Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

אולטראסאונד בתדירות גבוהה הדמיה של העכבר עוברית השתפרה דימות ברזולוציה, יכול לספק אפיון פולשני מדויק של התפתחות הלב, פגמים מבניים. פרוטוקול המתוארים במסמך זה מיועדת לביצוע בזמן אמת עוברי עכברים אקוקרדיוגרפיה ויוו.

Abstract

מומי לב מולדים (CHDs) הן הגורם השכיח ביותר בילדות התחלואה והתמותה מוקדם. זיהוי טרום לידתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס של CHDs חיונית להמציא אסטרטגיות חדשות מניעתיים וטיפוליים. העכבר המוטציות הן כלים רבי-עוצמה כדי לגלות מנגנונים חדשים מכפילי עקה לנהוג לב פיתוח ושינוי הפוטנציאליים שלהם ב CHDs. נעשו מאמצים להקים את סיבתיות של אלה תורמים בשם מוגבלת ללימודים היסטולוגית ומולקולרית בניסויים על בעלי חיים ההישרדות, בפיקוח אילו הפרמטרים המפתח פיזיולוגי ו והמודינמיקה זאת, לעתים קרובות נעדר. טכנולוגיית הדמיה חיה הפך להיות כלי חיוני להקים האטיולוגיה של CHDs. בפרט, אולטראסאונד הדמיה ניתן להשתמש prenatally מבלי לחשוף בניתוח, העוברים, ומאפשר שמירה על הפיזיולוגיה הבסיסית שלהם תוך מעקב אחר השפעת עקה על ההיבטים והמודינמיקה ומבניים של חדר הלב פיתוח. במסמך זה, אנו משתמשים במערכת סאונד בתדירות גבוהה (30/45) לבחון את מערכת הלב וכלי הדם בעכברים העובר בזמן E18.5 בתוך הרחם על הבסיס, בתגובה לחשיפה היפוקסיה טרום לידתי. נדגים את הכדאיות של המערכת כדי למדוד את גודל הלב קאמרית, מורפולוגיה, תפקוד, קצב דפיקות הלב, ואת מדדי הזרימה בעורק הטבור, והשינויים שלהם בעכברים העובר חשוף היפוקסיה כרונית מערכתית בתוך הרחם אמת הגיע הזמן.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מומים מולדים של הלב הם הטרוגנית פגמים מבניים המתרחשים במהלך התפתחות הלב מוקדמת. ההתקדמות הטכנית הנוכחי של הליכים תפעוליים הובילו לשיפור משמעותי שיעורי ההישרדות של תינוקות עם CHDs1,2. איכות חיים זאת, לעתים קרובות משני פרוץ אשפוז ממושך והצרכים עבור יזם את תיקון כירורגי הליכים1,2,3,4,5. זיהוי טרום לידתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס של CHDs חיוני כדי לתכנן התערבויות מוקדם, כדי לבצע אסטרטגיות מניעה חדשות, וכדי לשפר את תוצאות לכל החיים6,7.

למרות היו מעורבים מספר גורמים גנטיים וסביבתיים CHDs פתוגנזה, הקמה של סיבתיות נשאר צורך לשפר את האבחון, טיפולית ואסטרטגיות מניעה1,8,9 ,10,11,12. יתר על כן, לבחון את התפקידים של גורמי הלחץ בתוך הרחם מכפילי epigenetic פתיחת מקומות חדשים בעתיד חקירות11,12. בעשור האחרון אכן חוותה ההתקדמות המהירה בטכנולוגיית הדור הבא רצפי כולל microarray פולימורפיזם (הסנ פ) נוקלאוטיד יחיד, exome כל רצף הגנום כולו מתילציה מחקרים, ניצול שלהם ללמוד את גנטי גורם למחלות בבני אדם מורכבים, כולל CHDs1,8,9,10,11 סולל את הדרך לזיהוי מוטציות הרומן והן גרסאות גנטי טרם אושרו לבדוק שלהם פתוגניות במודלים של בעלי חיים מתאימים.

בין המערכות מודל המחלה שונה, העכבר הוא המודל בעלי חיים של בחירה, לא רק על חקירת מנגנוני CHDs במהלך המוקדמות cardiogenesis13,14,15,16, אלא גם להבהיר השפעתם על התבגרות קאמרית הלב ותפקוד -בסוף ההיריון ב גורמים לנשים בהריון ולאחר הלידה. לפיכך, ביצוע ויוו פנוטיפי אפיון לב מוטציה העכבר עוברית, בשלבים גם מוקדמת וגם מאוחרת של פיתוח, חיוני להבין את התפקיד של וריאציות גנטיות אלה גורמים סביבתיים על פיתוח לב, ו ההשפעה הפוטנציאלית העתידית על תהליכי התבגרות מסוימת קאמרית בעכברים.

גילוי מוקדם, אבחון מדויק של מומי לב במהלך הפיתוח היא קריטית עבור התערבותית התכנון17,18. להיות בטוחה, פשוטה, נייד, הדיר, sonography העובר אכן הפך הסטנדרט הדמיה טכניקה להערכת לב במרפאה. הערכת זרימת הדם העוברי באמצעות אולטרסאונד דופלר כבר בשימוש נרחב באימון קליניים לא רק על הגילוי של מומי לב, אלא גם כדי לזהות חריגות בכלי הדם, אי ספיקה השליה, פיגור גדילה תוך רחמי, וכדי להעריך העובר well-being, בתגובה בתוך הרחם עלבונות כולל hypoxemia, מחלה אימהית של תרופות רעילות17,18. במקביל לערכו בהערכת האנושי מולדים ומחלות, אולטרסאונד הערכת של עוברי עכברים צברה השירות גדל והולך הגדרות ניסיוני19,20,21,22, 23. בפרט, אולטרסאונד לב העובר (אקוקרדיוגרפיה) מאפשר רציפים ויוו ויזואליזציה של הלב המתפתח. מחקרים ניסויים רבים השתמשו בטכנולוגיית אולטראסאונד-הדמיה להתבונן העוברית לב וכלי דם ב העכברים הטרנסגניים בעובר. אולטרסאונד דופלר כבר שימושי במיוחד התירי את הפרמטרים הקשורים pathophysiological, כגון דפוסי זרימת מחזור הדם העוברי תחת אתגרים פיזיולוגיים או מחלת תנאים10,19. בני אדם והן חיות, אספקת דם חריג זרימה או חמצן לעובר יכול לנבוע לתנאים שונים יכול לשבש את הסביבה העובר בתוך הרחם , להשפיע על fetoplacental הציר, לרבות ליקויים היפרדות, היפוקסיה אימהי, סוכרת הריונית, כיווץ כלי דם הם המושרה15,22. לפיכך, הקמת מתוקננת מספקת שיטות לביצוע אולטרסאונד דופלר על עכברים עוברית מאוד אטיל מחקרים עתידיים של CHDs על ידי הקלת הפיקוח תבניות זרימה ובמדד והמודינמיקה מפתח של מעגלים לב וכלי דם במהלך בשלבים שונים של פיתוח לב במודלים של העכבר גנטי.

אולטרסאונד בתדירות גבוהה התפתחה כלי רב עוצמה כדי למדוד את הפרמטרים התפתחותית ופיזיולוגיים של מערכת הלב וכלי הדם מחלות אנושיות18ובדגמי העכבר. טכנולוגיה זו היה מעודן יותר בשנים האחרונות. ואנו חוקרים אחרים הראו את הכדאיות של מערכת זו עבור מחקרים אולטרסאונד בתדירות גבוהה במיוחד על העכבר עוברית לב15,19,20,21,22 ,23. המערכת מצוידת מיפוי זרימת דופלר צבע ו מתמרים ליניארי מערך לייצר תמונות דו-ממדיות, דינמי במחירים מסגרת בתדירות גבוהה (30-50 מגה-הרץ). יתרונות אלו, לעומת מערכות אולטרסאונד בתדר נמוך של הדור הקודם של אולטרסאונד בתדירות גבוהה21,22, לספק את הצורך רגישות והרזולוציה עבור הערכה מעמיק של העובר הדם מערכת, כולל אפיון מקיף של הלב מבנים, הפונקציה קאמרית מדדי תזרים של עוברי עכברים בהגדרות ניסיוני. במסמך זה, אנחנו חלוקה לרמות שיטות לביצוע הערכה מהירה של מחזור feto-היפרדות בזמן יום עובריים E18.5 ויוו והשאלה ריאות באמצעות מערכת בתדירות גבוהה. בחרנו מתמר 30/45 מגה-הרץ מספק פתרון צירית כ-60 מיקרומטר ופתרון לרוחב של מיקרומטר 150. עם זאת, ניתן לבחור מתמר בתדר גבוה (40/50 מגה-הרץ) לנתח שלבים התפתחותיים קודם לכן על-ידי ביצוע מתודולוגי בגישה דומה. M-למצב שנבחר מאפשר את הפריט החזותי של רקמות בתנועה ברמות רזולוציה טמפורלית גבוהה (מסגרות לשנייה 1,000). לבסוף, נדגים את הכדאיות של אולטראסאונד גבוהה עבור נתונים היסטוריים אפיון פנוטיפי מקיפה של מצב והמודינמיקה לב וכלי דם העובר ותפקוד בעכברים בנקודת ההתחלה, בתגובה ללחץ היפוקסיה טרום לידתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, חיה אכפת והוועדה שימוש אישר כל ההליכים המוצגים פרוטוקול זה. הניסויים נערכו במסגרת המחקר המתמשך תחת פרוטוקולים בעלי חיים פעילים, אושרה על ידי המוסדיים חיה אכפת שימוש הוועדה של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה ב. לטיפול בבעלי חיים וטיפול בעקבות בסטנדרטים של המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה.

1. הכנת סאונד בתדירות גבוהה מערכת הדמיה

  1. הפעל את מערכת הדמיה של סאונד ויחידת הניטור פיזיולוגיה.
  2. להתחבר מתמר 30/45 מגה-הרץ.
  3. במקום ראש הסריקה המתאימה על המחזיק בה ליד הרציף הדמיה.
  4. בחר באפשרות תוכנית מדידה הלב .
  5. המקום באולטרסאונד ג'ל הפוך במיכל שלה ההתחממות טרום מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
  6. לאשר מערכת צינורות המתאים עבור הרדמה ואמת את רמות חמצן, איזופלוריין.
  7. לחטא את פלטפורמת הדמיה של אזור העבודה.
  8. הגדר את רמת החום של פלטפורמת הדמיה כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה וקצב הלב של הסכרים.

2. בהריון העכבר הכנה

  1. מניחים את הסכר העכבר בהריון (C57/BL6) בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה.
  2. לגרום הרדמה באמצעות מועברת ברציפות איזופלוריין inhalational (איזופלוריין 2% - 3%) מעורבב עם 100% חמצן (100% O2) בספיקה של 200 mL/min בבית הבליעה אינדוקציה.
  3. העברת החיה מסומם על הפלטפורמה הדמיה במצב פרקדן.
  4. לספק מצב יציב הרגעה באמצעות facemask מחובר את ההרדמה אבובים מביאת-מערכת איזופלוריין (1.0% - 1.5%) מעורבב עם 100% O2 -200 mL/min.
    התראה: לשלוט לדליפת גז הרדמה בעזרת מערכת אוורור מצויד עם מסנן פחם עץ המכילות סט מיכל.
  5. קלטת את הגפיים בעדינות כדי האלקטרודות electrocardiographic מוטבע לאחר היישום של הג'ל אלקטרודה להשגת ניטור מתמיד של שיעורי אימהי הלב, מערכת הנשימה.
  6. התאם את רמת איזופלוריין לשמור על קצב הלב הממוצע של (450 + /-50 פעימות לדקה (bpm)).
  7. לשמור על טמפרטורת הגוף בטווח של 37.0 ° C + /-0.5 מעלות צלזיוס. נטר את טמפרטורת הגוף וקצב הלב מוצג על יחידת בקר פיזיולוגיה.
  8. המסמך סימני החיים של העכבר מסומם כל 15 דקות לאורך כל ההליך הדמיה.
  9. להעריך את הרמה של הרדמה על-ידי הערכת היציבה של העכבר, קצב הלב, בתגובה טו צובט.
  10. החל balm אופטלמולוגי (1 טיפה לתוך כל עין) כדי למנוע יובש העין ונזק הקרנית.
  11. להסיר את הפרווה מרמת מאמצע החזה אל הגפיים התחתונות באמצעות קרם depilatory כדי למזער את האולטרסאונד הנחתה. הסרת קרם 1-1.5 דקות לאחר יישום, לסירוגין גזה יבשה ורטובה מגבונים כדי למנוע נזק לעור.

3. העובר זיהוי

  1. ימשש לקיר הבטן בעדינות כדי לאתר את העוברים ולהפיץ אותם.
  2. ביאור כל העובר על הבטן של הסכר ולהגדיר שלהם אוריינטציות הקדמי-את ישבנה ואת הגבי הגחוני / על-ידי שימוש בסמן.
  3. השתמש את צוואר הרחם של הסכר מסומם כנקודת ציון. תווית העוברים על קרנות הרחם ישר ושמאלה L1, L2, L 3, וכדומה (בצד שמאל), R1, R2, R3, וכדומה (צד ימין), בהתאמה (איור 1 א').
    התראה: למנוע הפצת העוברים בכוח. 1-2 עוברים בכל המלטה לחפוף עם האחרים, שהופך את המיקום ואת ההדמיה לא אמין. אל תכלול אלה העוברים הניתוח.

4. הלב ויזואליזציה, ביאור

  1. החל מראש ומחוממת אולטרסאונד ג'ל על הבטן, להפיץ את זה בזהירות כדי למנוע היווצרות בועה. להוסיף סכום נוסף של ג'ל על האזור של סריקת הדמיה.
  2. למקם את החללית אולטרסאונד למחזיק מכני ולגייס אותו בהדרגה לכיוון העור ליצור קשר עם השכבה ג'ל עבה כשחיפשתי הלב הפועם באמצעות סריקה B-המצב (איור 1).
  3. לחץ על הלחצן B במצב סריקה כדי לקבל תמונות דו-ממד. השתמש שלפוחית השתן כנקודת ציון כדי לזהות את העובר הראשון בכיוון הימין או שמאל מקרן הרחם ולסמן אותו R1 או L1, בהתאמה.
  4. לאשר את הכיוון מימין ומשמאל של העובר בודדים בזמן אמת על-ידי העברת פלטפורמת הדמיה במישור האופקי. סרוק מראש עד זנב כדי לבאר את החוטם הגפיים, עמוד השדרה כמו ציוני דרך (איור 1B, 1 וידאו).
  5. לדמיין את הלב הפועם ומפרשות החדר השמאלי (LV) ואת החדר הימני (RV). השתמש במצב דופלר צבע כדי למטב את הפריט החזותי של הלב (איור 1 C-G, קטעי וידאו 1 - 2).
  6. לחץ על הלחצן B במצב סריקה כדי להשיג ציר קצר מתחת-תצוגה, LV של RV המוצגים שלהם מאקסימאלי במרכז הנתונים רכישת מסגרת. להתחיל לחיות הדמיה (איור 1B-C).
  7. שינוי הכיוון של העכבר ביחס סריקה מטוסים כדי לקבל תצוגה ארבע-הקאמרית האורך (איור 1D). ראשית, עליך לזהות את המבנים הנותרים של הלב כגון אטריה, מחצה interventricular וכן תזרים ימינה ושמאלה ספינלי. בשלב הבא, יש הצ'יימברס חדרית, פרפור המוצגים מאקסימאלי שלהם. לאחר מכן התחל ייבוא תמונות.
  8. אל תכלול תמונות בלתי אופטימאליים, המלוכסן הניתוח הסופי. לחץ על לחצן Cini להשיג הקלטה רציפה 'Cineloops' למשך תקופה מינימלית של 10 s, ואז לשמור תמונות מוקלטות.

5. הערכת תפקוד וקצב הלב העוברי

  1. לחץ על לחצן M-mode סריקה כדי לקבל תמונות לב מ תא ארבעה מטוסים (וידאו 3).
  2. להציג את רשימת ההקלטות לניתוח פעם התמונות של כל העוברים הושלמו.
  3. אל תכלול תמונות בלתי אופטימאליים, המלוכסן הניתוח הסופי.
  4. לחץ על לחצן ניתוח כדי עובי הקיר למדוד את קוטר פנימי חדרית שמאלה/ימינה ב diastole (LVID, d; . RVID, d) ו סיסטולה (LVID, סופרן; RVID, s), כמוצג באיור2.
  5. לקבוע קצב הלב העוברי הממוצע על ידי משחק אחד שנרשם M-mode מעקב וחישוב המידה של מחזור אחד זרימה לזרימה הבאים מחזור (המרווח בין פסגות סמוכים).
  6. לבצע מספר מדידות (לפחות 5 לכל עקיבה) כדי להשיג את קצב הלב הממוצע (איור 2).
  7. מודדים את השינויים טמפורלית בין שמאל חדרית הדיאסטולי קוטר פנימי (LVID, d) שמאלה קוטר פנימי חדרית-סוף סיסטולה (' LVID ', ' s ') לאורך כל המחזור של הלב. ואז לחשב אחוז קיצור החלקי (FS %) כדלקמן: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. לבצע מספר מדידות (לפחות 5 לכל עקיבה) כדי להשיג את הערכים % FS הממוצע.

6. הערכת מפרמטרי הזרם ריאות

  1. התאם המגזר בזווית של רכישת פחות מ 60o. לחץ על לחצן דופלר כדי לבצע מדידות דופלר גל פעמו מהמטוס דו-ממדיים ארבע קאמרית-הדמיה באמצעות מתמר 45-מגה-הרץ.
    1. ראשית, דמיינו ההסתעפות של עורק הריאה כדי לזהות את מערכת יצוא הנכון. לאחר מכן, לחץ על לחצן פעמו גל דופלר כדי להשיג את התבנית זרימה לאורך של ריאות, השסתומים אבי העורקים (איור 3 א, 4 וידאו).
  2. להשיג זרימת ריאתי מדידות של גל פעמו מעקב דופלר, כולל שיא מהירות סיסטולית (PkV), האצת (ב), וזמן הפליטה (ET).
  3. לבצע מספר מדידות (לפחות 5 לכל עקיבה) כדי לקבל מדידות הממוצע, כפי שמוצג באיור 3 א (מימין).
  4. לחשב את AT / יצוא שסתום כמחוון של יצוא ספינלי patency ET יחס לכל, דם זורם.
  5. להמשיך לקבל את דפוסי המסתם הדו-צניפי, אבי העורקים זרימה מתצוגות קאמרית ארבע הפסגה דו-ממדי באמצעות גל פעמו דופלר. ראשית, עליך לזהות הצ'יימברס חדרית פרפור ועל שמאל שמאל. בשלב הבא, במקום האחסון מדגם דופלר גל פעמו הקלטה של דפוסי דופלר תזרים המסתם הדו-צניפי, מדידת מהירות הדיאסטולי מוקדם (E) והמהירות התכווצות פרפור24,(א) (איור 3B)25.
  6. לכוון את עוצמת הקול מדגם דופלר כדי להשיג את התבנית סילון דופלר אבי העורקים. להשתמש את אבי העורקים דופלר המטוס עקיבה כדי למדוד האצה (ב) וזמן הפליטה (ET), כפי שמוצג באיור 3B (מימין) (וידאו 5)

7. הערכת הציר Feto-היפרדות

  1. השתמש הסריקה דופלר צבע כדי להמחיש את. עורק הרחם ועץ כלי הדם feto-היפרדות באמצעות מתמר 45 מגה-הרץ (איור 4A).
  2. לזהות את כלי הטבור (שני העורקים, העורק אחד) קטע אינטרה-שפיר הטבור, רק אחרי החוט יוצא מהבטן בעובר.
  3. המקום פעמו גל דופלר מדגם אמצעי כדי להשיג את תבנית הזרימה בעורק הטבור (איור 4A).
  4. למדוד פרמטרים זרימת שיא כלי דם כולל זמן התאוצה (בזמן), הוצאה (ET), שיא מהירות זרימה סוף סיסטולה (' PkV ', ' s ') באמצעות גל פעמו רשומה סריקה דופלר (איור 4B).
  5. להשיג 5 ברציפות ואת ב כל כלי, בהיעדרו של תנועות העובר ותנועות הנשימה אימהית, כדי למדוד את מהירות השיא הממוצע עבור כל כלי.
  6. המשך העובר הבא.

8. פוסט-הדמיה פיקוח על בעלי חיים

  1. בטל את המיכל איזופלוריין לאחר השלמת תהליך ההדמיה.
  2. המשך ניטור טמפרטורת הגוף, קצב נשימה, קצב הלב במהלך שלב ההתאוששות.
  3. הסר את facemask ומערכת צינורות מחוברים ברגע שהסכר מתחיל ספונטאניות.
  4. לחזור לסכר הדיור המתאימים ולהמשיך תצפית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים post-procedure מוסדיים.
  5. מסמך הזמן מלא חידוש פעילות רגילה.

9. ביצוע דרישות ושיקולים טכניים

  1. להגביל את זמן העיבוד עבור ~ 8 עוברים כ 1 ש כדי למנוע את ההשפעות השליליות של הרדמה ממושכת על סימנים חיוניים, פיסיולוגיים.
  2. להשלים את האימונים עם 8-10 עכברים בהריון כדי למטב את טכניקות זרימה של רכישת תבניות תמונה מעקב בתוך מסגרת זמן קצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתוחים סטטיסטיים של הלב ומדד והמודינמיקה בוצעו במצב לא מקוון. האמצעי של 5 מדידות רצופות בתמונות אופטימלית 3 חושבו. הנתונים שבאו לידי ביטוי אומר הסטודנט ב- SEM. ± t-מבחן שימש להסיק השוואות בין קבוצות. ערך P של ≤0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית.

בעקבות פרוטוקול לעיל, אנו מאופיין את ההשפעה של חשיפה כרונית היפוקסיה טרום לידתי על מצב הלב וכלי הדם העוברי עכברים-בסוף ההיריון על ידי קבלת הקלטות סאונד בתדירות גבוהה בזמן אמת על העכברים בהריון C57/BL6 מתוזמן- יום הריונית (GD) 18.5.

לאחר הקמתה של רבייה קבוצות, הזדווגות מוצלחת אושר. סכרים בהריון מתוזמן היו הקפיד בכלובים תחת משטר בהירה-כהה 12 שעות עם מים ואוכל ad libitum עד. ב GD14.5, העכברים בהריון הוקצו גם לקבוצה normoxia (בהשתתפות אויר) או לקבוצת היפוקסיה (ממוקם בתא היפוקסיה-10% FiO2 לזירוז היפוקסיה מערכתית). לאחר הלידה, הסכרים וגורי שלהם נשאר שהוקצה מצבם ניסיוני עד יום כמחנכת 7 (P7).

6 סה כ, סכרים נחקרו בניסויים אלה ו 42 העוברים היו בהצלחה עם תמונה-GD18.5. אלה, נתונים שהושגו מעוברים 36 שימשו לצורך ניתוח מאוחר יותר (טבלה 1). ניתוח של הלב העוברי, ממחירים GD18.5 הראה כי שתקבעו את העוברים סבל עוברי איטי (נמוכים הלב) ומנוסה ירידה משמעותית של מדדי תפקוד הלב העוברי (EF % ו- FS %) (טבלה 1). למרבה הפלא, מהירויות זרימת שיא (PkVs) בעורק הטבור PkVs ירדו העוברים חשופים היפוקסיה (4B איור , טבלה 1). יתר על כן, הגיע הזמן בעורק הטבור האצת הזמן/הוצאה (ב / ET) יחסי חשף באופן משמעותי הערכים נמוך חמצן בהשוואה, העוברים normoxic, רומז גברה ההתנגדות זרימת דם הטבור. בהסכם, עובי נכון חדרית הוגדל החשופים היפוקסיה ההתעסקות כפי שנמדדה בתמונות 2-D/M-mode (איור 5). הקרוואן בהנחה דומיננטי משאבת תפקוד במהלך התפתחות העובר, השליה מגישה כמו המיטה כלי דם ראשיים עבור חמצון, נתונים אלה באופן קולקטיבי מציע הזרימה גבוהות ההתנגדות במעגל וסקולרית feto-היפרדות שמוביל RV היפרטרופיה. חשוב, ילודים היפוקסיה נחשף בפני lethality כמחנכת מוקדם. RV כשל והתנגדות וסקולרית מוגברת הנגרם על ידי חשיפה כרונית היפוקסיה טרום לידתי תורמות שעשויות להיות הגורם. גורמים אחרים, כגון רעילות חמצון-חיזור הנובע חמצון מחדש פציעה, האכלה המסכן, מחלה אימהית לא ייכללו. ובכל זאת, מנגנון המשמש כבסיס המדויק של היפוקסיה טרום לידתי המושרה פתוגנזה הלב את הקטלניות מוקדם של העוברים עדיין נקבע במחקרים עתידיים.

Figure 1
איור 1: ביאור עוברי עכברים ו לב ויזואליזציה בתוך הרחם באמצעות סריקה B-מצב החקירה דופלר צבע. (א) ייצוג סכמטי של עכברים בעובר וזיהוי ביאור (l: שמאל, ימין r:). (B) תמונה ייצוגית של ציוני הדרך אנטומי בעובר להנחות את הכיוון של פעימות לב העובר הריונית יום 18.5 מהתצוגה מתחת ציר קצר של החדר השמאלי (LV), החדר הימני (RV) interventricular מחצה (עירויים). (ג) נציג תמונה של נוף ציר קצר מתחת של LV, RV עם צבע החקירה כדי להקל על ויזואליזציה קאמרית הלב. (ד) האורך 4-הקאמרית להציג בעירוי, הקרוואן, עזב אטריה (LA) וצבע נכון אטריה (RA) דופלר. (E) נוף ארבע-הקאמרית האורך של LV, RV, עם צבע החקירה דופלר כדי להקל את החזיית ספינלי יצוא: נכון החדר יצוא בדרכי (RVOT), בדרכי יצוא החדר השמאלי (LVOT), אבי העורקים (AO), החדר הימני יצוא בדרכי (RVOT). (F) נציג צבע דופלר חקירת RVOT, אבא (G) נציג צבע דופלר חקירתו של LVOT ו- AO. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הערכה של תפקוד וקצב הלב העוברי. (א) נציג M-Mode עקיבה המתקבל התצוגה 4-הקאמרית ציר זמן ב- 18.5 דיינמיקס. (LV: עזבו את החדר; RV: החדר הימני; LA: אטריום שמאל; רא: נכון Atrium). שיטת נציג כמת (קווים arrowed) (B) חדרית מידות כולל חדרית ישר ושמאלה קוטר פנימי-diastole (LVID, d; . RVID, d) ו סיסטולה (LVID, סופרן; RVID, s), שמאל וימין עובי הקיר חדרית-diastole (LVAW, d; RVW, d), Interventricular מחצה (עירויים), ביט כדי לנצח מדידה משאבי אנוש מוצגים מכל ארבעת קאמרית הדמיה המטוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פעמו גל מעקב דופלר של מדדי העובר זרימה ריאתי, וכשהם. (א) תמונה ייצוגית של עורק הריאה פעמו גל מעקב דופלר (משמאל). כימות שיטות (קווים) של מדדי תזרים ריאתי PkV (שיא מהירות), (בזמן האצה), ET (הוצאה זמן) מוצגים (מימין) מהתצוגה ארבע-הקאמרית האורך. תמונה ייצוגית (B) של המסתם הדו-צניפי, אבי העורקים פעמו תבנית זרימת דופלר (משמאל), כימות של מדדי תזרים צניפי E (מהירות הדיאסטולי מוקדמת) (התכווצות פרפור) ואת מדדי תזרים אבי העורקים בבית, ואח, PkV (מימין) מוקרנים ארבע-הקאמרית המטוס הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הערכת מחזור Feto-היפרדות. (א) נציג תמונה feto-היפרדות מעגלים כלי הדם באמצעות צבע החקירה דופלר (העליון) א האימהי רשומות (התחתון). (B) תמונת הנציגה של גל פעמו דופלר הקלטה של כימות מדדים (קווים) של מדדי הזרימה בעורק הטבור היפוקסיה (עליון) והבקרה normoxia חשוף עוברי עכברים (התחתון). PkV (שיא מהירות), (בזמן האצה), ET (הוצאה זמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הערכה של עובי הקיר הימני של היפוקסיה מטופלים עכברים עוברית. (A, B) נציג M-Mode עקיבה המתקבל התצוגה ארבע-הקאמרית ציר זמן ב- GD 18.5 בתנאים normoxia, היפוקסיה. LV: עזב את החדר, RV: נכון החדר, קיר ישר חדרית. הקווים מצביעים על מדידות כמותיים של RVW עובי סיסטולה (s), Diastole (d). (ג) RVW, כימות s מציג עובי RVW מוגברת בעכברים שטופלו היפוקסיה עוברית בהשוואה normoxia. קו שגיאה: שגיאת תקן של רשע. (ד) נציג תמונות חתך הרוחב לב עוברי-GD 18.5 המתארים גדל RV עובי הקיר היפוקסיה מטופלים וקבוצות normoxia מטופלים. ההגדלה המקורי 10 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פרמטר, יחידה Normoxia היפוקסיה טרום לידתי
מספר העוברים בהצלחה הדמיה 20 16
שיעור התמותה כמחנכת 5% 68.75%
פרמטר והמודינמיקה (זאת אומרת ± SEM) (זאת אומרת ± SEM)
קצב דפיקות הלב, bpm 138 ± 4 89 ± 8 * * *
החדר השמאלי EF % 71.2 ± 3 55 ± 2 * *
החדר השמאלי FS % 43 ± 2 29 ± 4 * *
עורק הריאה PkV, מ מ/s 102 ± 10 129 ± 8 * *
עורק הריאה AT ליחס ואח 0.42 ± 0.05 0.03* 0.35 ±
בעורק הטבור PkV, מ מ/s 58 ± 4 40 ± 1.5* * *
בעורק הטבור-יחס ואח 0.5 ± 0.03 0.025* 0.42 ±
וריד הטבור PkV, מ מ/s 13 ± 1.2 19.6 ± 3 * *
עיכוב עורקי-ורידי הטבור, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, שבריר פליטה; FS, השבר קיצור; נה, לא זמין; NS, לא משמעותי; PkV, שיא מהירות; PkV, d, מהירות שיא במהלך diastole; PkV, s, שיא מהירות בזמן סיסטולה; מבחן t של סטודנט שימש להסיק הבדלים בין קבוצות. P < 0.005. * * P < 0.01. * P < 0.05 מייצג הבדל משמעותי בהשוואות בין קבוצות. הסטודנט -t-test. Non-משמעות נשאר ריק.

טבלה 1: והמודינמיקה פרמטרים של normoxic, מחוסר חמצן עוברי עכברים ביום הריונית 18.5. EF, שבריר פליטה; FS, השבר קיצור; PkV, שיא מהירות; AT, האצת זמן; ואח, זמן הפליטה. מבחן t של סטודנט שימש להסיק הבדלים בין קבוצות. * * * P < 0.005. P < 0.01, ו * P < 0.05 מייצג הבדל משמעותי בהשוואה קבוצתיים.

Video 1
וידאו 1: תצוגת ציר קצר במצב B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Video 2
סרטון 2: דופלר צבע – תצוגה האורך הפסגה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Video 3
וידאו 3: M-Mode- אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Video 4
וידאו 4: עורק הריאה – פעמו גל דופלר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malformations לב וכלי דם ומחלות מושפעים באופן משמעותי על ידי גורמים גנטיים, גורמים סביבתיים19. בעבר הראו השפעה משמעותית של הגבלה קלורית אימהית, יזמה במהלך השליש השני, על זרימת הדם feto-היפרדות ועל תפקוד הלב העוברי9.

היפוקסיה טרום לידתי הוא גורם מתח נוסף נפוץ במהלך התפתחות העובר שישפיע רבות על הפיזיולוגיה feto-היפרדות ומערכת הדם. ההשפעה של חשיפה היפוקסיה לפני הלידה עשויים להיות עמוקה יותר בהקשר של CHD שמוביל המסכן הלידה הסתגלות לחיים כמחנכת. המחירים לב חריג ובמדד לב שזוהו במחקר זה הן אכן חשוב אינדיקטורים של דיאליזה ופיזיולוגיה הדם היפרדות מסולף, ולכן הם מהווים יסודות ראשוניים חיוניים לגילוי של ליקויים התפתחותיים, שינויים והמודינמיקה הסוגר כך עשוי להיות משמעותי נוסף בתגובה ללחץ ובשפתיים טרום לידתי, המוביל אל אי ספיקת לב. בניגוד לציפיות, היפוקסיה חשוף העוברים היו נמוכים הלב. תופעה זו עשוי לשקף מנגנונים autoregulation לב ילדותי בעכברים עוברית בתגובה היפוקסיה-GD18.5. עם זאת, בפתוגנזה המדויק אינו ידוע.

למרות השני מתקדם הדמיה שיטות, כמו MRI לב העובר, לאפשר הדמיה חיה של מבנים הלב במהלך פיתוח20, בגרימת המצב הוא לעיתים קרובות איבדו בשל תמונות סטטיות ונהלים ממושך. טכנולוגיית אולטרסאונד לא פולשנית, מצד שני, מאפשר ביצוע ויוו דינמי הדמיה המתחזק הפיזיולוגיה הבסיסית. עוד יותר, עם הזמינות של מתמרים בתדירות גבוהה עם רזולוציה משופרת, הפריט החזותי של הלב העוברי בשלבים התפתחותיים שונים של כל העובר בודדים יכול להיות יותר ריאלי של העכברים הטרנסגניים על-ידי מיטוב ביאור עוברית שיטות. לבסוף, העלות לכל ניסוי היא הרבה פחות בשיטה זו.

בדוח הקודם על ידי GH קים. et al., המחברים מספק תובנות חדשניים וחשובים בנוגע הדמיה תוכנית אופטימיזציה עבור רכישת נתונים באמצעות דור קודם של אולטרסאונד בתדירות גבוהה הדמיה מערכת21. דיווח נוסף על-ידי ג'ואו YQ. et al., הקימה למדידות בסיסית מתוקננת של מחזור הדם העוברי ברמה הפיזיולוגית באמצעות אולטרסאונד בתדירות גבוהה מצוידים צבע מערכת דופלר22. לפיכך, פרוטוקול המובאת כאן משלימה פרוטוקולים שנוצרו קודם לכן, ומרחיבה חלוקה לרמות שיטה מקיפה כי הוא ריאלי ומעשי בזמן אמת באווירה ניסיונית. מערכת סאונד בתדירות גבוהה מתקדם ורגיש מאוד נעשה שימוש במחקר זה לסרוק את המעגל feto-היפרדות כיחידה אחת. פרוטוקול מחולקת לרמות הוא פשוט מתוקננת להעסיק במערכת זו עוצמה ביעילות כפי שמתואר על ידי השגת מדידות המודדות של היפוקסיה ההשפעה על מחזור הדם העוברי בעכברים-GD18.5.

למרות זאת, עלינו לקבל מגבלות חשובות ואתגרים של הדמיה לב קטלני: סוכנים הראשון, הרדמה, כולל איזופלוריין, עשוי להשפיע על הפרמטרים הפיזיולוגיות של העובר. הרדמה ממושך, נשירת שיער, ג'ל קולי יכול להוביל היפותרמיה, אשר יכולים להשפיע על קצב הלב ועל מדדי והמודינמיקה של הסכר, כמו גם העוברים. בזמן הנוכחי, יש אין שיטה זמין כדי להעריך את הרמה של סוכנים הרדמה, שלהם השפעות על העובר. כדי לעקוף מגבלה זו, אנו titrate רמות איזופלוריין בשאיפה בקפידה כדי להשיג הרגעה מתאימה של הסכרים, תוך שמירה על קצב הלב הבזליים וסימני החיים שלהם. שנית, להמחיש שהעוברים ממוקמים עמוק בתוך הבטן הוא קשה, שיוצרת, המוביל אל אי-הכללה של העוברים האלו מניתוח הנתונים הסופי. דופלר הצבע מאפשר אופטימיזציה משופרת של מקטעים הדמיה ויישור נאותה בין מתמר ואת זרימת הדם. שלישית, ביצוע ניתוח בו זמנית של כל העוברים דורש היעילות של המפעיל להדמיה מהירה ומדויקת ורכישת תמונות במהירות, רומז על חשיבות ההכשרה המעשית.

לבסוף, השלבים החשובים בשיטה זו צריך להדגיש כולל 1) הכנה נכונה של המערכת. 2) שמירה על טמפרטורת גוף יציבה וקצב הלב עבור העכבר בהריון. 3) מיטוב קצב הזרימה של איזופלוריין כדי לשמור על הברית פיזיולוגית בסיסית של העוברים לרכוש מידע אמין. זהה במעבר 4), ייבוא תמונות יעילה בתוך בזמן הקצר ביותר האפשרי. 5) גיל ההיריון, סקס, זן בעלי חיים הם משתנים חשובים שעשויים להשפיע באופן משמעותי על התוצאות. לכן, פרוטוקול הניסוי צריך להיות מתוכנן בקפידה להביא בחשבון משתנים אלה על ידי הכללת ובקרות בגלל הלחץ חיות באותו ניתוח נתונים ופרשנות.

לסיכום, מערכת סאונד בתדירות גבוהה היא שיטה יעילה כדי להשיג אפיון פנוטיפי של מערכות הלב וכלי הדם העובר בתוך הרחם עם ערך חשוב ניסויית ומדעית, יישומים אפשריים בעתיד, זה ייתכן כלול 1) להבנה של הדינמיקה פיזיולוגיים במהלך התפתחות הלב. 2) Achieving פנוטיפי ניתוח מקיף של דגמים גנטיים של CHDs. 3) שחקרתי מחזור הדם feto-היפרדות של ההשפעה על פיתוח לב קאמרית, התבגרות, הסתגלות ללחץ. 4) ביצוע אולטרסאונד מודרכים הזרקת העובר ללמוד רעלים, teratogens או סוכני טיפולית בעתיד. 6) מיישמת את חודרני מעקב וניתוח זן יכולות להשיג מפורט תפקוד שריר הלב האזורי של שריר הלב המתפתח עשוי לספק בסיס מחקרים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים הליבה פיזיולוגיה של בעלי חיים, חטיבת לרפואה מולקולרית באוניברסיטת קליפורניה על מתן תמיכה טכנית וגישה פתוח למערכת biomicroscopy (UBM) אולטרסאונד Vevo 2100. מחקר זה נתמך על ידי המרכז לחקר בריאות NIH/ילד (5K12HD034610/K12), מכון דיסקברי של UCLA-הילדים, היום, מחר של הילדים הקרן, ו דייוויד גפן בית הספר של רפואה מחקר פרסי מ Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97, (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140, (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57, (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9, (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498, (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128, (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127, (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157, (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72, (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71, (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116, (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46, (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22, (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10, (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33, (11), 1167-1173 (2010).
הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter