Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ultrasensitive gjenkjenning av Biomarkers ved hjelp av en molekylær preging basert kapasitive Biosensor

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57208
Automatic Translation
1, 1
1Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Lund University

Summary

Her presenterer vi en protokoll av kvantifisering av lav rikelig molekyler i komplekse løsninger ved hjelp av molekylære preging i kombinasjon med en kapasitans biosensor.

Abstract

Muligheten til å oppdage og quantitate biomolecules i komplekse løsninger har alltid vært svært ettertraktet innen naturvitenskap; brukes for påvisning av biomarkers, forurensninger og andre molekyler av interesse. En vanlig teknikk for dette formålet er enzymet knyttet Immunosorbent analysen (ELISA), hvor ofte en antistoff er rettet mot et bestemt mål molekylet, og en andre merket antistoff brukes for påvisning av primære antistoffer, slik at den absolutt kvantifisering av biomolecule under studien. Men begrenser bruk av antistoffer som anerkjennelse elementer robust metoden; som behov for å bruke merket molekyler. For å overvinne disse begrensningene, er molekylær preging implementert, lage kunstige anerkjennelse webområder utfyllende til mal molekylet og obsoleting bruk av antistoffer for første bindingen. Videre gir enda høyere følsomhet, kan sekundær merket antistoffer erstattes av biosensors stole på kapasitans for kvantifisering av mål molekylet. I denne protokollen beskriver vi en metode for å raskt og etikett-fri oppdage og quantitate lav-rikelig biomolecules (proteiner og virus) i komplekse prøver, med en følsomhet som er betydelig bedre enn vanlige oppdagingssystemer som ELISA. Dette er alle formidlet av molekylære preging i kombinasjon med en kapasitans biosensor.

Introduction

Kvantifisering av biomolecules brukes i mange ulike forskningsfelt innen vitenskap, ansette metoder som radioimmunoassay (RIA) eller ELISA1. Noen av disse metodene krever en merket reagens som radioisotop eller enzym merket antistoff/antigen, noe som gjør dem arbeidskrevende og tidkrevende med komplekse prosedyrer2. Videre, robusthet, selektivitet og følsomhet av disse metodene er ikke nok for alle analyser; spesielt er de ikke tilstrekkelig når attogram mengder må analyseres, snarere enn piktogram mengder3. For dette formålet, har biosensors fått betydelig interesse4,5, spesielt i kombinasjon med molekylær preging for en økt robusthet.

Molekylær preging er avhengig av oppretter hulrom ved polymerizing funksjonelle monomerer rundt mal6, lage kunstige anerkjennelse webområder som perfekt ligner mal7. Denne teknikken er brukt for flere programmer, inkludert narkotika leveringssystemer og analytisk separasjon, men også som biorecognition elementer i biosensors8,9,10. Men er det fortsatt noen problemer i utformingen av molecularly trykt polymerer (MIPs) for macromolecular maler som proteiner og celler11,12. På grunn av dette, har mange forskere fokusert på å prege mal protein direkte på et substrat dermed skaper en overflate som gjenkjennes av målet protein12. Denne overflatebehandlingen teknikken brukes for å ansette anerkjennelse hulrom for store molekyler og samlinger inkludert proteiner kalles microcontact preging13,14. Den generelle fremgangsmåten av metoden avhenger av polymerisasjon mellom to flater - malen stempel og en polymer støtte - som malen er adsorbert på en overflate15,16, og tok i kontakt med den monomer-behandlet overflaten. Hermed vei, er en tynn polymer film dannet på støtte via UV-polymerisasjon. Til slutt, malen er fjernet, etterlot mal bestemt hulrom i overflaten av trykt elektroden. Denne metoden har noen fordeler inkludert redusert aktivitet tap av trykt molekylet, så vel som krever svært små mengder mal molekyler for preging behandle16,17. Dermed kan overflatene kostnadseffektiv, stabil, følsom og selektiv opprettes på sensoren overflater, målretting en mal av brukerens valg.

Biosensor kan brukes for påvisning av enkelt proteiner og mye større biomacromolecules, inkludert virus. En bestemt gruppe virus økende siste interesse er bacteriophage, som er et virus som infiserer bakterier. Rask og følsom påvisning av bacteriophages er viktig i bioteknologisk og biofarmasøytisk prosesser for å fastslå infeksjoner av bakteriekulturer med bacteriophages18. Mest brukte biologiske analysen for bacteriophage påvisning er dobbeltlag agar metoden19, som er arbeidskrevende og tidkrevende. Flere forsøk er gjort for å utvikle nye diagnostiske verktøy virus (inkludert bacteriophages) som atomic force mikroskopi (AFM)20, interferometry21, elektrokjemi22og sensor system23, 24. mye arbeid har vært fokusert på biosensors på grunn av sine fordeler som lett å betjene, svært følsomme og i stand til sanntid mål15,25. En bestemt type biosensor er basert på endringer i kapasitans. Disse kapasitive biosensors er de elektrokjemiske sensorene som måler endringer i egenskapene dielektrisk når en analytt samhandler med et biorecognition-element på sensoren overflaten, forårsaker en nedgang i kapasitans2,4 . Kapasitive biosensors har blitt brukt for påvisning av ulike analytter som antigener, antistoffer, proteiner og heavy metal, ioner,6,,26,,27,,28. Disse typene biosensors har mange fordeler som iboende hurtighet, høy følsomhet, enkelhet, rimelig, enkel manipulering og sanntids måling uten merking29.

Metoden beskrevet heri er rettet mot aktivere gjenkjenning og kvantifisering av lav-rikelig biomolecules i svært komplekse prøver, uten behov for å bruke noen merking. Spesielt er teknikken mest nyttig i atto-hører området biomolecules, der andre kommersielt eksisterende instrumenter mislykkes å nøyaktig quantitate deres mål.

Protocol

1. endring av Glass Cover Slips (mal frimerker)

  1. For å rengjøre glass cover papirlapper, fordype dem sekvensielt i 10 mL 1,0 M HCl, deionisert vann og 1,0 M NaOH, henholdsvis i 10 min i hvert trinn i en ultrasonisk renere ved romtemperatur.
    1. Tørr glass cover papirlapper med nitrogen gass.
      Merk: Cover papirlapper er tørket av fordampning under en strøm av gass nitrogen.
  2. Lev de rengjort og tørket cover slips i 10% (v/v), 10 mL løsning av 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) i etanol 1t å innføre amino grupper på dekselet glassoverflaten, ved romtemperatur.
    1. Skyll cover papirlapper med deionisert vann.
    2. Tørr cover papirlapper med nitrogen gass.
  3. Fordype APTES endret cover papirlapper på 5% (v/v), 10 mL løsningen av glutaraldehyde i 10 mM fosfatbuffer (pH 7.4) for 2t for å aktivere amino gruppene på overflaten, romtemperatur6,15.
    1. Skyll cover papirlapper med 10 mM fosfatbuffer (pH 7.4) for å fjerne overflødig glutaraldehyde fra overflaten.
    2. Tørr cover papirlapper med nitrogen gass.
  4. Forberede 1,0 mL av malen (protein/bacteriophage) løsning i 10 mM fosfatbuffer (pH 7.4) i 0,1 mg/mL konsentrasjonen.
    Merk: Oppløse 0,1 mg av proteinet i 1,0 mL av fosfatbuffer (10 mM, pH 7.4). Hvis nødvendig, et spektrofotometer (280 nm) kan brukes til å bestemme protein konsentrasjonen.
    1. Slipp 200 µL av denne malen løsningen på endret cover papirlapper og ruge på 4 ° C over natten.
      Merk: Den overskytende mal-løsningen kan brukes til å forberede 1-2 mer mal frimerker i karakterisering studiene.
    2. Skyll cover papirlapper med 10 mM fosfatbuffer (pH 7.4) for å fjerne malen ubundet fra overflaten.
      Merk: For å skylle elektrodene, vaske dem med fosfatbuffer (10 mM, pH 7.4) for 30 s.
    3. Tørr cover papirlapper med nitrogen gass.
      Merk: Cover papirlapper bør lagres på 4 ° C før de brukes i polymerisasjon trinn.

2. endring av kapasitive gull elektroder

  1. Å rengjøre elektrodene, fordype elektrodene i et lite beger, sekvensielt, som inneholder 5 mL av etanol (70%), vaskebuffer vann, aceton, deionisert vann, surt piranha løsning (3:1 H2SO4: H2O2, v/v), og deionisert vann, henholdsvis for 10 min i hvert trinn i en ultrasonisk renere ved romtemperatur.
    1. Tørr elektrodene med nitrogen gass.
  2. For å utføre electropolymerization av tyramine, forberede 8 mL 10 mM tyramine løsning i 10 mM fosfat buffer (pH 7.4) som inneholder etanol (2 mL)15.
    Merk: Det totale volumet av den tyramine løsningen må være 8 mL totalt inkludert 2 mL av etanol.
    1. Utføre syklisk voltammetric søk (15 sykluser) i denne løsningen med en potentiostat som dekker et spekter av 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) og en skanning av 50 mV/s30.
    2. Skyll elektrodene med deionisert vann.
    3. Tørr elektrodene med nitrogen gass.
  3. Fordype elektrodene i en løsning som inneholder 30 mM acryloyl chloride og 30 mM trimethylamine i toluen (Vtotale = 5 mL) i romtemperatur over natten6,15,30.
    1. Skyll elektrodene med deionisert vann.
      Merk: For å sikre en bedre flytting av Ureagert acryloyl chloride og trimethylamine rester, det er også mulig å vaske overflaten med NaOH etter deionisert vann.
    2. Tørr elektrodene med nitrogen gass.

3. forberedelse av trykt kapasitiv gull elektroder

  1. Utarbeidelse av bacteriophage trykt kapasitiv gull elektroder
    1. Før polymerisasjon, forberede en monomer løsning som inneholder monomer (N-hydroxymethyl akrylamid) og kryss-linker (polyetylenglykol-400-dimetakrylat) i forholdet 1:5 (mol/mol) i 1 mL av 10 mM fosfatbuffer (pH 7.4).
      Merk: Monomer løsningen inneholder monomer og kryss-linker kan brukes i forskjellige prosenter, eller monomer og kryss-linker kan endres i henhold til malen for optimalisering av bestemt interaksjon.
    2. Legge til 1 mg av foto-initiatoren i denne løsningen.
      Merk: Hvis polymerisasjon utføres under UV-lys, deretter Foto-initiatoren må brukes til å starte polymerisasjon. Hvis polymerisasjon utføres av frie radikaler polymerisasjon, endres av initiatoren.
    3. Pipetter 1,5 µL av denne løsningen på gull overflaten av endrede gull elektroden.
      Merk: Gull overflaten av elektroden vises skjematisk i figur 1.
    4. Bringe mal stempel i kontakt med monomer løsningen på gull elektrode overflaten.
    5. Starte UV polymerisasjon (365 nm, 400 W) og fortsette i 15 min31.
      Merk: UV polymerisasjon utføres i et avkjølende skap som er satt til-25 ° C før du iverksetter polymerisasjon. Deretter UV-lyset herding system er slått på og polymerisasjon er fortsatt 15 min før du slår av UV-lyset herding system.
    6. Fjerne malen stempel fra overflaten ved hjelp av pinsett.
      Merk: Mens du fjerner malen stempel fra overflaten, polymere filmen på overflaten kan være skadet. Derfor skal stempel fjernes fra overflaten veldig forsiktig og sakte uten å bruke kraft.
    7. Skyll elektrode overflaten med deionisert vann og tørk den med nitrogen gass.
    8. Fordype elektrodene i 1 mL av 10 mM 1-dodecanethiol forberedt i etanol 20 min for å dekke knappenålshull på elektroden overflaten.
    9. Skyll elektrodene med deionisert vann og tørk elektrodene med nitrogen gass.
  2. Utarbeidelse av Protein trykt kapasitiv gull elektroder
    1. Før polymerisasjon, forberede en monomer løsning som inneholder monomerer (akrylamid: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) og cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) i 820 µL av svært rent vann30,32.
    2. Forberede 5% (v/v) N N N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) i svært rent vann.
    3. Legge til 20 µL av TEMED løsningen i monomer løsningen og tømme med nitrogen gass i 5 min.
    4. Forberede 10% (w/v) ammonium persulphate (APS) i svært rent vann.
    5. Legge til 20 µL av APS løsningen i monomer løsningen.
    6. Pipetter 1,5 µL av monomer løsningen på endrede gull elektrode overflaten.
    7. Bringe mal stempel i kontakt med overflaten monomer-behandlet.
    8. Starte polymerisasjon ved romtemperatur og fortsette for 5 h.
      Merk: For utarbeidelse av protein-trykt gull elektroder, i stedet for UV-polymerisasjon, frie radikaler polymerisasjon ved romtemperatur (25 ° C) utføres ved hjelp av APS-TEMED som initiator-katalysator.
    9. Fjerne malen stempel fra overflaten nøye ved hjelp av pinsett.
    10. Skyll elektroden med deionisert vann og tørk med nitrogen gass.
    11. Fordype elektrodene i 1 mL av 10 mM 1-dodecanethiol forberedt i etanol 20 min for å dekke knappenålshull på elektroden overflaten.
    12. Skyll elektrodene med deionisert vann og tørk elektrodene med nitrogen gass.

4. karakterisering av elektroden overflaten med skanning elektronmikroskop (SEM)

  1. Montere prøver på aluminium eiere med selvklebende karbon tape.
  2. Coat elektrodene med 10 nm palladium/gull.
  3. Undersøke elektrodene med SEM.

5. sanntid kapasitiv målinger med mal preget kapasitiv gull elektroder

  1. Trykt kapasitiv gull elektrodene inn elektrokjemiske flyt cellen integrert en kapasitiv biosensor.
  2. Forberede 100 mL gjenfødelse buffer (25 mM glycine-HCl, pH 2.5, inkludert 50 mM Tween-20) og 1 L kjører buffer (for bacteriophage trykt system: 10 mM fosfat, pH 7.4; for protein-trykt systemet: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).
  3. Starte analysen med injeksjon av gjenfødelse buffer til å regenerere system og kjører buffer re equilibrate systemet for 25 min.
  4. Forberede standard mal løsninger i ønsket konsentrasjon området kjører buffer.
    Merk: Først forberede et lager av malen løsningen ved å løse opp 0,1 mg protein og ca 108 pfu bacteriophages, 1,0 mL fosfat buffer (10 mM fosfat, pH 7.4). Deretter forberede de standard løsningene for kalibreringskurven ved å lage ti sekvensiell 10 ganger fortynninger fra lager løsning. Disse løsningene vil bli analysert med kapasitive biosensor i trinn 5.5. Protein konsentrasjon kan måles ved hjelp av et spektrofotometer (280 nm). For å måle bacteriophage konsentrasjonen, en tolags agar metoden kan brukes, som er beskrevet i detaljer tidligere19.
  5. Injisere 250 µL av disse standard løsninger fortløpende til systemet i optimal forhold (flyt: 100 µL/min, temperatur: 25 ° C).
    Merk: I dette programmet, standard protein løsningene ble utarbeidet i området konsentrasjon 1,0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, mens bacteriophage konsentrasjonen var i området 1.0 x 101 - 1.0 x 105 pfu/mL. Løsningene ble plassert i injeksjon ventilen, og sekvensielt injisert i systemet, injisere eksemplene i triplicates gjennom enkelt sprøytepumpen og multiport ventilen. Nedgangen i kapasitans etter injisere de standard løsningene som oppstår fra binding av malen til trykt hulrom overvåkes automatisk av instrumentets programvare.

Representative Results

Ved å følge protokollen, i henhold til skjemaet i figur 1, vil en nakne gull elektrode trykt med en mal, som representerer strukturen til en biomacromolecule. Denne elektrode kan brukes i en kapasitiv biosensor (figur 2), slik at stabil anvendelsen av en mal på elektroden og måling av endringer i kapasitans ved binding av malen.

En skjematisk fremstilling av det kapasitive biosensor er vist i figur 2. Centris pumpen, som er ansvarlig for kontinuerlig injeksjon kjører bufferen (10 mM fosfat, pH 7.4) og gjenfødelse bufferen (25 mM glycine-HCl, pH 2.5) under regenerasjon i flyt cellen, kan sees tydelig i figuren. Flyt cellen består av arbeider, referanse og counter elektroder. Injeksjon ventilen består av standard protein/bacteriophage løsninger som passerer gjennom degasser først og deretter injisert sekvensielt i systemet. Så snart løsninger nå arbeider elektroden i flyt cellen, overvåkes resultatet i sanntid. Kapasitans verdiene kan registreres etter sensorgrams på skjermen.

Figur 3 og Figur 4 viser forskjellene mellom overflaten av nakne og trykt gull elektroder. Dette karakterisering er viktig å sikre at det er polymere hulrom, sett på som grovheten på overflaten av elektroden etter preging. Bortsett fra SEM, finnes det også andre karakterisering metoder inkludert AFM, kontakt vinkel målinger, ellipsometry etc., som kan brukes til å beskrive overflaten etter preging. Hermed vei, kan det sikres at prosessen preging er vellykket og at malen hulrom er dannet på overflaten. Innenfor disse hulrom, kan malen binde med stor detaljrikdom og affinitet.

Etter injisere de standard løsningene i kapasitive systemet, et gjennomsnitt av de fem siste målingene ble beregnet automatisk av programvaren og kalibrering grafene ble oppnådd ved å plotte endringen i kapasitans vs konsentrasjonen av den analytt. Nedgangen i registrerte kapasitans oppsto fra binding av malen. Flere molekylene som binder til gull elektroden overflaten, jo høyere reduksjon i totale kapasitans, i henhold til de generelle prinsippet av kapasitive målinger. Figur 5 og figur 6 viser at med økende konsentrasjonen av analytt, ΔC øker som forventet. Det dynamiske spekteret (mellom er konsentrasjon området der det er nyttig for påvisning av et spesifikt mål) og grensen for påvisning (LOD) kan vurderes ved å analysere disse grafene. Ifølge figur 6, bacteriophage preget kapasitive biosensor kan oppdage bacteriophages i området konsentrasjon på 101 - 105 pfu/mL, med LOD verdien 10 pfu/mL i denne studien. Både figur 5 og figur 6 også markere nødvendigheten av å måle kalibreringskurven i samme intervallet kreves for malen konsentrasjonen er ment, siden linearitet av regresjon kan variere over konsentrasjonen ( Figur 5), eller har ulike løyper (figur 6). Det bør også bemerkes at på grunn av de lave konsentrasjonene brukt systemet er ganske følsom svingninger (turbiditet i prøven, air utkast, etc.) og derfor er det anbefalt å kjøre minst triplicates å redusere potensialet i inkludert outliers . Av samme grunn, kan standardavviket være ganske betydelig for svært fortynnede prøver, som vist i figur 6.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av microcontact preging metoden. (A) utarbeidelse av glass cover papirlapper (mal frimerker), (B) utarbeidelse av kapasitive gull elektrodene, (C) microcontact preging av malen på gull elektrode overflaten via UV-polymerisasjon og (D) fjerning av malen fra elektrode overflaten (gjengitt fra Ertürk et al., bioteknologi rapporter 2014 (3): 65-72 med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Skjematisk fremstilling av det kapasitive biosensor. Det generelle oppsettet av kapasitive biosensor brukt i denne studien (gjengitt fra Ertürk et al., bioteknologi rapporter 2014 (3): 65-72 med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Skanning elektronmikroskop protein trykt elektroder. SEM bilder av (A) en nakne gull elektrode (skala bar = 20 µm), og (B) et protein trykt kapasitiv gull elektrode (skala bar = 10 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Skanning elektronmikroskop av bacteriophage trykt elektroder. SEM bilder av en naken gull elektrode (skala bar = 20 µm) (A), og en bacteriophage trykt kapasitiv gull elektrode i ulike forstørrelser (6600 x, skala bar = 10 µm) (B), 11 og 500 X, skala bar = 5 µm) (C); piler betegne overholdt bacteriophages). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Effekten av buffer komposisjon for kalibrering diagrammer. Kalibrering grafen viser endringen i kapasitans vs en protein konsentrasjon i optimal forhold (kjører Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Gjenfødelse Buffer: 25 mM glycine-HCl, pH 2.5 inkludert 50 mM Tween-20; Infusjonshastigheten: 100 µL/min, prøve volum: 250 µL; T: 25 ° C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Representant kalibreringskurven for store biomacromolecules. Kalibrering graf som viser endringen i kapasitans vs bacteriophage konsentrasjon i optimal forhold (kjører Buffer: 10 mM fosfat, pH 7.4; Gjenfødelse Buffer: 25 mM glycine-HCl, pH 2.5 inkludert 50 mM Tween-20; Infusjonshastigheten: 100 µL/min, prøve volum: 250 µL; T: 25 ° C) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Når denne metoden er gjennomført, er det noen avgjørende skritt som må vurderes når følger protokollen. En kritisk trinn er rengjøring trinn med syreholdig piranha løsning. Trinn 2.1 kan ikke være mer enn 10 min. Malen løsningen for trinn 1.4 må ikke overskride 0,1 mg/mL, siden disse verdiene er optimalisert tidligere. Syklisk voltametric skanner må ikke overskride 15 sykluser for å oppnå optimale tykkelsen. For trinn 3.1.3 er 1,5 µL en optimalisert verdi. Denne verdien kan ikke være høyere for denne type elektroden. Hvis UV herding system har en effekt på 400 W, må deretter polymerisasjon utføres maksimalt 10-15 min. Så snart APS (initiator) er lagt til løsningen etter TEMED, må det påfølgende trinnet utføres raskt for å unngå umiddelbar polymerisasjon (trinn 3.2.5).

En av de viktigste trinnene er fjerning av malen stempel fra overflaten etter UV polymerisasjon. Hvis dette trinnet ikke utføres riktig, det er en risiko som polymere filmen på overflaten av elektroden kan fjernes med stempel. Det anbefales derfor å fordype elektroden og protein stempel på topp i en løsning av vann etter polymerisasjon, fjerner stempelet veldig sakte og forsiktig fra overflaten (trinn 3.1.6).

Basert på malen som brukes, kan endringer og forholdet mellom monomerer brukes (funksjonell monomer og kryss-linker) vurderes i generere høyere følsomhet. Dette må bestemmes empirisk. Videre innebærer affinitet binding av malen molekylet vanligvis flere ulike interaksjoner samtidig. Derfor kan dette føre til problemer under gjenfødelse trinnene. Hvis malen bundet ikke er frigitt fra overflaten riktig, kan dette påvirke gjenbruk av elektroden for videre analyse. Disse multipunkt slektskap kan også skyldes binding via svakere interaksjoner. I slike systemer, kan ikke-spesifikk binding ta sted, som kan negativt påvirke selektivitet system16. Dette er vanlig, og generelt, begrensninger av metoden.

Bortsett fra disse bestemte begrensninger finnes det mange betydelige fordeler av metoden diskutert over eksisterende metoder. Mens RIAer, ELISAs og fluorometric mål er svært følsomme, krever de bruk av merket materiale (mal eller detektor), mens biosensor er helt etikett-fri. Disse metodene er også dyrere og tidskrevende. En biosensor tilnærming gir rask, parallelle syntese av MIPs i forskjellige komposisjoner på samme tid16. Siden bare noen microliters av monomer løsning er nødvendig for forberedelse, er metoden praktisk når du bruker dyre eller ellers begrenset monomerer. Videre, enkelt MIP elektrodene kan brukes for ca 80 analyser uten en betydelig reduksjon i ytelse, som er betydelig høyere enn andre eksisterende metoder30. Eksisterende metoder også lider, i varierende grad, lav sensitivitet og selektivitet, mens metoden beskrevet tillater påvisning og måling av molekyler i området pM med høy selektivitet.

På grunn av kostnadseffektivitet, enkel drift av apparatet, og sanntid sensitive gjenkjenning på kort tid sammenlignet med eksisterende metoder, biosensors er veldig lovende punkt-av gjenkjenning systemer under feltforhold; f.eksfor miljøovervåking og programmer i utviklingsland. I mange programmer innen diagnose av sykdommen er sanntid, følsom, selektiv og rask påvisning av en biomarkør i en kompleks blanding som serum nødvendige15,25. Her er biosensors bedre enn eksisterende metoder, spesielt på grunn av sin robusthet og følsomhet. Spesielt for påvisning av smittestoffer regnes nylig bacteriophages som alternativ biorecognition element for biosensors på grunn av deres vert bakterier spesifisitet33,34,35. Antistoffer med bacteriophages er veldig lovende for å redusere kostnadene og øke stabiliteten ytterligere36. Et slikt system kan også av kvantifisering av bestemte phages i miljøet og fra klinisk prøver. Utbredelsen av bacteriophages, og deres evne til å transduce bakterier med antibiotikaresistens gener37,38, kanskje slik metode er verdifulle studere spredning av motstandsdyktig bakteriell.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Maria Baumgarten (IQ bioteknologi plattform, infeksjon medisin, Lund universitet) er anerkjent for å utføre og gir skanning elektron micrographs. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra den svenske Research Council Formas (2017-00100) som en del av den europeiske tredje felles programmering initiativ på antimikrobielle motstand (JPIAMR) samtale "Overføring Dynamics." Fond ikke hadde noen rolle i studien design, tolkning, skriving, utarbeidelse av manuskriptet, beslutningen om å sende eller beslutning å publisere arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Cover slips ThermoFisher 102222 protein stamp
HCl Sigma-Aldrich H1758-500ML cleaning
NaOH Sigma-Aldrich 72068-100ML cleaning
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonic BRANSONIC M1800- E cleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648-100ML modification
EtOH Sigma-Aldrich 1009836010 rinsing/cleaning
glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882-100ML cross-linker
acetone Sigma-Aldrich 34850-1L-M cleaning
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741-100ML piranha solution
H2O2 Sigma-Aldrich H1009-500ML piranha solution
tyramine Sigma-Aldrich T90344-5G modification
CompactStat Ivium Technologies CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz potentiostat
Platinum Counter Electrode Kit Equilabrium AFCTR5 potentiostat
Reference Electrode Equilabrium RREF0021 potentiostat
acryloyl chloride EMD Millipore 8.00826.0100 modification
triethylamine EMD Millipore 8.08352.0100 modification
toluene Sigma-Aldrich 244511-100ML modification
N-hydroxymethyl acrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate Sigma-Aldrich 409510-250ML cross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma-Aldrich 410896-50G functional monomer
UV polymerizator Dymax Dymax 5000ECE UV-polymerization
forceps Sigma-Aldrich Z168777-1EA consumable
1-dodecanethiol Sigma-Aldrich 471364-100ML blocking agent
acrylamide Sigma-Aldrich A3553-100G functional monomer
N-hydroxymethylacrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
N-isopropylacrylamide Sigma-Aldrich 415324-50G functional monomer
methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich 146072-500G cross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-25ML catalyst
ammonium persulphate Sigma-Aldrich A3678-25G initiator
Capacitive biosensor CapSenze Equipment
Glycine Merck 1042011000 regeneration buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML regeneration buffer
Trizma base Sigma-Aldrich 93352-1KG running buffer
Na2HPO4 • 2H2O Calbiochem 567547-1KG running buffer
NaH2PO4 • 2H2O Calbiochem 567549-1KG running buffer
DELPHI correlative light and electron microscope Phenom-World equipment
Capacitive gold electrodes CapSenze Biosystems consumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) Sigma-Aldrich 441090-25G photo-initiator
CapSenze Smart Software CapSenze Biosystems software program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

Tags

Immunologi problemet 132 molekylær preging microcontact preging kapasitive biosensor bacteriophage polymer biomacromolecule
Ultrasensitive gjenkjenning av Biomarkers ved hjelp av en molekylær preging basert kapasitive Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ertürk, G., Lood, R.… More

Ertürk, G., Lood, R. Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e57208, doi:10.3791/57208 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter