Summary
Bu iletişim kuralı bir fizyolojik alakalı, basınçlı sıvı yaklaşım varicosities nöronlar içinde hızlı ve geri dönüşümlü indüksiyon için açıklar.
Abstract
Aksonal varicosities akson heterojenite yüksek derecesi ile Miller boyunca genişlemiş yapılardır. Onlar sadece beyin nörodejeneratif hastalıklar veya yaralanma ile ama aynı zamanda normal beyin bulunur. Burada, biz varisler oluşumu ve türdeş olmayan protein kompozisyon yöneten mekanizmalarını anlamamızı sağlayan hızlı, güvenilir ve ters aksonal varicosities, ikna etmek için bir yeni kurulan micromechanical sistemi açıklanmaktadır. Bu sistem farklı hücre altı bölmeleri nöronların, esas olarak germe etkisi üzerinde odaklanmak diğer vitro sistemlerinden farklı sıkıştırma ve kayma stres etkilerini değerlendirmek için bir roman araç temsil eder. Önemlisi, bizim sistemi ve benzersiz özellikleri sayesinde, son zamanlarda basınçlı sıvı uygulama hızla ve geri dönülebilir olarak geçici reseptör potansiyeli kanal etkinleştirmesi üzerinden aksonal varicosities tetikleyebilir gösterilen yeni bir keşif yaptı. Biyomekanik sistemimiz uygun ilaç perfüzyon, canlı hücre görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve yama kelepçe yazmak ile birlikte kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem mechanosensitive iyon kanalları, aksonlar Taşıma Yönetmeliği, aksonlar sitoiskeleti dinamikleri, sinyal kalsiyum ve morfolojik değişiklikler ile ilgili travmatik beyin hasarı eğitimi için kabul edilebilir.
Introduction
Varisler oluşumu veya şişlik/boncuk, akson, boyunca önemli bir özelliğidir birçok bozuklukları veya yaralanma multipl skleroz, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin gözlenen ateş ve travmatik beyin yaralanması1,2. Aksonal varicosities aksiyon potansiyeli yayma ve sinaptik iletimi3önemli fizyolojik etkileri rağmen varicosities nasıl oluşturulduğunu bilinmemektedir. Son zamanlarda, yeni kurulan microbiomechanical tahlil kemirgenler kültürlü Hipokampal neurons kullanarak, mekanik uyaranlara varicosities son derece ilginç özellikleri ile bu nöronlar içinde tetikleyebilir buldum. İlk olarak, varisler indüksiyon hızlı (< 10 s) ve bu işlem beklenmedik bir şekilde geri alınabilir. İkinci olarak, varisler başlatma basınç şişirme gücüne bağlıdır: yüksek basınç, hızlı başlatma. Üçüncü olarak, varisler başlatma nöronal yaş üzerinde bağlıdır. Genç nöronların aksonlar mekanik stres, büyük nöronlar için göre daha duyarlı görünür. Dördüncü olarak, süre dendrites ve ilk axon kesimleri bu nöronların Hipokampal nöronlar akson boyunca varicosities şeklinde değişiklik yok aynı şişirme koşul altında görüntüler. Böylece, bizim çalışma nöronal polarite roman bir özelliği ortaya koydu. Bu bulgular vitro sistemiyle fizyolojik ilgilidir. Vivo modeli hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) kullanarak, biz aksonal varicosities hemen sonra Kapat-kafatası etkisi, bizim vitro ile tutarlı fareler somatosensor korteks multifokal bir biçimde geliştirilen gösterdi sonuçları4. Boyama ve görüntüleme mTBI farelerin sadece bir görüntüsü nöronal morfolojik değişiklikler sağlamak, in vivo performans beri nöronal Morfoloji hızlandırılmış görüntüleme sırasında bir mekanik etkisi hala mümkün değil unutmamak önemlidir.
Bu sıvı şişirme sistem sadece mekanik stres kaynaklı varisler oluşumu ile ilgili benzersiz özellikleri yakalamak için ama aynı zamanda temel mekanizması belirlemek için izin verdi. Farklı hücre dışı çözümler, blokerler ve mechanosensitive iyon kanalları ve hücresel Elektrofizyoloji farklı adayların açacakları test ederek, biz geçici reseptör potansiyel katyon kanal bu alt familya V üye 4 (TRPV4) tespit Ca2 + ve Na+ geçirgen ve Şişirme tarafından aktive kanal aksonal varisler oluşumu4sırasında ilk mekanik stres algılamak için esas olarak sorumludur. Bu daha da bir siRNA nakavt yaklaşım ile doğrulandı. Birlikte, Hipokampal nöron kültürü ile hazırladığımız bu yeni tahlil sistem ele alındığında, diğer teknikleri ile birlikte özellikle merkezi nöronların micromechanical özelliklerini çalışmak için son derece değerlidir.
Biz kurduk bu micromechanical sistemi benzersizdir ve birkaç önemli yönü daha önce var olan sistemleri farklıdır. İlk olarak, bu sistemde nöronlar uçak mekanik stres sıkıştırma ve yamultma şekillerde deneyim. Mekanik etkisi sırasında nöronal süreçleri coverslip yüzeye bağlı kalır ve hareket etmiyor. Bu deneysel diğer esas olarak bükme ve uçak-germe dahil sistemleri (veya gerilim) farklıdır, örneğin, birlikte aksonlar saptırma gibi dizeleri5,6 taşıyarak veya micropatterned üzerinde yetiştirilen aksonlar yayarak kanalları ve gerilebilir membranlar7,8. Ayrıca, aksonlar varicosities da içinde indüklenen her ne kadar bu deneyleri gibi sistemimizde sıvı şişirme, bu ayarları sürecinde (üzerinden birkaç saat6,7,810 dk) çok daha fazla zaman alır ve görünür geri alınamaz. Son olarak, sistemimiz yerel sıvı şişirme kullanarak varisler oluşumu uzamsal özelliklerinin incelenmesi sağlar (örneğin., dendrites, dendritik omurgalar, soma, aksonlar ilk kesimleri, aksonlar terminalleri), zamansal özellikleri yanında. Bu sistemi kullanarak, biz birkaç beklenmedik ve benzersiz özellikleri aksonal varisler oluşumu, özellikle hızlı başlangıçlı, yavaş reversibility ve akson-dendrite polarite keşfetti.
Biz bu yazıda görüşmek sistem moleküler ile birçok teknikleri uyumludur ve hücre biyolojisi. Örneğin, nöronal morfoloji ve fonksiyonu mekanik stres etkileri çalışmaya, miyelin coculture ile birlikte, düşsel floresan rezonans enerji transferi (FRET) ve toplam iç yansıma floresan (TIRF), hızlandırılmış kullanılabilmesi için Kalsiyum görüntü ve yama kelepçe kayıt. Bu yazıda, sistemin çekirdek bileşenlerinin odaklanacağız. Hipokampal nöron kültürü, sıvı şişirme Kur, aksonlar taşıma için yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntü ve kalsiyum görüntüleme hakkında adım adım aşağıda gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntemler aşağıda açıklanan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Ohio State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Coverslip hazırlık
- Bir veya daha fazla kutu 12 mm veya 25 mm coverslips % 70 nitrik asit içeren bir cam kabı yerleştirin ve oda sıcaklığında coverslips gecede kuluçkaya.
Not: 12 mm coverslips olarak aynı ölçek 25 mm coverslips yıkama yok. Onları ayrı ayrı yıkamak iyidir. - GKD2O 2.5 L ile dolu bir 4 L kabı içine tüm coverslips transfer ve 1 h 100 RPM için coverslips içeren kabı sallamak. Lastik bantlar kabı sallayarak sırasında tutmak için kullanın. Durulama taze 2.5 L GKD2O ile dört kez tekrarlayın.
- Temizlenmiş coverslips metal bir kapak ile kuru bir şişesi aktarın. Coverslips 225 ° c 6 h için fırında pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğutmak izin.
Not: 25 mm coverslip için kırılma eğilimli. Coverslips tek tek ayrı ve kurutma sonra onları bir fırında pişirin. - Kurutulmuş ve temizlenmiş coverslips oda sıcaklığında bir steril plastik kap içinde kullanımı kadar saklayın.
-
Coverslips aşağıdaki gibi kat:
- Taze kaplama çözümde bir santrifüj tüpü hazırlayın.
- Her coverslip 24-iyi (veya 6-şey) plaka bir kuyunun içine yerleştirin. 30 (-100) µL coverslip kaplama çözüm (Tablo 1) bir 12 mm (veya 25 mm) coverslip ve girdap üzerine yerleştirin. 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, doku kültürü sınıf) kuyuya ekleyin. Bu tabakları hemen kullanılan ya da steril PBS için bir hafta içinde 4 ° C'de depolanan.
- Diseksiyon günü, PBS kaldırın. Kuruması ve UV ışık (30W) için 2-4 h altında tabak yerleştirin.
Not: Son adım bir hücre kültür laminar akış başlıklı UV ışığı ile tamamlanmalıdır. Kapıyı kapüşonlu coverslips kurutma için hava akımı sağlamak için biraz kaldırdı.
2. diseksiyon, ayrışma ve hamile Mouse/fare Hipokampal Neurons kültür
-
Diseksiyon ve Hipokampal nöron kültürü için ayrılma
- Proteaz enzimi çözüm (3 mg/mL proteaz 23 SLD'ler, Tablo 1içinde) çözülme ve kaplama öncesi sıcak ortam (Tablo 2) 37 ° C'de
- Hippocampus teşrih ve önceki yayın14' te açıklanan yöntemlere göre SLD ile durulayın.
Not: Dört hippocampi bir 24-şey veya bir 6-şey plaka için yeterince hücre sağlar. - SLD'ler kaldırmak, proteaz enzimi çözüm 2 mL ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO2 15dk için örnek kuluçkaya.
- Hippocampus explants 5-10 mL kaplama orta ile iki kez yıkayın. Orta kaplama 5 mL ekleyin. Hipokampal explants Tek Kişilik hücrelere bir pipet ile 1 mL plastik ucu kullanarak küçük bir girdap oluşturarak ayırmak. Yukarı ve aşağı yaklaşık 40 kez, pipet oksijen kabarcıkları, oluşumu çözüm bulutlu olur ve explant büyük no adet kalması kadar uzak durmaya.
Not: yıkama sırasında bazı medya bırakmayı unutmayın, Hipokampal explants tüm süreç sırasında ortamda batık kalmalıdır. - 1.125 x g 3 dk. süpernatant hücreleri ile medyada batık Kaldır, hücreleri santrifüj kapasitesi. Medya kaplama 145 mL hücrelerde resuspend. 1 mL/iyi hücre süspansiyon 24-şey plaka (3 mL/iyi bir 6-şey plaka) ekleyin.
Not: medya kaplama 145 mL düşük hücre yoğunluğu olan bir hücre süspansiyon üretmek için kullanılır. Bu birim hücre kaplama altı 24-şey plakaları, sekiz 6-şey plakaları veya yapılacak deneyler bağlı olarak 24 - veya 6-da plakaların çeşitli kombinasyonları sağlayacaktır. 24-şey plaka her şey-ecek-si olmak 3 x 104 hücreleri9. - Kaplama medya 37 ° c, % 5 CO2 için 2-4 h, hücrelerde kuluçkaya sonra tüm kaplama medyayı çıkarın ve taze bakım ortamı ile değiştirin.
- 2 gün sonra (2 gün vitro, 2DIV), medya yarısı ile 2 yerine µM Ara-C (arabinosylcytosine) çözünmüş bakım medya hangi fibroblastlar, endotel ve gliyal hücreler büyümesini engeller. Ara-C hücrelere iki gün boyunca maruz kalmaları ortamı taze bakım medya ile değiştirin.
-
Transfection hücre morfolojisi görselleştirme için
Not: yeşil flüoresan protein (GFP), sarı floresan protein (YFP), mCherry, bireysel nöronların morfolojisi aydınlatmak için vb floresan yapıları içeren hücreleri Transfect.- Yapıları (1 µg/µL) stoktan Opti-MEM medya (Opti-MEM Medya 50 µL inşa 0.8 µg) ve girdap sulandırmak. 1 yapı seyreltme her şey için hazır olun.
Not: 24-şey plaka 0.8 µg Opti-MEM Medya 50 µL inşa gerekir. 6-şey plaka yapı 150 µL Opti-MEM medya 2.4 µg gerektirir. - Lipozom aracılı transfection reaktif Opti-MEM medya (50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL) ve girdap sulandırmak. 1 transfection seyreltme her şey için hazır olun.
Not: 24-şey plaka 50 µL Opti-MEM medya transfection reaktif 1,5 µL gerektirir. 6-şey plaka transfection reaktif Opti-MEM medya 150 µL içinde 4,5 µL gerektirir. - 1:1 karışımı (100 µL) Opti-Mem medya ve transfection reaktif Opti-MEM medya ve girdap içinde yapı, hazır olun. Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
Not: iyi yaklaşık 100 µL yapý, transfection reaktif ve Opti-MEM medya 24-şey plaka (6-şey plaka için 300 µL) kullanarak, içeren çözüm olmalı. - Ve bu ortamı temiz konik tüp içine transfer medya (24-şey plaka, 6-şey plaka için 1,5 mL için 500 µL) yarısı her kuyudan çıkarın. Bu tüp da kuluçka makinesine tutun. Daha sonra 100 µL karışımı (Adım 2.2.3) iyi kalan medya ekleyin. 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya hücrelere izin.
- Kuluçka (Adım 2.2.4) sırasında konik tüp (Adım 2.2.4) medyada bir birim taze bakım medya ekleyin. Karışım aynı İnkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) yerleştirin.
- Kuluçka kuyulardan transfection solüsyon içeren tüm medyayı çıkarın ve 1:1 karışımı eski ve yeni bakım medya konik tüp (Adım 2.2.5) ile değiştirin.
Not: yapıları boyutuna bağlı olarak, hücre içinde 12 h ifade başlamak; yapıları, en yüksek ifade ulaşılmadan 3-4 gün daha büyük yapıları için gerekli olabilir.
- Yapıları (1 µg/µL) stoktan Opti-MEM medya (Opti-MEM Medya 50 µL inşa 0.8 µg) ve girdap sulandırmak. 1 yapı seyreltme her şey için hazır olun.
3. şişirme pipet aparatı ayarlama
Not: Bu kurulum için beş temel bileşeni vardır: cam pipet, tüp, şırınga, micromanipulator ve tampon (Hank'in). Fizyolojik olarak ilgili tuz konsantrasyonları vardır herhangi bir arabellek bu kurulum içinde kullanılabilir.
- 45-µm-çapı açılış ipucu Tablo 3' te bir micropipette çektirmenin ve teknik özellikleri kullanma civarında olması borosilikat pipet çek.
Not: Bulunan 45 µm deneysel koşullar altında açılış pipet çapları için uygun bir boyutudur. Açılış boyutu küçük farklılıklar sonuçları önemli ölçüde etkilememelidir. Bu sayıdan büyük gidiş hala pipet boru üzerinden bağlandığı şırınga yüksekliğini ayarlayarak varisler indüksiyon için çalışması gerektiğini unutmamak gerekir, ama bu ayarlamayı basınç değeri gerektirir. - Pipet un çekti sonuna ince lastik boru içine yerleştirin.
Not: Boru duvar ince ve sıvı direnci şırınga yüksekliğini doğrudan pipet ile ihmal edilebilir direnç akan sıvı basıncı orantılıdır sağlanması, en aza indirmek için katı olmalıdır. Yaklaşık 0,6 m uzunluğunda daha en aza indirmek daha direniş tüp artık olmalıdır. - 10 mL plastik enjektör çevirmek mümkün bir vana ile bir bağlayıcıyla hortumunun diğer ucunu bağlayın.
Not: Pipet akan kabul edilen basınç için doğru bir ölçü sağlamak için sürekli, ölçülebilir bir yükseklik yapılacak plastik şırınga ihtiyacı var. 190 mm yüksekliğe kullanılmıştır, beri bu en az basınç sağlar fakat güvenilir bir şekilde aksonlar varicosities neden olmaktadır. Eğer basınç coverslip yüzeyinden ayırmak hücreleri neden diğer yükseklik değerleri de kullanılabilir. Bu deney boyunca aynı ayarı kullanmak için tavsiye edilir. - Pipet pipet tutmak için micromanipulator vida tepesine yerleştirin. Böylece hemen üzerinde nerede alıpkendi bağlı olduğu pipet un çekti sonu tutan micromanipulator koluna bağlı metal, düz tepesinde vida canı cehenneme. Açı nöron içeren coverslips yüzeyi ile 45° açıyla pipet.
Not: pipet alıpkendi constricting olmadan tutulabilen böylece micromanipulator inşa edilmelidir. Micromanipulator doğru hücre aralığında pozisyon x, y ve z yön pipet hareket izin vermesi gerekir. Bir fotoğraf cihazları yanı sıra grafik (şekil 1) sağlamıştır. - Bir floresan Filtresi'ni açmak, diyafram açın ve floresan bir yer-ebilmek var olmak seen amacı ile geliyor emin olun. Micromanipulator kullanarak, pipet ucu ile floresan nokta kadar hatları ve pipet hücre kültür çanak (35 mm x 10 mm) yüksekliği yukarıda sadece bir konum içine daha düşük bir pozisyon içine taşıyın. Bir kez o pozisyonda, iletilen ışığı ve floresan açmak.
- Cımbız kullanarak, bir coverslip (hücrelerle pipet doğru yukarı bakacak şekilde) hücre kültür plaka Hank'in arabellek oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL içeren hücre kültür çanak ekleyin.
- Coverslip kapsamı üzerine içeren kültür çanak yerleştirin.
- İyi odak düğmesi ve 20 X objektif kullanarak, bir uçağa Hücreleri (yaklaşık 0.4 mm) yukarıda yaklaşık dört tam döner odaklan. Böylece odaklanmıştır ve merkezinde, uçağın göz parçaları görüldüğü gibi sol tarafta pipet ucu konumlandırmak için micromanipulator kullanın.
Not: Dendrites onlar kaynaklanan hücre organ olarak aynı çerçevede olmalıdır projeksiyonları vardır. Aksonal varicosities ikna etmek için bir daha uzun projeksiyonlar hücre gövdesinden medial ve distal aksonlar takip etmeli.
4. bir gerilebilir membran sistemi kullanan pipet Basınç Kalibrasyonu
- Şişirme pipet aparatı ile tam olarak aynı parametreleri içeren bir microfabricated silikon membran (çapı 500 µm) ve 50 µm kalınlığında bir sistemde yukarıda açıklandığı gibi kurulum ve membran yüzeyinin mikroskop odak.
Not: Bu sistem küçük basınç değerleri ölçmek için tasarlanmıştır ve sistem açıklaması10önce yayımlanmıştır. Bu ölçüm yalnızca bir kez şişirme tam aynı ayarı kullanıldığında deneyler şişirme için yapılması gereken. - Mikroskop merkezleri arasında ölçülen microdots (çapı 4 µm) ve 10 µm ayrı, diziler üzerinde odaklanın. Kapatma vanasını açın ve pipet dışarı akışı için sıvı sağlar. Sıvı basıncını cevaben membran saptırma confocal mikroskopla inceleyin.
- Membran saptırma ile ilişkili karşılık gelen basınç belirlemek için doğrusal bir model kullanmak.
Not: Süre son bir çalışmada bulundu ki bir saptırma w-3.143 = ± 0,69 µm 190 mm şırınga yükseklik için elde edilen, bu fizyolojik ve patolojik aralığı içinde olsa geçerli pipet kurulumundan 0,25 ± 0,06 nN/µm2 baskı üretilen şırınga yüksekliği tek belirleyici değil. Diğer faktörler açma, konumlandırma pipet (mesafe ve açı) hücreleri ve hatta esneklik tüp4,10göre pipet ucu da dahil olmak üzere tam basınç değeri de, nöronlar üzerinde etkiler.
5. Varicosities ikna etmek için şişirme
- Pipet konumda olduğunda, mikroskop ilgi bölgesi içeren bir uçakta odaklan. Sağ alan şişirme dışında iken hücreleri ve işlemleri (kamera canlı yakalama tarafından görüldü) görüntüleme alanı şişirme alaný sol yarısında yerleştirin.
Not: akson geniş akıbet ve nöronların dendrites nedeniyle, bu bir nöron tüm işlemler aynı şişirme alanı içinde olduğunu düşüktür. Şişirme yerel etkisi incelenmesi sağlayan bu sistem, aslında bir avantajı bu. Varicosities ikna etmek için kullanılan şişirme iki tür vardır: uzun süre şişirme ve nabız şişirme. -
Şişirme
- Uzun süre şişirme
- Kültürlü nöronlar4içeren coverslip yukarıda 190 mm yükseklikte şırınga getirin. İlgi alanı hızlandırılmış görüntüleme açık nöronal Morfoloji açığa bir en iyi duruma getirilmiş çekim hızı ile başlar. En az 15 kare taban çizgisi olarak 2 s aralıklarla (30 s toplam) yakalama. Aralığı dayalı deneme olarak ayarlanabilir. Karede 16, şırınga çevirmek mümkün vanasını açın ve sıvı akışı için 75 kare izin (150 s). Sıvı akışı durur böylece çerçeve 75, kapak kapat. Video yakalama durdurmak.
Not: büyük nöronlar formu varicosities için daha uzun sürer, ancak bu nöronlar içinde aksonal varicosities 7-9 DIV içinde 5-10 lar, ikna etmek.
- Kültürlü nöronlar4içeren coverslip yukarıda 190 mm yükseklikte şırınga getirin. İlgi alanı hızlandırılmış görüntüleme açık nöronal Morfoloji açığa bir en iyi duruma getirilmiş çekim hızı ile başlar. En az 15 kare taban çizgisi olarak 2 s aralıklarla (30 s toplam) yakalama. Aralığı dayalı deneme olarak ayarlanabilir. Karede 16, şırınga çevirmek mümkün vanasını açın ve sıvı akışı için 75 kare izin (150 s). Sıvı akışı durur böylece çerçeve 75, kapak kapat. Video yakalama durdurmak.
- Nabız (2 s süresi) şişirme
- Şırınga uygun yükseklikte (190 mm) konumlandırın. Hızlandırılmış görüntüleme başlar ve en az 15 çerçeveleri yakalamak (30 s) 2 s aralıkta. Karede 16, şırınga Vanayı aç ve sıvı akışı izin verin ve sonra tekrar kapak açmadan önce 2 s. bekle 5-20 s (bağlı olarak test edilmesi için frekans) ardından vanayı kapat. Açılış ve kapanış Vana sıvı bakliyat oluşturmak ve toplam 150-300 s. kurtarma sahne yakalamak için 20 min için Imaging hızlandırılmış devam için devam için yineleyin.
Not: Ne zaman aralığı 10'dan daha uzun s, bakliyat büyük ölçüde daha az varicosities ikna etmek. 20 s aralıkta, hiçbir varicosities bakliyat4tarafından indüklenen. Güvenilir ve tutarlı varisler formasyonu elde etmek için bu şırınga yüksekliği yaklaşık 190 mm. şırınga yüksekliği olmalıdır ve sıvı basıncı hücreleri coverslip yüzeyden ayırma başladığı bir noktaya artırılmalıdır değil tavsiye edilir.
- Şırınga uygun yükseklikte (190 mm) konumlandırın. Hızlandırılmış görüntüleme başlar ve en az 15 çerçeveleri yakalamak (30 s) 2 s aralıkta. Karede 16, şırınga Vanayı aç ve sıvı akışı izin verin ve sonra tekrar kapak açmadan önce 2 s. bekle 5-20 s (bağlı olarak test edilmesi için frekans) ardından vanayı kapat. Açılış ve kapanış Vana sıvı bakliyat oluşturmak ve toplam 150-300 s. kurtarma sahne yakalamak için 20 min için Imaging hızlandırılmış devam için devam için yineleyin.
- Kullanım bir gün önce 10 mL % 70 hakkında akan tarafından kurulum (pipet, boru ve şırınga) temiz up ile etanol. Etanol yıkayın, sistem o günkü kullanmak için hazırlamak için set-up Hank'in arabellek (veya istediğiniz arabellek) 10 mL akışı. Gün için bitirme deneyler temizledikten sonra set-up olarak etanol ile gecede kirletici gelişimini önlemek için daha önce açıklanan.
- Uzun süre şişirme
6. övgü yöntemleri
Not: Şişirme tahlil çeşitli giriş bölümünde açıklanan farklı teknikleri ile kombine edilebilir. Burada, yüksek çözünürlüklü Floresans timelapse görüntüleme, kalsiyum görüntüleme ve kurtarma deneyleri gibi şişirme tahlil ile birlikte, en sık kullanılan temel teknikleri üzerine odaklanmıştır. Bunlar aşağıda ele alınmıştır.
-
Aşağıdaki iletişim kuralı takip ederek yüksek çözünürlüklü floresan hızlandırılmış görüntüleme kuralları
- Nöronlar bir 100 X Petrol mercek ile içinde fluorescently öğesini proteinlerin hareketlerini takip. Nöronlar sahip uygun cDNA yapı transfected. İçin 150 çerçeveleri yakalamak (Toplam 300 s) 2 s aralığı ile.
Not: Bazen, aynı anda birden fazla protein fluorescently öğesini hareketi görüntüye birden çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yapılır. - Bir kymograph video yazılım yakalama veya aracılığıyla ImageJ (NIH) oluşturur.
Not: Hız ve yön seyahat kymograph kullanarak belirlenebilir. * Emin soma bölgeden yatıyor yönünü unutmamak yakalanması. Aksonal ipucu soma uzak seyahat anterograd soma doğru seyahat retrograd, iken. - Tekrar bu işlemi şişirme, veya kymograph görüntü yakalama sırasında şişirme tahlil kullanılarak oluşturulabilir.
Not: mitokondri ve sinaptik proteinler aksonal taşımacılığının şişirme etkileri bir son kağıt4' te gösterilmiştir.
- Nöronlar bir 100 X Petrol mercek ile içinde fluorescently öğesini proteinlerin hareketlerini takip. Nöronlar sahip uygun cDNA yapı transfected. İçin 150 çerçeveleri yakalamak (Toplam 300 s) 2 s aralığı ile.
-
Kalsiyum görüntüleme
- 1 µL (için 24-şey plaka) ya da 5 mm Fluo-4 (6-şey plaka için) 3 µL eklemek AM medya bir şey ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya kültürüne.
- 1 mL Hank'in arabellek iki kez hücrelerle yıkayın.
Not: Yüklenen nöronlar FITC filtre kümesi yeşil Floresans yayarlar. Loci hücre içinde kayda değer kalsiyum bölgeleri gösterir. Şişirme ile birleştirildiğinde, yoğunluğu (iç kalsiyum düzeyinde artış) bir artış görülebilir.
-
Varisler kurtarma
Not: Hemen şişirme bir deney, bir 20 dk kurtarma deneme yapılabilir.- 300 kare için çekim (1.200 s) 4 s aralığı ile.
Not: bir hücre ile YFP/mCherry/GFP çözünür transfected makul ses seviyelerinde (% 50'den az) görüntüleme oturum bitmeden kurtarma göstermelidir. Aksonal kurtarma bir dizi faktöre, kültürlü nöronlar4gelişim aşaması gibi bağlıdır. Bu da yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ve yukarıda açıklanan kalsiyum görüntüleme ile kombine edilebilir.
- 300 kare için çekim (1.200 s) 4 s aralığı ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şişirme önce akson normalde küçük varisler oluşumu göster. Aşağıdaki bizim standart basınç ile (190 mmH2O yükseklik), birçok boncuk benzeri varicosities geliştirmek için aksonlar Başlat şişirme. Varicosities oluşumu 10 dk kurtarma döneminden sonra (Şekil 2A-B) önceden kahvaltılık durumlarına geri dönen axon bölgelerinde tarafından gösterildiği gibi kısmen tersinir olduğunu. Kurtarma daha uzun bir süre sonra (> 20 dk), bazı aksonlar tamamen kurtarmak. Suboptimal şişirme pipet gibi sahne alanı üzerinde 190 mm şırınganın doğru konumlandırma konumlandırma varicosities hızla oluşturabilir değil. Optimal koşullar aksonlar varisler oluşumunda genç nöronların (yaklaşık 7 DIV) yaklaşık 5 s4yol açmalıdır.
Resim 1 : Şematik ve aparatı şişirme fotoğrafı. (A)fotoğrafları genel mikroskop kurulum gösteriliyor. (B) cam pipet gösterilen aparatı şişirme micromanipulator tarafından düzenlenen ve alıpkendi için bağlı. (C) faz kontrast odak birincil Hipokampal nöronların pipet gölgesi alt sağ gösterilen düzlemde görüntülerle. (D) dışarı-in hücre uçak pipet ucu şişirme üzerinde duruldu. (E) şeması mesafeler ve varicosities ikna için hesaplanan baskıların. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Şişirme takip varisler oluşumu temsilcisi görüntüler. 7DIV, bir akson öncesi gösterilen ve sonrası bir 10 min kurtarma süre aşağıdaki gibi şişirme transfected GFP fare Hipokampal nöronlar(a)görüntüleme. Hızlandırılmış görüntüleme nöron(a), (B) Kymograph. Kırmızı oklar gösterir 150 oluşan varicosities 190 mmH2O şişirme s (30'başlayan s). Ölçek çubuğu 15 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Coverslip kaplama çözüm | |
| 780 ΜL | Asetik acid17 mM stok: 50 µL Asetik asit H2O 50 ml |
| 200 ΜL | Poli-D-lizin (0,5 mg/mL stok) |
| 20 ΜL | Sıçan kuyruğu kollajen (3 mg/mL stok) |
| Toplam hacim kaplı olması coverslips sayısına göre belirlenir. | |
Tablo 1: Coverslip kaplama çözüm. Kültürlü coverslips hücrelere bağlı kalmak için kullanılan coverslip kaplama çözüm hazırlanması için reçete sağlar.
| Filtre 1 x dilim diseksiyon çözüm (SLD), pH 7.4, mağaza 4 ° c = | |
| 1 L | GKD2O |
| 82 mM | Na2kadar4 |
| 30 mM | K2kadar4 |
| 10 mM | HEPES (ücretsiz asit) |
| 10 mM | D-glikoz |
| 5 mM | MgCl2 |
| %0.00 | Fenol red (isteğe bağlı) |
| Medya kaplama (am, filtre, mağaza 4 ° C'de) | |
| 439 mL | MEM Earle ün tuzları |
| 50 mL | FBS |
| 11.25 mL | % 20 D-glikoz |
| 5 mL | Sodyum pyruvate (100 mM) |
| 62,5 ΜL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | Penisilin/streptomisin (P/S, 100 x) |
| Bakım medya (MM, filtre, mağaza 4 ° C'de) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x ek |
| 1,25 mL | L-glutamin (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Tüm çözümler bir filtre 0.2 mm gözenek boyutu ile sterilize. | |
Tablo 2: hücre kültürü medya tarifleri. Birincil Hipokampal nöron hücre kültürü çalışmalarının kullanılan ortam hazırlamak için yemek tarifleri sağlar.
| Hank'in arabellek (filtre, pH 7.4, mağaza, 4 =° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | KCl |
| 1.2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glikoz |
| 20 mM | HEPES |
Tablo 3: Hank'in arabellek tarifi. Şişirme Protokolü ve canlı hücre görüntüleme sırasında kullanılan arabellek hazırlanması için reçete sağlar.
| Parametreleri çekerek pipet | |||||
| Isı | Çekme | Hız | Gecikme | Basınç | Rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tablo 4: parametreleri çekerek pipet. Pipet çektirme çapı yaklaşık 45 µm olduğunu bir açıklık elde etmek için ayarlamak için parametreleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu microbiomechanical tahlil düz ön işlemdir. Eğer onun adımları dikkatlice yürütülen güvenilir sonuçlar üretecektir. Uygun olmayan şekilde gerçekleştirdiyseniz, başarılı veri toplama engel olacak çeşitli anahtar adımlar vardır. Akıntıya karşı kritik adımlara başlamadan şişirme uyarıcı gerçek uygulamanın. Dikkatli diseksiyon, kültür ve bakım birincil nöron kültürünün olağanüstü vardır. Kültürlü nöronlar sağlıklı değilse, onlar zaten stres için astarlanmalıdır bu yana sürekli olarak, tepki değil. Kültür, ilk kurulum ve varicosities neden ama dekolmanı hücrelerin coverslip yüzeyinden neden olmaz, sabır ile gerçekleştirilmesi gereken tutarlı baskı, sağlamak için şişirme cihazı kalibrasyonu aşağı. Tuzak doğru kalibrasyon pipet tıkanma, boru veya Vana sorunları nedeniyle 1 h sürebilir. Sıvı hücreleri tabakta yerleştirerek ve pipet ucu konumlandırma ile ileri geçmeden önce en az direnç pipet dışarı akıtır sağlamak için önemlidir. Set-up değişiklikler söz konusu sürece bir perfüzyon, yama sıkma ve herhangi bir diğer mikroskop tabanlı araç, çoğunlukla fiziksel yer mikroskop üstünde belgili tanımlık etraf ücretsiz bağımlı şişirme cihazı eşleştirebilirsiniz.
Bu sistem, dikkat edilmesi gereken iki iç sınırı vardır. Set-up sürekli geri dönüşümlü varicosities akson şişirme sıvı hücreleri aracılığıyla kültürlü Hipokampal nöronların oluşumu başlatabilir. Ancak, aynı şişirme alandaki nöronların üzerine tam basınç değerleri özdeş değil unutmamak gerekir. Bu hücreleri etkiler, basınç yükü ölçüm microfabricated silikon membran4,10temel alarak hesaplanan, şişirme alanının merkezinde ortalama basınç temsil eden sıvı basıncı. Böylece, tam şişirme basıncı en yüksek şişirme alan ve alanın kenarında en düşük merkezi mevcuttur. Basınç güç ilişkilendirir başlangıçlı, boyutu ve varicosities sayısı4indüklenen gösterdi. Yüksek basınç daha hızlı başlangıçlı, daha büyük ve daha bol varicosities4sonuçlandı. Bizim son çalışmalarda, biz hala güvenilir varicosities çoğu aksonlar4neden olabilir en az bir basınç (şişirme pipet ucu, 190 mmHg) kullanılır. Bu durum altında varisler başlangıçlı genç nöronlar için normalde yaklaşık 5 olduğunu s. Hangi nöronal tipi, yaş ve hücre altı yuvası bağlıdır, ancak Ayrıca şişirme alan nöron konumunu tarafından etkilenmiş olabilir ile tam olarak aynı sistem, şişirme başlangıçlı zaman değeri değişebilir, unutmamak gerekir. Şişirme Basıncı nöronlar tarafından alınan varyasyon rağmen bu tahlil sistem hala Merkezi nöronlar üzerinde mekanik etkileri eğitimi için güvenilir bir aracı sağlar ve son derece tutarlı ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar verir.
İkinci sistem tıkanma onun sorunu kısıtlamasıdır. Fizyolojik olarak ilgili basınç elde etmek için Pipetler açılışı 45 mikron küçüktür. Ancak, küçük açılış plastik boru enkazı ile zarar eğilimi ve enkaz pipet ucu içinde mikroskop altında açıkça görülebilir. Bu kurulumu, durumunda bir pipet takunya prepping süreyi artırır. Bu nedenle, tüm çözümler dikkatle şırınga, boru ve pipet koymak önce filtre uygulanır. Şişirme sistem başlangıç ve filtre uygulanmış Hank'in arabellek ile yıkayarak ardından günün sonunda % 70 etanol ile yıkamak önemlidir. Potansiyel tıkanma sorunu çözmek için birden çok Pipetler çekmek denemenizi öneririz. Çözüm aslında pipet deneyler başlamadan önce görselleştirme yoluyla dışarı kabarık onaylamak için esastır. İyi bir şişirme sistem kurulduktan sonra genellikle gün boyunca sürebilir.
Nöron kültürü ile birlikte bu biyomekanik tahlil fizyolojik ve patofizyolojik koşulları taklit eden Merkez nöron mechanosensation çalışmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Bu sistem sıkıştırma ve nöronlar üzerinde kesme etkilerini incelemek için bize izin verir. Buna ek olarak, diğer sistemleri uçak-germe5,6,7incelemek için kullanılmıştır. Şişirme alanları Merkezi nöronlarda tarafından alınan ortalama basınç bizim sistem40,25 ± 0,06 nN/µm2 ' dir. Bu basınç hücrelerdeyse sarf daha önce kullanan optik indüklenen deformasyon13,14, tanımlamak için tarama kuvvet mikroskobu ve toplu Reolojisi, ölçülen Hipokampal nöronlar elastik modül için karşılaştırılabilir yanı sıra tarama tarafından ölçülen neurite önde gelen kenarları in vitro büyüme değiştirmek için kullanılan basınç mikroskobu (0,27 ± 0,04 nN/µm2)16zorlamak. Bu basınç doğal bir E11 embriyo Mezenkimal hücreler tarafından mekanik olarak belirli floresan hücreyi boyutlandırdıktan petrol microdroplets (1,6 ± 0,8 nN/µm)2,14kullanarak ölçülen oluşturulabilir basınç fazla olamaz.
Bu sistem zaten başarıyla kalsiyum görüntüleme, yama sıkma, elektronik mikroskop ve kapalı kafatası mTBI fare modeli4hücresel analizi ile birlikte kullanılmıştır. Tahlil de floresan kurtarma photobleaching (sıkı BAĞLAMAK), sonra gibi mikroskop tabanlı deneyler ile birlikte yanı sıra protein dönüş-over varicosities içinde incelemek protein-protein etkileşimleri değişmiş Eğer çalışmaya YIPRATMAK için kullanılabilir varisler oluşumu sırasında. Aslında, herhangi bir yöntem-ebilmek kılınmak istimal mikroskop ve set-up Imaging canlı bir hücre eşleştirilmiş ile şişirme bu tahlil. Bu tahlil çok yönlülük nöronal morfoloji ve işlevleri çeşitli etkileri tarafından micromechanical stres altında yatan moleküler mekanizmaları eğitim son derece değerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Tüm hayvan deneyleri Ulusal kurumları, sağlık hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. Bu eser kısmen C. Gu için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01NS093073 ve R21AA024873) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
