Summary
אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.
Abstract
חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין היא טכניקה הוקמה באופן כללי במערכות האיקריוטים. כאן, אנו מספקים שיטה הקיבעון, הטבעה, ואת חלוקתה של biofilms בשלמותם המושבה חיידקים באמצעות perfused פרפין. להתאים שיטה זו לשימוש על המושבה biofilms, אנחנו פיתח טכניקות לשמירה על כל דגימה על מצע הגידול שלה, למינציה זה עם overlayer אגר, נוספו ליזין הפתרון מקבע. אלה אופטימיזציות לשפר את שימור הדגימה של שימור תכונות micromorphological. דוגמאות שהוכנו באופן זה נתונות דק חלוקתה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, זריחה, שידור. אנחנו החלת טכניקה זו המושבה biofilms של Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis ויבריו cholerae. רמה גבוהה של פירוט הגלויות בדגימות שנוצר על ידי שיטה זו, בשילוב עם זן כתבת הנדסה או השימוש של צבע ספציפי, יכול לספק תובנות מרגש הפיזיולוגיה והפיתוח של קהילות מיקרוביאלי.
Introduction
רוב החיידקים יש את היכולת ליצור biofilms, קהילות של תאים מחוזק ע י מטריצות מתוצרת עצמית. ניתן לגדל Biofilms בסוגים רבים של כיוונונים פיזית, עם משטרים שונים של הוראה התזונתי, המצע. מבחני ספציפי עבור ביופילמים נוטים להניב מבנים multicellular לשחזור, ואת לארכיטקטורות נפוצות שנצפו phylogenetically מגוון מינים הקהילה או ברמה מאקרוסקופית. כאשר חיידקים גדלים כמו מושבות בינוני מוצק תחת אווירה, מורפולוגיה מאקרוסקופית מוסרת מידע אודות היכולת לייצור מטריקס, לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם אחרים תכונות 1,2,3. הארכיטקטורה הפנימית של מושבות חיידקים יכולים גם לספק רמזים לגבי כימיה biofilm ספציפיים, פיזיולוגיה, אבל היה קשה לאפיין. היישומים האחרונים של טכניקות cryoembedding ו- cryosectioning למושבות חיידקים אפשרו הדמיה והדמיה של תכונות ספציפיות החלטה חסרת תקדים 4,5,6. עם זאת, מחקרים ברקמות בעלי חיים הראו כי פרפין הטבעה ומוצריה מעולה של מורפולוגיה בהשוואה cryoembedding 7 שימש כדי להמחיש חיידקים רקמות 8,9. לכן פיתחנו פרוטוקול קיבוע, פרפין הטבעה של דק חלוקתה של מושבת חיידקים biofilms. כאן, אנו נתאר את הכנת Pseudomonas aeruginosa PA14 המושבה-biofilm דק סעיפים 10,11, אבל אנחנו גם בהצלחה החלת טכניקה זו biofilms הנוצרת על-ידי החיידק Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ו ויבריו cholerae12.
התהליך של הטמעה-פרפין, דק-חלוקתה biofilms עוקב אחר פשוט הגיון. ראשית, biofilms עטוף בשכבה של אגר לשמר מורפולוגיה במהלך העיבוד. שנית, עטוף-biofilms טובע לשבועיים כדי crosslink מקרומולקולות, לשמר את micromorphology. אלה מכן מיובש עם אלכוהול, פינה עם הממס יותר לא קוטביים הינם הסתננו ואז עם פרפין נוזלי. לאחר שחדר, הדגימות מוטבעים לגושי שעווה על חלוקתה. סעיפים לחתוך, רכוב על שקופיות, ואז ולמיומנות כדי להחזיר אותם למצב יותר מקורי. מנקודה זו, ניתן צבעונית או מכוסה הרכבה בינונית לבדיקה מיקרוסקופית.
פרוטוקול זה מייצר חלקים דקים של חיידקים פתוגנים המועברים במזון מתאים לבדיקה היסטולוגית. המושבה biofilm substructures גלויים כאשר סעיפים דקים שהוכן בשיטה זו הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור. Biofilms יכול להיות גם גדל על כתמי פלורסנט המכיל מדיה ספציפיים עבור תכונות בודדות או צבעונית בשלב התייבשות, מייד לפני הרכבה (שלבים 9.5-9.6). לבסוף, ניתן לתכנן חיידקים כדי לייצר חלבונים פלורסנט אופנה מכוננת או מוסדר ומאפשר בחיי עיר הדיווח של התא הפצה או גנים ביטוי בתוך קהילות אלה. השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע המושבה biofilm עומק תא הפצה, הפצה מטריקס, דפוסי הצמיחה, ייתכן גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול של Pseudomonas aeruginosa Biofilms המושבה
- הכנת לוחות בינוני-Bilayer
- להכין עם 10 גרם/ליטר טריפטון, אגר 10 גרם/ליטר (ראה טבלה של חומרים) פתרון במים יונים.
- אוטוקלב במשך 20 דק מגניב ל 50-60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- שופכים 45 מ של הפתרון אגר-טריפטון לתוך תבשיל מרובע 100 מ"מ x 100 מ"מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות צינור חרוטי 50-mL. לאפשר את אגר לגבש (~ 20-30 דקות). שופכים שכבה שנייה, 15-mL על גבי השכבה הראשונה. תן לחזק בן לילה, הסרת עיבוי של העפעפיים במידת הצורך על ידי מנגב עם טישו נטולת מוך.
- תצפיתנות כלי Biofilms המושבה
- פסים הזנים של ריבית מן המקפיא מניות על פלטות אגר LB13 , דגירה בחושך 12-16 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו- 80-100% לחות יחסית.
- עבור כל זן או שכפול, להשתמש מושבה בודדת ועד לחסן 2 מ ל LB דגירה בחושך 12-16 קמ"ש ב 37 ° C עם רועדת-250 סל"ד.
- תת תרבות על ידי דילול מטריים לתוך טריים LB ואת המקננת בחושך 2.5-3 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
- למדוד צפיפות אופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהתאים עם LB סטרילי כדי להשיג השעיה תא עם מנת יתר500 nm של ~ 0.5.
- בהתאם המושבה הרצוי גודל, µL pipet 2.5-10 של התא השעיה על צלחת בינונית-bilayer (להכין בשלב 1.1) ולאפשר במקום להתייבש במשך ~ 20 דק. עוזב את המכסה פטרי אג'ר ליד להבה פתוחה יכול להקל על ייבוש.
- דגירה מושבות ספוט-25 ° C ו- 80-100% לחות, בחושך עד 4 ימים.
2. הכנת הפתרון מקבע
- להכין את הפתרון לשבועיים ביום של מדגם קציר. לדלל 37% פורמלדהיד (FA) ב- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 4% הפא.
התראה: הפא הוא תנודתי, רעיל. ללבוש ציוד מגן ולעבוד בשכונה-fume מאוורר היטב. - מיד לפני שימוש, להתמוסס L-ליזין הידרוכלוריד ב 4% פא (להכין בשלב 2.1) בטמפרטורת החדר כדי ריכוז סופי של 50 מ מ L-ליזין HCl.
3. ישירה ליישום של מקבע המושבה Biofilm [אופציונלית]
הערה: מצאנו כי biofilm מורפולוגיה נשמר בצורה הטובה ביותר כאשר הכיסוי אגר נוספת לפני קיבוע. עם זאת, שלב זה מהווה גם שינוי בתנאים סביבתיים יכולים להשפיע על ביטוי גנים. כתב פלורסנט ביטוי דפוסי צריכה ולכן אפשר יהיה לאמתו באמצעות פרוטוקול נפרד שבו הצעד קיבוע מבוצע לפני התוספת של הכיסוי אגר, כפי שמתואר כאן.
- ביום של קיבעון, והוא פועל בשכונה-fume מאוורר היטב, pipette מקבע את מוכנה בשלב 2 ישירות אל פני השטח אגר סביב הקצה של המושבה, ולאפשר לו להגיע לפריפריה של המושבה בלי השוקע זה. חלים רק כמו הרבה מקבע כמו יש צורך מלא להקיף את המושבה, כ-500 µL. להתיר את מקבע לנטרל לתוך המושבה, אגר המקיפים.
- ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה ומדיה שמסביב, בערך 20-30 דקות, הפא שיורית אינה גלויה על הצלחת, חזור על שלב 3.1. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב.
- ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה, מדיה שמסביב חזור על שלב 3.1, הפעם החלת מקבע פני השטח של המושבה ישירות. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב, ממשיך לשלב 4 רק אחרי הכל מקבע כבר נספג, אינה גלויה על הצלחת.
4. overlaying מושבות עם אגר
- ביום של קיבעון, להכין 10 גרם/ליטר פתרון אגר מים יונים, החיטוי במשך 10-20 דקות להתמוסס. מגניב באמבט מים כדי 50 הלעפה תרוטרפמט
- שופכים בעדינות 15 מ"ל של הפתרון אגר מדיום הגידול ואת המושבה. לאפשר את אגר ליצירת ג'ל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות (איור 1B).
- השימוש סכין גילוח חדה לחתוך של צ'אק מרובע, 3-שכבה עם המושבה למינציה בין שתי השכבות העליון. אם הכנת דוגמאות מרובים, ודא כי כל צ'אק הוא חתך לגודל דומה.
- הסר בעדינות אגר עודף הצ'אק המכיל מושבת.
- כדי להרים את שתי השכבות העליונות של אגר (המכיל את המושבה) מן השכבה התחתונה של הצ'אק (איור 1C), להרטיב ראש שטוח מרית 1 x PBS או מים ולהוסיף בעדינות בין הרבדים העליונים והתחתונים. המושבה למינציה צריך להפריד בין השכבה התחתונה. יש להיזהר לא לעוות או לכופף את המושבה למינציה בעת הרמת זה מבסיסו.
5. קיבוע
- עובד בברדס fume מאוורר היטב, להעביר מיד המושבה למינציה (קרי, צ'אק 2-שכבה) לתוך קלטת ההטבעה (ראה טבלה של חומרים), שכותרתו עם עט סימון עמיד כימי. למקם את הקלטת ההטבעה למבוטחים שקופיות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) המכיל את מקבע שהוכנו בשלבים 2.1-2.2. ודא כי ישנם אין בועות אוויר לכוד בתוך בקלטת ההטבעה.
- דגירה המדגם לשבועיים בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
6. דוגמת עיבוד: מאגר לשטוף, התייבשות, סליקה, הסתננות
- לאחר קיבוע בין לילה, לשטוף את הדגימה פעמיים ב- PBS 1 x על 1 h. לקבלת תוצאות מיטביות, להפוך לאוטומטיות המגון ריאגנט להשתמש במהדורה הפונקציה של מעבד רקמות אוטומטית (ראה טבלה של חומרים) מוגדר קביעת ערך נמוך. אם המעבד לא זמין, ניתן להפעיל עיבוד ידני.
- פעל לשטוף את מאגר על-ידי התייבשות באמצעות סדרת דילולים אתנול (EtOH) ב- PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) מדורגת 1 h כל בטמפרטורת החדר.
- מייבשים ב שלושה שוטף של 100% EtOH על 1 h כל בטמפרטורת החדר.
- נקה המדגם מיובש ב שלושה שוטף של סוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז 100% (ראה טבלה של חומרים) עבור 1 h כל בטמפרטורת החדר.
- לחדור הדגימה שנוקה פעמיים עם שעווה מותכת שעווה (ראה טבלה של חומרים), מחומם ל 55˚C, כבר שעתיים כל אחד.
7. דוגמאות הטבעה
- ממלאים תבנית שעווה מותכת פרפין מחומם ל הלעפה תרוטרפמט 55. השתמש מרית מחוממת שטוחים, להעביר במהירות את הצ'אק הסתנן מ בקלטת ההטבעה לתבנית שעווה, המבטיח הצ'אק. מונח מקביל לבסיס התבנית. למנוע הפעלת לחץ יתר על גבי הצ'אק. שעווה בתבניות ייתכן תלת-ממדי מותאמת אישית מודפס, או אינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
- אפשר שעווה לגבש בין לילה-הלעפה תרוטרפמט 4. ניתן לאחסן דגימות יצוק ומצופה בשעווה מוצק ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט.
- לאחר השעווה התחזק, לסלק את הדגימה של העובש ולחיתוך שעווה עודפת מ מסביב הדגימה. עם סכין גילוח. להשאיר עודף שעווה הארכת מקצה אחד של המדגם, מקביל למישור חלוקתה, זה יכול לשמש כדי. תהדק את זה לתוך האזמל הקטן (ראה טבלה של חומרים). גם יוצאים נדן ווקס, כ 1 מ מ עבה, סביב המדגם, להחליק את הפנים שלה.
8. חלוקתה
- חום באמבט מים כדי הלעפה תרוטרפמט 42. תהדק את המדגם לתוך האזמל הקטן עם פני השטח של המושבה מונחה בניצב על קצה הלהב (ראה טבלה של חומרים).
- חתוך את הדגימה במרווחים 50-מיקרומטר עד הגיעה למטוס הרצוי של המושבה, שממנו ייאספו מקטעים.
- חותך רצועה של המספר הרצוי סעיפים בעובי 10-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום של הגדר מהירות אופטים של 75-80 סל"ד ואת זווית סיווג של 6-10˚ להשתמש במכחול שקצהו הקנס כדי לנתק את רצועת הכלים של הלהב.
- באמצעות טיפת מים בקצה של פסטר פיפטה (מועדפת) או מלקחיים, להעביר בעדינות את רצועת הכלים המים הרותחים. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת המקטע.
- מיד להוסיף שקופית לאמבט מים ומקם אותה מתחת לרצועת הכלים בזווית של 45˚.
- לגעת בקצה הצר של רצועת הכלים אל השקופית, רק מתחת לתווית עמומה. רצועת הכלים צריך לדבוק.
- משוך את השקופית מהאמבטיה מים, התאמת הזווית להיות בניצב למשטח של המים, ומאפשר הכלים כדי להשתטח נגד השקופית לאורכו. למנוע השמנה עודף מים מתחת לרצועת הכלים.
- בעדינות לעמוד השקופית אל סופג נטולת רקמות, הפתילה המים העודפים מהסעיף.
- להניח את השקופית על מגבת נייר, ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה בחושך. ניתן לאחסן שקופיות ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט בחושך.
9. חום-תיקון התייבשות, הרכבה
- מחממים תנור מפולס כדי הלעפה תרוטרפמט 45. מחממים את השקופית למשך 30-60 דקות. השעווה להיות מותך למחצה ולשטח נגד השקופית.
- בעדינות להרים את השקופית מ הכיריים ושים אותה שטוח על משטח חלק, מפולס, בטמפרטורת החדר, באמצעות טיפול להבטיח כי שעווה מותכת לא למשוך בכל צד של השקופית, עד שהשעווה עפור (~ 1 דקה).
- באמצעות הדיוור שקופיות זכוכית, שעווה מבטל את השקופיות ארבע שוטף של הבהרת סוכן עבור 5 דקות כל אחד, באמצעות ליניקת ביכנר כדי להסיר את הפתרון בין שוטף.
- לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-100% EtOH עבור 1 דקות כל אחד.
- נתרענן השקופיות בסדרה מדורגת של אתנול בסדר ההפוך של עיבוד (95%, 70%, 50% ו- 25%) 1 דקות, ולאחריו שוטף 1-מין שני ב- 1 x PBS.
- מיד הר הסעיפים במדיום באגירה טריס הרכבה (ראה טבלה של חומרים) ולהחיל על coverslip, הימנעות המבוא של בועות אוויר. לאפשר הרכבה בינוניים עד פולימריזציה ללילה בטמפרטורת החדר.
- ברגע polymerized, חותם את coverslip אל השקופית באמצעות לק ברורה. ניתן לאחסן שקופיות אטום ללא הגבלת זמן בחושך-הלעפה תרוטרפמט 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו יוצרת biofilm דק-סעיפים שבה תכונות מורפולוגיות שונות ואזורי גנים יכולים לדימות על ידי DIC, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, TEM. בעוד DIC הדמיה באמצעות 40 X שמן טבילה המטרה יכול להיות מספיק כדי להראות כמה תכונות מורפולוגיות (איור 2E), מצאנו כי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של זנים מתוכנן חלבון פלואורסצנטי צורונים אקספרס מספקת משופרת ויזואליזציה של התפלגות התא בתוך המדגם (איור דו-ממדי). תמונות של מקטעים בודדים ניתן להשתמש ביריעות ליצירת חתך רוחב של המושבה כולה (איור 2B), כדי לספק הקשר עבור ההתאמה של תכונות מבניות בתוך המבנה הכללי ברמה מאקרוסקופית (השווה איור 2A, B, ו- C). תכוניות מורפולוגיות, אותות פלואורסצנט ניתן למדוד באמצעות תוכנת הדמיה14. מבנים בתוך biofilm או מעברים בין אזורי גנים ואז ישויך עם הפצות של מטבוליטים או מעברי צבע כימי11 .
פרוטוקול זה יכול להיות מתוקן ומותאמים במספר דרכים. שימוש זן מתוכנן חלבון פלואורסצנטי אקספרס תחת השליטה של מקדם מכירות מסוים מאפשר הדמיה של ההתפלגות של ביטוי גנים (איור 3 א). ניתן לגדל מושבות באמצעי המכיל צבעים, או צבעים ניתן להוסיף פוסט-חלוקתה, כתם סוכרים מסוימים (דמויות 3B ו- C). לבסוף, דגימות המבושלות גירסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיבדק על ידי TEM (איור 3D) כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר זה מופעל על-ידי DIC או קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
איור 1: מפרטים טכניים המתארים ההתקנה לצמיחה המושבה לפני קיבוע.
(א) מושבות גדלים על גבי שתי שכבות של מדיום הגידול פני השטח-למוצק אגר (העליון והתחתון), (ב) הערוכים בשכבות ואז שכבה חדשה (שכבת-על), השומרת את המושבה מורפולוגיה. (ג) המושבה דחוקה בין שכבת-על השכבה העליונה ואז מופרדת מן השכבה התחתונה עיבוד נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Micromorphological ותכונות YFP פלורסצנטיות, חתכי רוחב של מושבות פרפין-מוטבע.
נציג נתונים עבור Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz המושבה15 צורונים לבטא YFP גדל במשך 3 ימים ב- 1% טריפטון, אגר 1% המכיל Coomassie, קונגו אדום כחול. (א) להציג העליונה, קרינה פלואורסצנטית תמונת מראה חצי מושבה לפני קיבוע. (ב) חתך רוחב של המושבה כולה לאחר הטמעת פרפין. האזור מסגרת צולמה עם עדשה המטרה X 10 (ג). אזור מסגרת ב (ג) היה אז עם תמונה עם 40 X עדשה המטרה של טבילה שמן באמצעות קרינה פלואורסצנטית (ד) ו- DIC (E). סולם העמודות מייצגות 2 מ מ (א), 500 מיקרומטר (B) ו- 100 מיקרומטר (ג-ה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כתב ביטוי, מראש, שלאחר ההגדלה של תכונות biofilm, TEM הדמיה של המושבה פרפין-מוטבע biofilm דגימות.
(א) mexGPr-GFP כתב קרינה פלואורסצנטית במושבה aeruginosa פ PA14 גדל במשך 3 ימים על טריפטון 1%, 1% אגר. (ב) זריחה קונגו מאוגד, באדום מושבה synxantha פ גדל במשך 5 ימים על מדיום המכיל לצבוע. (ג) זריחה של הכתם לקטין ויסטריה floribunda עבור רב-סוכר פל במושבה aeruginosa פ PA14 Δphz (גדל במשך יומיים על טריפטון 1%, 1% אגר המכיל קונגו אדום ו Coomassie כחול), להחיל לאחר חלוקתה. (ד) TEM תמונה של מושבה Δ aeruginosa פ PA14phz (גדל במשך 3 ימים ב- 1% טריפטון, אגר 1% המכיל Coomassie, קונגו אדום כחול), ומעובדים על חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין *. סרגל קנה מידה מייצג 40 µm (A-B), 20 מיקרומטר (ג) ו- 5 מיקרומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
* דוגמה זו היה מעובד עבור חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין דרך בשלב 4 של פרוטוקול לעיל, תוך השמטת צעדים 4.1-4.3, ומעובד מכן בנפרד לניתוח TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגימות רקמה הטבעה-פרפין, דק-חלוקתה היא טכניקה היסטולוגית הקלאסי מאפשר הדמיה של מבנה מיקרו-מורפולוגי, משמש בדרך כלל על רקמות האיקריוטים ולאחר הוחלה בהצלחה מסוימת על חיידקים דגימות8 ,9. בעוד cryoembedding מאפשר שמירה חזקה של אות אנדוגני, immunofluorescent, פרפין הטבעת היא כלל עדיף כפי ומוצריה יותר מורפולוגיה16. בהתאמת בשיטה זו עבור יישום כדי חיידקים פתוגנים המועברים במזון, התמקדנו מאפיינים ייחודיים למערכת שלנו. התאים ואת מטריצה של רקמות לעיתים קרובות מוחזקים ביחד יחסית robustly, בעוד biofilms נוטים להיות עדין יותר; אנחנו אופטימיזציה לכן קיבוע שגרתית ושעווה הטמעת פרוטוקולי להגדיל את המדגם השמירה. שמירה על המדגם על מצע הגידול שלה, שכיסה את המושבה עם אגר מייד לפני קיבוע מבטיחה כי המדגם אינו אבוד מהחלק העליון או הבסיס. עם זאת, שכיסה מושבות עם אגר זה חם מדי עלולה לגרום נזק המושבות, ולכן יש לנקוט משנה זהירות במהלך שלב זה.
קיבוע שלב קריטי עבור מבנה דרך התייבשות קשה, ניקוי, שמירה, הסתננות השלבים הנדרשים להטבעת פרפין. מצאנו באותו קיבעון ליזין-פורמלדהיד הכי טוב שומר על השלמות של המדגם. ליזין מסיסים, diamine ב, יכול להגיב עם aldehydes כדי ליצור פולימרים צולבים, הוצע לחזק את החומר exopolymeric (EPS) נגד השפלה מכני17,18.
הבחנו כי הרקע פלורסצנטיות יורדת עם רצופים שוטף את הסוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז, או באמצעות חשיפה ממושכת, במהלך מדגם התייבשות (שלב 9.3). טיפול יתר עם הסוכן ניקוי יכול, עם זאת, לגרום דגימות שבירות שקשה סעיף19. יתכן צורך להתאים את אמצעי האחסון או את מספר שוטף כדי לשקף את הסכום של שעווה נוכח במהלך כל התייבשות. קרינה פלואורסצנטית רקע מוגבר יכול לנבוע גם זיהום של הרקמה עיבוד ריאגנטים, איפה השעווה, וזה קצת autofluorescent, באופן מלא או באופן חלקי miscible ניקוי ממיס או אתנול בשימוש השלבים (שלבים 6.1-6.4). בנוסף, מצאנו כי אתנול פוחתת כתב אות, זה קריטי להוות מחדש את fluorophore בעוד שני שוטף ל- PBS לפני הרכבה (שלב 9.5-9.6).
שיטה זו מאפשרת גם עבור הלוקליזציה של קרינה פלואורסצנטית מכוננת ומונהג על-ידי יזם ברזולוציה של תאים. עם זאת, אנו מייעצים זהירות כאשר משתמשים בשיטה זו כדי לפרש ביטוי גנים. הצעד כיסוי הציג את פרוטוקול זה (שלב 4.2), חלה לפני קיבוע ב 50 הלעפה תרוטרפמט, מציג שינוי סביבתי ניכר ביחס לתנאי הגידול הראשוני שעשוי להשפיע על דפוסי ביטוי גנים. זה עשוי להיות שימושי לאמת דפוסי ביטוי על-ידי החלת מקבע למושבה ישירות, מייד לפני מזיגת הכיסוי, אבל עם עלות מורפולוגיה (שלב אופציונלי 3.1-3.3).
גורם נוסף המשפיע את הפרשנות של קרינה פלואורסצנטית הוא הטופוגרפיה של הסעיף עצמו. אזורים שונים של biofilm עשויים להפגין בדרגות שונות של שלמות מבנית, להיות פחות או יותר מקובל שימור דרך קיבעון, בהתאם, אם בכלל, קבוצות פונקציונליות רכיבים אלה הם מסוגלים לתרום מקבע cross-linking 20. כתוצאה מכך, סעיפים עלולים לאבד ביומסה פרופורציה מהמשטח סעיף כאשר משתנה מאזור מורפולוגיים או מטבוליות אחד למשנהו לאורך ציר z של המושבה. זה יכול להתבצע על ידי הדמיה פרוסה מוקד שלם של המקטע עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
בנוסף להחלה טכניקה זו זנים מהונדסים חלבונים אקספרס הניאון, בחנו תכונות micromorphological על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ועל בדגימות biofilm צבעונית עם צבעי פלורסנט ספציפיים (איור 3A ). ג'נינגס. ואח תיאר לאחרונה צבע ספציפי עבור פל, רב-סוכר העיקרי המיוצר על ידי biofilms פ aeruginosa PA14 21. כפי שמתואר התוצאות. פרוטוקול ונציג לעיל, היישום של זה צבע למקטעי מאפשר הדמיה של הפצה פל PA14 biofilms המושבה ברזולוציה גבוהה (איור 3C) 3. לעומת זאת, צבעי פלורסנט כגון אדום קונגו עשויים להתווסף מדיום הגידול, עם תמונה פוסט-אופטים (איור 3B). היישום של כיסוי גם שומר המושבה biofilm מבנה התא ומורפולוגיה במהלך עיבוד עבור TEM (איור תלת-ממד).
שיטת אופטימיזציה המתוארים כאן מאפשרת ההכנה של המושבה biofilms חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין, שבה האות אנדוגני, תכונות או צבעי ומורכבת עשוי להיות מותאם ויוו עם רזולוציה מעולה תוך מזעור מדגם המושבה יליד מאקרו - ו מיקרו-מורפולוגיות אובדן ושימור. אנו להכיר כי מאמץ ניכר, זמן ושימוש ריאגנט נדרשים עבור שיטה זו. עם זאת, אנחנו מרגישים שאת החסרונות האלה הם להגיב על-פי מידת של שימור מורפולוגי, הרזולוציה של זריחה בבאתרו את amenability קדם ושגרות שלאחר ההגדלה או אסטרטגיות עיבוד חלופיות (כגון הכנה TEM) המוענקת על ידי שיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF הקריירה פרס 1553023 ופרס NIH/NIAID R01AI103369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
