Summary
Este protocolo describe un acercamiento fluido fisiológicamente relevante, presurizado para la inducción rápida y reversible de las várices en las neuronas.
Abstract
Várices axonales son estructuras ampliadas a lo largo de los ejes de axones con un alto grado de heterogeneidad. Están presentes no sólo en los cerebros con lesiones o enfermedades neurodegenerativas, sino también en el cerebro normal. Aquí, describimos un sistema de micromechanical recién establecida rápidamente, confiable y reversible inducir várices axonales, lo que nos permite entender los mecanismos que regulan la formación de várices y de composición heterogénea. Este sistema representa un nuevo medio para evaluar los efectos del estrés de compresión y cizalla en diferentes compartimentos subcelulares de las neuronas, diferentes de otros sistemas en vitro que se centran principalmente en el efecto de estiramiento. Importante, debido a las características únicas de nuestro sistema, recientemente hizo un nuevo descubrimiento que demuestra que la aplicación de fluido a presión puede inducir várices axonales a través de la activación de un canal potencial de receptor transitorio rápido y reversible. Nuestro sistema biomecánico puede utilizarse convenientemente en combinación con perfusión de drogas, proyección de imagen de células vivas, proyección de imagen de calcio y parche abrazadera grabación. Por lo tanto, este método puede ser adoptado para el estudio de canales del ion mechanosensitive, regulación de transporte axonal, dinámica del citoesqueleto axonal, señalización de calcio y cambios morfológicos relacionados con traumatismo craneoencefálico.
Introduction
Formación de várices o inflamación o abalorios, a lo largo de los axones, es una característica prominente de la neurodegeneración observada en muchos trastornos o lesiones del sistema nervioso central, incluyendo esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y traumática cerebro lesiones1,2. A pesar de los significativos impactos fisiológicos de várices axonales en la propagación del potencial de acción y transmisión sináptica3, cómo se generan las várices se desconoce. Recientemente, usando un análisis microbiomechanical de reciente creación en neuronas hippocampal cultivadas de los roedores, encontramos que los estímulos mecánicos pueden inducir várices en estas neuronas con muy interesantes características. En primer lugar, la inducción de várices es rápida (< 10 s) y este proceso es reversible de forma inesperada. En segundo lugar, iniciación de varices depende de la fuerza que sopla a presión: cuanto mayor sea la presión, más rápido la iniciación. En tercer lugar, iniciación de varices depende de edad neuronal. Los axones de las neuronas más jóvenes aparecen más sensibles a la tensión mecánica, en comparación con los de las neuronas más viejas. En cuarto lugar, la forma de várices a lo largo de los axones de las neuronas hipocampales, dendritas y segmentos inicial del axón de estas neuronas no muestran ningún cambio bajo la misma condición que sopla. Por lo tanto, nuestro estudio reveló una característica novedosa de polaridad neuronal. Estos resultados con el sistema in vitro son fisiológicamente relevantes. Usando un modelo en vivo para lesiones traumáticas leves del cerebro (mTBI), demostramos que várices axonales desarrollaron de una manera multi-focal en la corteza somatosensorial de los ratones inmediatamente después del impacto de cierre-cráneo, consistente con nuestro en vitro resultados4. Es importante tener en cuenta que la tinción y proyección de imagen de los ratones de la LCT sólo proporcionan un tiro rápido de cambios morfológicos neuronales, desde realizar en vivo Time-lapse la proyección de imagen de morfología neuronal durante un impacto mecánico es todavía no es factible.
Este sistema de líquido soplar nos permitió no sólo para capturar características únicas asociadas con la formación de várices inducida por estrés mecánico, sino también para determinar el mecanismo subyacente. Probando diferentes soluciones extracelulares, los bloqueadores y abridores de diferentes candidatos de mechanosensitive canales del ion y electrofisiología celular, identificamos que el catión potencial transitorio del receptor canal de miembros de la subfamilia V 4 (TRPV4) canal que es permeable al Ca2 + y Na+ y activado por soplar es principalmente encargada de detectar el estrés mecánico inicial durante la formación de várices axonal4. Esto fue confirmado más con un enfoque de nocaut de siRNA. Tomados en conjunto, este nuevo sistema de análisis que hemos desarrollado con cultura de neurona del hipocampo, es muy valiosa para el estudio de las propiedades de la micromecánica de las neuronas centrales, especialmente en combinación con otras técnicas.
Este sistema de micromechanical que hemos establecido es única y difiere de los sistemas previamente existentes en varios aspectos importantes. En primer lugar, en este sistema, las neuronas experimentan estrés mecánico fuera de plano en las formas de compresión y corte. Durante el impacto mecánico, procesos neuronales permanecen adheridos a la superficie del cubreobjetos y no se mueven. Esto difiere de otros sistemas que participan principalmente de flexión y estiramiento en el plano experimental (o tensión), por ejemplo, la desviación de axones incluidas como mover cuerdas5,6 o estiramiento de axones en micropatterned canales y membranas elástica7,8. Por otra parte, aunque las várices axonales pueden ser también inducidas en estos ensayos como en nuestro sistema que sopla el fluido, el proceso en estos ajustes toma mucho más tiempo (de 10 minutos a varias horas6,7,8) y aparece irreversible. Por último, nuestro sistema usando soplar líquido local permite el examen de las características espaciales de la formación de várices (e.g., dendritas, espinas dendríticas, soma, segmentos iniciales axonales, terminales axonales), además de sus características temporales. Mediante este sistema, descubrimos varias características inesperados y únicos de la formación de várices axonal, especialmente Inicio rápido lenta reversibilidad y polaridad de axón-dendrita.
El sistema que comentaremos en este artículo es compatible con muchas de las técnicas de molecular y biología de la célula. Por ejemplo, para estudiar los efectos del estrés mecánico sobre la morfología neuronal y función, puede ser utilizado junto con cocultivo de mielina, Time-lapse de imágenes de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) proyección de imagen de calcio y parche abrazadera grabación. En este artículo, nos centramos en los componentes del sistema. Cultura de neuronas hippocampal, líquido soplar configuración, alta resolución imágenes de Time-lapse para transporte axonal y proyección de imagen de calcio se ilustran paso a paso a continuación.
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Protocol
Todos los métodos descritos a continuación han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.
1. cubreobjetos preparación
- Coloque una o más cajas de cubreobjetos de 12 mm o 25 mm en un vaso de vidrio que contiene ácido nítrico del 70% e incubar el cubreobjetos a temperatura ambiente durante la noche.
Nota: No lave el cubreobjetos de 25 mm en el mismo vaso como el cubreobjetos de 12 mm. Es mejor lavarlos por separado. - Transferir los cubreobjetos en un vaso de 4 L con 2.5 L de ddH2O y agitar el vaso que contiene el cubre-objetos durante 1 h a 100 rpm. Utilizar bandas de goma para sujetar el vaso durante el sacudimiento. Repetir el enjuague con fresco 2.5 L Dec2O cuatro veces.
- Transferencia de cubreobjetos limpio a un frasco seco con una cubierta de metal. Hornear el cubreobjetos en un horno a 225 ° C por 6 h y déjelos enfriar a temperatura ambiente.
Nota: El cubreobjetos de 25 mm es fractura propenso. Separar cubreobjetos uno por uno y secar al aire, luego hornear en un horno. - Guarde el cubreobjetos limpio y seco a temperatura ambiente en un recipiente de plástico esterilizado hasta uso.
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Cubrir el cubreobjetos como sigue:
- Preparar solución fresca capa en un tubo de centrífuga.
- Coloque cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos (o bien 6). Colocar 30 (o 100) μl de solución de recubrimiento cubreobjetos (tabla 1) en un cubreobjetos de 12 m m (o 25 mm) y remolino. Añadir 1 mL de tampón fosfato salina (PBS, grado de cultivo de tejidos) al pozo. Estas placas pueden utilizar inmediatamente o almacenar a 4 ° C en PBS estéril por hasta una semana.
- En el día de la disección, retirar el PBS. Seque y coloque las placas bajo luz UV (30W) para 2-4 h.
Nota: El último paso debe completarse con la luz UV en una campana de flujo laminar de la cultura de célula. La puerta de la campana se debe levantar ligeramente para permitir el flujo de aire para secar el cubreobjetos.
2. disección, la disociación y la cultura de neuronas hipocampales de rata ratón embarazada
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Disección y disociación de las neuronas hippocampal de la cultura
- Descongele la solución de enzima de proteasa (protease de 3 mg/mL 23 en SLDS, tabla 1) y caliente previamente las placas media (tabla 2) a 37 ° C.
- Hipocampo de diseccionar y enjuague con SLDS, según los métodos descritos en la anterior publicación14.
Nota: Cuatro hipocampos proporcionan suficientes células para un pozo de 24 o una placa de 6 pozos. - Quitar SLDS, añadir 2 mL de solución de enzima proteasa e incubar la muestra a 37 ° C, 5% CO2 durante 15 minutos.
- Lavar dos veces los explantes de hipocampo con 5-10 mL de medio de chapado. Añadir 5 mL de medio de la galjanoplastia. Disocian hippocampal explantes en las células generando un vórtice pequeño usando una pipeta con una punta de plástico de 1 mL. Pipetee hacia arriba y hacia abajo cerca de 40 veces, evitando la formación de burbujas de oxígeno, hasta que la solución se vuelve turbia y no pedazos grandes de explante siendo.
Nota: Recuerde dejar algunos medios de comunicación durante los lavados, los explantes hipocampales deben permanecer sumergidos en el medio durante todo el proceso. - Centrifugar las células a 1.125 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante con las células sumergido en medios de comunicación. Resuspender las células en 145 mL de medios de la galjanoplastia. Añadir 1 mL/pozo de la suspensión celular a una placa de 24 pocillos (3 mL/pocillo de una placa de 6 pozos).
Nota: 145 mL de medios de la galjanoplastia se utiliza para producir una suspensión de células que tiene una densidad baja de la célula. Este volumen permitirá la galjanoplastia de las células en placas de 24 pocillos seis, ocho placas de 6 pocillos o varias combinaciones de platos bien 24 o 6 dependiendo de los experimentos a llevarse a cabo. Cada pocillo de la placa de 24 pocillos tendrá aproximadamente 3 x 104 células9. - Incubar las células en los medios de la galjanoplastia a 37 ° C, 5% CO2 para 2-4 h, luego retirar todos los medios de la galjanoplastia y sustituirla por los medios de mantenimiento fresco.
- Después de 2 días (2 días en vitro, 2DIV), vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con 2 μm ara-c (Arabinosilcitosina) disuelto en los medios de mantenimiento que inhiben el crecimiento de fibroblastos, células endoteliales y glial. Después de exponer las células a Ara-C para dos días, vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de mantenimiento fresco.
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Transfección para la visualización de la morfología celular
Nota: Transfectar las células con construcciones fluorescentes de la proteína fluorescente de la proteína verde fluorescente (GFP), amarillo (YFP), mCherry, etc. para iluminar la morfología de las neuronas individuales.- Diluir las construcciones de la acción (1 μg/μl) en los medios de comunicación Opti-MEM (0.8 μg de la construcción en 50 μl de medio de Opti-MEM) y vortex. Preparar 1 dilución de construcción para cada pozo.
Nota: Un plato 24-well requiere de 0.8 μg de construcción en 50 μl de medio de Opti-MEM. Una placa de 6 pozos requiere 2,4 μg de construcción en 150 μL Opti-MEM los medios de comunicación. - Diluir el reactivo de transfección mediada por liposomas en Opti-MEM medios (1,5 μl del reactivo de transfección en 50 μl de medio de Opti-MEM) y vortex. Preparar 1 dilución de transfección para cada pozo.
Nota: Una placa de 24 pozos requiere 1,5 μl de reactivo de transfección en 50 μl de medio de Opti-MEM. Una placa de 6 pozos requiere 4.5 μl de reactivo de transfección en 150 μL de medio de Opti-MEM. - Prepare una mezcla 1:1 (100 μL) de la construcción en el reactivo de transfección y medios Opti-Mem en medios Opti-MEM y vortex. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Nota: Por el bien, debe haber cerca de 100 μl de solución constructo, reactivo de transfección y Opti-MEM medios si se utiliza una placa de 24 pozos (300 μL para placa de 6 pozos). - Quitar la mitad de los medios de comunicación (500 μL para la placa de 24 pocillos, 1,5 mL de placa de 6 pozos) de cada bien y transferir este medio a un tubo limpio cónico. Mantenga este tubo en el incubador. Luego añadir la mezcla de 100 μl (paso 2.2.3) a los restantes medios de comunicación en el pozo. Permitir a las células a incubar a 37 ° C durante 20-30 min.
- Durante la incubación (paso 2.2.4), añadir un volumen de medio fresco mantenimiento a los medios de comunicación en el tubo cónico (paso 2.2.4). Coloque la mezcla en la misma incubadora (37 ° C y 5% CO2).
- Después de la incubación, retirar todos los medios que contienen la solución de la transfección de los pozos y reemplácelo con la mezcla 1:1 de la antigüedad y los medios de mantenimiento fresco en el tubo cónico (paso 2.2.5).
Nota: Dependiendo del tamaño de las construcciones, las células pueden comenzar expresando dentro de 12 h; para construcciones más grandes, se puede necesitar 3-4 días antes de alcanza la expresión máxima de las construcciones.
- Diluir las construcciones de la acción (1 μg/μl) en los medios de comunicación Opti-MEM (0.8 μg de la construcción en 50 μl de medio de Opti-MEM) y vortex. Preparar 1 dilución de construcción para cada pozo.
3. puesta en funcionamiento del aparato que sopla de la pipeta
Nota: Hay cinco componentes básicos de este montaje: la pipeta de cristal, el tubo, la jeringa, el instrumental quirúrgico y el buffer (Hank). Cualquier tampón que tiene concentraciones fisiológicamente relevantes de la sal podría utilizarse en este montaje.
- Tire una pipeta de borosilicato para tener alrededor de 45 μm de diámetro abertura punta utilizando un extractor de la micropipeta y las especificaciones en la tabla 3.
Nota: Se encontró que 45 μm es un tamaño adecuado para el diámetro de la pipeta de apertura bajo condiciones experimentales. Ligeras variaciones en el tamaño de la abertura no deben afectar significativamente los resultados. Es importante señalar que salidas más grandes de este número aún deben trabajar para la inducción de várices ajustando la altura de la jeringa que está vinculada a la pipeta a través de la tubería, pero esto requerirá calibración del valor de presión. - Inserte el extremo no tiró de la pipeta en el tubo delgado de caucho.
Nota: La pared de la tubería debe ser fino y rígido para minimizar la resistencia del líquido, asegurándose de que la altura de la jeringa es directamente proporcional a la presión del fluido que fluye a través de la pipeta con resistencia despreciable. La tubería debe ser ya no de unos 0,6 m de longitud a otro minimizar la resistencia. - Conecte el otro extremo de la tubería a una jeringa de plástico de 10 mL a través de un conector con una válvula capaz de vuelta.
Nota: La jeringa de plástico debe realizarse a una altura constante, medible para una medida exacta para la supuesta presión que fluye de la pipeta. Se utilizó una altura de 190 mm, ya que esto proporciona presión mínima pero confiablemente induce várices en axones. También pueden utilizar otros valores de altura si la presión de hacer que las células se separan de la superficie del cubreobjetos. Se recomienda utilizar el mismo valor durante todo el experimento. - Introduzca la pipeta en la parte superior del tornillo de las amalgamas dentales para sujetar la pipeta en posición. El tornillo metálico, plana rematada fija al brazo instrumental quirúrgico por lo que sostiene el extremo de la o.n.u-tirado de la pipeta justo arriba donde se une el tubo de goma. Ángulo de la pipeta en un ángulo de 45° con la superficie de los cubreobjetos que contiene neurona.
Nota: El instrumental quirúrgico debe ser construido de modo que la pipeta puede ser sostenida sin constricción en el tubo de goma. El instrumental quirúrgico debe permitir el movimiento de la pipeta en la direcciones de z, x y y con precisión la posición dentro de la gama de las células. Un gráfico así como una fotografía del aparato se proporciona a continuación (figura 1). - Activar un filtro de fluorescencia, abrir la abertura y asegurar que un punto fluorescente se puede ver que a través del objetivo. Mediante el micromanipulador, mueva la pipeta en una posición que alinea la punta con el spot fluorescente y coloque la pipeta en una posición justo por encima de la altura de la placa de cultivo celular (35 x 10 mm). Una vez en posición, encienda la luz transmitida y apagar de la fluorescencia.
- Con unas pinzas, añadir un cubreobjetos (con las celdas mirando hacia arriba hacia la pipeta) de la placa de cultivo celular para la placa de cultivo celular que contiene aproximadamente 2 mL de tampón de Hank a temperatura ambiente.
- Coloque la placa de cultivo con el cubreobjetos sobre el ámbito de aplicación.
- Usando la perilla de enfoque fino y objetivo 20 X, se centran en un plano aproximadamente cuatro vueltas completas sobre las células (aprox. 0,4 mm). Utilizar el instrumental quirúrgico para colocar la punta de la pipeta que se centra y en el centro, lado izquierdo del avión a través de los pedazos del ojo.
Nota: Las dendritas son proyecciones que deben estar en el mismo marco que el cuerpo de la célula que originan. Para inducir várices axonales, uno debe seguir más proyecciones del cuerpo celular a axones mediales y distales.
4. calibración de la presión de la pipeta utilizando un sistema de membrana elástica
- Configurar el aparato que sopla de la pipeta con los mismos parámetros exactos como se describe anteriormente sobre un sistema que contiene una membrana de silicona recientemente (500 μm de diámetro) y 50 μm de espesor y enfocar el microscopio sobre la superficie de la membrana.
Nota: Este sistema fue diseñado para medir los valores de presión pequeña y una explicación del sistema ha sido publicada antes de10. Esta medida sólo debe hacerse una vez para soplar experimentos si se utiliza la misma configuración exacta de fumar. - Enfocar el microscopio en las matrices de diethylamide (4 μm de diámetro) y 10 apart, medido entre centros. Gire la válvula de cierre y deje que el fluido salga de la pipeta. Examinar la deflexión de la membrana en respuesta a la presión del líquido con un microscopio confocal.
- Utilizar un modelo lineal para determinar la presión correspondiente asociada a desviación de la membrana.
Nota: Mientras que un reciente estudio encontró que una desviación de w =-3.143 ± 0.69 μm fue obtenida de 190 mm de altura de jeringa, esto produce una presión de 0,25 ± 0.06 nN/μm2 de la configuración actual de la pipeta, que está dentro del rango fisiológico y patológico, aunque la altura de la jeringa no es el único factor determinante. Otros factores influyen en el valor de la presión exacta en las neuronas, incluyendo pipeta apertura, posicionamiento (distancia y ángulo) de la punta en relación a las células y aún la flexibilidad de la tubería4,10.
5. soplar para inducir várices
- Una vez la pipeta en posición, enfocar el microscopio sobre un plano que contiene una región de interés. Posición de las células y los procesos en la mitad izquierda del campo imagen (visto por captura vivo de la cámara) dentro del área que sopla, mientras que la mitad derecha es fuera del área el soplar.
Nota: Debido a la amplia extensión de los axones y las dendritas de las neuronas, es poco probable que todos los procesos de una neurona están dentro de la misma zona que sopla. Esto es realmente una de las ventajas de este sistema, que permite el examen de los efectos locales de soplar. Hay dos tipos de fumar que pueden ser utilizados para inducir várices: larga duración soplar y soplar de pulso. -
Que sopla
- Larga duración que sopla
- Coloque la jeringa en la altura, 190 mm por encima del cubreobjetos que contiene neuronas cultivadas4. Comenzar el Time-lapse proyección de imagen del área de interés con un tiempo de exposición optimizado revelar la morfología neuronal claro. Capturar por lo menos 15 fotogramas en un intervalo de s 2 (total de 30 s) como base. El intervalo puede ajustarse en base a la experiencia. En el cuadro 16, abra la válvula de parada capaz de vuelta de la jeringa y deje que el fluido fluya para marcos de 75 (150 s). En el marco de la 75, apagan la válvula para que el flujo de fluidos se detiene. Detener la captura de vídeo.
Nota: Esto debe inducir várices axonales en las neuronas DIV 7-9 5-10 s, mientras que las neuronas más viejas tardan más tiempo en várices de forma.
- Coloque la jeringa en la altura, 190 mm por encima del cubreobjetos que contiene neuronas cultivadas4. Comenzar el Time-lapse proyección de imagen del área de interés con un tiempo de exposición optimizado revelar la morfología neuronal claro. Capturar por lo menos 15 fotogramas en un intervalo de s 2 (total de 30 s) como base. El intervalo puede ajustarse en base a la experiencia. En el cuadro 16, abra la válvula de parada capaz de vuelta de la jeringa y deje que el fluido fluya para marcos de 75 (150 s). En el marco de la 75, apagan la válvula para que el flujo de fluidos se detiene. Detener la captura de vídeo.
- Pulso (2 s de duración) que sopla
- Coloque la jeringa a la altura adecuada (190 mm). Comienza la proyección de imagen de Time-lapse y capturar por lo menos 15 fotogramas (30 s) en un intervalo de s 2. En el cuadro 16, abra la válvula de la jeringa y deje que el fluido fluya, luego cerrar la válvula después de 2 s. espera 5-20 s (dependiendo de la frecuencia para ser probado) antes de abrir la válvula otra vez. Repetir la apertura y cierre de la válvula para crear pulsos de fluidos y continuar por un período total de 150-300 s. continuar Time-lapse la proyección de imagen de 20 minutos para capturar la etapa de recuperación.
Nota: Cuando el intervalo es más de 10 s, los impulsos inducen drásticamente menos várices. A intervalos de 20 s, no las várices pueden ser inducidas por los pulsos4. Para obtener la formación de várices confiable, coherente, se aconseja la altura de la jeringa debe ser alrededor de 190 mm. altura de la jeringa y la presión del líquido no debe elevarse a un punto donde las células comienzan a separar de la superficie del cubreobjetos.
- Coloque la jeringa a la altura adecuada (190 mm). Comienza la proyección de imagen de Time-lapse y capturar por lo menos 15 fotogramas (30 s) en un intervalo de s 2. En el cuadro 16, abra la válvula de la jeringa y deje que el fluido fluya, luego cerrar la válvula después de 2 s. espera 5-20 s (dependiendo de la frecuencia para ser probado) antes de abrir la válvula otra vez. Repetir la apertura y cierre de la válvula para crear pulsos de fluidos y continuar por un período total de 150-300 s. continuar Time-lapse la proyección de imagen de 20 minutos para capturar la etapa de recuperación.
- Antes de un día de uso, limpie la configuración (pipeta, tubos y jeringas) que fluye sobre 10 mL 70% etanol a través de la puesta a punto. El etanol lavar, flujo 10 mL de buffer de Hank (o búfer deseado) a través de la puesta a punto para preparar el sistema para el uso de ese día. Después de experimentos acabados para el día, limpie la configuración como descrito previamente con etanol para evitar el crecimiento de contaminantes durante la noche.
- Larga duración que sopla
6. complementando métodos
Nota: El ensayo que sopla puede combinarse con una gran variedad de diferentes técnicas que se describen en la sección de introducción. Aquí, el foco está en las técnicas de base que más frecuentemente se utilizan junto con el ensayo que sopla, incluyendo imágenes de timelapse de fluorescencia de alta resolución, proyección de imagen de calcio y ensayos de recuperación. Estos se discuten a continuación.
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Alta resolución imágenes fluorescentes de Time-lapse a cabo siguiendo el siguiente protocolo
- Seguir el movimiento de proteínas con etiqueta fluorescente dentro de las neuronas con un 100 X lente de aceite. Las neuronas son transfected con el cDNA adecuada construcción. Captura para 150 marcos (total 300 s) con un intervalo de s 2.
Nota: A veces, la proyección de imagen múltiple-color Time-lapse se realiza para el movimiento de más de una proteína fluorescente etiquetado de imágenes simultáneamente. - Generar un kymograph a través de video captura de software o a través de ImageJ (NIH).
Nota: La velocidad y la direccionalidad de los viajes pueden ser determinados mediante la kymograph. * Seguro observar la dirección que el soma se encuentra desde la región de captarse. Viaje hacia el soma es retrógrado, mientras que viajes lejos del soma a la extremidad axonal son anterógrada. - Repita este proceso después de que sopla, o un kymograph se puede crear utilizando la captura de imagen durante el ensayo que sopla.
Nota: Los efectos de fumar en el transporte axonal de mitocondrias y de proteínas sinápticas se muestran en un reciente documento4.
- Seguir el movimiento de proteínas con etiqueta fluorescente dentro de las neuronas con un 100 X lente de aceite. Las neuronas son transfected con el cDNA adecuada construcción. Captura para 150 marcos (total 300 s) con un intervalo de s 2.
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Proyección de imagen del calcio
- Añadir 1 μl (para una placa de 24 pocillos) o 3 μl (para una placa de 6 pozos) de 5 mM Fluo-4 AM a la cultura de los medios de comunicación en uno así e incuban a 37 ° C durante 30 minutos.
- Lavan las células dos veces con buffer de 1 mL Hank.
Nota: Carga las neuronas emiten fluorescencia verde a través de un sistema de filtro FITC. Loci denotan regiones de calcio apreciable dentro de la célula. Cuando se combina con soplar, se aprecia un aumento en la intensidad (aumento en el nivel de calcio interno).
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Recuperación de várices
Nota: Inmediatamente después de un experimento que sopla, un experimento de recuperación de 20 minutos puede llevarse a cabo.- Capturar imágenes de 300 marcos (1.200 s) con un intervalo de s 4.
Nota: Una célula transfectada con YFP/mCherry/GFP soluble debe mostrar un nivel moderado (menos de 50%) de recuperación al final de la sesión de imágenes. Recuperación axonal depende de varios factores, como la etapa de desarrollo de las neuronas cultivadas4. Esto puede combinarse también con la proyección de imagen fluorescente de alta resolución e imágenes de calcio descrito anteriormente.
- Capturar imágenes de 300 marcos (1.200 s) con un intervalo de s 4.
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Representative Results
Antes de soplar, axones normalmente muestran poca formación de várices. Siguientes soplar con la presión estándar (190 mmH2O altura), el comienzo de axones a desarrollar várices grano-como muchos. La formación de várices es parcialmente reversible, como se muestra por regiones del axón regresan a su estado pre-inflado después de un período de recuperación de 10 minutos (figura 2A-B). Después de un período de recuperación más largo (> 20 min), algunos axones se recuperan totalmente. Colocación óptima de la pipeta que sopla como un posicionamiento preciso de la jeringa en 190 mm encima del escenario puede no generar várices rápidamente. Condiciones óptimas deben resultar en la formación de várices en los axones de las neuronas jóvenes (alrededor 7 DIV) en cerca de 5 s4.
Figura 1 : Esquema y fotografía del aparato el soplar. Fotografías (A) general montaje de microscopio. (B) soplar aparato mostrando la pipeta de cristal sostenido por las amalgamas dentales y conectado a la tubería de goma. Contraste de fase (C) imágenes con foco en el plano de las neuronas hippocampal primarias mostrando sombra de la pipeta en la parte inferior derecha. (D) fuera de la célula plano centrado en soplar la pipeta. (E) esquema de distancias y de las presiones calculadas para inducir várices. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes representativas de la formación de várices después soplar. (A) la proyección de imagen de 7DIV, neuronas hippocampal de GFP transfectada ratón que muestra un axón pre- y post-soplar así como después de un período de recuperación de 10 minutos. (B) Kymograph de lapso de tiempo de proyección de imagen de neurona (A). Flechas rojas indican las várices que se han formado después de 150 s de 190 mmH2O fumar (comenzando en 30 s). Barra de escala = 15 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de revestimiento de cubreobjetos | |
| 780 ΜL | Stock de mM acid17 acético: ácido acético de 50 μL en 50 mL de H2O |
| 200 ΜL | Poly-D-lisina (valores de 0,5 mg/mL) |
| 20 ΜL | Colágeno cola de rata (valores de 3 mg/mL) |
| El volumen total se determina basándose en el número de cubreobjetos para cubrir. | |
Tabla 1: solución de revestimiento de cubreobjetos. Proporciona la receta para preparar la solución de recubrimiento cubreobjetos utilizada para adherir las células cultivadas en el cubreobjetos.
| 1 rebanada disección solución x (SLDS), filtrado, pH = 7.4, conservar a 4 ° C | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | Na2por4 |
| 30 mM | K2por4 |
| 10 mM | HEPES (ácido libre) |
| 10 mM | D-glucosa |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0.00% | Rojo de fenol (opcional) |
| Los medios de la galjanoplastia (PM, filtrar, almacenar a 4 ° C) | |
| 439 mL | Sales de Earle MEM |
| 50 mL | FBS |
| 11,25 mL | 20% D-glucosa |
| 5 mL | Piruvato de sodio (100 mM), |
| 62.5 ΜL | L-glutamina (200 mM) |
| 5 mL | Penicilina/estreptomicina (P/S, 100 x) |
| Medios de mantenimiento (MM, filtrar, almacenar a 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | Suplemento de 50 x de B27 |
| 1.25 mL | L-glutamina (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Todas las soluciones se esterilizan utilizando un filtro con tamaño de poro de 0,2 mm. | |
Tabla 2: recetas de medios de cultivo de células. Proporciona las recetas para la preparación de los medios de comunicación utilizados en el cultivo de células primarias neuronas hippocampal.
| Buffer de Hank (filtro, pH = 7.4, tienda en 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glucosa |
| 20 mM | HEPES |
Tabla 3: receta del almacenador intermediario de Hank. Proporciona la receta para preparar el tampón utilizado en el protocolo que sopla y durante la proyección de imagen de células vivas.
| Pipetee tirando de parámetros | |||||
| Calor | Tire de | Velocidad | Retardo de | Presión | Rampa de |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabla 4: pipetear tirando parámetros. Proporciona los parámetros a ajustar en el tirador de la pipeta para obtener una apertura que es alrededor de 45 μm de diámetro.
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Discussion
El procedimiento de este ensayo microbiomechanical es hacia adelante. Va a producir resultados confiables, si se realizan cuidadosamente todos sus pasos. Hay varios pasos fundamentales que, si se realiza incorrectamente, dificultará la recopilación de datos exitosa. Los pasos críticos comienzan aguas arriba de la aplicación real del estímulo que sopla. Disección cuidadosa, cultivo y cuidado de la cultura de la neurona primaria son primordiales. Si las neuronas cultivadas no son saludables, no reaccionarán, ya que podrían haber ya sido preparados para estrés. Aguas abajo de la cultura, la configuración inicial y la calibración del aparato que sopla para suministrar presión constante, que inducirá la várices pero no causa desprendimiento de las células de la superficie del cubreobjetos, se debe realizar con paciencia. Calibración precisa de la configuración puede tardar 1 h debido a obstrucción de la pipeta, tubo, válvula problemas o. Es importante garantizar que sale líquido de la pipeta con una resistencia mínima antes de seguir adelante con colocar las células en el plato y posicionamiento de la punta de la pipeta. En cuanto a modificaciones en la configuración, se puede asociar el aparato que sopla con perfusión, fijación con abrazadera del remiendo y cualquier otro microscopio instrumento, sobre todo dependiente en el espacio libre a los lados del microscopio.
Este sistema tiene dos limitaciones intrínsecas que necesitan atención. La configuración siempre puede iniciar la formación de várices reversibles en axones de las neuronas hippocampal cultivadas a través de fluido que sopla a las células. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los valores de presión exacta sobre las neuronas dentro del mismo campo que sopla no son idénticos. La presión del líquido que afecta a las células, calculado en base a mediciones de carga de un recientemente silicona membrana4,10, representa la presión media en el centro del campo que sopla. Así, la presión exacta que sopla es el más alto en el centro del campo que sopla y los más bajos alrededor del borde del campo. Demostramos que la fuerza de presión se correlaciona con la aparición, el tamaño y el número de las várices inducidas por4. Una presión más alta resultó en Inicio más rápido, más grande y más abundante de várices4. En nuestros estudios recientes, se utilizó una presión mínima (190 mmHg en la punta de la pipeta que sopla) que todavía fiable puede inducir várices en la mayoría de axones4. Bajo esta condición, aparición de várices por neuronas jóvenes es normalmente cerca de 5 s. Es importante tener en cuenta que con el exacto mismo soplar el sistema, el valor de la hora de inicio puede variar, que no sólo depende de tipo neuronal, la edad y el compartimento subcelular, pero también puede ser influenciada por la posición de la neurona en el campo que sopla. A pesar de la variación de presión que sopla por las neuronas, este sistema de ensayo todavía proporciona un medio confiable para el estudio de efectos mecánicos sobre las neuronas centrales y produce resultados experimentales altamente consistente y reproducibles.
La segunda limitación del sistema es su obstrucción. Para conseguir presión fisiológicamente relevante, la apertura de las pipetas es pequeña, alrededor de 45 μm. Sin embargo, la pequeña abertura tiende a obstruir con los desechos de la tubería plástica y los escombros en la punta de la pipeta se pueden ver claramente al microscopio. Esto aumenta la cantidad de tiempo preparando el montaje, en el caso de una obstrucción de la pipeta. Por lo tanto, todas las soluciones son cuidadosamente filtradas antes de ser puesto en la jeringa, tubo y pipeta. También es importante lavar el sistema que sopla con etanol al 70% al principio y al final del día, seguido de lavado con tampón de Hank filtrada. Para resolver el problema de obstrucción potencial, le sugerimos intentar tirar pipetas múltiples. Es esencial para confirmar que la solución es realmente sopló fuera de la pipeta a través de la visualización antes de comenzar los experimentos. Una vez establecido un buen sistema que sopla, generalmente puede durar por el resto del día.
Este análisis biomecánico, combinado con la cultura de la neurona, presenta una oportunidad única para el estudio de la neurona central mechanosensation imitando las condiciones fisiológicas o fisiopatológicas. Este sistema nos permite analizar los efectos de compresión y cizallamiento en las neuronas. Por el contrario, otros sistemas fueron utilizados para examinar en el plano que estira5,6,7. La presión promedio recibida por las neuronas en el centro de las áreas que sopla es de nN/μm ± 0.25 0.062 en nuestro sistema4. Esta presión ejercida sobre las células es comparable con el módulo elástico de las neuronas hippocampal medida previamente utilizando análisis fuerza microscopia y a granel reología, para identificar ópticamente inducido deformación13,14, así como las presiones que se utilizan para alterar el crecimiento de la neurita borde in vitro, medido por análisis de fuerza de microscopía (0.27 ± 0.04 nN/μm2)16. Esta presión no supere la presión que puede ser generada naturalmente por las células mesenquimales en un embrión de E11, medido utilizando aceite de tamaño de célula fluorescente mecánicamente específico microgotas (1,6 ± 0,8 nN/μm)2,14.
Este sistema ya se ha utilizado con éxito en combinación con la proyección de imagen de calcio, fijación con abrazadera del remiendo, microscopio electrónico y celular análisis de un cráneo cerrado mTBI ratón modelo4. El ensayo puede utilizarse también en combinación con experimentos basados en el microscopio, tales como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo (FRAP), para examinar la proteína volteo dentro de várices, así como del traste para estudiar si se alteran las interacciones proteína-proteína durante la formación de várices. Esencialmente, cualquier método que se puede hacer usando un microscopio y un configuración de imagen vivo de la célula puede ser asociado con este ensayo que sopla. La versatilidad de este ensayo es muy valiosa en el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes de varios efectos sobre la morfología neuronal y funciones mediante micromechanical estrés.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Todos los experimentos con animales se ha realizado según los institutos nacionales de Salud Animal uso directrices. Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los institutos nacionales de salud (R01NS093073 y R21AA024873) a C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
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