Summary
Det här protokollet beskriver en fysiologiskt relevanta, trycksatt vätske strategi för snabb och vändbar induktion av varicosities i nervceller.
Abstract
Axonal varicosities är utvidgade strukturer längs axlarna av axoner med en hög grad av heterogenitet. De finns i hjärnor med neurodegenerativa sjukdomar eller skador, men också i den normala hjärnan. Här beskriver vi ett nyinrättade mikromekaniska system för att snabbt, tillförlitligt och reversibelt inducera axonal varicosities, tillåter oss att förstå de mekanismer som styr Praparat bildandet och heterogena protein sammansättning. Detta system utgör en roman innebär att utvärdera effekterna av komprimering och shear stress på olika subcellulär fack av nervceller, skiljer sig från andra in vitro- system som främst fokuserar på effekten av stretching. Allt på grund av de unika funktionerna i vårt system gjort vi nyligen en roman upptäckten visar att tillämpningen av trycksatta vätskan kan snabbt och reversibelt inducera axonal varicosities genom aktivering av en övergående receptor potentiell kanal. Vårt biomekaniska system kan utnyttjas praktiskt i kombination med drogen perfusion, levande cell imaging, kalcium imaging och patch clamp inspelning. Denna metod kan därför antas för att studera mechanosensitive jonkanaler, axonal transport förordning, axonal cytoskelettet dynamics, calcium signalering och morfologiska förändringar relaterade till traumatisk hjärnskada.
Introduction
Praparat bildandet eller svullnad/beading, längs axoner, är ett framträdande inslag i neurodegeneration observerats i många sjukdomar eller skador i centrala nervsystemet, inklusive multipel skleros, Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, och traumatiska hjärnan skada1,2. Trots de betydande fysiologiska konsekvenserna av axonal varicosities på aktionspotentialens spridning och synaptisk transmission3fortfarande hur varicosities genereras okänd. Nyligen hittade med en nyinrättade microbiomechanical analys på odlade Hippocampus nervceller från gnagare, vi att mekaniska stimuli kan orsaka varicosities i dessa nervceller med mycket spännande funktioner. Först Praparat induktion är snabb (< 10 s) och denna process är oväntat reversibel. Det andra Praparat inledande beror på styrkan pustande tryck: ju högre tryck, desto snabbare inledandet. Det tredje beror Praparat inledande på neuronal ålder. Axoner av yngre nervceller visas mer lyhörda mot mekanisk stress, jämfört med de äldre nervceller. Fjärde, varicosities form längs axoner av hippocampus nervceller, medan dendriter och inledande axon segment av dessa nervceller visar ingen förändring på samma tuffande villkor. Vår studie visade således ett nytt inslag av neuronala polaritet. Dessa fynd med in vitro- system är fysiologiskt relevanta. Använda en in-vivo -modell för mild traumatisk hjärnskada (mTBI), visade vi att axonal varicosities utvecklas i en multi fokal mode i somatosensoriska cortex av mössen omedelbart efter close-skalle effekt, överensstämmer med vår in vitro- resultat4. Det är viktigt att notera att våra färgning och bildbehandling av mTBI möss ger bara ett snap shot av neuronala morfologiska förändringar, sedan utför i vivo time-lapse avbildning av neuronala morfologi under en mekanisk påverkan är ännu inte är möjligt.
Denna vätska-pustande system tillät oss inte bara att fånga unika funktioner i samband med mekanisk stressinducerade Praparat bildandet, men också att fastställa bakomliggande mekanism. Genom att testa olika extracellulära lösningar, blockerare och konservöppnare olika kandidater av mechanosensitive jonkanaler och cellulär elektrofysiologi, identifierat vi att transient receptor potential cationen kanal underfamilj V medlem 4 (TRPV4) kanal som är genomsläppliga för Ca2 + och Na+ och aktiveras av pustande ansvarar huvudsakligen för att upptäcka inledande mekanisk stress under axonal Praparat bildandet4. Detta bekräftades ytterligare med siRNA knockout tillvägagångssätt. Sammantaget skapar detta nya test system har vi utvecklat med Hippocampus neuron kultur, är mycket värdefulla för att studera egenskaperna mikromekaniska av centrala nervceller, särskilt i kombination med andra tekniker.
Detta mikromekaniska system har vi etablerat är unikt och skiljer sig från de tidigare befintliga system i flera viktiga aspekter. Först i detta system uppleva nervceller out-av-plane mekanisk stress i form av komprimering och klippning. Under den mekaniska stötar, neuronala processer sitta kvar på täckglas ytan och flytta inte. Detta skiljer sig från andra experimentella system som främst handlat om böjning och i-plane stretching (eller spänning), exempelvis omläggning av medföljande axoner som flytta strängar5,6 eller stretching axoner som odlas på micropatterned kanaler och töjbart membran7,8. Dessutom även om axonal varicosities kan också induceras i dessa analyser som i våra vätska-pustande system, processen i dessa inställningar tar mycket mer tid (från 10 min till flera timmar6,7,8) och visas irreversibel. Slutligen, vårt system som använder lokala vätska pustande gör granskningen av rumsliga funktioner i Praparat bildandet (t.ex., Dendritutskotten, axonal initiala segment, soma, dendriter, axonal terminaler), förutom dess temporal funktioner. Med detta system, upptäckte vi flera oväntade och unika funktioner av axonal Praparat bildande, särskilt snabbt insättande, långsam reversibilitet och axon-dendrite polaritet.
Det system som vi diskuterar i denna uppsats är kompatibel med många tekniker av molekylära och cellbiologi. Exempelvis för att studera effekterna av mekanisk stress på neuronal morfologi och funktion, kan det användas tillsammans med myelin coculture, time-lapse avbildning av fluorescerande resonans energiöverföringen (bandet) och Totalreflexion fluorescens (Frida), kalcium imaging och patch clamp inspelning. I detta papper fokuserar vi på de centrala delarna av systemet. Hippocampus neuron kultur, vätska-pustande setup, högupplösta time-lapse imaging för axonal transport och kalcium imaging är illustrerade steg för steg nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs nedan har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Ohio State University.
1. täckglas förberedelse
- Placera en eller flera lådor med 12 mm eller 25 mm coverslips i en glasbägare innehållande 70% salpetersyra och inkubera i coverslips i rumstemperatur över natten.
Obs: Tvätta inte den 25 mm coverslips i samma bägaren som den 12 mm coverslips. Det är bättre att tvätta dem separat. - Överför alla coverslips till en 4 L bägare fylld med 2,5 L ddH2O och skaka bägaren som innehåller coverslips för 1 h vid 100 rpm. Använd gummiband för att hålla bägaren under skakning. Upprepa sköljningen med färska 2.5 L ddH2O fyra gånger.
- Överföra rengjorda coverslips till en torr kolv med en metall cover. Baka coverslips i ugn vid 225 ° C i 6 h och låt dem svalna till rumstemperatur.
Obs: De 25 mm täckglaset är benägna att bryta. Separata coverslips en lufttorka och baka dem i ugn. - Lagra de torkade och rengjorda coverslips vid rumstemperatur i en steriliserad plastbehållare fram till användning.
-
Päls av coverslips enligt följande:
- Bered färskt beläggning i ett centrifugrör.
- Placera varje täckglas i ett väl platta 24-väl (eller 6-well). Placera 30 (eller 100) µL täckglas beläggning lösning (tabell 1) på en 12 mm (eller 25 mm) täckglas och virvel. Tillsätt 1 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, vävnadsodling grade) till brunnen. Dessa plåtar kan antingen användas omedelbart eller förvaras vid 4 ° C i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning för upp till en vecka.
- Dag av dissektion, ta bort PBS. Lufttorka och placera plåtarna i UV-belysning (30W) för 2-4 h.
Obs: Sista steget bör kompletteras med UV-ljus på i en cell kultur LAF. Dörren till huven bör lyftas något så att luftflödet för torkning av coverslips.
2. dissektion, Dissociation och kultur av hippocampus nervceller från gravid mus/råtta
-
Dissektion och dissociation av hippocampus nervceller för kultur
- Tina proteas enzym lösning (3 mg/mL proteas 23 i SLDS, tabell 1) och pre värma plätering media (tabell 2) vid 37 ° C.
- Dissekera hippocampus och skölj med SLDS, enligt de metoder som beskrivs i föregående publikation14.
Obs: Fyra hippocampi ger tillräckligt med celler för en 24-brunn eller en 6-bra platta. - Ta bort SLDS, tillsätt 2 mL av proteashämmare enzym lösning och inkubera provet vid 37 ° C, 5% CO2 för 15 min.
- Tvätta de hippocampus bladsticklingar med 5-10 mL plätering medium två gånger. Tillsätt 5 mL av plätering medium. Separera Hippocampus bladsticklingar in enstaka celler genom att generera en liten virvel med pipett med en 1 mL plastspets. Pipettera upp och ned ungefär 40 gånger, undvika bildandet av syre bubblor, tills lösningen blir grumlig och inga stora bitar av explant kvar.
Obs: Kom ihåg att lämna vissa medier under tvättar, de Hippocampus bladsticklingar ska vara nedsänkt i mediet under hela processen. - Centrifugera cellerna vid 1 125 x g i 3 min. ta bort supernatanten med celler nedsänkt i media. Att resuspendera cellerna i 145 mL plätering media. Tillsätt 1 mL per brunn av cellsuspensionen till en 24-väl tallrik (3 mL per brunn till en 6-well platta).
Obs: 145 mL plätering media används för att producera en cellsuspension som har en låg cell densiteten. Denna volym kan plätering av celler till sex 24 brunnar, åtta 6 brunnar eller olika kombinationer av 24 - eller 6-bra plattor beroende på experiment skall utföras. Varje brunn av 24-väl plattan kommer att ha ca 3 x 104 celler9. - Inkubera cellerna i bordläggningen media vid 37 ° C, 5% CO2 för 2-4 h, ta sedan bort alla plätering media och ersätta det med frisk underhållsmassmedia.
- Efter 2 dagar (2 dagar in vitro-, 2DIV), ersätta hälften av media med 2 µM Ara-C (arabinosylcytosine) upplöst i underhållsmassmedia vilket hämmar tillväxten av fibroblaster, endotel och glial celler. Efter utsätta celler till Ara-C i två dagar, ersätta mediet med färska underhållsmassmedia.
-
Transfection för visualisering av cellmorfologi
Obs: Transfect cellerna med fluorescerande konstruktioner av grönt fluorescerande protein (GFP), gula fluorescerande protein (YFP), mCherry, etc. att belysa morfologi av enskilda nervceller.- Späd konstruktioner lagervara (1 µg/µL) till Opti-MEM media (0,8 µg av konstruktionen i 50 µL Opti-MEM media) och vortex. Bered 1 konstruera utspädningen för varje brunn.
Obs: En 24-well platta kräver 0,8 µg av construct i 50 µL av Opti-MEM media. En 6-well platta kräver 2,4 µg av construct i 150 µL Opti-MEM media. - Späd Liposom-medierad transfection reagens i Opti-MEM media (1,5 µL av transfection reagens i 50 µL Opti-MEM media) och vortex. Bered 1 transfection utspädningen för varje brunn.
Obs: En 24-well platta kräver 1,5 µL transfection reagens i 50 µL Opti-MEM media. En 6-well platta kräver 4,5 µL transfection reagens i 150 µL Opti-MEM media. - Förbereda en 1:1 blandning (100 µL) av konstruktionen i Opti-Mem media och transfection reagens i Opti-MEM media och vortex. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 20 min.
Obs: Per brunn, det bör finnas ca 100 µL av lösning innehållande konstruera, transfection reagens och Opti-MEM media om använder en 24-well platta (300 µL för 6-well plate). - Ta bort hälften av media (500 µL för 24-väl plåt, 1.5 mL för 6-well plate) från varje brunn och överföra denna media till en ren koniska rör. Hålla denna tube i inkubatorn. Lägg sedan till 100 µL blandningen (steg 2.2.3) återstående media i brunnen. Att cellerna att Inkubera vid 37 ° C i 20-30 min.
- Under inkubationen (steg 2.2.4), lägga till en volym av färska underhållsmassmedia media i koniska röret (steg 2.2.4). Lägg blandningen i samma inkubator (37 ° C och 5% CO2).
- Efter inkubering, ta bort allt material som innehåller transfection lösningen från brunnarna och ersätta det med 1:1 blandning av gamla och färska underhållsmassmedia i koniska röret (steg 2.2.5).
Obs: Beroende på storleken av konstruktioner, celler kan börja uttrycka inom 12 h; för större konstruktioner, kan 3-4 dagar behövas innan peak uttrycket av konstruktioner nås.
- Späd konstruktioner lagervara (1 µg/µL) till Opti-MEM media (0,8 µg av konstruktionen i 50 µL Opti-MEM media) och vortex. Bered 1 konstruera utspädningen för varje brunn.
3. ställa in tuffande pipett apparaten
Obs: Det finns fem grundläggande komponenter till detta upplägg: glas pipetten, slangen, sprutan, micromanipulator och bufferten (Hank's). Någon buffert som har fysiologiskt relevanta salt koncentrationer skulle kunna användas i detta upplägg.
- Dra ett Borsilikat pipetten att ha runt 45-µm-diameter öppning spets med en mikropipett avdragare och specifikationerna i tabell 3.
Obs: Det konstaterades att 45 µm är en lämplig storlek för diametern på pipetten öppettider under experimentella förhållanden. Små variationer i öppning storlek bör inte signifikant resultat. Det är viktigt att notera att större avgångar från detta nummer bör fortfarande fungera för Praparat induktion genom att justera höjden på sprutan som är kopplad till pipetten via slangar, men detta kommer att kräva omkalibrering av trycket värdet. - Sätt in un-drog slutet av pipetten i tunn gummi slangar.
Obs: Slang väggen bör vara tunn och styv att minimera vätska motståndet, att säkerställa att höjden på sprutan är direkt proportionell mot trycket av vätska strömmar genom pipetten med försumbar resistans. Slangen bör vara längre än ca 0,6 m i längd för att ytterligare minimera motståndet. - Anslut den andra änden av slangen till en 10 mL spruta av plast genom en kontakt med en tur-stånd ventil.
Obs: Plast sprutan måste hållas på en konstant, mätbara höjd att säkerställa en korrekt åtgärd för antas trycket flödar från pipetten. En höjd av 190 mm utnyttjades, eftersom detta ger minimalt tryck men tillförlitligt inducerar varicosities i axoner. Andra höjdvärden kan också användas om trycket orsaka cellerna att lossna från ytan täckglas. Det rekommenderas att använda samma inställning under hela försöket. - Sätt pipetten i skruv toppen av micromanipulator att hålla pipetten på plats. Skruva metall, platta toppad skruven bifogas micromanipulator armen så att den rymmer un-drog slutet av pipetten precis ovanför där gummi slangen är fäst. Vinkel på pipetten i 45° vinkel med ytan av de neuron-innehållande coverslips.
Obs: Micromanipulator bör vara konstruerat så att pipetten kan hållas utan bromsande gummi slangen. Micromanipulator måste tillåta rörelse av pipetten i x, y och z riktningar att exakt Placera det inom spänna av cellerna. En grafisk samt ett fotografi av apparaten följer nedan (figur 1). - Aktivera en fluorescens filtret, öppna bländaren och säkerställa en fluorescerande plats kan ses komma igenom målet. Använda micromanipulator, flytta pipetten till en position som ställer upp spetsen med fluorescerande plats och sänka pipetten i en position strax ovanför höjden av cell kultur skålen (35 x 10 mm). När den är i position, slå på genomlysning och av fluorescens.
- Med pincett, lägga ett täckglas (med celler uppåt mot pipetten) från cell kultur plattan i cell kultur skålen som innehåller ca 2 mL Hanks buffert vid rumstemperatur.
- Placera kultur skålen som innehåller täckglaset på omfattningen.
- Använda fina fokus ratten och 20 X mål, fokusera på ett plan ca fyra fullständiga varv ovanför cellerna (ca 0,4 mm). Använda micromanipulator för att placera pipettspetsen så att den är fokuserad och i centrera, vänster sida av planet sett genom ögat-bitar.
Obs: Dendriter är projektioner som bör vara i samma ram som de påbörjar från cellkroppen. För att inducera axonal varicosities, bör man följa längre prognoser från cellkroppen till mediala och distala axoner.
4. Kalibrera trycket av pipetten utnyttja ett töjbart-membran-System
- Setup tuffande pipett apparaten med exakt samma parametrar som beskrivs ovan över ett system som innehåller ett biochips silikon membran (500 µm i diameter) och 50 µm tjock och fokusera mikroskopet på ytan av membranet.
Obs: Systemet var utformat för att mäta små tryckvärden och en förklaring av systemet har publicerats före10. Denna mätning behöver bara göras en gång för pustande experiment om exakt samma inställning av pustande används. - Fokusera mikroskopet på arrayer av mikropunkter (4 µm i diameter) och 10 µm apart, mätt mellan centra. Stäng avstängningsventilen och låta vätskan rinner ut ur pipetten. Undersök omläggning av membranet svar på vätsketrycket med en confocal Mikroskop.
- Utnyttja en linjär modell för att fastställa motsvarande trycket är associerad med omläggning av membranet.
Obs: Medan en nyligen studie fann att en omläggning av w =-3.143 ± 0,69 µm erhölls för spruta höjd 190 mm, detta producerade ett tryck på 0,25 ± 0,06 nN/µm2 från aktuella pipett inställning, som är inom intervallet fysiologiska och patologiska, men den sprutan höjd är inte den enda faktorn. Andra faktorer påverka värdet exakt tryck på nervceller samt, inklusive pipett öppning, positionering (avstånd och vinkel) av pipettspetsen i förhållande till cellerna, och även flexibiliteten i slangen4,10.
5. pustande inducera Varicosities
- När pipetten är i position, fokusera mikroskopet på en plan som innehåller en region av intresse. Placera celler och processer i den vänstra halvan av imaging fältet (sett av levande ta till fånga av kameran) inom området tuffande, medan den högra halvan är utanför pustande område.
Obs: På grund av omfattande utväxt av axoner och dendriter av nervceller, det är osannolikt att alla processer av en neuron befinner sig inom samma pustande. Detta är faktiskt en fördel med detta system, som tillåter granskning av lokala effekten av pustande. Det finns två typer av pustande som kan utnyttjas för att inducera varicosities: lång varaktighet pustande och puls pustande. -
Pustande
- Lång varaktighet pustande
- Placera sprutan på höjden, 190 mm ovanför den täckglas innehållande odlade nervceller4. Börja time-lapse avbildning av intresseområde med en optimerad exponeringstid som avslöjar tydligt neuronala morfologi. Fånga minst 15 bilder på en 2 s intervall (30 s totalt) som baslinje. Intervallet kan justeras baserat på experimentet. På RAM 16, öppna tur-stånd utloppsventilen i sprutan och tillåter vätska att flöda för 75 ramar (150 s). På ram 75, stänga ventilen så att vätska stannar. Stoppa videoinspelning.
Obs: Detta bör föranleda axonal varicosities i nervceller 7-9 DIV inom 5-10 s, medan äldre neuroner tar längre tid att bilda varicosities.
- Placera sprutan på höjden, 190 mm ovanför den täckglas innehållande odlade nervceller4. Börja time-lapse avbildning av intresseområde med en optimerad exponeringstid som avslöjar tydligt neuronala morfologi. Fånga minst 15 bilder på en 2 s intervall (30 s totalt) som baslinje. Intervallet kan justeras baserat på experimentet. På RAM 16, öppna tur-stånd utloppsventilen i sprutan och tillåter vätska att flöda för 75 ramar (150 s). På ram 75, stänga ventilen så att vätska stannar. Stoppa videoinspelning.
- Puls (2 s varaktighet) pustande
- Placera sprutan på rätt höjd (190 mm). Börja time-lapse imaging och fånga minst 15 ramar (30 s) 2 s intervall. På RAM 16, öppna ventilen på sprutan och tillåter vätska att flöda, sedan Stäng ventilen efter 2 s. vänta 5-20 s (beroende på frekvensen ska testas) innan du öppnar ventilen igen. Upprepa öppna och stänga ventilen till skapa flytande pulser och fortsätta under totalt av 150-300 s. Fortsätt time-lapse imaging för 20 min att fånga återhämtning scenen.
Obs: När intervallet är längre än 10 s, pulserna inducera drastiskt mindre varicosities. 20 s intervall, kan ingen varicosities induceras av pulser4. För att få tillförlitlig och konsekvent Praparat bildandet, rekommenderas det spruta höjden bör vara runt 190 mm. spruta höjd och vätsketrycket bör inte höjas till en punkt där celler börjar lossa från täckglas ytan.
- Placera sprutan på rätt höjd (190 mm). Börja time-lapse imaging och fånga minst 15 ramar (30 s) 2 s intervall. På RAM 16, öppna ventilen på sprutan och tillåter vätska att flöda, sedan Stäng ventilen efter 2 s. vänta 5-20 s (beroende på frekvensen ska testas) innan du öppnar ventilen igen. Upprepa öppna och stänga ventilen till skapa flytande pulser och fortsätta under totalt av 150-300 s. Fortsätt time-lapse imaging för 20 min att fånga återhämtning scenen.
- Innan en dags användning, rengör set-up (pipett, slangar och spruta) genom att flöda om 10 mL 70% etanol genom set-up. Efter etanolen tvätta, flöda 10 mL av Hanks buffert (eller önskad buffert) genom set-up till prime systemet för dagens användning. Efter efterbehandling experiment för dagen, rengör set-up som tidigare beskrivits med etanol att förhindra tillväxt av föroreningar över natten.
- Lång varaktighet pustande
6. komplimanger metoder
Obs: Tuffande analysen kan kombineras med en mängd olika tekniker som diskuteras i avsnittet inledning. Här är fokus på de grundläggande tekniker som används oftast tillsammans med pustande analysen, inklusive högupplösta fluorescens timelapse imaging, kalcium imaging och återhämtning analyser. Dessa diskuteras nedan.
-
Genomföra högupplösta fluorescerande time-lapse avbildning genom att följa protokollet nedan
- Följa utvecklingen av fluorescently-märkta proteiner inom nervceller med 100 X olja linsen. Nervceller är transfekterade med den ordentliga cDNA konstruktion. Fånga för 150 ramar (totalt 300 s) med 2 s intervall.
Obs: Ibland, multipel-färg time-lapse imaging utförs för att bilden förflyttning av mer än en fluorescently-taggade protein samtidigt. - Generera en kymograph antingen genom den video erövrare programvara eller genom ImageJ (NIH).
Obs: Hastighet och riktningen av reser kan bestämmas med hjälp av kymograph. * Säker att notera riktningen soma ligger från regionen fångas. Resa mot soma är bakåtsträvande, medan resa bort från soma till axonal spetsen är anterograd. - Upprepa denna process efter tuffande, eller en kymograph kan skapas med hjälp av stillbilder under tuffande analysen.
Obs: Effekterna av pustande axonal transport av mitokondrier och synaptic proteiner visades i en nyligen papper4.
- Följa utvecklingen av fluorescently-märkta proteiner inom nervceller med 100 X olja linsen. Nervceller är transfekterade med den ordentliga cDNA konstruktion. Fånga för 150 ramar (totalt 300 s) med 2 s intervall.
-
Kalcium imaging
- Lägg till 1 µL (för en 24-well platta) eller 3 µL (för en 6-well platta) av 5 mM Fluo-4 AM till kultur media i en väl och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL Hanks buffert.
Obs: Laddade nervceller avger grön fluorescens genom en FITC filter. Loci beteckna regioner av märkbar kalcium i cellen. Kombination med pustande, kan en ökning av intensitet (ökad inre kalciumnivå) ses.
-
Praparat återhämtning
Obs: Omedelbart efter ett tuffande experiment, en 20 min återhämtning experiment kan utföras.- Fånga bilder för 300 ramar (1200 s) med 4 s intervall.
Observera: En cell transfekterade med lösliga YFP/mCherry/GFP bör visa en måttlig nivå (mindre än 50%) av återhämtning i slutet av bildsession. Axonal återhämtning beror på ett antal faktorer, såsom utvecklingsstadiet av odlade nervceller4. Detta kan också kombineras med högupplösta fluorescerande imaging och kalcium imaging beskrivs ovan.
- Fånga bilder för 300 ramar (1200 s) med 4 s intervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan pustande, Visa axoner normalt lite Praparat bildandet. Följande pustande med vårt standardtryck (190 mmH2O höjd), axoner början att utveckla många pärla-liknande varicosities. Bildandet av varicosities är delvis reversibla, som visas av regioner av axon återvänder till sin förväg svälld tillstånd efter en 10 min återhämtningsperiod (figur 2A-B). Efter en längre period av återhämtning (> 20 min), några axoner helt återställa. Suboptimal placering av såväl tuffande pipett som exakt positionering av sprutan på 190 mm ovanför scenen kan inte generera varicosities snabbt. Optimala förhållanden bör resultera i Praparat bildandet i axoner av unga nervceller (cirka 7 DIV) i cirka 5 s4.
Figur 1 : Schematisk och fotografi av pustande apparatur. (A) fotografier visar övergripande Mikroskop set-up. (B) pustande apparaten visar glas pipetten innehas av micromanipulator och ansluten till gummi slangen. (C) fas kontrast bilder med fokus i plan av primära Hippocampus nervceller visar skuggan av pipett längst ned till höger. (D) ut ur cellen planet fokuserade på pustande pipettspetsen. (E) Schematisk avstånd och beräknad påtryckningar för att inducera varicosities. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av Praparat bildandet efter pustande. (A) avbildning av 7DIV, GFP transfekterade mus Hippocampus nervceller visar ett axon före och efter pustande samt efter en 10 min återhämtningsperiod. (B) Kymograph för time-lapse imaging av neuron (A). Röda pilarna visar varicosities som har bildats efter 150 s av 190 mmH2O stånkande (början 30 s). Skalstapeln = 15 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Täckglas beläggning lösning | |
| 780 ΜL | Ättiksyra acid17 mM lager: 50 µL ättiksyra i 50 mL H2O |
| 200 ΜL | Poly-D-lysin (0,5 mg/mL lager) |
| 20 ΜL | Rat tail kollagen (3 mg/mL lager) |
| Den totala volymen bestäms utifrån antalet coverslips skall beläggas. | |
Tabell 1: täckglas beläggning lösning. Ger receptet för beredning av lösning för beläggning av täckglas som brukade följa odlade celler till coverslips.
| 1 x Slice dissektion lösning (SLDS), filtrerat, pH = 7.4, förvaras vid 4 ° C | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | Na2så4 |
| 30 mM | K2så4 |
| 10 mM | HEPES (fri syra) |
| 10 mM | D-glukos |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0,00% | Fenolrött (tillval) |
| Plätering Media (PM, filtrera, förvaras vid 4 ° C) | |
| 439 mL | MEM Earle salter |
| 50 mL | FBS |
| 11,25 mL | 20% D-glukos |
| 5 mL | Natrium pyruvat (100 mM) |
| 62,5 ΜL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | Penicillin/Streptomycin (P/S, 100 x) |
| Underhållsmassmedia (MM, filtrera, förvaras vid 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x tillägg |
| 1,25 mL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Alla lösningar är steriliserade med ett filter med porstorlek 0,2 mm. | |
Tabell 2: Cell kultur media recept. Ger recept för att förbereda media utnyttjas i odling av primära Hippocampus neuron celler.
| Hanks buffert (filter, pH = 7.4, butiken på 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1.2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glukos |
| 20 mM | HEPES |
Tabell 3: Hanks buffert recept. Ger receptet för att förbereda den buffert som utnyttjas i protokollet pustande och under live-cell imaging.
| Pipettera dra parametrar | |||||
| Värme | Dra | Hastighet | Fördröjning | Tryck | Ramp |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabell 4: Pipettera dra parametrar. Ger parametrarna som anges på den pipett avdragare till få en öppning som är cirka 45 µm i diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förfarandet i denna microbiomechanical analys är rakt fram. Det kommer att producera tillförlitliga resultat, om alla dess steg utförs noggrant. I området i närheten finns det flera viktiga steg som, om felaktigt utfört, hindrar framgångsrik datainsamling. De kritiska steg börja uppströms i den faktiska tillämpningen av pustande stimulans. Noggrann dissektion, odling och vård av den primära neuron kulturen är avgörande. Om de odlade nervcellerna inte är friska, reagerar de inte konsekvent, eftersom de skulle har redan varit primas för stress. Nedströms kulturen, den första installation och kalibrering av pustande apparaten att ge konsekvent tryck, som kommer att framkalla varicosities men kommer inte att orsaka avlossning av cellerna från täckglas ytan, måste utföras med tålamod. Korrekt kalibrering av set-up kan ta 1 h på grund av pipett igensättning, slangar eller ventil problem. Det är viktigt att se till att vätskan rinner ut ur pipetten med minimalt motstånd innan man går framåt med att placera cellerna i skålen och placera pipettspetsen. Vad beträffar ändringar set-up är, kan man para ihop tuffande apparaten med perfusion, patch fastspänning och andra Mikroskop-baserade instrument, främst beroende på det fysiska utrymmet som är gratis på sidorna av mikroskopet.
Detta system har två inneboende begränsningar som behöver uppmärksamhet. Upplägget kan konsekvent initiera bildandet av reversibel varicosities i axoner av odlade Hippocampus nervceller genom tuffande vätska till cellerna. Det är dock viktigt att notera att de exakta tryckvärden på nervceller inom samma tuffande inte är identiska. Vätsketrycket som påverkar cellerna, beräknade utifrån belastning mätning från en biochips silikon membran4,10, representerar genomsnittliga trycket i mitten av fältet pustande. Således, exakta tuffande trycket är den högsta i mitten av fältet pustande och den lägsta runt kanten på fältet. Vi visade att de pressar styrka korrelerar med uppkomsten, storleken och antalet varicosities inducerad4. Högre tryck medförde snabbare insättande, större, och mer riklig varicosities4. I vår nyligen genomförda studier använde vi ett minimalt tryck (190 mmHg vid spetsen av pustande pipett) som fortfarande tillförlitligt kan inducera varicosities i de flesta axoner4. Under detta tillstånd, Praparat debut för unga nervceller är normalt cirka 5 s. Det är viktigt att notera att med exakt samma pustande system, värdet av debut tiden kan variera, vilket inte bara beror på neuronal typ, ålder och subcellulär fack, men kan också påverkas av placera av neuron i fältet pustande. Trots variationen av pustande tryck emot av nervceller, detta test system fortfarande ger ett tillförlitligt sätt för att studera mekaniska effekter på centrala nervceller, och ger mycket konsekvent och reproducerbara experimentella resultat.
Den andra begränsningen av systemet är dess igensättning problem. För att uppnå fysiologiskt relevanta trycket, är öppnandet av pipetterna små, runt 45 μm. Men den lilla öppningen tenderar att täppa med skräp från plaströr och skräp i pipettspetsen syns tydligt i mikroskopet. Detta ökar mängden tid prepping set-up, i händelse av en pipett täppa. Alla lösningar filtreras därför noga innan de tas i den sprutan, slangar och pipett. Det är också viktigt att tvätta tuffande systemet med 70% etanol i början och slutet av dagen, följt av tvättning med filtrerade Hanks buffert. För att lösa problemet med igensättning, föreslår vi att försöka dra flera pipetter. Det är viktigt att bekräfta att lösningen faktiskt är svälld ur pipetten genom visualisering innan experimenten. När ett bra tuffande system är etablerad, kan det vanligtvis pågå resten av dagen.
Denna biomekanisk analys, kombinerat med neuron kultur, presenterar en unik möjlighet för att studera centrala neuron mechanosensation imitera fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Detta system tillåter oss att undersöka effekterna av komprimering och klippning på neuroner. Däremot användes andra system för att undersöka i-plane stretching5,6,7. Genomsnittliga trycket tas emot av nervceller i mitten av pustande områdena är 0,25 ± 0,06 nN/µm2 i våra system4. Detta påtryckningarna på celler är jämförbar med elasticitetsmodulen av hippocampus nervceller mätt tidigare utnyttja skanning kraft mikroskopi och bulk reologi, för att identifiera optiskt inducerad deformation13,14, samt Tryck används för att förändra tillväxten av neurite framkanter in vitro mätt genom att skanna tvinga mikroskopi (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16. Detta tryck överstiger inte trycket som kan genereras naturligt av mesenkymala celler i ett E11 embryo, mätt med mekaniskt specifika fluorescerande cell-sized olja microdroplets (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14.
Detta system har redan använts framgångsrikt i kombination med kalcium imaging, patch fastspänning, elektronisk Mikroskop och cellulära analys av en sluten skalle mTBI mus modell4. Analysen kan också användas i kombination med Mikroskop-baserade experiment, såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP), att undersöka protein turn-over inom varicosities, liksom GRÄMA för att studera om protein-protein interaktioner är förändrad under Praparat bildandet. I huvudsak någon metod som kan göras med hjälp av ett mikroskop och en levande cell imaging set-up kan kopplas ihop med denna tuffande analys. Mångsidigheten hos denna analys är mycket värdefullt att studera de molekylära mekanismerna bakom olika effekter på neuronal morfologi och funktioner av mikromekaniska stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Alla djurförsök har utförts i enlighet med de nationella institut för hälsa djur Använd riktlinjerna. Detta arbete stöds delvis av anslag från National Institutes of Health (R01NS093073 och R21AA024873) till C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
