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Developmental Biology

Fetal Mouse Cardiovascular de imagem usando um sistema de ultra-som de alta frequência (30 / 45MHZ)

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

Imagem de ultra-som de alta frequência do mouse fetal melhorou a resolução de imagem e pode fornecer precisa caracterização não-invasivo do desenvolvimento cardíaco e defeitos estruturais. O protocolo descrito neste documento é projetado para executar em tempo real de ratos fetal ecocardiografia na vivo.

Abstract

Defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são a causa mais comum da infância morbi -mortalidade precoce. A detecção pré-natal dos mecanismos moleculares subjacentes do CHDs é crucial para inventar novas estratégias preventivas e terapêuticas. Modelos de rato mutante são ferramentas poderosas para descobrir novos mecanismos e modificadores de estresse ambiental que impulsionam o desenvolvimento cardíaco e sua potencial alteração no CHDs. No entanto, os esforços para estabelecer a causalidade destes putativos contribuintes foram limitado a estudos histológicos e moleculares em experiências com animais não-sobrevivência, no qual monitoramento de parâmetros fisiológicos e hemodinâmicos chaves é frequentemente ausente. Tecnologia de imagem ao vivo tornou-se uma ferramenta essencial para estabelecer a etiologia do CHDs. Em particular, ultra-sonografia pode ser usada de pré-Natal sem expor cirurgicamente os fetos, permitindo a manutenção de sua fisiologia de base enquanto monitora o impacto do estresse ambiental sobre os aspectos estruturais e hemodinâmicos da câmara cardíaca desenvolvimento. Aqui, usamos o sistema de ultra-som de alta frequência (30/45) para examinar o sistema cardiovascular em ratos fetais no E18.5 no utero na linha de base e em resposta à exposição de hipóxia pré-natal. Podemos demonstrar a viabilidade do sistema para medir o tamanho da câmara cardíaca, morfologia, função ventricular, ritmo cardíaco fetal e índices de fluxo da artéria umbilical e suas alterações em fetais camundongos expostos a hipóxia crônica sistêmica no utero no real está na hora.

Introduction

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Malformações congênitas do coração são heterogêneos defeitos estruturais que ocorrem durante o desenvolvimento cardíaco precoce. Os avanços técnicos atuais dos procedimentos operacionais levaram a melhorias significativas nas taxas de sobrevivência de crianças com CHDs1,2. No entanto, qualidade de vida é muitas vezes comprometida secundária à hospitalização prolongada e necessidades dos encenado reparo cirúrgico procedimentos1,2,3,4,5. A detecção pré-natal dos mecanismos moleculares subjacentes do CHDs é crucial para planificar intervenções precoces, de realizar novas estratégias de prevenção e para melhorar os resultados ao longo da vida6,7.

Embora vários fatores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogênese do CHDs, que institui o nexo de causalidade continua a ser uma necessidade insatisfeita para melhorar o diagnóstico, terapêuticos e estratégias preventivas1,8,9 ,10,11,12. Além disso, examinar o papel de fatores de estresse no utero e modificadores epigenéticas abre novos espaços para futuras investigações11,12. Na última década testemunhou realmente rápidos avanços no sequenciamento tecnologia de última geração incluindo microarray de nucleotídeo único (SNP) de polimorfismo, toda exome sequenciamento e estudos de metilação de todo o genoma, sua utilização no estudo da genética causas de doenças humanas complexas, incluindo CHDs1,8,9,10,11 pavimentando o caminho para identificar novas mutações e variantes genéticas que ainda não foram testado para sua patogenicidade em modelos animais apropriados.

Entre os sistemas de modelo de doença diferente, o rato é o modelo animal de escolha, não apenas para investigar os mecanismos do CHDs durante cedo cardiogenesis13,14,15,16, mas também para elucidar seu impacto na maturação de câmara cardíaca e função em final de gestação nos fatores de estresse pré-natal e perinatal. Portanto, realizando na vivo fenotípica caracterização de um coração de rato mutante de fetal, durante os estágios iniciais e finais de desenvolvimento, é crucial para compreender o papel destas variações genéticas e fatores ambientais no desenvolvimento cardíaco, e o futuro potencial impacto sobre os processos de maturação específico de câmara em camundongos.

Deteção adiantada e diagnóstico preciso de defeitos cardíacos durante o desenvolvimento é fundamental para intervencionista planejamento17,18. Sendo seguro, simples, portáteis e repetível, ecografia fetal tornou-se efectivamente a norma técnica para avaliação cardíaca na clínica de imagem. Avaliação de circulação fetal usando ultra-som Doppler foi amplamente utilizada na prática clínica não só para a detecção de defeitos cardíacos, mas também para detectar anormalidades vasculares, insuficiência da placenta e restrição de crescimento intra-uterino e avaliar o fetal bem-estar em resposta a insultos no utero incluindo hipoxemia, doença materna e toxicidade de drogas17,18. Em paralelo ao seu valor na avaliação de doenças e defeitos humanos, avaliação de ultrassom dos ratos fetais tem ganhado crescente utilidade em configurações experimentais19,20,21,22, 23. Em particular, ultrassom do coração fetal (ecocardiografia) permite visualização sequencial na vivo do coração em desenvolvimento. Muitos estudos experimentais utilizaram tecnologia de geração de imagens de ultra-som para observar o desenvolvimento cardiovascular fetal em ratos transgénicos fetais. Ultrassom Doppler tem sido particularmente útil para elucidar os parâmetros fisiopatológicos, como os padrões de fluxo na circulação fetal sob desafios fisiológicos ou doença condições10,19. Em seres humanos e animais, vascularização anormal da fluxo ou oxigênio para o feto pode resultar de diversas condições que podem perturbar o ambiente do feto no útero e afetam o eixo fetoplacental, incluindo anormalidades da placenta, hipóxia materna, diabetes gestacional e constrição vascular farmaceuticamente induzido15,22. Portanto, estabelecer métodos padronizados para a realização de ultra-som Doppler fetal ratos irá tremendamente capacitar futuros estudos do CHDs, facilitando o monitoramento de padrões de fluxo e principais índices hemodinâmicos dos circuitos cardiovasculares durante diferentes estágios de desenvolvimento cardíaco em modelos genéticos de rato.

Ultra-som de alta frequência tem emergido como uma poderosa ferramenta para medir os parâmetros fisiológicos e do desenvolvimento do sistema cardiovascular em modelos do rato e doenças humanas18. Esta tecnologia tem sido aperfeiçoada nos últimos anos. Nós e outros pesquisadores têm demonstrado a viabilidade desse sistema para a realização de estudos de ultra-som ultra alta frequência sobre o rato fetal coração15,19,20,21,22 ,23. O sistema é equipado com mapeamento de fluxo Doppler cor e Transdutores de matriz linear que geram imagens bidimensionais, dinâmicas em taxas de quadro de alta frequência (30 a 50 MHz). Estas vantagens, em comparação com sistemas de ultra-som de baixa frequência e a geração anterior de alta frequência ultra-som21,22, fornecem a necessária sensibilidade e resolução para avaliação aprofundada de fetal circulatória sistema, incluindo a caracterização abrangente das estruturas do coração, função de câmara e índices de fluxo dos ratos fetais em configurações experimentais. Neste documento, descrevem métodos para executar uma avaliação rápida da circulação cardiopulmonar e circulação feto-placentária no dia embrionário E18.5 na vivo por meio de um sistema de alta frequência. Optamos por um transdutor de 30/45 MHz que proporciona uma resolução axial de cerca de 60 µm e uma resolução lateral de 150 µm. No entanto, um transdutor de frequência mais elevado (40/50 MHz) pode ser escolhido para analisar os estádios de desenvolvimento mais cedo, seguindo uma abordagem metodológica semelhante. O M-modo selecionado permite a visualização de tecidos em movimento em níveis de alta resolução temporal (1.000 quadros/s). Finalmente, podemos demonstrar a viabilidade de ultra-som de alta para detalhada Caracterização fenotípica abrangente do estado hemodinâmico cardiovascular fetal e função em ratos na linha de base e em resposta ao estresse da hipoxia pré-natal.

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Protocol

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A Universidade da Califórnia, Los Angeles, cuidado Animal e uso comitê aprovou todos os procedimentos mostrados neste protocolo. Os experimentos foram realizados como parte de um estudo em curso sob ativos animais protocolos aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comitê da Universidade da Califórnia, Los Angeles, Califórnia, EUA. Cuidados e tratamento de animais seguiram as normas do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.

1. preparar o ultra-som de alta frequência, sistema de imagem

  1. Ligue o sistema de imagens de ultra-som e a unidade de monitorização de fisiologia.
  2. Conecte o transdutor de 30/45 MHz.
  3. Coloque a cabeça de varredura correspondente no suporte perto da plataforma de imagem.
  4. Selecione a opção do Programa de medição cardíaca .
  5. Lugar do ultra-som gel de cabeça para baixo em seu contêiner de pré-aquecimento conjunto para 37 ° C.
  6. Confirmar o sistema de mangueiras apropriadas para anestesia e verificar os níveis de oxigênio e isoflurano.
  7. Desinfecte a plataforma de imagem e a área de trabalho.
  8. Defina o nível de calor da plataforma de imagem para manter a temperatura corporal constante e frequência cardíaca das barragens.

2. preparação do rato grávida

  1. Coloca a barragem de rato grávida (C57/BL6) na câmara de indução de anestesia.
  2. Induzi anestesia usando continuamente entregues isoflurano inalatório (isoflurano 2-3%) misturado com oxigênio a 100% (100% O2) com um caudal de 200 mL/min na câmara de indução.
  3. Transferi o animal sedado para a plataforma de imagem em uma posição supina.
  4. Fornece o estado estacionário sedação usando uma máscara, conectada ao anestesia tubulação, fornecendo sistema isoflurano (1,0% - 1,5%) misturado com 100% O2 a 200 mL/min.
    Atenção: Controle o vazamento de gás anestésico, usando um sistema de ventilação equipado com um filtro de carvão que contém o conjunto do cilindro.
  5. Fita Membros suavemente para os eletrodos de eletrocardiograma incorporados após a aplicação do gel eletrodo para alcançar o monitoramento constante da maternas taxas cardíacas e respiratórias.
  6. Ajuste o nível de isoflurano para manter uma média da frequência cardíaca (450 + /-50 batimentos/minuto (bpm)).
  7. Manter a temperatura corporal dentro de um intervalo de 37,0 ° C + /-0,5 ° C. Monitore a temperatura corporal e frequência cardíaca, sendo exibido na unidade de controlador de fisiologia.
  8. Documente os sinais vitais do mouse sedado cada 15 minutos durante todo o procedimento da imagem latente.
  9. Avalie o nível de anestesia, avaliando a postura do rato, frequência cardíaca e resposta aos pés pitadas.
  10. Aplica o bálsamo oftálmico (1 gota em cada olho) para evitar ressecamento do olho e danos da córnea.
  11. Remova a pele do nível do meio do peito para os membros inferiores, usando um creme depilatório para minimizar a atenuação do ultra-som. Remova o creme 1-1,5 min após aplicação pela alternância de gaze úmida e seca limpa para evitar danos à pele.

3. embrião identificação

  1. Palpe a parede abdominal suavemente para localizar os fetos e espalhe-as.
  2. Anotar cada embrião no abdômen da barragem e definir suas orientações ântero-posterior e dorso-ventral usando um marcador.
  3. Use o colo do útero da barragem sedado como um marco. Rotular os fetos nos chifres esquerdos e direito uterinos como L1, L2, L 3, etc. (lado esquerdo) e R1, R2, R3, etc. (lado direito), respectivamente (figura 1A).
    Atenção: Evite espalhar os fetos com força. 1-2 fetos em cada ninhada podem sobrepor-se com os outros, tornando o seu posicionamento e da imagem latente não confiável. Exclua estes fetos a partir da análise.

4. o batimento cardíaco visualização e anotação

  1. Aplicar o gel de ultra-som pré-aquecido no abdômen e espalhá-lo com cuidado para evitar a formação de bolhas. Adicione uma quantidade adicional de gel sobre a área de digitalização de imagem.
  2. Coloque a sonda de ultra-som no suporte mecânico e mobilizá-la gradualmente em direção a pele ao contato com a camada de gel espesso enquanto olha para o coração batendo, usando o B-modo de digitalização (Figura 1).
  3. Clique no botão B modo de digitalização para obter imagens 2-D. Use a bexiga como um marco para identificar o primeiro feto posicionado no direito ou o corno uterino esquerdo e marcá-lo como R1 ou L1, respectivamente.
  4. Confirme a orientação direita e esquerda do feto individual em tempo real, movendo a plataforma de imagem no plano horizontal. Varredura da cabeça à cauda para anotar o focinho, membros e coluna vertebral como Marcos (figura 1B, vídeo 1).
  5. Visualize o coração pulsante e anotar o ventrículo esquerdo (LV) e o ventrículo direito (RV). Modo de uso cor Doppler para otimizar a visualização do coração (Figura 1 C-G, vídeos 1 - 2).
  6. Clique no botão B modo de digitalização para obter um curto eixo-esternal, ter o LV e RV exibido em seu diâmetro máximo no centro do quadro de aquisição de dados. Começa a imagem ao vivo (figura 1B-C).
  7. Altere a orientação do mouse com relação a digitalização aviões para obter uma visão de quatro câmaras longitudinal (Figura 1). Em primeiro lugar, identifica as estruturas restantes do coração como os átrios, septo interventricular e os tratos de saída esquerda e direita. Em seguida, temos as câmaras ventriculares e atrial, exibidas no seu diâmetro máximo. Então comece a aquisição de imagens.
  8. Exclua as imagens não ideal, oblíquas da análise final. Clique no botão de Cini para obter a gravação contínua 'Cineloops' para um mínimo de 10 s, em seguida, salvar as imagens gravadas.

5. avaliação da frequência cardíaca Fetal e função Ventricular

  1. Clique no botão M-modo de digitalização para obter imagens cardíacas de quatro aviões de câmara (vídeo 3).
  2. Ver a lista de gravações para análise uma vez que as imagens de todos os embriões forem concluídas.
  3. Exclua as imagens não ideal, oblíquas da análise final.
  4. Clique no botão de análise de espessura de parede medida e o diâmetro interno ventricular esquerda/direita na diástole (LVID, d; RVID, d) e a sístole (LVID, s; RVID, s), conforme mostrado na Figura 2.
  5. Determine a taxa média de coração fetal, jogando cada um gravou M-modo de rastreamento e calcular a medida do fluxo de um ciclo para o seguinte fluxo de ciclo (o espaçamento entre picos adjacentes).
  6. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter a média da frequência cardíaca (Figura 2).
  7. Medir as mudanças temporais entre esquerda ventricular diastólica de diâmetro interno (LVID, d) e de diâmetro interno ventricular esquerdo na sístole final (LVID, s) em todo o ciclo cardíaco. Então calcular o percentual de encurtamento fracionário (% de FS) como segue: % de FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter os valores médios de % FS.

6. avaliação de parâmetros de fluxo cardiopulmonar

  1. Ajuste o setor em um ângulo de aquisição inferior a 60o. Clique no botão Doppler para realizar medições Doppler pulsado onda do avião 2-D quatro imagens de câmara usando um transdutor de 45 MHz.
    1. Em primeiro lugar, visualize a bifurcação da artéria pulmonar para identificar o tracto de saída direita do. Em seguida, clique em botão de onda pulsada Doppler para obter o padrão de fluxo através do pulmonar e as válvulas aórtica (Figura 3A, Video 4).
  2. Obter medições de fluxo pulmonar de onda pulsada Doppler rastreamento, incluindo velocidade sistólica de pico (PkV), tempo de aceleração (AT) e tempo de ejeção (ET).
  3. Realizar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) para obter medições médias como mostrado na Figura 3A (à direita).
  4. Calcular o AT / ET ratio para cada válvula de saída como um indicador da patência de folhetos a saída e o fluxo de sangue.
  5. Proceda para obter os padrões de fluxo mitral e aórtica de 2-D apical câmara quatro modos de exibição usando a onda pulsada Doppler. Em primeiro lugar, identifica as câmaras de ventriculares esquerdas e atrial esquerdas. Em seguida, coloque o volume de amostra Doppler pulsado onda para gravação de padrões Doppler mitral afluência e medição de velocidade diastólica precoce (E) e velocidade de contração atrial (A) (Figura 3B)24,25.
  6. Ajuste o volume de amostra Doppler para obter o padrão de jato Doppler da aorta. Use o jato Doppler da aorta rastreamento para medir aceleração tempo (AT) e o tempo de ejeção (ET), conforme mostrado na Figura 3B (à direita) (Video 5)

7. avaliar o eixo Feto-placentária

  1. Use o scan Doppler cor para visualizar a artéria uterina e feto-placentária árvore vascular usando o transdutor de 45 MHz (Figura 4A).
  2. Identifica os vasos umbilicais (duas artérias e uma veia) no segmento intra-amniótica do cordão umbilical, apenas após o cabo sai do abdome fetal.
  3. Onda pulsada de lugar volume de amostra Doppler para obter o padrão de fluxo da artéria umbilical (Figura 4A).
  4. Medir parâmetros de fluxo de pico vasculares incluindo tempo de aceleração (em), tempo de ejeção (ET) e o pico de velocidade de fluxo na sístole final (PkV, s) usando a onda pulsada Doppler registro varredura (Figura 4B).
  5. Obter 5 formas de onda consecutivas em cada navio, na ausência de movimentos fetais e maternos movimentos respiratórios, para medir a velocidade média de pico para cada navio.
  6. Prossiga para o próxima embrião.

8. pós-imagem Animal monitoramento

  1. Desligue o recipiente de isoflurano após a conclusão do processo de geração de imagens.
  2. Continue a acompanhar a frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura corporal durante a fase de recuperação.
  3. Remova a máscara e o sistema de mangueiras ligadas, uma vez que a represa começa movimentos espontâneos.
  4. Retornar a barragem à habitação adequada e continuar a observação de acordo com protocolos de após o procedimento padrão institucionais.
  5. O tempo para reinício completo da atividade normal de documento.

9. requisitos e considerações técnicas

  1. Limite o tempo de processamento para ~ 8 fetos de cerca de 1 h, para evitar os efeitos adversos da anestesia prolongada sobre os sinais vitais e parâmetros fisiológicos.
  2. Complete a formação com 8-10 ratos grávidas para otimizar técnicas para padrões de fluxo e aquisição de imagem de rastreamento em um curto espaço de tempo.

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Representative Results

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Análises estatísticas de índices cardíacas e hemodinâmicas foram realizadas off-line. Calcularam-se os meios de 5 medições consecutivas em 3 imagens ideais. Os dados foram expressos como média ± SEM. Student t-teste foi usado para inferir comparações intergrupais. Um valor de P de ≤0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

Seguindo o protocolo acima, temos caracterizado o impacto da exposição crônica à hipoxia pré-natal no estado cardiovascular de ratos fetais em final de gestação obtendo gravações de ultra-som em tempo real de alta frequência nos ratos grávidas C57/BL6 cronometrado em dia gestacional (GD) 18,5.

Após a criação de grupos de reprodução, acasalamento bem sucedido foi confirmado. Cronometrado grávidas barragens foram mantidas em gaiolas sob um regime de claro-escuro de 12 h com comida e água ad libitum até. Em GD14.5, os ratos grávidas também foram atribuídos ao grupo de normoxia (mantida no ar ambiente) ou ao grupo de hipóxia (colocado numa câmara de hipóxia em 10% FiO2 para induzir a hipóxia sistêmica). Após o nascimento, as barragens e seus filhotes permaneceram alocados para sua condição experimental até pós-Natal dia 7 (P7).

No total, 6 barragens foram estudadas nestas experiências e 42 fetos foram fotografados com sucesso no GD18.5. Destes, foram utilizados dados obtidos de 36 fetos para posterior análise (tabela 1). Análise das taxas de coração fetais no GD18.5 mostrou que fetos hipóxicos sofriam de bradicardia fetal (taxas mais baixas do coração) e experimentaram uma diminuição significativa dos índices de função cardíaca fetal (EF % e % FS) (Tabela 1). Notavelmente, velocidades de fluxo de pico (PkVs) da artéria umbilical PkVs foram menores em fetos expostos a hipóxia (Figura 4B e tabela 1). Além disso, a tempo de aceleração artéria umbilical/ejeção tempo (no / ET) rácios revelaram significativamente os valores mais baixos na hipoxia em comparação com os fetos normoxic, sugerindo aumentaram da resistência umbilical fluxo vascular. De acordo, a espessura da parede ventricular direita foi aumentada em fetos expostos a hipóxia, medido nas imagens 2-D/M-modalidade (Figura 5). Desde que o RV assume função dominante da bomba durante o desenvolvimento fetal, enquanto a placenta serve como o leito vascular primário para oxigenação, esses dados sugerem coletivamente resistência de fluxo elevado no circuito vascular do feto-placentária, levando a RV hipertrofia. Importante, os recém-nascidos exposto de hipóxia enfrentaram letalidade pós-natal precoce. Falha de RV e aumento da resistência vascular induzido pela exposição crônica à hipoxia pré-natal contribuem potencialmente causa. Outros fatores, tais como toxicidade redox resultantes da lesão de re-oxigenação, má alimentação e doença materna não podem ser excluídos. No entanto, o mecanismo subjacente exato de patogênese cardíaco hipoxia pré-natal induzida e a letalidade precoce dos fetos permanecem para ser determinado em estudos futuros.

Figure 1
Figura 1: Anotação de ratos Fetal e coração visualização no útero usando digitalização modo-B e Color Doppler interrogatório. (A) representação esquemática da identificação de ratos fetal e anotação (l: esquerda, direita r:). (B) imagem representativa dos marcos anatómicos em um feto para guiar a orientação do coração fetal dia gestacional 18,5 do vista paraesternal eixo curto do ventrículo esquerdo (LV), ventrículo direito (RV) e septo interventricular (IVS). (C) imagem representativa de esternal eixo curto de LV e RV com interrogatório de cor para facilitar a visualização de câmara do coração. (D) quatro-câmara Longitudinal Ver os de LV e o RV, deixou átrios (LA) e átrios direito (RA) color Doppler. (E) Longitudinal vista de quatro câmaras de LV e RV, com color Doppler interrogatório para facilitar a visualização de extensões de saída: direita tracto de saída do ventrículo (RVOT), tracto de saída do ventrículo esquerdo (LVOT), aorta (AO) e saída do ventrículo direito tracto (RVOT). (F) representante cor Doppler interrogatório de RVOT e o pai. (G) representante cor Doppler interrogatório do LVOT e AO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: avaliação da frequência cardíaca Fetal e da função Ventricular. (A) representante M-modo rastreamento obtido na exibição de 4-câmara de eixo longo no GD 18,5. (LV: deixou o ventrículo; RV: Ventrículo direito; LA: Átrio esquerdo; RA: direito átrio). Método de quantificação representativa (linhas accione) (B) de dimensões ventriculares incluindo diâmetro interno esquerdo e o ventrículo direito na diástole (LVID, d; RVID, d) e a sístole (LVID, s; RVID, s), esquerda e direita a espessura da parede ventricular na diástole (LVAW, d; O septo Interventricular (IVS), de RVW, d), e medição de batimento a batimento de RH são mostrados dos quatro câmara de imagem de avião. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: pulsado onda Doppler rastreamento de índices de fluxo pulmonar, aórtica e Mitral Fetal. (A) imagem representativa da artéria pulmonar onda pulsada Doppler rastreamento (à esquerda). Métodos de quantificação (linhas) de índices de fluxo pulmonar PkV (velocidade de pico), hora (aceleração), ET (tempo de ejeção) são mostrados (direita) do vista longitudinal de quatro câmaras. (B) a imagem representativa da valva aórtica e mitral pulsado padrão de fluxo Doppler (à esquerda) e quantificação de índices de fluxo da válvula mitral E (velocidade diastólica precoce) e uma (contração atrial) e índices de fluxo da aorta no, ET, e PkV (à direita) são mostradas a partir do avião de imagens de quatro câmaras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: avaliação da circulação Feto-placentária. () Imagem de representante do feto-placentária circuitos vasculares usando cor Doppler interrogatório (superior) e registros de ECG maternos (inferior). (B) Imagem representativa de onda pulsada Doppler gravação e quantificação medições (linhas) de índices de fluxo artéria umbilical em hipóxia (superior) e controle de normoxia expostos ratos fetais (inferior). PkV (velocidade de pico), hora (aceleração), ET (tempo de ejeção). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: avaliação da espessura da parede do ventrículo direito em hipóxia tratados ratos Fetal. (A, B) Modo-M representante rastreamento obtido na exibição de quatro câmaras de eixo longo no GD 18,5 em condições normoxia e hipóxia. LV: deixou o ventrículo, RV: direita ventrículo, parede do ventrículo direito. As linhas indicam as medições quantitativas de espessura RVW no (s) de sístole e a diástole (d). RVW (C), quantificação de s mostra maior espessura RVW em tratados com hipóxia fetais ratos comparados a normoxia. Barra de erro: erro padrão da média. (D) representante imagens transversais do coração fetal no GD 18,5 retratando aumentou espessura de parede RV em hipóxia tratados e grupos de normoxia Tratado. Original ampliação 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetro, unidade Normoxia Hipoxia pré-natal
Número de fetos com êxito a imagens 20 16
Taxa de mortalidade pós-natal 5% 68,75%
Parâmetro hemodinâmico (Média ± SEM) (Média ± SEM)
Frequência cardíaca fetal, bpm 138 ± 4 89 ± 8 * * *
Ventrículo esquerdo EF % 71.2 ± 3 55 ± 2 * *
Ventrículo esquerdo FS % 43 ± 2 29 ± 4 * *
Artéria pulmonar PkV, mm/s 102 ± 10 129 ± 8 * *
Artéria pulmonar em relação ET 0,42 ± 0,05 0,35 ± 0.03*
Artéria umbilical PkV, mm/s 58 ± 4 40 ± 1.5* * *
Artéria umbilical na relação ET 0,5 ± 0,03 0.025* ± 0,42
Veia umbilical PkV, mm/s 13 ± 1,2 19,6 ± 3 * *
Atraso arterial-venosa umbilical, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, fração de ejeção; FS, frações de encurtamento; ND, não disponível; NS, não significativo; PkV, velocidade de pico; PkV, d, a velocidade máxima durante a diástole; PkV, s, a velocidade de pico durante a sístole; Teste t de Student foi utilizado para inferir diferenças intergrupos. P < 0.005. * * P < 0,01. * P < 0.05 representa uma diferença significativa na comparação inter-grupal. teste tde Student. Non-significado foi deixado em branco.

Tabela 1: parâmetros hemodinâmicos de normoxic e hipoxia fetais ratos no dia gestacional 18,5. EF, fração de ejeção; FS, frações de encurtamento; PkV, velocidade de pico; AT, tempo de aceleração; ET, tempo de ejeção. Teste t de Student foi utilizado para inferir diferenças intergrupos. * * * P < 0.005. P < 0,01, e * P < 0.05 representa uma diferença significativa na comparação inter-grupal.

Video 1
Video 1: visão do eixo curto de modo-B. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 2
Video 2: Color Doppler – vista longitudinal apical. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 3
Vídeo 3: modo-M. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video 4
Video 4: artéria pulmonar – onda pulsada Doppler. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

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Discussion

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Doenças e malformações cardiovasculares são substancialmente influenciadas por fatores genéticos e ambientais elementos19. Nós demonstramos anteriormente um impacto significativo de restrição calórica materna, iniciada durante o segundo trimestre, no feto-placentária fluxo circulatório e a função cardíaca fetal9.

Hipoxia pré-natal é outro factor comum de stress durante o desenvolvimento fetal que pode afetar enormemente a fisiologia feto-placentária e o sistema circulatório. O impacto da exposição de hipóxia pré-natal pode ser mais profundo no contexto de um CHD levando a pobre perinatal adaptação à vida pós-natal. As taxas de coração anormais e índices cardíacos detectados neste estudo são de fato importantes indicadores de estresse cardíaco e fisiologia circulatória placentária alterada e constituem, portanto, essenciais elementos primários para a detecção de defeitos no desenvolvimento e consequentes alterações hemodinâmicas que podem tornar-se ainda mais pronunciadas em resposta ao estresse hipóxico pré-natal, levando ao início de insuficiência cardíaca. Contrariando as expectativas, fetos de hipóxia exposto tinham taxas mais baixas do coração. Este fenómeno pode refletir mecanismos de autoregulação cardíaca imaturo em camundongos fetais em resposta à hipoxia no GD18.5. No entanto, a patogênese exata ainda é desconhecida.

Embora outros avançados métodos de imagem tais como ressonância magnética cardíaca fetal, permitir que imagens ao vivo das estruturas cardíacas durante desenvolvimento20, o status hemodinâmico é muitas vezes perdido devido a imagens estáticas e procedimentos morosos. Tecnologia de ultra-som não invasiva, por outro lado, permite executar na vivo imagem dinâmica que mantém a fisiologia de linha de base. Além disso, com a disponibilidade de transdutores de alta frequência com resolução aprimorada, a visualização do coração fetal em diferentes fases do desenvolvimento de cada feto individual pode tornar-se mais viável em ratos transgénicos otimizando anotação fetal métodos. Por último, o custo de cada experiência é muito menos usando esse método.

Em um relatório anterior por Kim GH et al, os autores fornecido importantes e novos insights sobre otimização de imagens de plano para aquisição de dados por meio de uma geração anterior de ultra-som de alta frequência de imagem de sistema21. Um outro relatório por Zhou YQ et al., estabeleceu medidas de base padronizada de circulação fetal a nível fisiológico usando um ultra-som de alta frequência equipado com cor sistema Doppler22. Portanto, o protocolo aqui apresentado complementa protocolos previamente estabelecidos e se expande para delinear um método abrangente que é viável e prático em tempo real em um ambiente experimental. Um sistema de ultra-som avançado e altamente sensíveis de alta frequência foi usado neste estudo para digitalizar o feto-placentária circuito como uma unidade. O protocolo descrito é simples e padronizada para empregar este poderoso sistema efetivamente como demonstrado através da realização de medições quantificáveis de impacto de hipoxia na circulação fetal em ratos em GD18.5.

No entanto, devemos reconhecer importantes limitações e desafios de imagiologia cardíaca fatal: agentes anestésicos, primeiros, incluindo o isoflurano, podem afectar os parâmetros fisiológicos do feto. Anestesia prolongada, perda de cabelo e gel de ultra-som podem levar a hipotermia, o que pode afetar a frequência cardíaca e índices hemodinâmicos da barragem, bem como os fetos. Neste momento, não há nenhum método disponível para avaliar o nível de agentes anestésicos e seus impactos sobre o feto. Para contornar essa limitação, titula-se níveis de isoflurano inalados cuidadosamente para alcançar a sedação adequada das barragens, mantendo seus batimentos basal e sinais vitais. Em segundo lugar, visualizando fetos localizados profundamente no abdome... é difícil e de qualidade inferior, levando a exclusão destes fetos da análise final dos dados. A cor Doppler permite melhor otimização de seções de imagem e alinhamento adequado entre o transdutor e o fluxo de sangue. Em terceiro lugar, realizando a análise simultânea de todos os fetos requer eficiência do operador na aquisição de imagem e visualização rápida e precisa rapidamente, sugerindo a importância do treinamento prático.

Finalmente, principais etapas neste método precisam ser enfatizado incluindo 1) preparação apropriada do sistema. 2) mantendo uma temperatura corporal estável e a frequência cardíaca para o mouse grávida. 3) otimizando a taxa de fluxo do isoflurano para manter Estados fisiológicos de linha de base dos embriões para adquirir dados confiáveis. 4) consistente e aquisição de imagem eficiente em menor tempo possível. 5) gestacional idade, sexo e estirpe animal são variáveis importantes que podem afetar significativamente os resultados. Portanto, o protocolo experimental deve ser projetado cuidadosamente para dar conta dessas variáveis, incluindo controles combinados da mesma estirpe animal na interpretação e análise de dados.

Em conclusão, um sistema de ultra-som de alta frequência é um método eficaz para atingir a caracterização fenotípica dos sistemas cardiovascular do feto no útero com importante valor científico e experimental e potenciais aplicações futuras que podem incluem 1) compreensão da dinâmica fisiológica durante o desenvolvimento cardíaco. 2) atingir fenotípica análise abrangente de modelos genéticos de CHDs. 3) elucidar a circulação feto-placentária de impacto no desenvolvimento da câmara cardíaca, maturação e adaptação ao estresse. 4) realização de ultra-som guiado fetal injeção para estudar as toxinas, teratógenos ou agentes terapêuticos no futuro. 6) implementar o rastreamento de speckle e análise de tensão capacidades para obter detalhada função miocárdica regional do miocárdio em desenvolvimento podem fornecer uma base para estudos futuros.

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Disclosures

Não há conflito de interesse declarado.

Acknowledgments

Agradecemos o núcleo de fisiologia animal, divisão de medicina molecular na UCLA para fornecer suporte técnico e acesso aberto ao sistema Vevo 2100 ultra-som biomicroscopia (UBM). Este estudo foi suportado pelo centro de pesquisa de saúde NIH/filho (5K12HD034610/K12), a UCLA-crianças Discovery Institute e hoje e amanhã da criança e o prêmio David Geffen escola de medicina pesquisa inovação para M. Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

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Fetal Mouse Cardiovascular de imagem usando um sistema de ultra-som de alta frequência (30 / 45MHZ)
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Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

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