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Developmental Biology

Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

Formazione immagine di ultrasuono ad alta frequenza del mouse fetale ha migliorato imaging ad alta risoluzione e può fornire precisa caratterizzazione non invasiva di sviluppo cardiaco e difetti strutturali. Il protocollo descritto nel presente documento è stato progettato per eseguire ecocardiografia fetale in tempo reale di topi in vivo.

Abstract

Difetti congeniti del cuore (CHDs) sono la causa più comune di infanzia morbilità e mortalità precoce. Rilevazione prenatale i meccanismi molecolari di CHDs è cruciale per inventare nuove strategie preventive e terapeutiche. Modelli di topo mutante sono strumenti potenti per scoprire nuovi meccanismi e modificatori di stress ambientale che guidano lo sviluppo cardiaco e loro potenziale alterazione in CHDs. Tuttavia, gli sforzi per stabilire la causalità di questi presunti collaboratori sono stati limitati a studi istologici e molecolari negli esperimenti sugli animali non-sopravvivenza, nel quale monitoraggio di parametri fisiologici ed emodinamici chiave sono spesso assenti. Tecnologia di imaging dal vivo è diventata uno strumento essenziale per stabilire l'eziologia di CHDs. In particolare, l'imaging ad ultrasuoni può essere utilizzato prenatally senza esporre chirurgicamente i feti, che permette di mantenere la loro fisiologia di base durante il monitoraggio dell'impatto dello stress ambientale sugli aspetti strutturali ed emodinamici della camera cardiaca sviluppo. Nel presente documento, utilizziamo il sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30/45) per esaminare il sistema cardiovascolare in topi fetali al E18.5 nell'utero alla linea di base ed in risposta all'esposizione prenatale ipossia. Dimostriamo la fattibilità del sistema per misurare dimensioni camera cardiaca, morfologia, funzione ventricolare, frequenza cardiaca fetale e indici di flusso dell'arteria ombelicale e loro alterazioni fetali topi esposti ad ipossia cronica sistemica nell'utero in tempo reale tempo.

Introduction

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Malformazioni congenite del cuore sono eterogenei difetti strutturali che si verificano durante lo sviluppo cardiaco iniziale. Gli avanzamenti tecnici correnti delle procedure operative hanno condotto ai miglioramenti significativi nei tassi di sopravvivenza dei neonati con CHDs1,2. Tuttavia, la qualità della vita è spesso compromessa secondaria alle esigenze e l'ospedalizzazione prolungata per in scena riparazione chirurgica procedure1,2,3,4,5. Rilevazione prenatale i meccanismi molecolari di CHDs è cruciale al fine di pianificare gli interventi precoci, per realizzare nuove strategie di prevenzione e migliorare i risultati permanente6,7.

Anche se più fattori genetici e ambientali sono stati implicati nella patogenesi di CHDs, stabilire la causalità rimane un bisogno insoddisfatto per migliorare il sistema diagnostico, terapeutico e strategie preventive1,8,9 ,10,11,12. Inoltre, esaminando il ruolo di fattori di stress nell'utero e modificatori epigenetici apre nuove sedi per le indagini future11,12. Nell'ultimo decennio ha infatti visto rapidi progressi nel sequenziamento tecnologia di nuova generazione tra cui microarray di singolo nucleotide polymorphism (SNP), il sequenziamento dell'esoma intero e studi di metilazione del genoma, loro utilizzo nello studiare la genetica cause di malattie umane complesse, compreso spianando la strada per identificare mutazioni novelle e varianti genetiche che non sono ancora state CHDs1,8,9,10,11 testati per la loro patogenicità in modelli animali adatti.

Tra i sistemi di modello differenti di malattia, il mouse è il modello animale di scelta, non solo per studiare i meccanismi di CHDs durante i primi cardiogenesis13,14,15,16, ma anche per delucidare loro impatto sulla maturazione camera cardiaca e funzione a fine gestazione in fattori di stress prenatale e perinatale. Quindi, eseguendo in vivo caratterizzazione fenotipica di un cuore fetale murino, durante fasi sia precoce e tardiva di sviluppo, è fondamentale per comprendere il ruolo di queste variazioni genetiche e fattori ambientali sullo sviluppo cardiaco, e il potenziale futuro impatto sui processi di maturazione specifici di camera in topi.

Diagnosi precoce e accurata diagnosi dei difetti cardiaci durante lo sviluppo è fondamentale per interventistica pianificazione17,18. Essere sicuro, semplice, portatile e ripetibile, l'ecografia fetale è infatti diventata la norma tecnica per la valutazione cardiaca nella clinica di imaging. Valutazione di circolazione fetale usando ultrasuono di Doppler è stato ampiamente utilizzato nella pratica clinica non solo per la rilevazione di difetti cardiaci, ma anche per rilevare le anomalie vascolari, insufficienza di placenta e restrizione della crescita intrauterina e di valutare il benessere fetale in risposta agli insulti in utero tra cui ipossiemia, malattia materna e droga tossicità17,18. In parallelo al suo valore nella valutazione delle malattie e difetti umani, valutazione di ultrasuono dei mouse fetali ha guadagnato sempre maggiore utilità Impostazioni sperimentali19,20,21,22, 23. In particolare, ecografia del cuore fetale (ecocardiografia) permette la visualizzazione sequenziale in vivo del cuore in via di sviluppo. Molti studi sperimentali hanno utilizzato tecnologie di imaging ad ultrasuoni per osservare lo sviluppo cardiovascolare fetale in topi transgenici fetali. L'ultrasuono di Doppler è stato particolarmente utile per chiarire i parametri fisiopatologici, come i modelli di flusso nella circolazione fetale sotto fisiologiche sfide o malattia condizioni10,19. In entrambi gli esseri umani e animali, flusso o dell'ossigeno di sangue anormale al feto può derivare da varie condizioni che possono interferire con ambiente fetale nell'utero e influenzare l'asse fetoplacental, compreso le anomalie placentare, ipossia materna, il diabete gestazionale e costrizione vascolare farmacologicamente indotto15,22. Di conseguenza, che fissa i metodi standardizzati per l'esecuzione di ultrasuoni Doppler fetale topi tremendamente potenzieranno gli studi futuri di CHDs facilitando il monitoraggio dei flussi e indici emodinamici chiavi dei circuiti cardiovascolari durante diverse fasi di sviluppo cardiaco in modelli genetici murini.

L'ultrasuono ad alta frequenza è emerso come un potente strumento per misurare i parametri fisiologici e di sviluppo del sistema cardiovascolare in modelli murini e malattie umane18. Questa tecnologia è stata ulteriormente perfezionata negli ultimi anni. Noi ed altri ricercatori abbiamo dimostrato la fattibilità di questo sistema per lo svolgimento di studi ultrasuoni altissima frequenza sul fetali del mouse cuore15,19,20,21,22 ,23. Il sistema è dotato di tracciato di flusso di Doppler di colore e allineamento lineare trasduttori che generano immagini bidimensionali, dinamiche a frequenze di fotogrammi ad alta frequenza (da 30 a 50 MHz). Questi vantaggi, rispetto ai sistemi ad ultrasuoni a bassa frequenza e la generazione precedente di alta frequenza ultrasuoni21,22, forniscono la necessaria sensibilità e risoluzione per valutazione approfondita del fetale circolatori sistema, tra cui la completa caratterizzazione delle strutture del cuore, funzione della camera e indici di flusso dei mouse fetali nei quadri sperimentali. Qui, descriviamo i metodi per eseguire la valutazione rapida di circolazione cardiopolmonare e la circolazione feto-placentare al giorno embrionale E18.5 in vivo utilizzando un sistema ad alta frequenza. Abbiamo scelto un trasduttore di 30/45 MHz che fornisce una risoluzione assiale di circa 60 µm e una risoluzione laterale di 150 µm. Tuttavia, un trasduttore di frequenza più alto (40/50 MHz) può essere scelto per analizzare le precedenti fasi di sviluppo seguendo un simile approccio metodologico. M-modalità selezionata consente la visualizzazione dei tessuti in movimento a livelli di alta risoluzione temporale (1.000 fotogrammi/s). Infine, dimostriamo la fattibilità dell'ultrasuono alta per dettagliata completa caratterizzazione fenotipica di condizione emodinamica cardiovascolare fetale e funzione nei topi alla linea di base e nella risposta allo stress prenatale ipossia.

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Protocol

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La University of California, Los Angeles, cura degli animali e uso Comitato ha approvato tutte le procedure illustrate nel presente protocollo. Gli esperimenti sono stati condotti nell'ambito di uno studio continuo sotto protocolli animale attivi approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Comitato della University of California, Los Angeles, California, USA. Cura e manipolazione degli animali seguiti gli standard della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. preparazione del sistema di Imaging a ultrasuoni ad alta frequenza

  1. Accendere il sistema di imaging ad ultrasuoni e l'unità di controllo di fisiologia.
  2. Collegare il trasduttore di 30/45 MHz.
  3. Posizionate la testina di scansione corrispondente al suo titolare vicino alla piattaforma di imaging.
  4. Selezionare l'opzione di Programma di misurazione cardiaca .
  5. Posto l'ecografia gel capovolto nel relativo contenitore pre-riscaldamento impostato a 37 ° C.
  6. Confermare il sistema appropriato della tubazione per l'anestesia e verificare i livelli di ossigeno e isoflurano.
  7. Disinfettare la piattaforma di formazione immagine e l'area di lavoro.
  8. Impostare il livello di calore della piattaforma imaging per mantenere costante la temperatura corporea e la frequenza cardiaca delle dighe.

2. preparazione del Mouse incinta

  1. Posizionare la diga incinta del mouse (C57/BL6) nella camera di induzione di anestesia.
  2. Inducono anestesia utilizzando continuamente consegnato da inalazione isoflurane (isoflurano 2% - 3%) mescolata con ossigeno al 100% (100% O2) con una portata di 200 mL/min in camera di induzione.
  3. Trasferire l'animale sedato sulla piattaforma di imaging in posizione supina.
  4. Fornire sedazione allo steady-state utilizzando un facemask collegato per l'isoflurano consegna sistema di tubazione anestesia (1,0% - 1,5%) miscelato con il 100% O2 a 200 mL/min.
    Attenzione: Controllare la fuoriuscita di gas anestetico utilizzando un sistema di ventilazione equipaggiato con un filtro al carbone contenente canister set.
  5. Nastro degli arti delicatamente agli elettrodi elettrocardiografici incorporati dopo l'applicazione del gel elettrodo per realizzare un monitoraggio costante dei tassi materni di cardiaci e respiratori.
  6. Regolare il livello di isoflurane per mantenere una frequenza cardiaca media (450 + /-50 battiti/min (bpm)).
  7. Mantenere la temperatura corporea all'interno di una gamma di 37,0 ° C ± 0,5 ° C. Monitorare la temperatura corporea e la frequenza cardiaca viene visualizzato sull'unità di regolatore di fisiologia.
  8. I segni vitali del mouse sedato ogni 15 minuti durante la procedura di formazione immagine del documento.
  9. Valutare il livello di anestesia valutando postura, frequenza cardiaca e la risposta alla punta pizzichi del mouse.
  10. Applicare il balsamo oftalmica (1 goccia in ciascun occhio) per prevenire la secchezza degli occhi e danni alla cornea.
  11. Rimuovere la pelliccia dal livello medio-toracico agli arti inferiori utilizzando una crema depilatoria per ridurre al minimo l'attenuazione con ultrasuoni. Rimuovere la crema 1-1,5 min dopo applicazione da un'alternanza di secco ed umido garza salviettine per prevenire danni alla pelle.

3. embrione identificazione

  1. Palpare la parete addominale delicatamente per individuare i feti e li sparsi.
  2. Annotare ogni embrione sull'addome della diga e definire i loro orientamenti antero-posteriore e dorso-ventrale utilizzando un marcatore.
  3. Utilizzare la cervice della diga sedata come punto di riferimento. Etichettare i feti sui corni di sinistra e destra dell'utero come L1, L2, L3, ecc (lato sinistro) e R1, R2, R3, ecc (lato destro), rispettivamente (Figura 1A).
    Attenzione: Evitare di diffondere i feti con forza. 1-2 feti in ogni cucciolata possono coincidere con gli altri, rendendo il loro posizionamento e imaging inaffidabile. Escludere questi feti dall'analisi.

4. fetale cuore visualizzazione e annotazione

  1. Applicare il gel per ultrasuoni pre-riscaldato sull'addome e distribuire attentamente per evitare la formazione di bolle. Aggiungere ulteriori quantità di gel sulla zona di scansione imaging.
  2. Posizionare la sonda ad ultrasuoni sul suo supporto meccanico e mobilitare esso gradualmente verso la pelle a contatto con lo strato di gel spessa mentre cercavo il cuore utilizzando la modalità di scansione del B (Figura 1).
  3. Fare clic sul pulsante modalità di scansione per ottenere immagini 2D. Utilizzare la vescica come un punto di riferimento per identificare il primo feto posizionato a destra o il sinistro corno uterino e contrassegnarlo come R1 o L1, rispettivamente.
  4. Confermare l'orientamento destro e sinistro del feto individuo in tempo reale spostando la piattaforma di imaging nel piano orizzontale. Scansione dalla testa alla coda per annotare il muso, gli arti e la colonna vertebrale come punti di riferimento (Figura 1B, Video 1).
  5. Il cuore pulsante di visualizzare e annotare il ventricolo sinistro (LV) e il ventricolo di destra (RV). Modo di Doppler di colore uso per ottimizzare la visualizzazione del cuore (Figura 1 C-G, video 1 - 2).
  6. Fare clic sul pulsante scansione modalità B per ottenere un asse corto parasternale-vista, avere il LV e RV visualizzati nel loro massimo diametro al centro del frame di acquisizione dati. Avviare live imaging (Figura 1B-C).
  7. Modificare l'orientamento del mouse rispetto alla scansione aerei per ottenere una vista del quattro-alloggiamento longitudinale (Figura 1). In primo luogo, identificare le strutture rimanenti del cuore come l'atria, setto interventricular e tratti di uscita destra e sinistra. Successivamente, hanno gli alloggiamenti ventricolari e atriali visualizzati nel loro diametro massimo. Quindi avviare acquisizione immagine.
  8. Escludere le immagini non ottimale, oblique dall'analisi finale. Fare clic sul pulsante Cini per ottenere la registrazione continua 'Cineloops' per un minimo di 10 s, poi Salva le immagini registrate.

5. valutare la frequenza cardiaca fetale e funzione ventricolare

  1. Fare clic sul pulsante M-modalità di scansione per ottenere immagini cardiache da quattro piani di camera (Video 3).
  2. Una volta completate le immagini di tutti gli embrioni, visualizzare l'elenco delle registrazioni per l'analisi.
  3. Escludere le immagini non ottimale, oblique dall'analisi finale.
  4. Fare clic sul pulsante analisi di misura dello spessore di parete e del diametro interno ventricolare sinistra/destra in diastole (LVID, d; RVID, d) e sistole (LVID, s; RVID, s), come illustrato nella Figura 2.
  5. Determinare la frequenza cardiaca fetale media giocando ognuno registrato M-modalità traccia e calcolare la misura del ciclo di un flusso di flusso seguente ciclo (la spaziatura tra picchi adiacenti).
  6. Eseguire misurazioni multiple (almeno 5 per l'analisi) per ottenere la frequenza cardiaca media (Figura 2).
  7. Misurare i cambiamenti temporali tra diametro diastolico interna ventricolare sinistra (LVID, d) e diametro interno ventricolare sinistro in sistole fine (LVID, s) durante tutto il ciclo cardiaco. Quindi calcolare la percentuale di accorciamento frazionario (% FS) come segue: % FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Eseguire misurazioni multiple (almeno 5 per l'analisi) per ottenere i valori medi di % FS.

6. valutare i parametri di flusso cardiopolmonare

  1. Regolare il settore con un angolo di acquisizione inferiore a 60o. Fare clic sul pulsante Doppler per eseguire misurazioni Doppler pulsato dal piano 2-D quattro camera-imaging utilizzando un trasduttore 45-MHz.
    1. In primo luogo, visualizzare la biforcazione dell'arteria polmonare per identificare il tratto di efflusso destro. Successivamente, fare clic su pulsante onda pulsata Doppler per ottenere il modello di flusso attraverso la polmonare e le valvole aortiche (Figura 3A, Video 4).
  2. Ottenere misure di flusso polmonare dall'onda pulsata Doppler traccia, tra cui il picco di velocità sistolica (PkV), tempo di accelerazione (a) e il tempo di espulsione (ET).
  3. Eseguire misurazioni multiple (almeno 5 per l'analisi) per ottenere misure medie come mostrato in Figura 3A (a destra).
  4. Calcolare l'AT / ET ratio per ciascuna valvola di deflusso come indicatore della pervietà di tratti di deflusso e flusso sanguigno.
  5. Procedere per ottenere i modelli di flusso mitrale e aortica da viste 2D apicale quattro camera mediante l'onda pulsata Doppler. In primo luogo, identificare la sinistra camere ventricolari atriali e sinistra. Successivamente, inserire il volume campione Doppler pulsato per la registrazione dei modelli Doppler mitrale afflusso e misurazione velocità diastolica precoce (E) e velocità di contrazione atriale (A) (Figura 3B)24,25.
  6. Regolare il volume campione Doppler per ottenere il modello jet aortico di Doppler. Utilizzare l'analisi per misurare l'accelerazione tempo (AT) e tempo di espulsione (ET) come illustrato in Figura 3B (a destra) il getto di Doppler aortico (Video 5)

7. valutare l'asse Feto-placentare

  1. Utilizzare la scansione di Doppler di colore per visualizzare l'arteria uterina e l'albero vascolare feto-placentare utilizzando il trasduttore 45 MHz (Figura 4A).
  2. Identificare i vasi ombelicali (due arterie e una vena) nel segmento intra-amniotic del cordone ombelicale, appena dopo il cavo esce dall'addome fetale.
  3. Luogo onda pulsata volume campione Doppler per ottenere il modello di flusso dell'arteria ombelicale (Figura 4A).
  4. Misurare i parametri di flusso vascolare picco compreso il tempo di accelerazione (a), tempo di espulsione (ET) e al massimo la velocità di flusso in sistole fine (PkV, s) usando l'onda pulsata Doppler scansione record (Figura 4B).
  5. Ottenere 5 forme d'onda consecutive in ogni nave, in assenza di movimenti fetali e materni movimenti respiratori, per misurare la velocità di punta media per ciascuna nave.
  6. Procedere all'embrione successivo.

8. post-Imaging monitoraggio animali

  1. Spegnere il contenitore di isoflurane dopo il completamento del processo di imaging.
  2. Continuare a monitorare la temperatura corporea, frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca durante la fase di recupero.
  3. Rimuovere la maschera e il sistema di tubazione collegato una volta che la diga inizia movimenti spontanei.
  4. Restituire la diga all'alloggiamento appropriato e continuare osservazione secondo protocolli standard di post-procedura istituzionale.
  5. Documento il momento di piena ripresa della normale attività.

9. prestazioni requisiti e considerazioni tecniche

  1. Limitare il tempo di elaborazione per i feti di ~ 8 a circa 1 h per evitare gli effetti negativi dell'anestesia prolungata su segni vitali e parametri fisiologici.
  2. Completare la formazione con 8-10 topi incinto per ottimizzare tecniche per motivi di immagine acquisizione e flusso della traccia in un breve lasso di tempo.

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Representative Results

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Analisi statistiche degli indici cardiaci ed emodinamici sono state eseguite non in linea. I mezzi di 5 misurazioni consecutive in 3 immagini ottimali sono stati calcolati. I dati sono stati espressi come media ± SEM. dello studente t-test è stato utilizzato per dedurre i confronti intergruppo. Un valore P ≤ 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

A seguito del protocollo di cui sopra, abbiamo caratterizzato l'impatto dell'esposizione cronica all'ipossia prenatale sullo stato cardiovascolare dei mouse fetali a fine gestazione ottenendo le registrazioni di ultrasuono in tempo reale ad alta frequenza sui topi C57/BL6 cronometrato incinta alle giorno gestazionale (GD) 18,5.

Dopo l'istituzione di gruppi di allevamento, accoppiamento riuscito è stato confermato. Temporizzato incinte dighe erano tenute in gabbie sotto un regime di chiaro-scuro di 12h con cibo e acqua ad libitum fino. A GD14.5, i topi incinto o sono stati assegnati al gruppo normoxia (mantenuto nell'aria ambiente) o al gruppo di ipossia (inserito nella camera di ipossia alle 10% FiO2 per indurre ipossia sistemica). Dopo la nascita, le dighe e i loro cuccioli rimasero allocati alla loro condizione sperimentale fino postnatale giorno 7 (P7).

In totale, 6 dighe sono stati studiati in questi esperimenti e 42 feti erano imaged con successo a GD18.5. Di questi, i dati ottenuti da 36 feti sono stati utilizzati per l'analisi successiva (tabella 1). Analisi della frequenza cardiaca fetale a GD18.5 ha mostrato che i feti hypoxic soffrivano di bradicardia fetale (bassa frequenza cardiaca) e sperimentato un calo significativo degli indici di funzione cardiaca fetale (EF % e % FS) (Tabella 1). Notevolmente, le velocità di flusso di picco (PkVs) dell'arteria ombelicale PkVs sono state diminuite in feti esposti a ipossia ( tabella 1eFigura 4B ). Inoltre, l'arteria ombelicale accelerazione tempo/espulsione tempo (AT / ET) rapporti hanno rivelato significativamente i valori più bassi nell'ipossia rispetto ai feti normoxic, suggerendo aumentato resistenza di flusso vascolare ombelicale. D'accordo, lo spessore della parete ventricolare di destra è stato aumentato nei feti esposti ipossia come misurato su immagini 2-D/M-mode (Figura 5). Poiché la RV assume funzione di pompa dominante durante lo sviluppo fetale, mentre la placenta serve come il letto vascolare primario per l'ossigenazione, questi dati suggeriscono collettivamente resistenza di elevato flusso nel circuito vascolare feto-placentare che conduce a RV ipertrofia. D'importanza, i neonati esposto l'ipossia fronte letalità postnatale precoce. Fallimento di RV e aumento della resistenza vascolare indotto tramite l'esposizione cronica ad ipossia prenatale stanno contribuendo potenzialmente causa. Altri fattori, quali la tossicità di redox derivanti dalla lesione di riossigenazione, scarsa alimentazione e malattia materna non possono essere escluso. Tuttavia, l'esatto meccanismo sottostante della patogenesi cardiaca prenatale ipossia indotta e la mortalità precoce dei feti restano per determinare negli studi futuri.

Figure 1
Figura 1: Annotazione di topi fetali e cuore nell'Utero mediante scansione B-modalità di visualizzazione e interrogatorio di Doppler di colore. (A) rappresentazione schematica dell'identificazione di topi fetali e annotazione (l: sinistra, destra r:). (B) immagine rappresentativa dei punti di riferimento anatomici in un feto per guidare l'orientamento del cuore fetale giorno gestazionale 18,5 dalla visualizzazione parasternale asse corto del ventricolo sinistro (LV), ventricolo di destra (RV) e setto interventricolare (IVS). (C) immagine rappresentativa di parasternale asse corto vista LV e RV con interrogatorio di colore per facilitare la visualizzazione di camera del cuore. (D) longitudinale quattro-alloggiamento Mostra di LV e la RV, lasciato atria (LA) e Doppler di colore di destra atria (RA). (E) vista di quattro-alloggiamento longitudinale di LV e RV, con color Doppler interrogatorio per facilitare la visualizzazione dei tratti di uscita: tratto di efflusso del ventricolo (RVOT), tratto di efflusso del ventricolo sinistro (LVOT), aorta (AO) e deflusso del ventricolo destro a destra tratto (RVOT). (F) rappresentante colore Doppler interrogatorio di RVOT e PA. (G) rappresentante colore Doppler interrogatorio di LVOT e AO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: valutazione della frequenza cardiaca fetale e la funzione ventricolare. (A) rappresentante M-modalità traccia ottenuto dalla visualizzazione asse lungo 4-camera presso GD 18,5. (LV: lasciato ventricolo; RV: Ventricolo destro; LA: Atrio sinistro; RA: Atrium a destra). (B) metodo di quantificazione rappresentativa (indicato dalla freccia linee) di dimensioni ventricolari comprese diametro interno ventricolare destra e sinistra in diastole (LVID, d; RVID, d) e sistole (LVID, s; RVID, s), sinistra e destra di spessore della parete ventricolare in diastole (LVAW, d; Setto Interventricular RVW, d), (IVS), e misurazione battito per battito di HR sono indicati da quattro camera aereo di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Pulsed Wave Doppler l'analisi degli indici di flusso polmonare e aortica e mitrale fetale. (A) immagine rappresentativa dell'arteria polmonare onda pulsata Doppler traccia (a sinistra). Metodi di quantificazione (linee) di indici di flusso polmonare PkV (velocità di picco), a (tempo di accelerazione), ET (tempo di eiezione) vengono visualizzati (destra) dalla vista del quattro-alloggiamento longitudinale. (B) immagine rappresentativa della mitrale e aortica pulsata modello di flusso di Doppler (a sinistra) e quantificazione degli indici di flusso della valvola mitrale E (velocità diastolica precoce) e una (contrazione atriale) e indici di flusso aortico a, ET e PkV (a destra) sono indicati dalla quattro-alloggiamento imaging aereo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: valutazione della circolazione Feto-placentare. (A) Immagine rappresentante dei circuiti vascolari feto-placentare usando colore Doppler interrogatorio (superiore) e materna ECG records (inferiore). (B) Immagine rappresentativa di onda pulsata Doppler registrazione e quantificazione misurazioni (linee) degli indici di flusso dell'arteria ombelicale in ipossia (superiore) e controllo normoxia esposto i topi fetali (inferiore). PkV (velocità di picco), a (tempo di accelerazione), ET (tempo di espulsione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: valutazione di spessore di parete del ventricolo di destra nell'ipossia fetali topi trattati. (A, B) Rappresentante M-modalità traccia ottenuto dalla visualizzazione asse lungo quattro-alloggiamento presso GD 18,5 in condizioni di ipossia e normoxia. LV: lasciato ventricolo, RV: ventricolo, parete ventricolare di destra a destra. Le linee indicano le misure quantitative di spessore RVW in sistole (s) e Diastole (d). RVW (C), quantificazione s Mostra spessore maggiorato RVW in topi fetali ipossia-trattati rispetto al normoxia. Barra di errore: errore Standard della media. (D) immagini rappresentative della sezione trasversale del cuore fetale a GD 18,5 raffigurante aumentato spessore della parete RV in ipossia trattati e gruppi normoxia trattato. Originale ingrandimento 10x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro, unità Normoxia Ipossia prenatale
Numero di feti con successo imaged 20 16
Tasso di mortalità postnatale 5% 68.75%
Parametri emodinamici (Media ± SEM) (Media ± SEM)
Frequenza cardiaca fetale, bpm 138 ± 4 89 ± 8 * * *
Ventricolo sinistro EF % 71,2 ± 3 55 ± 2 * *
Ventricolo sinistro FS % 43 ± 2 29 ± 4 * *
Arteria polmonare PkV, mm/s 102 ± 10 129 ± 8 * *
Arteria polmonare AT rapporto ET 0.42 ± 0.05 0.35 ± 0.03*
Arteria ombelicale PkV, mm/s 58 ± 4 40 ± 1.5 * * *
Arteria ombelicale al rapporto ET 0,5 ± 0.03 0.025* ± 0.42
Vena ombelicale PkV, mm/s 13 ± 1.2 19,6 ± 3 * *
Ritardo-venosa ombelicale, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, frazione di eiezione; FS, frazionario accorciamento; NA, non disponibile; NS, non significativo; PkV, velocità di picco; PkV, d, velocità di picco durante la diastole; PkV, s, velocità di picco durante la sistole; Test t di Student è stato utilizzato per dedurre le differenze intergruppo. P < 0,005. * * P < 0.01. * P < 0,05 rappresenta una differenza significativa nei confronti tra gruppi. di Student t-test. Non-significato è stata lasciata vuota.

Tabella 1: parametri emodinamici di normossia ed ipossico fetali topi a giorno gestazionale 18,5. EF, frazione di eiezione; FS, frazionario accorciamento; PkV, velocità di picco; AT, tempo di accelerazione; ET, tempo di espulsione. Test t di Student è stato utilizzato per dedurre le differenze intergruppo. * * * P < 0,005. P < 0.01, e * P < 0,05 rappresenta una differenza significativa in confronto inter-gruppo.

Video 1
Video 1: visualizzazione in asse corto B-modalità. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 2
Video 2: Color Doppler – vista longitudinale apicale. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 3
Video 3: modalità di M. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 4
Video 4: arteria polmonare – onda pulsata Doppler. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

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Discussion

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Malattie e malformazioni cardiovascolari sono sostanzialmente influenzati da fattori genetici e ambientali elementi19. Precedentemente abbiamo dimostrato un impatto significativo della restrizione calorica materna, avviata durante il secondo trimestre, il flusso circolatorio feto-placentare e funzione cardiaca fetale9.

L'ipossia prenatale è un altro fattore di stress comuni durante lo sviluppo fetale che può influenzare enormemente la fisiologia feto-placentare e sistema circolatorio. L'impatto dell'esposizione prenatale ipossia può essere più profonda nel contesto di una CHD portando a scarso adattamento perinatale di vita postnatale. Le frequenze cardiache anormali e indici cardiaci rilevati in questo studio sono infatti importanti indicatori di stress cardiaco e alterata fisiologia circolatoria placenta e pertanto costituiscono elementi essenziali primari per rilevare i difetti inerenti allo sviluppo e conseguenti alterazioni emodinamiche che possono diventare ulteriormente pronunciate in risposta allo stress ipossico prenatale che conducono all'infarto precoce. Contrariamente alle aspettative, i feti esposto l'ipossia ha avuto tassi più bassi di cuore. Questo fenomeno può riflettere i meccanismi di autoregolazione cardiaca immaturo nei topi fetali in risposta all'ipossia alle GD18.5. Tuttavia, la patogenesi esatta rimane sconosciuta.

Anche se altri avanzati metodi di imaging quali MRI cardiaca fetale, consentire live imaging delle strutture cardiache durante sviluppo20, la condizione emodinamica è spesso persa a causa di immagini statiche e lunghe procedure. Tecnologia ad ultrasuoni non invasiva, d'altra parte, consente di effettuare in vivo imaging dinamico che mantiene la fisiologia di base. Inoltre, con la disponibilità di trasduttori ad alta frequenza con risoluzione potenziata, la visualizzazione del cuore fetale alle varie fasi di sviluppo di ogni singolo feto può diventare più fattibile in topi transgenici ottimizzando annotazione fetale metodi. Infine, il costo per esperimento è molto meno utilizzando questo metodo.

In un precedente rapporto di GH Kim et al., gli autori fornito le comprensioni importanti e romanzo per quanto riguarda imaging ottimizzazione del piano per l'acquisizione dati utilizzando una generazione precedente di sistema21di imaging a ultrasuoni ad alta frequenza. Un altro rapporto di YQ Zhou et al., ha stabilito misurazioni di base standardizzati di circolazione fetale a livello fisiologico utilizzando un ultrasuono ad alta frequenza con color Doppler sistema22. Quindi, il protocollo presentato qui integra i protocolli precedentemente stabiliti e si espande per delineare un metodo completo che è fattibile e concreta in tempo reale in un ambiente sperimentale. Un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza avanzata e altamente sensibile è stato utilizzato in questo studio per analizzare il circuito come unità feto-placentare. Il protocollo descritto è semplice e standardizzato per impiegare questo potente sistema efficacemente come dimostrato con la realizzazione di misure quantificabili di impatto di ipossia sulla circolazione fetale nei topi a GD18.5.

Tuttavia, dovremmo riconoscere importanti limitazioni e sfide di imaging cardiaco fatale: primi, anestetici agenti, tra cui isoflurano, possono influenzare i parametri fisiologici del feto. L'anestesia prolungata, la perdita di capelli e gel per ultrasuoni può portare all'ipotermia, che possa influenzare la frequenza cardiaca e indici emodinamici della diga così come i feti. Allo stato attuale, non esiste un metodo disponibile per valutare il livello di agenti anestetici e il loro impatto sul feto. Per aggirare questa limitazione, abbiamo titolo per inalazione Isoflurane livelli accuratamente per ottenere sedazione appropriata delle dighe, pur mantenendo la loro frequenza cardiaca basale e segni vitali. In secondo luogo, visualizzare i feti che si trovano nel profondo l'addome è difficile e non ottimali, che conduce all'esclusione di questi feti dall'analisi finale dei dati. Il colore Doppler consente Ottimizzazione migliorata delle sezioni imaging e adeguato allineamento tra il trasduttore e il flusso sanguigno. In terzo luogo, l'analisi simultanea di tutti i feti richiede efficienza dell'operatore nell'acquisizione rapida e accurata visualizzazione e immagine rapidamente, implicando l'importanza della formazione pratica.

Infine, passaggi chiave di questo metodo devono essere sottolineato compreso 1) preparazione adeguata del sistema. 2) mantenendo una temperatura corporea stabile e la frequenza cardiaca per il mouse incinta. 3) ottimizzazione della portata di isoflurane per mantenere gli stati fisiologici basale degli embrioni per acquisire dati affidabili. 4) coerenti e acquisizione di immagini efficiente nel più breve tempo possibile. 5) gestazionale età, sesso e ceppo animale sono importanti variabili che possono influenzare significativamente i risultati. Quindi, il protocollo sperimentale dovrebbe essere progettato con attenzione per tenere conto di queste variabili, includendo i comandi abbinati dal medesimo ceppo animale nell'interpretazione e analisi dei dati.

In conclusione, un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza è un metodo efficace per ottenere la caratterizzazione fenotipica dei sistemi cardiovascolare fetale nell'utero con importante valore scientifico e sperimentale e potenziali future applicazioni che possono includono 1) comprensione delle dinamiche fisiologiche durante lo sviluppo cardiaco. 2) realizzare analisi fenotipica completa di modelli genetici di CHDs. 3) chiarire la circolazione feto-placentare di impatto sullo sviluppo di camera cardiaca, di maturazione e di adattamento allo stress. 4) esecuzione di ecografia guidata fetale iniezione per studiare le tossine, teratogeni o agenti terapeutici in futuro. 6) attuazione della tracciatura speckle e ceppo analisi funzionalità per ottenere la funzione del miocardio regionale dettagliata del miocardio in via di sviluppo può fornire una base per gli studi futuri.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo il nucleo di fisiologia animale, divisione di medicina molecolare presso la UCLA per fornire supporto tecnico e accesso aperto al sistema Vevo 2100 ultrasuono biomicroscopy (UBM). Questo studio è stato sostenuto dal centro di ricerca di salute di NIH/bambino (5K12HD034610/K12), UCLA-bambini Discovery Institute e fondo di oggi e di domani di bambini e David Geffen School of medicina ricerca Innovation award per M. Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

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References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97, (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140, (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57, (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9, (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498, (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128, (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127, (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157, (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72, (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71, (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116, (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46, (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22, (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10, (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33, (11), 1167-1173 (2010).
Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)
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Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

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