Summary
Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.
Abstract
Angeborene Herzfehler (CHDs) sind die häufigste Ursache von Morbidität Kindheit und frühe Sterblichkeit. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend für neue präventive und therapeutische Strategien zu erfinden. Mutierte Maus-Modellen sind mächtige Werkzeuge zu entdecken, neue Mechanismen und Umweltstress Modifikatoren, die kardiale Entwicklung und deren mögliche Veränderung im CHDs fahren. Bemühungen um die Kausalität von diesen vermeintlichen Mitwirkende gewesen ist jedoch beschränkt auf histologische und molekularbiologische Untersuchungen in Tierversuchen nicht überleben, in denen die Überwachung die wichtigsten physiologischen und hämodynamischen Parameter oft abwesend. Live-imaging-Technologie ist ein wesentliches Instrument herstellen die Ätiologie der CHDs geworden. Vor allem Ultraschall-Bildgebung kann ohne chirurgisch die Föten pränatal eingesetzt werden so dass Aufrechterhaltung ihrer Grundlinie Physiologie während der Überwachung der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf die hämodynamische und strukturellen Aspekte der kardialen Kammer Entwicklung. Hier benutzen wir das Hochfrequenz-Ultraschall (30/45)-System, um das Herz-Kreislauf-System im fetalen Mäuse beim E18.5 in Utero an der Grundlinie und als Reaktion auf pränatale Hypoxie Exposition zu untersuchen. Wir zeigen die Machbarkeit des Systems, kardiale kammergröße, Morphologie, linksventrikulären Funktion, fetale Herzfrequenz und Nabelarterie Fluss Indizes und deren Veränderungen im fetalen Mäuse ausgesetzt systemischen chronischen Hypoxie in Utero in Echtzeit zu messen Zeit.
Introduction
Angeborene Fehlbildungen des Herzens sind heterogene strukturelle Mängel, die während der frühen kardiale Entwicklung auftreten. Aktuelle technische Fortschritte der betrieblichen Abläufe führten zu signifikanten Verbesserungen in den Überlebensraten von Säuglingen mit CHDs1,2. Lebensqualität ist jedoch oft gefährdeten sekundär zu längeren Krankenhausaufenthalt und Bedürfnisse für chirurgische Reparatur Verfahren1,2,3,4,5in Szene gesetzt. Vorgeburtliche Erkennung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von CHDs ist entscheidend, um frühe Interventionen, neue Präventionsstrategien durchzuführen und die lebenslange Ergebnisse6,7zu verbessern planen.
Obwohl mehrere genetische und umweltbedingte Faktoren in der Pathogenese der CHDs verwickelt waren, bleibt zur Gründung der Kausalität ein ungedeckter Bedarf zur Verbesserung der diagnostischen, therapeutischen und präventiven Strategien1,8,9 ,10,11,12. Darüber hinaus öffnet untersuchen die Rolle der in Utero Stressfaktoren und epigenetische Modifikatoren neue Schauplätze für künftige Untersuchungen11,12. Das letzte Jahrzehnt erlebte in der Tat schnelle Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Microarray, ganze Exome Sequenzierung und genomweite Methylierung Studien, deren Nutzung bei der Untersuchung der genetischen Ursachen der komplexen menschlichen Krankheiten, einschließlich CHDs1,8,9,10,11 ebnet den Weg zu identifizieren, neue Mutationen und genetische Varianten, die bislang nicht für ihre Pathogenität in geeigneten Tiermodellen getestet.
Unter die andere Krankheit Modellsystemen ist Maus Tiermodell der Wahl, nicht nur für die Untersuchung von Mechanismen der CHDs während der frühen Cardiogenesis13,14,15,16, sondern auch zu erläutern deren Auswirkungen auf kardiale Kammer Reifung und Funktion am späten Schwangerschaft im pränatalen und perinatalen Stressfaktoren. Durchführung von in-Vivo phänotypischen Charakterisierung eines mutierte Maus fetalen Herzens während der frühen und späten Stadien der Entwicklung, ist daher wichtig zu verstehen, die Rolle dieser genetischen Variationen und Umweltfaktoren auf kardiale Entwicklung und die möglichen zukünftigen Auswirkungen auf Kammer spezifischen Reifung Prozesse bei Mäusen.
Früherkennung und Diagnose von Herzfehlern während der Entwicklung ist entscheidend für interventionelle Planung17,18. Als sichere, einfache, portable und wiederholbare, fetale Sonographie in der Tat die Standard imaging Technik für kardiale Beurteilung in der Klinik geworden. Fetalen Kreislauf Bewertung mittels Doppler-Ultraschall hat in der klinischen Praxis nicht nur für den Nachweis von Herzfehlern, sondern auch, vaskulären Anomalien, Plazenta-Insuffizienz und intrauterine Wachstumsretardierung zu erkennen und zu beurteilen, verbreitet Die fetalen Wohlbefinden als Reaktion auf in Utero Beleidigungen einschließlich Hypoxämie, mütterliche Erkrankung und Drogen Toxizität17,18. Parallel zu seinen Wert bei der Bewertung von menschlichen Fehlern und Krankheiten hat Ultraschall Beurteilung der fetalen Mäuse zunehmende Dienstprogramm in experimentelle Einstellungen19,20,21,22gewonnen, 23. Insbesondere kann fetale Herz-Ultraschall (Echokardiographie) sequentielle in Vivo Visualisierung des Herzens entwickeln. Viele experimentelle Studien haben Ultraschall-Imaging-Technologie verwendet, um fetale Herz-Kreislauf-Entwicklung in fetalen Transgene Mäuse zu beobachten. Doppler-Ultraschall ist besonders nützlich, um die pathophysiologische Parameter, wie die Strömungsmuster im fetalen Kreislauf unter physiologischen Herausforderungen oder Krankheit Bedingungen10,19aufzuklären gewesen. Bei Mensch und Tier kann abnormale Flow oder Sauerstoff Blutversorgung für den Fötus aus verschiedenen Bedingungen führen, die fetalen Umwelt in der Gebärmutter stören und beeinflussen die Fetoplacental Achse, einschließlich der plazentare Auffälligkeiten, mütterliche Hypoxie, Schwangerschafts-Diabetes und pharmazeutisch induzierten vaskulären Zusammenziehung15,22. Daher wird Etablierung standardisiertere Methoden zum Ausführen von Doppler Ultraschall auf fetale Mäuse enorm Zukunftsstudien CHDs stärken durch die Erleichterung der Überwachung fließstrukturen und wichtige hämodynamische Indizes der Herz-Kreislauf-Schaltungen während verschiedenen Entwicklungsstadien kardiale in genetischer Mausmodelle.
Hochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Tool zum Messen der Entwicklungs- und physiologische Parameter des Herz-Kreislauf-Systems in Mausmodellen und menschliche Krankheiten18entstanden. Diese Technologie hat in den letzten Jahren weiterentwickelt worden. Wir und andere Forscher haben die Machbarkeit dieses Systems zur Durchführung von Ultrahochfrequenz Ultraschall Studien über die fetalen Maus Herz15,19,20,21,22 gezeigt. ,23. Das System ist ausgestattet mit Doppler Fluss Farbzuordnung und linear-Array-Sensoren, die zweidimensionale, dynamische Bilder bei hoher Frequenz (30 bis 50 MHz) Frameraten zu generieren. Diese Vorteile, im Vergleich zu niederfrequenten Ultraschall-Systeme und die vorherige Generation der Hochfrequenz Ultraschall21,22, bieten die notwendige Empfindlichkeit und Auflösung für eingehende Beurteilung der fetalen Kreislauf System, inklusive umfassende Charakterisierung von Herzen Strukturen, Kammer-Funktion und Fluss-Indizes der fetalen Mäuse in experimentelle Einstellungen. Hier erläutern wir Methoden, um schnelle Beurteilung der Herz-Lungen-Kreislauf und Feto-plazentaren Zirkulation an embryonalen Tag E18.5 in Vivo mit einem Hochfrequenz-System durchführen. Wir entschieden uns für einen 30/45 MHz Wandler, der einer axialen Auflösung von etwa 60 µm und einer lateralen Auflösung von 150 µm bietet. Jedoch kann ein höhere Frequenz-Wandler (40/50 MHz), früher Entwicklungsstadien zu analysieren, indem Sie folgen einen ähnlichen methodischen Ansatz gewählt werden. Die ausgewählten M-Modus ermöglicht die Visualisierung von Gewebe mit hoher zeitlicher Auflösung Ebenen (1.000 Bilder/s) in Bewegung. Zu guter Letzt zeigen wir die Machbarkeit der hohen Ultraschall für detaillierte umfassende phänotypischen Charakterisierung der fetalen Herz-Kreislauf-hämodynamischen Status und Funktion bei Mäusen zu Studienbeginn und in Reaktion auf Stress pränatale Hypoxie.
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Protocol
Die University of California, Los Angeles, Animal Care und Use Committee genehmigt alle Verfahren, die in diesem Protokoll angezeigt. Die Experimente wurden im Rahmen einer laufenden Studie unter aktiven Tier Protokolle, genehmigt durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der University of California, Los Angeles, Kalifornien, USA. Tierische Handhabung und Pflege folgten die Standards des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Vorbereitung des Hochfrequenz-Ultraschalls-Imaging-System
- Aktivieren Sie die Ultraschall-imaging-System und die Physiologie-Überwachungseinheit.
- Schließen Sie den 30/45 MHz-Schallkopf.
- Legen Sie die entsprechenden Scan-Kopf auf der Halterung in der Nähe der bildgebungsplattform.
- Die Kardiale Messprogramm Option.
- Ort der Ultraschall gel kopfüber in seinem vor-Erwärmung Container setzen auf 37 ° C.
- Bestätigen Sie entsprechenden Schlauchsystem für die Anästhesie zu und überprüfen Sie die Ebenen aus Sauerstoff und Isofluran.
- Desinfizieren Sie die imaging-Plattform und den Arbeitsbereich.
- Legen Sie die Wärme der imaging Plattform weiterhin eine Konstante Körpertemperatur und Herzfrequenz der Dämme.
2. Schwangere Maus Vorbereitung
- Legen Sie die schwangere Maus (C57/BL6)-Damm in der Anästhesie-Induktion-Kammer.
- Induzieren Sie Anästhesie mittels inhalativer Isofluran (Isofluran 2 % - 3 %), gemischt mit 100 % Sauerstoff (100 % O2) bei einer Durchflussrate von 200 mL/min in der Induktion Kammer kontinuierlich geliefert.
- Das sedierten Tier auf die imaging Plattform in Rückenlage zu übertragen.
- Bieten Sie stationäre Sedierung mit einer Gesichtsmaske, verbunden mit der Anästhesie Schlauch System liefert Isofluran (1,0-1,5 %) mit 100 % O2 bei 200 mL/min gemischt.
Achtung: Steuern Sie das Austreten von betäubende Gas mithilfe einer Lüftungsanlage ausgestattet mit einen Kohlefilter, Kanister Satz enthält. - Kleben Sie die Glieder sanft zu den eingebetteten elektrokardiographischen Elektroden nach Anwendung der Elektroden-Gel zu erreichen, ständige Überwachung der mütterlichen Herz- und Atemwegserkrankungen Raten.
- Der Pegel der Isofluran weiterhin eine durchschnittliche Herzfrequenz (450 + /-50 Schläge/min (Bpm)).
- Aufrechterhaltung der Körpertemperatur innerhalb eines Bereichs von 37,0 ° C +/-0,5 ° C. Überwachen Sie die Körpertemperatur und die Herzfrequenz auf die Physiologie-Controller-Einheit angezeigt wird.
- Dokumentieren Sie die Vitalfunktionen der sediert Maus alle 15 min in den bildgebenden Verfahren.
- Bewertung des Anästhesie durch die Auswertung der Maus Haltung, Herzfrequenz und Reaktion bis zu den Zehen drückt.
- Bewerben Sie ophthalmologische Balsam (1 Tropfen in jedes Auge), um Augentrockenheit und Hornhaut Schaden zu verhindern.
- Entfernen Sie das Fell aus der Mitte des Brusthöhe an den unteren Extremitäten mit einer Enthaarungscreme Ultraschall Dämpfung zu minimieren. Creme 1-1,5 min nach Anwendung durch den Wechsel von nassen und trockenen Gaze wischt, um Schäden an der Haut zu entfernen.
(3) Embryo Identifikation
- Ertasten der Bauchwand sanft zum Suchen der Föten und verteile sie.
- Kommentieren Sie jeder Embryo auf dem Damm Bauch und mit einem Marker definieren Sie ihre anterior-posterioren und dorsal-Ventral Orientierungen.
- Verwenden Sie den Muttermund sediert dam als Wahrzeichen. Beschriften Sie die Föten auf die Links und rechts uterine Hörner als L1, L2, L 3, etc. (linke Seite) und R1, R2, R3, usw. (rechts), bzw. (Abbildung 1A).
Achtung: Vermeiden Sie die Verbreitung der Feten mit Nachdruck. 1-2 Föten in jedem Wurf überschneiden sich mit den anderen, um ihre Positionierung und bildgebenden unzuverlässig. Diese Föten von der Analyse auszuschließen.
(4) fetalen Herzens Visualisierung und Annotation
- Tragen Sie vorgewärmten Ultraschallgel auf den Bauch auf und verteilen Sie es sorgfältig durch, um Blasenbildung zu vermeiden. Fügen Sie zusätzliche Menge des Gels auf dem Gebiet der Bildgebung Scan.
- Die Ultraschallsonde auf der mechanischen Halterung und mobilisieren Sie allmählich in Richtung der Haut die dicken Gelschicht Kontakt während der Suche nach das schlagende Herz Scan B-Modus (Abbildung 1) zu.
- Klicken Sie auf die Scan B Modus um 2-D-Bilder zu erhalten. Verwenden Sie die Blase als Wahrzeichen zu identifizieren den ersten Fötus positioniert in der rechten oder der linken Uterus Horn und markieren Sie ihn als R1 oder L1, beziehungsweise.
- Bestätigen Sie die Rechte und linke Ausrichtung des einzelnen Fötus in Echtzeit durch Verschieben der bildgebungsplattform in der Horizontalebene. Scannen von Kopf Schwanz um die Schnauze, die Gliedmaßen und der Wirbelsäule als Landmarken (Abbildung 1 b, 1 Video) zu beschriften.
- Visualisieren Sie das schlagende Herz zu und mit Anmerkungen versehen Sie, der linke Ventrikel (LV) und den rechten Ventrikel (RV). Verwendung Doppler Farbmodus zur Optimierung der Herz-Visualisierung (Abbildung 1 C-G, Videos 1 - 2).
- Klicken Sie auf Scan B Modus um ein Parasternal kurze Achse-Ansicht zu erhalten haben die LV und RV in ihrer maximalen Durchmesser in der Mitte des Datenrahmens Erwerb angezeigt. Starten Sie live Imaging (Abbildung 1 b-C).
- Ändern Sie die Ausrichtung der Maus im Hinblick auf die Scan-Flugzeuge, um einen längs vierkammer-Blick (Abbildung 1) zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die restlichen Strukturen des Herzens wie Atrien, interventricular Septum und Links und rechts Abfluss Traktate. Als nächstes müssen Sie die ventrikulären und Vorhofflimmern Kammern in ihrer maximalen Durchmesser angezeigt. Starten Sie Bildaufnahme.
- Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen. Klicken Sie auf Cini Daueraufzeichnung "Cineloops" erhalten für ein Minimum von 10 s, dann speichern Sie die aufgezeichneten Bilder.
5. Bewertung der fetalen Herzfrequenz und linksventrikulären Funktion
- Klicken Sie der Scan M-Modus um kardiale Bilder aus vier-Kammer-Flugzeuge (Video 3) zu erhalten.
- Zeigen Sie die Liste der Aufnahmen für die Analyse, sobald die Bilder aller Embryonen abgeschlossen sind.
- Letzten Endes die suboptimale, schiefe Bilder ausschließen.
- Klicken Sie auf Analyse , Wandstärke Messen und die Links/rechts-ventrikuläre Innendurchmesser bei Diastole (LVID, d; RVID, d) und Systole (LVID, s; RVID, s), wie in Abbildung 2dargestellt.
- Bestimmen Sie die durchschnittliche fetale Herzfrequenz durch das Spielen jedes M-Modus aufgezeichnet Ermittlung und Berechnung der Messung einen Flow-Zyklus, der folgende Ablauf Zyklus (den Abstand zwischen benachbarten Gipfeln).
- Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die durchschnittliche Herzfrequenz (Abbildung 2) zu erhalten.
- Messen Sie die zeitlichen Veränderungen zwischen linken ventricular diastolische Innendurchmesser (d LVID) und linken ventricular Innendurchmesser am Ende Systole (LVID, s) in dem Herzzyklus. Berechnen Sie gebrochene Verkürzung Prozentsatz (FS %) wie folgt: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] X100.
- Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um die FS % Durchschnittswerte zu erhalten.
6. Bewertung der kardiopulmonalen Strömungsparameter
- Passen Sie dem Sektor in einem Winkel des Erwerbs weniger als 60o. Klicken Sie Doppler gepulsten Doppler Messungen aus dem 2-D vier-Kammer-Bildgebung Flugzeug mit einer 45-MHz-Schallkopf durchführen.
- Zunächst visualisieren Sie die Verzweigung der Lungenarterie, die richtige Ausflusstrakt zu identifizieren. Als nächstes klicken Sie auf gepulsten Doppler um den Strömungsverlauf durch die Lungen- und Aortenklappen (Abb. 3A, Video 4) zu erhalten.
- Erhalten Sie pulmonale Durchflussmessungen von gepulsten Doppler Ablaufverfolgung, einschließlich Gipfel systolischen Geschwindigkeit (PkV), Beschleunigung der Zeit (AT) und Auswurf Zeit (ET).
- Führen Sie mehrere Messungen (mindestens 5 pro Ablaufverfolgung) um durchschnittlichen Messwerte zu erhalten, wie in Abbildung 3A (rechts) dargestellt.
- Berechnen die AT / ET Ratio für jeden Abfluss Ventil als Indikator für den Abfluss Traktate Durchgängigkeit und Durchblutung.
- Fahren Sie mit der Mitral- und Aortenklappe Strömungsmuster von apikalen vier Kammer 2-D-Ansichten mit gepulsten Doppler zu erhalten. Ermitteln Sie zuerst die linken Vorhofflimmern und linke ventrikulären Kammern. Als nächstes legen Sie die gepulsten Doppler Probenmenge für die Aufnahme der Mitral-Zufluss Doppler Muster und Mess Frühe Diastolische Geschwindigkeit (E) und atrial Kontraktion Geschwindigkeit (A) (Abb. 3 b)24,25.
- Doppler-Beispiel Lautstärke um die Aorta Doppler Jet Muster zu erhalten. Verwenden Sie die Aorten-Doppler Jet tracing um Beschleunigung (AT) und Auswurf Zeit (ET) zu messen, wie in Abbildung 3 b (rechts) gezeigt (Video 5)
7. Bewertung der Feto-plazentaren Achse
- Verwenden Sie den Doppler Farbscan uterine Arterie und Feto-plazentaren Kreislauf Baum visualisieren, indem mit den 45 MHz-Schallkopf (Abb. 4A).
- Identifizieren Sie die Nabelschnur Schiffe (zwei Arterien und eine Vene) im Segment der Nabelschnur, Intra-Fruchtwasser kurz nachdem die Schnur aus dem fetalen Bauch verlässt.
- Ort gepulsten Doppler Probenvolumen Nabelarterie Strömungsmuster (Abb. 4A) zu erhalten.
- Vaskuläre Peak Strömungsparameter einschließlich der Beschleunigung der Zeit (Zeitpunkt), Auswurf (ET) zu messen, und peak Strömungsgeschwindigkeit am Ende Systole (PkV, s) mit gepulsten Doppler scanning Datensatz (Abbildung 4 b).
- Erhalten Sie 5 aufeinander folgenden Wellenformen in jedem Gefäß, in das Fehlen von Kindsbewegungen und mütterliche Atembewegungen, zur Messung der durchschnittlichen Geschwindigkeit für jedes Schiff.
- Fahren Sie mit der nächsten Embryo.
8. Post-Bildgebung Tier Überwachung
- Schalten Sie den Isofluran-Container nach Abschluss den imaging-Prozess.
- Überwachung der Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz während der Erholungsphase weiter.
- Die Gesichtsmaske und die angeschlossenen Leitungssystem zu entfernen, sobald der Damm spontane Bewegungen beginnt.
- Der dam mit dem entsprechenden Gehäuse und Fortfahren Sie Beobachtung nach institutionellen postoperativ Standardprotokolle.
- Die Zeit, um volle Wiederaufnahme der normalen Aktivität zu dokumentieren.
9. die Leistungsanforderungen und technische Überlegungen
- Begrenzen Sie die Bearbeitungszeit für ~ 8 Feten bis ca. 1 h, die negativen Auswirkungen der verlängerten Anästhesie auf Vitalparameter und physiologische Parameter zu vermeiden.
- Komplette Ausbildung mit 8-10 schwangeren Mäusen, Techniken für Bildmuster Erwerb und Flow Ablaufverfolgung in einem kurzen Zeitrahmen zu optimieren.
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Representative Results
Statistische Analysen der Herz- und hämodynamische Indizes wurden offline durchgeführt. Die Mittel von 5 aufeinander folgenden Messungen in 3 optimale Bilder wurden berechnet. Die Daten wurden geäußert, da ± SEM Student tbedeuten-Test diente der interfraktionellen Arbeitsgruppe Vergleiche zu schließen. Ein P -Wert des ≤0.05 galt als statistisch signifikant.
Im Anschluss an das oben genannte Protokoll gekennzeichnet wir die Auswirkungen der chronischen Exposition gegenüber pränatale Hypoxie auf die Herz-Kreislauf-Status des fetalen Mäuse am späten Schwangerschaft durch den Erwerb von Real-Time hochfrequente Ultraschall Aufnahmen auf die C57/BL6 zeitlich Schwangere Mäuse an Tag (GD) 18,5.
Nach Gründung der Zuchtgruppen wurde die erfolgreiche Paarung bestätigt. Zeitgesteuerte schwanger Dämme wurden in Käfigen unter einem 12 h hell-dunkel-Regime mit Nahrung und Wasser Ad Libitum bis beibehalten. Bei GD14.5 bekamen die schwangere Mäuse entweder zugunsten der normoxiezustand Gruppe (gehalten in der Luft) oder der Hypoxie-Gruppe (in 10 % FiO2 induzieren systemischer Hypoxie Hypoxie Kammer platziert). Nach der Geburt blieb die Dämme und ihre Welpen bis postnatale 7.Tag (P7) ihre versuchsbedingung zugewiesen.
In insgesamt 6 Dämme wurden in diesen Experimenten untersucht und 42 Feten wurden erfolgreich auf GD18.5 abgebildet. Von diesen wurden 36 Föten gewonnene Daten für die spätere Analyse (Tabelle 1) verwendet. Analyse der fetalen Herzfrequenz bei GD18.5 zeigten, dass hypoxische Föten fetale Bradykardie (niedriger Herzfrequenz) litt und erlebt deutlichen Rückgang der fetalen Herzfunktion Indizes (EF und FS %) (Tabelle 1). Bemerkenswerterweise wurden Spitze Strömungsgeschwindigkeiten (PkVs) der Nabelarterie PkVs bei Hypoxie-exponierten Feten (Abbildung 4 b und Tabelle 1) gesenkt. Darüber hinaus der Nabelarterie Beschleunigung Zeit/Auswurf Zeit (an / ET) Verhältnisse offenbart deutlich niedrigere Werte in der hypoxischen im Vergleich zu den Inklusieve Föten, was darauf hindeutet Nabelschnur vaskulären Strömungswiderstand erhöht. Zustimmend, stieg rechtsventrikuläre Wandstärke bei Hypoxie-exponierten Feten gemessen auf 2-D/M-Modus Bilder (Abbildung 5). Da die RV dominierende Pumpenfunktion während der fetalen Entwicklung, übernimmt während die Plazenta als primären vaskulären Bettes für Sauerstoffanreicherung dient, empfehlen diese Daten gemeinsam erhöhter Strömungswiderstand im Feto-plazentaren Kreislauf Kreislauf führt zu RV Hypertrophie. Wichtig ist, gegenüber Hypoxie ausgesetzt Neugeborene frühen postnatalen Letalität. RV-Versagen und erhöhten Gefäßwiderstand durch chronische Exposition gegenüber pränatale Hypoxie induziert sind potentiell Ursache beitragen. Andere Faktoren wie die Redox-Toxizität infolge Re Sauerstoffversorgung Verletzungen, schlechte Ernährung und mütterliche Krankheit werden nicht ausgeschlossen. Trotzdem noch den genauen zugrunde liegenden Mechanismus der pränatale Hypoxie induzierte kardiale Pathogenese und die frühen Letalität der Föten in zukünftigen Studien festgelegt werden.
Abbildung 1: Fetale Mäuse Annotation und Herz Visualisierung in Utero mit B-Scanmodus und Farbe Doppler Verhör. (A) schematische Darstellung des fetalen Mäuse Kennzeichnung und Beschriftung (L: Links, R: rechts). (B) repräsentatives Bild von der anatomischen Orientierungspunkte: ein Fötus, die Ausrichtung des fetalen Herzens Tag 18,5 von Parasternal kurze Achse Ansicht der linke Ventrikel (LV), rechter Ventrikel (RV) und interventricular Septum (IVS) führen. (C) repräsentatives Bild von Parasternal kurze Achse Blick auf LV und RV mit Farbe Verhör Herz Kammer Visualisierung zu erleichtern. (D) längs vierkammer-Blick auf das LV und RV, verließ Atria (LA) und rechten Herzvorhof (RA) Farbdoppler. (E) längs vierkammer-Blick auf LV und RV, mit Farbe Doppler Verhör, um die Visualisierung von Abfluss Traktaten zu erleichtern: rechter Ventrikel Ausflusstrakt (RVOT), linke Herzkammer Ausflusstrakt (LVOT), Aorta (AO) und rechten Ventrikel Abfluss Darm-Trakt (RVOT). (F) repräsentative Farbe Doppler Verhör des RVOT und PA. (G) repräsentative Farbe Doppler Verhör des LVOT und AO. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beurteilung der fetalen Herzfrequenz und linksventrikulären Funktion. (A) Vertreter M-Modus Ablaufverfolgung aus der langen Achse 4-Kammer-Blick auf GD 18.5 gewonnen. (LV: Links Ventrikel; RV: Rechten Ventrikel; LA: Linker Vorhof; RA: rechter Atrium). (B) Vertreter (als Zeilen) Quantifizierungsmethode ventrikuläre Dimensionen einschließlich Links- und rechtsventrikuläre Innendurchmesser bei Diastole (LVID, d; RVID, d) und Systole (LVID, s; RVID, s), linke und Rechte Ventrikelwand Dicke bei Diastole (LVAW, d; Vaughan Williams, d), Interventricular Septum (IVS), und Schlag zu Schlag Messung des HR werden aus den vier Kammer imaging Flugzeug. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Pulsed Wave Doppler Rückverfolgung der fetalen Lungen, Aorten- und Mitralklappe Flow Indizes. (A) repräsentatives Bild der Lungenarterie gepulsten Doppler Ablaufverfolgung (links). Quantifizierungsmethoden (Zeilen) der pulmonalen Fluss Indizes PkV (Peak Velocity), bei (Beschleunigung), ET (Auswurf Zeit) werden angezeigt (rechts) aus der längs-vierkammer-Blick. (B) repräsentatives Bild der Mitral- und Aortenklappe Gepulste Doppler Strömungsmuster (links) und Quantifizierung der Mitralklappe Fluss Indizes E (Frühe Diastolische Geschwindigkeit) und (atrial Kontraktion) und Aorta fließen Indizes um ET und PkV (rechts) gezeigt, von der vierkammer-Abbildungsebene. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Beurteilung der Feto-plazentaren Zirkulation. (A) Vertreter Bild der Feto-plazentaren Kreislauf Schaltungen mit Farbe Doppler Verhör (oben) und mütterlichen ECG Records (unten). (B) Repräsentatives Bild der gepulsten Doppler Erfassung und Quantifizierung Messungen (Zeilen) der Nabelarterie Fluss Indizes in Hypoxie (oben) und normoxiezustand Kontrolle ausgesetzt fetalen Mäuse (unten). PkV (Peak Velocity), bei (Beschleunigung), ET (Auswurf-Zeit). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bewertung der rechten Ventrikel Wanddicke in Hypoxie behandelt fetalen Mäuse. (A, B) Vertreter M-Modus Ablaufverfolgung von der Längsachse vierkammer-Blick auf GD 18.5 in normoxiezustand und Hypoxie Bedingungen erhalten. LV: Links Ventrikel, RV: rechten Ventrikels, die rechtsventrikuläre Wand. Linien zeigen die quantitative Messungen der RVW Dicke in Systole (s) und Diastole (d). (C) RVW s Quantifizierung zeigt erhöhte RVW Dicke in fetalen Hypoxie-behandelten Mäusen im Vergleich zu normoxiezustand. Fehlerbalken: Standardfehler von Mittelwert. (D) repräsentative Querschnittsbilder der fetalen Herzen bei GD 18.5 Darstellung erhöht RV Wandstärke Hypoxie behandelt und normoxiezustand behandelt. Ursprüngliche Vergrößerung 10 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Parameter Einheit | Normoxiezustand | Pränatale Hypoxie |
| Zahl der erfolgreich abgebildeten Feten | 20 | 16 |
| Postnatale Sterblichkeit | 5 % | 68,75 % |
| Hämodynamischen Parameter | (Mittelwert ± SEM) | (Mittelwert ± SEM) |
| Fetale Herzfrequenz, bpm | 138 ± 4 | 89 ± 8 *** |
| Linke Herzkammer EF % | 71,2 ± 3 | 55 ± 2 ** |
| Linke Herzkammer FS % | 43 ± 2 | 29 ± 4 ** |
| Lungenarterie PkV, mm/s | 102 ± 10 | 129 ± 8 ** |
| Lungenarterie AT ET-Verhältnis | 0,42 ± 0,05 | 0,35 ± 0.03* |
| Nabelarterie PkV, mm/s | 58 ± 4 | 40 ± 1.5* ** |
| Nabelarterie bei ET-Verhältnis | 0,5 ± 0,03 | 0,42 ± 0.025* |
| Nabelader PkV, mm/s | 13 ± 1,2 | 19.6 ± 3 ** |
| Nabelschnur venösen und arteriellen Verzögerung, ms | 122 ± 4 | 238 ± 20 * |
| EF, Auswurffraktion; FS, gebrochene Verkürzung; NA, nicht zur Verfügung; NS, nicht signifikant; PkV, Peak-Geschwindigkeit; PkV, d, Peak Geschwindigkeit während der Diastole; PkV, s, Spitze Geschwindigkeit während der Systole; Der Student t-Test wurde zur interfraktionellen Unterschiede ableiten. P < 0,005. ** P < 0,01. * P < 0,05 stellt einen signifikanten Unterschied bei konzerninternen vergleichen. Studenten t-Test. Non-Bedeutung war leer. | ||
Tabelle 1: hämodynamische Parameter Inklusieve und hypoxischen fetalen Mäuse am Tag 18,5. EF, Auswurffraktion; FS, gebrochene Verkürzung; PkV, Peak-Geschwindigkeit; AT, Beschleunigung der Zeit; ET, Auswurf Zeit. Der Student t -Test wurde zur interfraktionellen Unterschiede ableiten. *** P < 0,005. P < 0,01, und * P < 0,05 stellt einen signifikanten Unterschied im konzerninternen Vergleich.
Video 1: B-Modus kurze Achse Blick. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2: Farbe Doppler – apikale längs Blick. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 3: M-Modus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 4: Lungenarterie – gepulsten Doppler. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Herz-Kreislauf-Fehlbildungen und Krankheiten werden von genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen19wesentlich beeinflusst. Wir haben bisher einen signifikanten Einfluss der mütterlichen kalorische Restriktion, initiiert während des zweiten Trimesters auf Feto-plazentaren Kreislauf fließen und fetalen Herzfunktion9gezeigt.
Pränatale Hypoxie ist eine weitere gemeinsame Stressfaktor während der fetalen Entwicklung, die Ungeheuer der Feto-plazentaren Physiologie und Herz-Kreislauf-System beeinträchtigen können. Die pränatale Hypoxie Exposition kann tiefer im Zusammenhang mit einer KHK führt zu schlechten Perinatale Anpassung an postnatalen Lebens auswirken. Die abnorme Herzfrequenzen kardiale Indizes in dieser Studie nachgewiesen sind in der Tat wichtige Indikatoren der Herzbelastung und veränderte plazentare Kreislauf Physiologie und somit wesentliche primäre Elemente für die Erkennung der Entwicklungsschäden dar und konsequente hämodynamischen Veränderungen, die in Reaktion auf pränatale hypoxischer Stress führt zu frühen Herzinsuffizienz weiter ausgesprochen werden können. Entgegen den Erwartungen hatte Hypoxie ausgesetzt Föten niedrigere Herzfrequenzen. Dieses Phänomen kann unreife kardiale Selbstregelung Mechanismen im fetalen Mäuse als Reaktion auf Hypoxie bei GD18.5 widerspiegeln. Die genaue Pathogenese bleibt jedoch unbekannt.
Obwohl andere erweiterte bildgebende Verfahren, wie z. B. fetale kardiale MRT ermöglichen live Darstellung der kardialen Strukturen während der Entwicklung20, ist der hämodynamische Status oft durch statische Bilder und langwierige Verfahren verloren. Nicht-invasive Ultraschall-Technologie erlaubt auf der anderen Seite in Vivo dynamische Darstellung, die die Grundlinie Physiologie unterhält. Darüber hinaus kann mit der Verfügbarkeit von hochfrequenten Schallköpfe mit Erhöhung der Auflösung, die Visualisierung des fetalen Herzens in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von jedem einzelnen Fötus mehr bei transgenen Mäusen machbar durch die Optimierung der fetalen annotation Methoden. Schließlich sind die Kosten pro Experiment weit weniger mit dieser Methode.
In einem früheren Bericht von Kim GH Et Al.bereitgestellt die Autoren wichtige und neue Erkenntnisse über bildgebende Plan-Optimierung für die Datenerfassung mithilfe von einer vorherigen Generation von Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung System21. Ein weiterer Bericht von Zhou YQ Et Al., etablierte standardisierte Basisberechnungen der fetalen Zirkulation auf physiologischer Ebene mithilfe einer Hochfrequenz-Ultraschall mit Farbe Doppler System22ausgestattet. Daher das Protokoll hier vorgestellten vorher festgelegten Protokolle ergänzt und erweitert, um eine umfassende Methode zu skizzieren, die machbar und praktisch in Echtzeit in einer experimentellen Umgebung ist. Eine erweiterte und hochsensiblen Hochfrequenz-Ultraschall-System wurde in dieser Studie verwendet, die Feto-plazentaren Schaltung als Ganzes gescannt. Das skizzierte Protokoll ist einfache und standardisierte, dieses leistungsstarke System effektiv wie gezeigt durch das erreichen quantifizierbarer Messungen der Hypoxie-Auswirkungen auf den fetalen Kreislauf bei Mäusen bei GD18.5 zu beschäftigen.
Dennoch sollten wir anerkennen wichtige Einschränkungen und Herausforderungen der tödliche kardiale Bildgebung: Erstens die Narkose-Mittel, insbesondere Isofluran, können die physiologische Parameter des Fötus beeinträchtigen. Längerer Anästhesie, Haarausfall und Ultraschall Gel führt zu Unterkühlung, die die Herzfrequenz und hämodynamische Indizes der Damm als auch die Föten beeinflussen können. Derzeit gibt es keine Methode, die Höhe der Anästhetika und deren Auswirkungen auf den Fötus zu bewerten. Um diese Einschränkung zu umgehen, titrieren wir inhalierte Isofluran Ebenen sorgfältig, um entsprechende Sedierung der Dämme, unter Wahrung ihrer basale Herzfrequenz und Vitalfunktionen zu erreichen. Zweitens ist die Visualisierung von Föten, die tief in den Bauch befinden schwierig und suboptimal, führt zum Ausschluss von diesen Föten aus der endgültige Datenanalyse. Der Farbdoppler ermöglicht verbesserte Optimierung von bildgebenden Abschnitte und angemessene Ausrichtung zwischen dem Schallkopf und Blutfluss. Drittens erfordert gleichzeitige Analyse alle Föten des Betreibers Effizienz in eine schnelle und genaue Visualisierung und Bild Erwerb schnell, impliziert die Bedeutung der praktischen Ausbildung.
Wichtige Schritte in dieser Methode müssen schließlich betont werden, einschließlich 1) Vorbereitung des Systems. (2) Erhaltung eine stabile Körpertemperatur und Herzfrequenz für die schwangere Maus. (3) Optimierung des Durchfluss von Isofluran weiterhin Grundlinie physiologischen Zuständen der Embryonen, verlässliche Daten zu erwerben. (4) einheitliche und effiziente Bildakquisition innerhalb der kürzest möglichen Zeit. (5) Gestational Alter, Geschlecht und Tier Sorte sind wichtige Variablen, die die Ergebnisse erheblich beeinträchtigen können. Experimentelle Protokoll sollte daher sorgfältig geplant werden, für diese Variablen zu berücksichtigen, durch die Einbeziehung abgestimmte Kontrollen aus dem gleichen Tier-Stamm in Datenanalyse und Interpretation.
Zusammenfassend ist ein Hochfrequenz-Ultraschall-System eine effektive Methode zur phänotypischen Charakterisierung des fetalen kardiovaskulären Systems in Utero mit experimentellen und wissenschaftlichen Wert und mögliche zukünftige Anwendungen, die möglicherweise zu erreichen beinhalten 1) Verständnis der physiologischen Dynamik während der kardialen Entwicklung. (2) erreichen umfassende phänotypische Analyse von genetischen Modellen von CHDs. 3) Erläuterung der Auswirkungen Feto-plazentaren Zirkulation auf kardiale Kammer Entwicklung, Reifung und Anpassung zu betonen. (4) Durchführung von Ultraschall geführte fetalen Injektion um Toxine, teratogene oder Therapeutika in Zukunft studieren. (6) Umsetzung der Speckle-Ablaufverfolgung und Belastungsanalyse, dass Fähigkeiten, detaillierte regionale myokardiale Funktion der entwickelnden Myokard zu erhalten als Grundlage für zukünftige Studien dienen können.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Wir danken den Tierphysiologie Kern, Abteilung für Molekulare Medizin an der UCLA für die Bereitstellung von technischer Unterstützung und freien Zugang zu der Vevo 2100-Ultraschall-biomikroskopie (UBM)-System. Diese Studie wurde unterstützt durch das NIH/Child Health Research Center (5K12HD034610/K12), die UCLA-Kinder Discovery Institute und heute und Morgen Kinder Fonds und David Geffen School of Medicine Research Innovation Award, M. Touma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
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