşılık gelen BSL-2, BSL-3 veya BSL-4 yönergeleri altında patojenler ile enfekte hayvan işlemi doku örnekleri.
  2. Hemen bir örnek microcentrifuge tüpler temiz forseps ile gevşetti sonra yaklaşık 50-100 mg korunmuş doku fenol-esaslı reaktif içeren homojenizasyon tüp aktarın.
    1. Fenol-esaslı reaktif için ek Önce çözdürme sınırlayın. Birden çok örnekleri işleme için dondurucu kaldırılır depolama kuru buza kullanın.
  3. Sıkıca tüp kap, homogenizer yerleştirin ve fenol-esaslı reaktif bir rotor-stator doku homogenizer ile örnek homojenize. Oda sıcaklığında işlemeyi tamamlamak. Ne zaman tam bir bulutlu görünüm örnek başarıyla homojenize emin olmak kontrol edin; doku bulutlu bir süspansiyon dağınık.
    Not: 2 dk RNA ayıklama ayar kullanılır (önceden ayarlanmış RNA_02_1 ayarı homogenizer için Malzemeler tabloaçıklanan; dondurulmuş dokular için tasarlanmış). Bu protokol için belirtilen rotor-stator (bakınız Tablo reçetesi) büyük dişli ve doku türleri, lifli malzeme dahil olmak üzere bir dizi homojenizasyon için uyarlanmıştır. RNA_02_01 ayar özellikle dondurulmuş (taze aksine) için tasarlanmıştır dokular. Lenf düğümleri fibröz bağ dokusu bileşenleri gibi benzer şekilde en iyi duruma getirilmiş rotor-stator homogenizer etkili bir ayrılma elde etmek için tavsiye edilir. Çevre Sağlık Bilimler Ulusal Enstitüsü21 homojenizasyon önerileri hakkında daha fazla bilgi için bkz.
    1. Büyük boyutta doku homojenizasyon sonra kalırsa, homojenizasyon yordamı yineleyin. RNA verimli bir şekilde kurtarmak için doku de ayrışmış olmalı.
    2. Daha lifli lenf nodu adet lenf nodu parça ön homojenizasyon tüp transferi önce birkaç küçük parça halinde doğrayın için forseps ve makas kullanın. Giriş bölümünde açıklandığı gibi büyük hayvanlar lenf nodu dokulardan daha lifli olabilir.
      Not: Ana bilgisayar ve patojen RNA çift bir analiz isteniyorsa, (örneğin, boncuk homojenizasyon) ek tedavi bakteriyel RNA, kurtarma için özellikle gram-pozitif patojenler ve dokularda varsa gerekli olabilir.
  4. Hemen homojenize örnek tüpler kaldırın ve RNase free microcentrifuge (boyutu 2.0 mL) ile tüplerin P1000 micropipette aktarmak.
  5. Örnek için 12.000 x g 4 ° C'de herhangi bir örnek enkaz kaldırmak için de 5 dk santrifüj kapasitesi. P1000 micropipette ucu kullanarak, süpernatant Pelet geride bırakarak bir taze microcentrifuge tüp aktarın.
  6. Süpernatant oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Her örnek iki 1.5 microcentrifuge tüpleri arasında bölünmüş.
  7. Kloroform fenol-esaslı reaktif (yani, 1,5 mL örnek için 0.3 mL); 1 mL başına 0.2 mL ekleyin el ile 1-2 dk aşamaları karıştırmak, ama değil girdap örnek tersine çevirin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
  8. Vasıl 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
  9. Üst katman, olur formu Interphase veya kırmızı fenol kloroform katman aksatmadan micropipette bahşiş (P1000 veya P200) ile üst, açık sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Yeni bir microcentrifuge tüp aktarın.
  10. % 100 etanol eşit bir hacmi ile karıştırın; Tüp 4 - 5 kez ters çevirme tarafından iyice karıştırın. Tüp bulutlu görünmez.
  11. Micropipette ucu ile daha fazla arındırmak ve üreticinin yönergeleri22takip RNA, elute için bir ticari spin silis tabanlı sütun için sıvı transfer. Üretilen RNA elute ~ 50-100 µl RNase free su dokusuna 50 mg.
    Not: fenol-esaslı reaktif ayıklama qRT-PCR ve/veya RNA-sıralama uygulamaları, RNA'ın kullanım aşağı akım için Organik faz DNA kaldırırken RNA örnekleri DNaz ile ek bir tedavi önerilir.
  12. Aliquot tüpler kullanılmak üzere herhangi bir donma-çözülme ana RNA örneği azaltmak için bir miktar ve kalite değerlendirme ayırmak için eluted RNA. -80 ° C için depolama tüpler aktarın.
  13. Örnek bir alt Biyogüvenlik düzeyi kapsama alanına taşınır düzeyinde özellikle BSL-3 çevreleme, hayvansal patojenler ile enfekte hayvanlardan elde edilen lenf nodu örnekleri durumunda ortaya çıkan RNA örnek patojenlerin devamsızlığın doğrulayın kalitesi analizi, RT-PCR ve/veya RNA-sıralama kitaplığı hazırlık için.
    Not: Yerel düzenlemeler dikkate almak önemlidir ve select ajanlar ile çalışmaları için CDC (hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri) inactivation kurallar söz konusu olduğunda, tüm inactivation yordamları araştırmacı yerel sitesinde doğrulamak gereklidir.
    1. 1/10th hacmi her eluted RNA örnek 4.12. adımdaki (yani, toplam RNA'ın 50 µl üzerinden 5 µl) kaldırın. Steril tekniği kullanarak, örnek 100 µl bakteriyel büyüme suyu bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp ile karıştırın. Steril plastik dağıtıcısı kullanarak, RNA-suyu karışımı bir agar plaka yüzeyi boyunca yayıldı.
      Not: bir suyu türü ve agar plaka ile hangi hayvanlar meydan patojen büyüme ile tutarlı seçin.
    2. Agar plaka ile hangi hayvanlar meydan patojen büyüme için belirli koşullar altında kuluçkaya. Kurtarılan bakteri yokluğu için örnekleri BSL-3 kapsama çıkarmadan önce denetleyin.
      Not: Miktar ve testleri, bütünlüğü, sonra elde edilen eluted RNA, RNA-sıralama ve RT-PCR analiz gibi aşağı akım uygulamalar için uygun.
  14. RNA kurtarma ve saflık bir spektrofotometre kullanarak değerlendirmek. RNA kalitesini değerlendirmek için 1-2 µl spektrofotometre bir analiz için eluted RNA örneği yükleyin. Örnek bir spektrumu ultraviyole (UV) aralığında kaydeder.
    1. A260/A280 oranı, A260/A230 oranı ve örnek için A260 değer UV spektrumu kayıt (A = absorbans).
    2. Olarak tek iplikçikli RNA 40 µg/mL bir konsantrasyon, bir absorbans 1.0 260 nm, RNA konsantrasyonu (µg/mL) A260 x 40 arıtılmış örnekleri için çarparak hesaplar.
  15. Değerlendirme, RNA bütünlük, hızlı bir yöntem herhangi bir bozulmuş örnekleri daha fazla çözümleme dışı bırakmak için her RNA örneğinin 2 µl 1.5 x formamide yükleme boya [deiyonize % 95'formamide, % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 ksilen cyanol, 5 mM EDTA (pH 4 µl ile karıştırın 8.0), % 0,025 (w/v) SDS]23,24microcentrifuge 1,5 mL tüpler.
  16. 70 ° c için 1 dk tüpler ısı ve sonra 1 dakika buz tüplere aktarın.
  17. Örnek 1'de hazırlanan % 1'özel jel için yük x TBE (RNA için bir yerel özel jel elektroforez tam açıklaması için bkz: Rio, Ares Jr., Hannon ve Nilsen)24. Örnekleri standart jel elektroforez yöntemleri tarafından ayrı ve 28S ve 18S ribozomal RNA bantları varlığını doğrulamak.
  18. Temsilcisi sonuçları ve Mueller, O. anlatılan RNA bütünlük tayini [Örneğin, bir Bioanalyzer ve RIN (RNA bütünlük numarası) analiz] için kantitatif analiz yöntemleri ile jel elektroforez kadar izleyin ve ark. 25 ve Schröder, A. vd. 26.

5. alternatif çıkarma yöntemini Formalin-sabit, parafin gömülü (FFPE) doku

Not: FFPE doku koruma en güçlü yöntemi nükleik asit koruma temsil etmiyor olsa da, aşağıda sunulan Protokolü korunmuş diğer dokulara kullanılamaz olduğunda transkripsiyon bazı değişiklikler çalışma için bir yol olabilir.

  1. Formalin reaktifler formalin plastik kaplara dağıtımı tarafından doku koruma için hazır olun. Doku 20:1 formalin: doku hacmi/ağırlık, oranında formalin içinde sırasıyla korunmalıdır.
    Dikkat: Formalin bilinen bir insan kanserojen olduğu ve akut toksik olsa da, (genellikle aracılığıyla inhale duman) Kronik pozlama bir önemli sağlık tehlikesi temsil edebilir. Uygun havalandırma ve KKE (yani, nitril eldiven, ilk maruz kaldıktan sonra 15 dk içinde değiştirilecek kullanımı) sağlık riskleri en aza indirmek için gereklidir. OSHA formaldehit standart için başvurun (29 CFR 1910.1048) maruz kalma izleme ve risk değerlendirme hakkında daha fazla bilgi için.
    Not: çok az formalin kullanarak doku tam koruyucu içinde sular altında korunur hale yeteneğini etkileyebilir.
  2. Faiz dokusunun yalıtım sonra dikkatle kalınlığı 5 mm'den az doku kırpın.
    1. Forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde kesilmiş doku herhangi bir sıçramasına en aza indirmek için formalin daldırın.
      Not: Dokuları tamamen tam bir fiksasyon için izin vermek için formalin içinde ve sular altında. Bu yüzeylerin dokusunun tamamen formalin ile kaplıdır önemlidir.
  3. Bir kez formalin içinde belgili tanımlık doku sular altında en az 24 saat oda sıcaklığında doku fiksasyon için bekleyin.
    Not: Formalin dokularda yavaş, tüm yüzeyler27,28üzerinden saatte 1 mm oranında nüfuz eder. Bu nedenle, doku bölümleri kalınlığı tüm doku bir hızlı fiksasyonu için daha 5 mm sonuçlar daha az tutmak.
  4. Fiksasyon sonra parafin katıştırma için uygun bir reaktif dokuların aktarın.
    Not: Örneğin, bu el yazması muayene doku gömme önce % 70 etanol transfer edildi.
  5. Dokular parafin embed. 29
  6. 10-80 µm için doku kalınlığı (miRNA ayıklanmasını isterseniz kullanımı 10-20 µm) bölüm29.
  7. Neşter ve forseps kullanarak bir 40 mg doku parça işleme ve steril, nükleaz ücretsiz microfuge tüp içine yerleştirmek için her örnek kaldırın.
  8. Ticari bir kit RNA korunmuş örneklerinden ayıklamak için deparaffinization ve FFPE doku örnekleri nükleik asit kurtarılması için tasarlanmış kullanır.
    Not: Malzeme tablo başvurulan kiti ksilen kullanır ve parafin, proteaz tedavi adım ve RNA arındırmak için Cam elyaflı filtre kaldırmak için etanol yıkar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

(Adım 1-4 iletişim kuralı) Bu makalede sunulan konuları kullanımı bir aşağı akım Analizi ana bilgisayar gen ifade çalışmalar için uygundur RNA kurtarılması büyük hayvan örneklerinden yardımcı olacak. RNA kalitesi aşağı akım uygulamaları için birden fazla standart önlemlerle değerlendirilir. Spectrophotometry, protein kontaminasyonu ölçüsü A260/A280 oranı sağlar ve A260/A230 oranı fenol gibi kimyasal kirleticiler algılar saflık değerlendirmenin başka bir yol sağlar. Her durumda, oranları ~ 2.0 yüksek kaliteli RNA kanıtı ve düşük oranları kirlenme kanıtı. Önemlisi, bu oranları niteliksel tespit edilebilir RNA Bozulması hakkında herhangi bir bilgi vermeyin (4,15-4,17 adımlar) ve kantitatif (4.18, bütünlük numarası veya RIN bir RNA puan edinildi gibi adım).

Lenf nodu doku bölümlerden kurtarılan RNA'ın beklenen kalite düzeyi, ortalama olduğunu unutmayın, RNA sığır beyaz kan hücresi örnekleri yeniden elde etmek için daha düşük önemlidir. RNA çekimi sığır doku ve hücre satırlarından kapsamlı bir dizi içinde Fleige ve Pfaffl30 bulmak ortalama RIN (bir Bioanalyzer üzerinde ölçülen RNA bütünlük numaraları) değişir arasında değişir ve Rum doku için 5 < ve > 9 beyaz kan hücreler ve orta ortalama 6,9 düşen lenf nodu RIN puanları ile corpus luteum. Genel olarak, Fleige ve Pfaffl30 Not sağlam dokulara RIN puanları bağ dokusu yüksek konsantrasyonları ile 6-8 ve o dokular arasında değişen üretmek daha yüksek bir ortalama bozulması sergi. Sürekli olarak yeniden elde etmek RNA RIN ile yetersizlik > 9 lenf düğümlerinden puanları için bağ dokusu lenf düğümünde yoğunluğu, artı RNases iç düzeyi bu doku tür, sorumlu olabilir.

Ancak, bir örnek bir bizon supramammary lenf nodu burada sunulan metodoloji kullanarak kurtarılan RNA Bioanalyzer profilinin RNA kurtarma 8,6 (öncelikle sağlam ve uygun RIN puanı gösteren Şekil 4A, görüntülenir Aslında tüm aşağı akım uygulamaları için). Bu yordam oluşturulan RNA başarıyla kullanmak için kitaplıklarına RNA-sıralama içinde oluşturmak için kullanılmıştır; Bu iletişim kuralı, RNA örnekleri normal yalıtımı için bizon ve sığır lenf düğümleri RIN değerleri > 8 (ve genellikle 9 >) izin verir. İçin bir örnek el sekiz ayıklanan RNA örnekleri, ortalama absorbans oranı, 260 nm/280 nm 2.1 ve 260 nm/230 nm 2.1, düşük protein kirlenme ve düşük kirlilik fenol, kimyasal madde ile sırasıyla gösteren oldu. Her ayıklama ortalama nükleik asit kurtarma başına 97 ± 10 µg oldu ~ 100 mg veya bir verim ~ 1 µg RNA/mg lenf nodu doku.

Figure 4
Şekil 4 . Çıkarma yöntemleri kalitesinden RNA tasvir eden temsilcisi kalite izleri. (A) Bu el yazması sunulan yordamı kullanarak bir bizon lenf düğümü, üretilen yüksek kaliteli RNA'ın bu paneli gösterir bir toplam RNA izleme. (B) Bu panel çok bozulmuş RNA resmeden bir izleme Tablo 4' ten, seçili sığır FFPE-örneği gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Ötenazi ve doku parçalar halinde bir RNA koruma yerleşimini arasında gecikme etkisi örnekleme yaban hayatı türlerden durumunda özellikle büyük leşleri dokulardan hızlı yalıtım zorluklar nedeniyle ilişkili çözüm analiz potansiyel endişe etmektir. Edebiyat hakkında bilgi istikrar RNA'ın lenf dokularda, özellikle de sınırlıdır. Bu nedenle, doku koleksiyonu için kabul edilebilir parametreler hakkında bilgi sağlamak için RNA istikrardır bizon lenf nodu sonrası ötenazi karakterize edildi.

Bu deneme için zaman 0 hayvan ölü bir kalp atışı eksikliği ve Korneal refleks bir yokluğu tarafından telaffuz edildi zaman olarak kabul edildi. Karkas ve Nekropsi, başlangıcı takip ~ 15 dk ilk lenf nodu örnek alma önce geçen (15-20 dk gözlemlerimiz alan hayvan kurtarma için standart; zaman kursları konumuna bağlı olarak değişir ). Supramammary lenf nodu tespit edildi ve doku küçük bir bölümünü kaldırıldı ve oda sıcaklığında muhafaza. Bölümleri daha sonra yaklaşık 15 dk aralıklarla alınan ve koruyucu RNA transfer vardı; zamanlı kurs ortasında hayvan serisi (5A rakam; kapalı daireler, Şekil 5C) 4 saat noktaları ikinci dizi için lenf nodu ikinci bir örnek alınmıştır. RNA paralel yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak lenf nodu parçalardan ayıklandı. 1s bu deney lenf nodu RNA bütünlüğünü çoğunluğu sadece hafif indirimleri (ve 5 C5B anlamaya) zaman ders yılı sonuna RIN puanı ile saat ders boyunca muhafaza ortaya koymaktadır. Benzer şekilde, RNA sığır prescapular ve parotid lenf düğümlerinde RIN skora göre üzerinde ölçülen bütünlüğünü muhafaza ~ 1 h saat kursları öldükten sonra (Şekil 5C; hayvan bilgiler Tablo 2' de). Ayrıca, RNA 8 h ölümünden sonra toplanan supramammary lenf nodu bölümlerden hücre kültür ortamında her iki oda sıcaklığında veya 37 ° C'de bir hayvan leşi holding zamanında benzetimini yapmak için tüm bölümlerde tutan ayıklandı. Ribozomal RNA 8 h (Şekil 5 d) tutarak sonra bile gözlemlenebilir oldu.

Figure 5
Şekil 5 . RNA kalite bizon lenf nodu örneklerinde toplanan saat ders sonrası ölüm. (A) Bu panel deneysel bakış 1 h saat ders yordam gösterir. (B, C) Bu paneller arasında bir supramammary lenf nodu Amerikalı bir bizon izole 1 h saat dersten alınan örnekler için RNA kalite muayene göster. Jel RNA örnekleri formamide içinde denatüre ve üzerinde % 1 sigara denaturing jel ayrılmış yansıtır. Paneli (C) her örnek için RIN puanlarında değişiklik gösteriyor. Sığır prescapular ve parotid lenf düğümleri üzerinde ek deneyler verilerden belirtildiği şekilde overlaid. (D) Bu panel RNA jel, örneği (B) panelinde kullanılan jel için açıklandığı gibi supramammary lenf nodu örnekleri, kuluçka ya oda sıcaklığında (1 yolu) veya 37 ° c (2 yolu) hücre kültür medya 8 h sonra işlenen gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Temsilcisi bu bulgular diğer doku türleri ve kaynakları için RNA istikrar sonuçları ile uyumludur. Tablo 3 RNA istikrar öncesi koruma zaman kursları üzerinde araştırdık yayımlanmış belgeleri örneği sonuçlarının bir özetini sağlar. RIN puanları ve/veya rRNA tek eğilimleri gözlem (Toplam RNA) jel Not kağıtlarını mRNA bütünlüğü, ek bir analizini gibi oranları 5' vs belirlenmesi 3' seçilen RNA'ların segmentlerinin sağlasa tabloda dahil edilir (Örneğin, Fajardy vd.) 31. ancak, ölüm ve örnek korunması arasındaki daha uzun süreleri RNA ifade profillerde değiştirilmesine neden, örneğin, plasental doku31için gösterildiği hatırlamak önemlidir. İstikrarlı transkript için karşılaştırıldığında, daha kararsız RNA'ların tükenmiş. Bu nedenle, hayvan en biyolojik olarak geçerli RNA profilleri elde etmek için Nekropsi için kullanıma hazır olduğunda herhangi bir gecikme azaltmak için doku kurtarma için hızlı, akıcı iş akışı kullanmak önemlidir. Sağlam ribozomal RNA varlığı herhangi bir değişiklik transcriptome profilde yokluğu gösterir varsaymak bir hata olur. Hala, temsilcisi sonuçları bile artan işleme kez ile için gerekli büyük hayvan örnekleme, lenf nodu örneklerinden bir gen ifade analizi için uygundur RNA hazırlamak mümkün olduğunu göstermektedir.

Ayrıca, sonrası Çözülme zamanı değişken etkisi incelenmiş; Bu süre boyunca, RNA düşmesine enzimler doku mevcut üzerinden daha duyarlıdır. 0 veya 64 dk ile işlenmiş bu iletişim kuralını kullanan 4.1 adımda sonrası çözdürme oda sıcaklığında zaman tutun RNA örnekleri kalitesini bir RIN skora göre ölçüldü. Bu deney sağlam birden fazla örnekleri (6A rakam) işlenmesi için yapım o protokol tezcan vakti oldukça büyük küçük harf duyarlı olduğunu gösterir.

Figure 6
Şekil 6. RNA kalite parametreleri ek analiz. Hemen (0 dak) çözdürme sonra veya işleme önce oda sıcaklığında 64 dk basılı sonra saf RNA için RNA kaliteli sonuçlar (A) Bu panel gösterir. Çubuklar 3 doku parçaları her koşul, ± standart sapma ortalamasını gösterir. İletişim kuralında tanımlandığı gibi tüm dokulara çözdürme önce bir RNA koruyucu solüsyonda depolanmaktaydı. (B) Bu panel Bioanalyzer izlemesi bağ dokusu büyük bölümü içeren bir kötü homojenize lenf nodu parçasındaki örneği gösterir. Belgili tanımlık küçük büyüklük 28S ve 18S doruklarına 5S aralığında, zirveleri ile karşılaştırıldığında belirgindir. 5S aralığı ve 18S tepe arasında nispeten düz taban çizgisi zavallı çıkarımı alternatif olarak müstehcen olmasına rağmen bu da RNA bozulması nedeniyle oluşabilir; Avraham, R. ve ark. görmek 48 ek ayrıntılar için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Lenf düğümlerinden RNA izolasyonu için karşılaştırma noktası, sığır FFPE mezenterik lenf nodu parçalarıyla RNA'ın deneme bir kurtarma yapılmıştır. Yukarıda açıklandığı gibi örnekleri 1 hafta içinde katıştırma, parafin, oda sıcaklığında depolama 4 ay ardından parafin önce formalin tespit edildi. Dokular beş 10 µm bölümlere kesitli ve FFPE ayıklama işlemi uygulayarak, yaklaşık 62 ng/µL RNA'ın örnek (± 14 ng/µL) başına kurtarıldı. 260 nm/280 nm absorbans oranlarıyla 1,9 A260/A230 oranları olumsuz (Tablo 4) olmasına rağmen düzeyi düşük protein kirlenme, ürün gösteren, ortalama. Bu örnekleri çok vardı için RIN puanları gözlenen Not RNA ürünleri (Tablo 4; bir bozulma gösteren düşük (< 2), Şekil 4B), Srinivasan ve arkaçıklaması ile tutarlı. 45. kullanan qPCR, RNA veya daha ayrıntılı olarak cDNA (< 200 bp) genellikle küçük bölümlerini deneyleri içinde güçlendirilmiş. Bu nedenle, küçük ürün amplifikasyon hala bozulmuş örnekler ortaya çıkabilir ve qPCR Analizi yapılabilir. Örneğin, bir kesimi (RPS9) ribozomal protein S9 yükseltmek mümkün transkript bu FFPE kurtarılan örneklerinden qPCR tarafından. CT değerlerini örnekler üzerindeki tutarlı ve ortalaması 19,2 ± 1.8. Ne zaman FFPE hazırlanan örnekleri, ancak kullanan, daha büyük ürünleri mutlaka mevcut değildir ve bozulması Tekdüzen bir oranda tüm örnekler üzerindeki oluşmuş olabilir değil gibi mevcut sınırlamaları unutmayın. Bu nedenle, bu malzeme araştırmaları uyarılar ile kullanılabilir, ama RNA-sıralama gibi herhangi bir aşağı akım uygulamaları için önemli kısıtlamalar mevcuttur.

Lenf nodu türü Konumu Uzunluğu Genişlik Düğümler tarafından drene bölgeleri
Prescapular Sadece medial omuz eklemi için; subkutan yağ ve kas tabakası altında gömülü 1-10 cm 1.5-2 cm Boyun Cilt; omuz; ve deri, kas ve eklem alt göğüs bacak (ref. 8)
(Ayrıca precrural denir) Prefemoral Sadece dorsal ve medial bastırmak, yaklaşık 12-15 cm yukarıda diz kapağı için 8-10 cm 2.5 cm Cilt pelvik bacak, karın ve göğüs (ref. 8) kaudal kısımları
Retropharyngeal Orta çizgi içinde için yutak dorsal bulundu 4-5 cm 2-3,5 cm Dil, ağız boşluğu, diş etleri, dudaklar, sert yüzey, tükürük bezleri, boyun kaslarının çoğu müköz membranlar
Parotid Subkutan ventral temporomandibular eklem, masseter kas (ref. 8) kaudal için yer alan 6-9 cm 2-3 cm Cilt, subkutiste, baş, kas göz ve kulak, göz kapakları, gözyaşı bezinin, burun boşluğuna rostral bölümünü kaslarının çoğu
(1-3 hediye olabilir) Submandibular Subkutan tükürük bezleri ile ilişkili alt çene açısı medial yönü üzerinde bulunan 3-4 cm 2-3 cm Namlu, dudak, yanak, sert yüzey, burun boşluğuna rostral parçası, dil, cilt ve kas (ref. 8) baş ucu
Supramammary (erkek yüzeysel kasık, genellikle 2 mevcut) Caudally ve dorsally göre meme dokuları bulundu 6-10 cm Meme, vulva, antre vajina, cilt uyluk, bacak medial yüzeye medial ve kaudal yanları hakkında
Skrotal (erkek sürümü yüzeysel kasık) Testis boynuna yağ tabakası içinde prepublic tendon aşağıda bulundu 3-6 cm Skrotum, sünnet derisi ve penis

Tablo 1. Sığır yüzeysel lenf düğümleri bakış.

Hayvan açıklaması El yazması konumda Yaş Seks Sağlık durumu
Üsteki bizon bizon Bizon video--lenf nodu kurtarma 5-6 yo Erkek Sağlıklı
Üsteki Bos Toros Sığır video--lenf nodu kurtarma 7-8 yo Koyun erkek Sağlıklı
Bizon bizon RNA istikrar çalışma için Şekil 5A-C 5-6 yo Erkek Sağlıklı
Bos Toros A RNA istikrar çalışma için Res. 5C, Res. 6A 7-8 yo Koyun erkek Sağlıklı
Bos Toros B RNA istikrar çalışma için Şekil 5C 7-8 yo Koyun erkek Sağlıklı
Bos Toros FFPE kalite çalışma için Tablo 4, Res. 4B 0,5 yo Koyun erkek Sağlıklı (O157: H7 enfeksiyonu çalışma denetiminden)
Metodoloji birden çok ek sığır, bizon ve keçi lenf nodu örnekleri, burada vurgulanır olanlar dışında kullanılan unutmayın.
Ayrıca, biz toplanan lenf düğümünde aynı metodoloji kullanılan bir 1,5 Mo-yaşlı kadın buzağı.

Tablo 2. Pilot çalışmalarda kullanılan hayvanların özellikleri.

Doku türü Koruma yöntemi Koşullar holding Bozulma sonuç Başvuru
Sığır adipose, iskelet kas, karaciğer (Sıvı N2) dondurma snap 4 ° C, vakum doku paketlenmiş. Kas RNA daha kararlı (bile 8 gün için depolama alanı); esas olarak yağ ve karaciğer için 24 h rRNA bantları görünümünü tarafından değerlendirildi olarak istikrarlı Bahar ve ark. (2007)32
İnsan iki nokta üst üste, kolorektal kanser RNA koruma çözümü Oda sıcaklığında. RIN için 2 h. korunmuş, ancak alt genlerin ifade 0,5-2 değişiklikleri göster h. Yamagishi et al. (2014)33
Fare karaciğer, dalak RNA koruma çözümü veya ek (Kuru buz Bulamaç) dondurma Fare karkas (37 ° C) içinde Dalak istikrarlı 1,5 saat için dışarı edildi; önceki bozulma (%24 azalma RIN 105 dk.) karaciğer örnekleri sergilenmektedir Choi ve ark. (2016)34
Fare karaciğer Hiçbiri (Homogenized guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform içinde taze) 25 ° C, 37 ° C Sınırlı düşmesine 25 ° c 4 h dışarı, ama 4 h (RIN puanlarını kullanarak gibi) için 37 ° C'de geniş bozulması. Almeida ve ark. (2004)35
İnsan ileum RNA koruma çözümü veya buz gibi ek 4 ° C, 37 ° C Genellikle 1,5 h. 37 ° C'de, kararlı; 6 h. (RIN puanlarını kullanarak gibi) 4 ° C'de sabit dışarı.  Not yazarlar da ek bir referans olarak o için daha fazla doku RNA bütünlük edebiyat incelemede baktılar hizmet verebilir tablo S1 seçili RNA istikrar kaynakların özetini sağlar. Lee ve ark. (2015)36
İnsan karaciğer Dondurucu (sıvı N2 ve isopentane) kendine gel Oda sıcaklığında. (En çok 0,85 ΔRIN); 1 h. gözlenen bozulma daha küçük örneklerinde daha fazla bozulma karaciğerde daha büyük örnekleri. Kap et al. (2015)37
İnsan kolorektal kanser (Sıvı N2/isopentane) soğuk dalgası 4 ° C Bozulma gözlenen tarafından 1 h.; RIN puanı sadece 4.2 sonra 90 dk. gecikme zaman dondurma Hong ve ark. (2010)38
İnsan karaciğer RNA koruma çözümü, aynı zamanda flash (sıvı N2) dondurma Oda sıcaklığında, 4 ° C 1 olarak istikrarlı bile dışarı edildi ö. buz; bozulma gözlenen 1 sonra ö. oda sıcaklığında. (ama RIN puanlarını kullanarak değil 3 h. sonra; olarak gözlenen) Lee ve ark. (2013)39
At adipose, iskelet kas (Sıvı N2) dondurma snap 13 ° C Yazarlar tavsiye en iyi o bütünlük içinde 2 h kas oldu.; 0.5 (rRNA jel görünüm tarafından kutlanan gibi) yazarlar tarafından önerilen h. içinde yağ koruma Morrison ve ark. (2014)40
Somon beyin, böbrek, karaciğer, kas RNA koruma çözümü Oda sıcaklığında. Beyin RNA istikrarlı bir 4-8 h., böbrek ve kas exhbiit için bazı bozulma 8 h (jel, kullanılan RIN puanı her iki) tarafından Seear & Sweeney (2008)41
Tavşan bağ dokusu (ligament, tendon, kıkırdak) (Sıvı N2) dondurma snap 4 ° C, oda sıcaklığında. Hiçbir "aleni" düşmesine dışarı 96 h. rRNA jel görünüm tarafından gözlemlediği gibi öldükten sonra Marchuk et al. (1998)42
Sıçan beyin, akciğer, kalp, karaciğer Taze elde edilebilir görünüyor 20 ° C kuluçka makinesine düzenlenen fare leşi içinde En yüksek RNA istikrar (bozulma mevcut olmasına rağmen 7 gün için dışarı rRNA bantları öldükten sonra gözlemlemek) beyinde orta istikrar akciğer ve kalp, karaciğer içinde alçak kararlılık gözlenen; rRNA jel görünüm tarafından gözlemlediği gibi Inoue vd (2002)43
İnsan bademcik, kolon Sonra ek dondurulmuş-ile ve RNA koruma çözüm olmadan Oda sıcaklığında. (22 ° C), 4 ° C RNA koruma çözümü, soğuk serum veya buz (0 ° C) 16 h. buz üzerinde veya RNA koruma çözüm için kararlı; hafif bozulma 6 veya 16 h. soğuk serum fizyolojik içinde veya RT (RIN puanları tarafından ölçülen) Micke et al. (2006)44

Tablo 3. Post-mortem doku örneklerinde RNA istikrar üzerindeki önceki bulgular örneği. RNA istikrar, temsil, doku türleri antikorundan, dahil olmak üzere bir dizi üzerinde edebiyattan seçilen el yazmaları girişi belirtir insan biyopsi ve hayvan hastalıklarıyla ilgili örnekler. Yöntemi korunması, muhafazası ön ayıklama modu ve sonuçları kısa bir özeti her örnek için sağlanır. Aksi belirtilmediği sürece, örnekleri, buz ek donma veya bir infüzyon RNA koruma çözümü, sonrası zaman sahası ile 37 ° C arasında değişen koşulları saklanır (diğer bir deyişle, istikrar bir RNA huzurunda ölçüldü değil koruma çözümü kuluçka sırasında belirtilmediği sürece).

Örnek kimliği 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
260/A280 1,96 1,98 1,98 1.91 1,98 1.89 1.89 1.91 1.9 1,84 1,84 1,97
260/A230 0,67 0,14 0,19 0,26 0,61 0,69 1.33 0,11 0.21 0,39 0,1 0,44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tablo 4. Temsilcisi sonuçları sığır FFPE mezenterik lenf düğümleri izole RNA üzerinden. Spektrofotometrik sonuçlarından tablo göstermektedir ve bu el yazması açıklanan yöntemi kullanarak FFPE sığır lenf nodu örnekleri bir dizi kalite analizleri işlenebilir. Her durumda, sonuçlar son derece bozulmuş RNA yansıtacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transcriptomic çalışmaları ve ilgili protokolleri çoğunluğu fare, sıçan veya öldükten sonra insan örnekleri üzerinde odaklanın. Ancak, Hayvancılık ve yaban hayatının araştırmalarda çok çeşitli insan halk sağlığı için hastalık, hem veteriner ilaçları ve hayvansal hastalıklar açısından uygulanabilir olarak bağışıklık yanıtı karakterizasyonu için fırsatlar sağlar. Bu iletişim kuralı bir taslağını dokuları yüksek bütünlük RNA çıkarılması için kritik noktalar sığır, Bizon, keçi ve koyun gibi büyük hayvanlar üzerinden sağlanan. Hayvanlar gibi örnek koleksiyon için koşullarını boyutunu iyileşme fare lenf nodu kurtarma için daha uzun öldükten sonra işlem süresi ile daha geniş bir süreç. Benzer şekilde, bu lenf nodlarının büyük boy paralel örnekleri lenf nodu içinde immünolojik/patolojik değişiklikler temsilcisi örnekleri yanı sıra farklı hayvan kurtarmak protokolleri gerektirir. Lenf nodu kesit göre temsilcisi profiller gelince de sağlam RNA kurtarılması için örnek koleksiyonunda bu iletişim kuralı için öneriler sağlar.

Bir standart örnekleme strateji ve iletişim kuralı öneminin gücümüzü, burada anlatılan gibi biz transcriptomes hayvancılık lenf nodlarının karakterize PubMed Merkezi veritabanı 25 gazetelerden incelenmiştir. Bir kağıt belirtilen işleme büyük lenf nodu bölümünün aynı anda, bir özel lazer yakalama mikrodiseksiyon yöntemleri ele, kimse söz "temsil edici bir örnek" lenf düğümü toplanmıştır ve belirtilen tek bir kağıt46 lenf nodu parçası (10 mm3 boyutunda) toplanan korteks ve medulla bölgeleri dahil. Küçük örnekleri (genellikle 30-100 mg) RNA analizi için işlenmiş olan diğer kağıtlar kaydetti iken, %84 gazetelerin bu doku parçaları topluluğu için bir örnekleme strateji söz etmedi. Olarak RNA-sıralama hala nispeten pahalı, lenf düğüm başına birden çok bölüm özellikle biyolojik Çoğalt örnekleri genellikle istatistiksel analiz için öncelik bu yana çoğu durumda, mali açıdan uygun olması olası analizidir. Bir örnek bir kama sagittally kesitli bir lenf nodu arasında toplayarak, RNA bağışıklık hücreleri farklı türde zengin lenf nodu bölgelerden tüm örnekleri ele geçirildi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için bir belgelenen ve tekrarlanabilir örnekleme strateji lenf nodu transcriptomics için bir başvuru olarak görebilir.

Dokulara gelen RNA hazırlanmasında, yordam karar için birden çok anahtar adımlar vardır. İlk olarak, metodolojik edebiyat flaş donmuş doku örnekleri (ve sonraki soğuk sıcaklık taşlama) kullanımı kullanımı koruma çözümleri vs. açısından karıştırılır. Özellikle büyük hayvan Nekropsi durumunda, birden çok olası yordam faydası vardır bir koruma çözümü kullanmak için bu protokol için dahil olarak. İlk olarak, doku örnekleri hemen tüpler için sıvı azot aktarım gerek kalmadan koruma çözümde Nekropsi sırasında saklanır. İkinci olarak, Eğer özellikle örnek kısmen veya kısa bir süre önce homojenizasyon Tammy'nin koruma çözümü kullanımı örnek işleme RNA çıkarılması için önce ilave koruma sağlar. Sonuçlar Şekil 6A ' Bu koruyucu etkisi lenf dokusu ile genişletir gösterir. Buna ek olarak, flaş donmuş örnekleri donmuş durumda homojenizasyon fenol içeren arabellekte ana kadar sürdürülmelidir. Laboratuara döndürülebilir kadar son olarak, alan Nekropsi için sıvı azot hazır olmadığı, büyük hayvanların korunması çözümde örnekleri depolanabilir.

Homojenizasyon örnekleri için aerosol oluşturma işlemi sırasında bir dezenfektan olarak hizmet veren ilk doku işleme sırasında fenol varlığı burada sunulan yordamı moleküler bileşenleri ek avantajları şunlardır hayvanlar ve artık fenol ve guanidin isothiocyanate örnekten kaldırmak için spin sütun yordam kullanımını bulaşmış. Temsilcisi sonuçları yordamı bir260/A280 ve260/A230 oranları tarafından değerlendirildi gibi yüksek kaliteli RNA oluşturur, Jel Elektroforez ve RIN puanları ve saat ders zorluklar karşısında sağlam olduğunu göstermektedir Hayvancılık ve yaban hayatı örnekleme. (Örneğin, RNALater olarak), doku korunması homojenizasyon fenol tabanlı reaktifler (Örneğin, TRIzol) ve silis sütun arıtma eşleştirme başarıyla profil gen ifade desenleri ovine için edebiyatında kullanılmıştır abomasal lenf bezleri sığır lenf düğümleri ve gastrointestinal nematodlar46 ile enfekte bir herpesvirus47, RIN puanları daha büyük 8 ve 7 tüm örnekleri arasında daha büyük ile sırasıyla bulaşmış.

Aşağı akım analizi için kabul edilemez RIN puanları ile elde edilen bir RNA durumunda RNA işlenmesi için standart, aşağıdaki değişkenleri tespit edilebilir: toplam işlem zaman post-mortem, durumu, dokular, işlem saat/gecikme sonrası çözülme sırasında RNA çıkarma ve RNA işleme sonrası ayıklama tekniği. Zaman öldükten sonra işleme toplam özellikle doku euthanized hayvanların aksine ölü bulundu hayvanlar kurtarıldı durumunda tespit edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi RNA lenf düğümleri nispeten sabit, ama uzun gecikmeler işlemedeki bozulması, özellikle kararsız transkript için neden olabilir. Bir karıştırıcı zaman değişken örnekleri arasında alanında farklı tutarlarının kalmıştır leşleri karşılaştırılır, mevcut olabilir. Enfeksiyonu ile ilişkili patolojik değişiklikler nedeniyle doku bütünlüğünün bozulması RNA istikrar azaltabilir çünkü dokuları durumu değerlendirildi. Örneğin, alt RNA kalite brusellaplacentome içinde gözlenmiştir-enfekte hayvan sonrası kürtaj (gönderilmiş Boggiatto vd.,). İşleme süresi/gecikme sonrası tezcan koruma çözümleri, kullanımı ile bu protokol için açıklandığı gibi hafifletilmiş. Doku parçaları kalınlığı koruyucu çözüm doğru ve hızlı penetrasyon (koruyucu Malzemeler tablobelirtilen kullanarak < 5 mm kalınlık) doku haline izin vermek için düşük olduğunu emin olun. RNA ayıklama sırasında arabellekleri RNase free olmalı ve kontamine maddelerin (RNases cilt üzerinde bulunur) eldiven ve diğer ile temas kaçınılmalıdır. Lenf dokusunun taşlama için potansiyel RNases en büyük kaynağı doku içinde olacak, ama kirletici giriş yordamı her aşamasında azaltmak faydalıdır. RNA sonrası ayıklama kuralında tanımlandığı gibi işlemek için aliquot RNA tüpler içine önce dondurma ve-80 ° c, depolama donma-çözülme örnekleri analiz kalite ve miktar gereğini ortadan kaldırmak için örnekler.

Düşük verimleri yordamda, RNA örnekleri bozulma sonucu ek olarak, verimsiz bir homojenizasyon protokol 4.3 adımda lenf dokusunun nedeniyle olabilir. Her ne kadar çoğu lenf nodu dokularda etkili büyük pilot ishal ayrışmış dişli rotor-stator dissociator burada anlatılan bir RNA koruma çözümünde kuluçka (artış sertliği), doku doku değiştirebileceğinizi unutmayın. 4.3.1. adımda belirtildiği gibi fenol-esaslı reaktif homojenizasyon olmalıdır ayrılma eksik olup olmadığını tekrarladı. Harç havaneli zımpara, fenol-esaslı reaktif zemin örnekte resuspension ve ardından başka bir erişim olmadan laboratuarlar için bu özelliklere sahip bir homogenizer alternatiftir. Ancak, bir homojenizasyon tek kullanımlık tüpler bir harç ve havaneli birden çok örnekleri, işlenmesi için daha uygun ve daha kısa iş akışı örnek kaybı taşlama olmayışı da dahil olmak üzere, donmuş doku bileme üzerinde birden çok potansiyel avantajları sunar , hiçbir temizleme ve enfekte hayvan dokulardan durumunda güç örnekleri ile potansiyel teması.

Avraham vd. 48 tarif büyük 5S RNA zirveye 28S ve 18S ribozomal RNA'ların, düşük bir kurtarma ile eşleştirilmiş son RNA üründeki bir eksik lizis (hangi sırayla, lenf nodu işlenmek üzere tiss eksik bir ayrılma nedeniyle olabilir hücre belirtisi olabilir UE). Şekil 6B sığır parotid lenf nodu bağ dokusu içinde çok yüksek ve etkili bir şekilde homojenize değil bir parçası oluşturulan bir RNA profil örneği sağlar. RNA verimleri hesaplanır ve bir küme doğrulamak benzer iyileşme mg-doku alınır ve örnekleri RNA-sıralama tarafından doğrudan karşılaştırma için aynı homojenizasyon kullanarak toplu iş iş işlemde işlenip analiz örnekleri arasında izlenen Tüm örnekleri için strateji. Kama örnekleme yaklaşım aynı zamanda sadece geniş bağ dokusu bir bölgedir bir örnek topluluğu kaçınarak yardımcı unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var. Tüm araştırma ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi üzerinden intramural fonları ile finanse edilmektedir. Belirli bir ürünün tüm başvuruları deneysel tekrarlanabilirlik amacıyla sağlanmaktadır ve bu ürünlerin herhangi bir ciro federal hükümet tarafından temsil etmemektedir.

Acknowledgments

Yazar James Fosse mükemmel çalışmaları tüm videografisi ve video işleme için teşekkür etmek istiyorum; Michael Marti sayısallaştırılmış sığır görüntüleri nesil mükemmel çalışmaları için; Lilia Walther RNA çıkarma konusunda ona yardım için ve Bioanalyzer çalışır; Mitch Palmer ve yararlı bir daha gözden geçirme ve geribildirim lenf nodu görüntülerde Carly Kanipe; ve hayvan bakımı ve veteriner kadroyla ulusal hayvan hastalığı Merkezi için tüm-in onların sert iş ve hayvancılık ile ilgili yardım ve Nekropsi için hazırlık.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10, (6), e0131459 (2015).
  2. Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
  3. Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
  4. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  5. Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, (5), 425-454 (2006).
  6. Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33, (5), 454-461 (1980).
  7. Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216, (5), 556-562 (2010).
  8. Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
  9. Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18, (12), 2075-2078 (2011).
  10. Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75, (5), 854-858 (2012).
  11. Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28, (2), 238-241 (1980).
  12. Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71, (8), 1685-1688 (2008).
  13. Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61, (4), 1586-1590 (1995).
  14. Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43, (5), 780-784 (1982).
  15. Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65, (11), 1483-1489 (2004).
  16. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15, (3), 532-537 (1993).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162, (1), 156-159 (1987).
  18. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, (2), 615-619 (1979).
  19. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
  20. TRIzol Reagent Manual. ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
  21. Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
  22. PureLink RNA Mini Kit Protocol . Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
  23. RNA Gel-loading Buffer. Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
  24. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  25. Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21, (1), 128-134 (2000).
  26. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  27. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone. China. (2012).
  28. Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61, (1-2), 46-57 (1941).
  29. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  30. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
  31. Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10, (21), (2009).
  32. Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
  33. Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31, (4), 1532-1538 (2014).
  34. Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11, (12), e0167391 (2016).
  35. Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328, (2), 101-108 (2004).
  36. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10, (9), e0138214 (2015).
  37. Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13, (3), 200-206 (2015).
  38. Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26, (5), 316-325 (2010).
  39. Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53, (1), 1-8 (2013).
  40. Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9, (6), e100810 (2014).
  41. Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34, (1), 19-24 (2008).
  42. Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379, (2), 171-177 (1998).
  43. Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130, (2-3), 127-132 (2002).
  44. Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86, (2), 202-211 (2006).
  45. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  46. Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10, (5), e0124823 (2015).
  47. Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169, (1), 246-254 (2012).
  48. Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).
Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter