Summary
衛星細胞の正確な同定は様々 な生理学的、病理学的条件の下でその機能を研究するために不可欠です。この記事では、蛍光抗体法による染色による大人の骨格筋のセクションの衛星細胞を識別するためにプロトコルを示します。
Abstract
蛍光抗体法は、異なる細胞ティッシュ セクションの種類を識別するため効果的な方法です。目的のセル人口を研究するために特定のセル マーカーの抗体はティッシュ セクションに適用されます。大人の骨格筋衛星細胞 (SCs)、筋肉の修復と再生に貢献する幹細胞です。したがって、視覚化し、異なる生理学的な条件の下で衛星細胞集団を追跡することが重要です。安静時骨格筋の SCs は基底膜と筋線維膜の間に存在します。筋線維、細胞培養、SCs を識別するために一般的に使用されるマーカーは、ペアになっているボックス タンパク質 Pax7 です。この記事では、非特定の染色と背景を最小限に抑える骨格筋のセクションに最適化された Pax7 蛍光プロトコルが表示されます。基底膜のタンパク質 (ラミニン) を認識する別の抗体はまた SCs 同じようなプロトコルを識別するのに役立つダブルまたはトリプル Pax7 興味の他の蛋白質のための抗体とラベル付けを実行するも使用ことができますを追加しました。
Introduction
骨格筋は多核巨細胞の筋肉細胞から成るであると呼ばれる、力および収縮運動を生成する筋線維で構成されています。いくつかの顔面の筋肉を除いて、最も骨格筋は、体節1と呼ばれる一時的な萌芽期の構造から派生します。筋芽細胞になる上皮体節から筋前駆細胞が剥離されます。さらに筋芽細胞は多核筋線維を形成する細胞になる融合細胞に分化します。上記のプロセス筋形成と遺伝子発現の制御を一時的に規制されているが特徴です。筋原性前駆体は筋芽細胞表現 MyoD および/または Myf5 と心筋細胞表現する myogenin とミオシンの2,3に対し Pax3 と Pax7 を表現します。筋肉の成長は、既存のファイバー (過形成) により筋核を組み込むことによって、筋線維 (肥大) のサイズ4の増加によってに筋線維が大きくなるプロセスです。筋肉の成長の間に、彼らは区別し、自己更新できる幹細胞プロパティを持つ筋細胞の持続可能なソースです。これらの細胞は筋鞘 (筋線維の細胞膜) と基底膜5の間の物理的な場所に基づく衛星細胞と呼ばれます。SCs は、精力的に幼若期 (生後マウスの最初の 2-3 週間) 筋肉の成長に貢献するが、大人の筋6を安静時の休止状態になります。驚くことに、筋肉への応答で再アクティブ化できます傷つけるし、7損傷した筋肉を修復する新しい筋肉細胞に分化します。
茎セルのプロパティは、基本的な筋生物学、筋疾患8の治療に関連する SCs の研究を行います。その結果、過去数十年で強烈な調査の領域だった。途方もない進歩は、遺伝学および SCs9,10のエピジェネティクスを切り裂くことにしました。分離するとその場でSCs を識別する技術を開発し、11の方法に沿って最適化します。免疫蛍光染色は、Pax7 を含む特定の抗体を使用して SCs を識別できます。しかし、希少性と大人の骨格筋組織の強い自己蛍光と組み合わせて SCs の小型レンダリング視覚化挑戦。ここでは、蛍光染色プロトコル Pax7 のマウスの筋肉組織の最適化し、ゼブラフィッシュ筋12既存法に基づくについて述べる。さらに、SCs が下である基底膜を識別するために異なる蛍光ラベルの付いたラミニン抗体を採用します。このプロトコルは、一貫して Pax7 正 SCs と発達段階とすべてのテストの生理学的な条件の下で筋前駆体の可視化をできます。
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Protocol
このプロトコルではアダルト マウス (2-6 ヶ月)、脛骨前方 (TA) と長趾伸筋 (EDL) の前後肢の筋肉は、SCs の染色蛍光を実行する例として用いられました。マウスおよび筋肉の処理手順をすべて組織解剖は、動物の世話、NIAMS/NIH の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。
1. マウスの後肢から TA/EDL 筋を解剖します。
- NIH の ACUC のガイドラインの下で CO2充填安楽死室でマウスを安楽死させます。必要な場合は、頚部転位を実行します。
- マウスの顔アップを郭清パッド (仰臥位) に置きます。その腹の皮の上に 70% エタノールをスプレーします。マウスの腹皮の中央に水平方向に開く 1 ~ 2 cm をカットし、マウス フィートに向かって開口部を引っ張って、マウスを deskin します。マウスの後肢の片側を公開します。
- 2 つのシャープな鉗子を使用: TA/EDL を付ける、足首の腱を保持するために 1 つを使用し、破るし、TA/EDL を覆う筋膜をせん断する他の 1 つを使用します。筋膜を剥離鉗子の先端の鋭利な TA/EDL 筋の下にあるヒントを実行して、脛骨骨から TA/EDL をデタッチするのに使用します。
- まだそれらを生検鉗子で保持しながら足首の腱をハサミでカットします。足首から膝までの TA/EDL の縦の線に沿ってハサミ鉗子足首側から TA/EDL を持ち上げながら筋肉をトリムします。脛骨から全体の TA/EDL をデタッチする膝側の腱を切った。
2. TA/EDL 筋の低温埋め込み
- 液体窒素容器、例えばお風呂の準備します。、液体窒素デュワー フラスコ。Methylbutane を半分に小さなプラスチック ビーカー (約 20 mL) に注ぐ。それを凍結する液体窒素風呂でビーカーを置きます。数分後、methylbutane が固定されることを確認します。
注: 液体窒素、ドライアイスのバケツによって置き換えることができますが、凍結時間は遅くなります。 - 小さなプラスチック製のシリンジのプランジャーの平らな表面に切り裂かれた TA/EDL を横たわっていた。数滴の最適な切削温度 (O.C.T.) 化合物 (凍結中) TA/EDL を完全にカバーします。
- 液体窒素風呂から methylbutane ビーカーを取るし、温かみのあるオブジェクトで表面を解凍 (e.g。、はさみのハンドル)。すぐにディップ、O.C.T. はプランジャー TA/EDL をスナップ凍結組織を溶かし methylbutane に覆われて。
- 鉗子、プランジャーから埋め込まれた組織を外し、1.5 mL 遠心チューブに入れてください。多くのサンプルを処理しながら保存する液体窒素にチューブを配置します。
注: 埋め込み組織は-80 ° C の長期 (2 年) または-20 ° C で短期 (6 ヶ月) に格納できます。
3. クライオスタット切片
- クライオスタットの試料ホルダーの中心に化合物 O.C.T. のドロップを追加します。O.C.T. 化合物はほぼ固化するまでを待ちます。O.C.T. 化合物、足首側に垂直に埋め込まれた TA/EDL をすばやくスティック ダウンと膝側を。
- クライオスタットに試料ホルダーをマウント、10 μ m 間隔で組織をカット、低温セクションに、フロスト コーティング スライドと収集 1 つのスライド上の 4-8 のセクション。
- 一夜にして、少なくとも 3 時間室温でセクションを乾燥させます。
注: 乾燥一晩以上冷凍庫のセクションは問題ありませんが、それは必然的に増やすこと、蛍光。最高の結果を得るには、乾燥 0.5 h のセクション進みます固定や染色の手順ですぐに。 - スライド ボックスのスライドを収集し、すぐにそれらを使用または-80 ° C または-20 ° C 保存用のスライドを保存します。
4. 蛍光染色試薬の調製
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次のバッファーを準備します。
- 10 x PBS からのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 L を準備します。
- 16% から 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 40 mL を準備 PFA。
- PBST の 2 L を準備: 0.1% トリトン-100 と 1 × PBS。
- 2% ウシ血清アルブミン (BSA) と pbst; b: PBST の 50 mL を準備します。
- 2 %bsa と 5% 通常ヤギ血清 pbst; B-g: PBST の 10 mL を準備します。
- ブロッキング溶液 1 mL を準備します。希釈 AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウスは IgG pbst; b (H + L) (1:10)
- 200 mL の 1x クエン酸バッファーを準備します。
注: ソリューション上記のボリュームは、少なくとも 5 つのスライドに対して十分です。ボリュームは、スライドの数およびスライド容器のサイズに合わせて調整する必要があります。
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抗体は汚れるを準備します。
- 一次抗体 (作業濃度): Pax7 マウスのモノクローナル抗体 (IgG1) を希釈して一次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (1 ~ 5 μ g/mL) + ラミニン ポリクローナルウサギ (0.5-2 μ G/ml) MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) + (0.5 2.5 μ g/mL) pbst; B g
注: MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) はオプションです。 - 二次抗体 (作業濃度): ヤギ抗マウス IgG1 クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 希釈することによって二次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (0.5-2 μ g/mL) + 二次抗体高いクロス吸着ヤギ抗うさぎ IgG (H + L)、Alexa Fluor プラス 555 (0.5-2 μ g/mL) + ヤギ抗マウス IgG2bクロス吸着二次抗体、Alexa Fluor 647 (0.5-2 μ G/ml) pbst; B g
注: Alexa Fluor 647 はオプションです。
- 一次抗体 (作業濃度): Pax7 マウスのモノクローナル抗体 (IgG1) を希釈して一次抗体ミックス 1.2 mL を準備 (1 ~ 5 μ g/mL) + ラミニン ポリクローナルウサギ (0.5-2 μ G/ml) MF20 マウスのモノクローナル抗体 (IgG2b) + (0.5 2.5 μ g/mL) pbst; B g
5. 蛍光染色手順
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水分補給、PFA と低温セクションを修正します。
- スライド ボックスから TA/EDL クライオ セクション スライドのいくつかを削除します。暖かい室温でスライドを保持トレイにスライド。
- 低温 - のすべてのセクション スライドにはが含まれている領域を描画するのに液体ブロッカー ペン (PAP ペン) を使用します。このサークルでは、ソリューションがスライドを離れて流れることをできなくなります。
- 研究室の発煙のフードにトレイを取る。4% の 300-500 μ L を追加 10 分 1 × PBS で PFA を洗って室温でセクションを修正する囲まれた領域内のスライドに PFA スライド コンテナーに少なくとも 3 x 5 分。
注意: PFA は毒性と有害廃棄物;ケアと運営し、有害廃棄物容器に廃棄する必要があります。
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抗原検索
- 別のスライドのコンテナーを 200 mL のクエン酸バッファーに入力します。
- コンテナーにスライドをコピーします。スライドのコンテナーを 10 分間の高圧モードでスライドを調理する圧力鍋に転送します。
- 排水の水で 10 分間転送 PBST (200 mL) を新しいコンテナーにすべてのスライドを持つコンテナーを冷やす、PBST と少なくとも 3 x 5 分用のスライドをすすいでください。
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ブロック
- トレイ スライドの乾燥を避けるために湿った環境を作成するスライドを保持する水に浸したキムワイプを追加します。
- トレイにスライドを戻すし、ブロック各スライドに液 200 μ L を追加します。カバー キャップ付きトレイと 30 分間開発ブロックを聞かせてください。
注: マウスの筋肉組織に高いバック グラウンドを作成するマウス IgG の不明確な結合があるので、Pax7 抗体はマウスのモノクローナル抗体です。マウスの非特異的結合をブロック、AffiniPure Fab フラグメント ヤギ抗マウス IgG (H + L) を使用します。
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一次抗体を適用します。
- スライドのコンテナーに一度 PBST とスライドをすすいでください。その後に移動するスライド染色トレイ。
- 各スライド上の一次抗体ミックス 200 μ L を適用、キャップ、トレイをカバーし、反応室温 1 時間または一晩のための 4 ° C で開発を聞かせてください。
注: 4 ° C で一晩反応は満足のいく結果を与えるが室温で反応の開発に最高の結果を与えます。ミオシン MF20 抗体は、トリプル (Pax7、ラミニン、MF20) ラベルを実行するためにミックスに追加できます。MF20 汚れには、筋線維が区別されます。この手順は、二次抗体 (ヤギ抗体) 次の手順でから潜在的な非特異的結合を抑える pbst; B g ブロック一歩としても使用されます。
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二次抗体を適用します。
- 常温 PBST と一次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。
- 各スライドに二次抗体ミックス 200 μ L を追加し、少なくとも 1 時間室温で開発する反応します。
注: Pax7 + ラミニン ヤギ抗マウス IgG1 アレクサ 488 とヤギ抗うさぎ Alexa 555 を使用します。
Pax7 + ラミニン + MF20 ミックスでヤギ抗マウス IgG2b Alexa 647 を追加します。 - PBST と二次抗体を洗浄、少なくとも 3 x 5 分。
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DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) カウンターの汚れと取り付け
- スライド コンテナーなど、DAPI pbst; 200 mL に 10 μ L の PBST の DAPI (1:20, 000) を希釈します。
- 3 分の DAPI コンテナー内のスライドを染色します。
- 少なくとも 5 x 5 分 PBST の DAPI を洗い流します。
- メディアをマウントをスライドをマウントします。Coverslips にスライドをカバーします。
注意: DAPI は有害です。取り扱いし、廃棄ボトルで破棄する必要があります。
6. 蛍光顕微鏡
注: 上記の報告蛍光汚損のプロトコルと可能にする SCs 可視化ワイド フィールドまたは共焦点蛍光顕微鏡のいずれか。SCs を識別するために最初に困難なことがあります。助けになることがありますいくつかの推奨される手順を示します。
- DAPI チャネルと低倍率の目的を使用して、スライドのセクションを視覚化します。
- 高から低倍率を切り替えます。SCs を観察するには、少なくとも 20 の X 目的が必要) です。
- 488 (FITC) 用デュアル フィルター キューブ/555 SCs を識別するために同時に信号を (ローダミン) Pax7 とラミニンを観察します。この設定は、Pax7 染色の信号はバック グラウンド ノイズに優れたコントラストを持ちます。
- すぐに別の SCs を正しく識別するために DAPI を FITC からチャネル。すべての Sc は、Pax7/DAPI 陽性をする必要があります。
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Representative Results
上記の手順に従って、SCs は、蛍光顕微鏡 (図 1) 成人の安静時筋セクションで正常に視覚化できます。大人の筋組織は強い自己蛍光が繊維の特定のタイプで、明るいアレクサ シリーズ染料がバック グラウンド ノイズを克服できるし、際立っている信号 (図 1 a, B; 矢印)。二光子励起共焦点顕微鏡は、広視野蛍光顕微鏡 (図 1 a) よりも比較的クリーンなイメージ (図 1 b) をキャプチャします。同じプロトコルはまた少年マウス (図 2 a)、マウス胚 (図 2 b) の筋肉組織で十分に働きました、大人の筋組織 (図 3) を負傷しました。少年と胚筋組織では活性の SCs (図 2 aの矢印) 以上 Pax7 正筋前駆体 (図 2 b, 矢印) が比較的大きい核;そのため、成体マウス (図 1と図 2 ) のより若いマウスの SCs を視覚化する比較的簡単です。損傷した筋肉組織でもある以上アクティブ Pax7 正 SCs (図 3)。
図 1: マウスの筋肉ティッシュを休んで大人 Pax7、ラミニンの蛍光像。成体マウスの TA/EDL 筋セクション Pax7 (緑) と (赤) のラミニン抗体、immunostained、カウンター染色 DAPI (青)。(A) 広視野の蛍光顕微鏡画像(B) 共焦点顕微鏡画像スケール バー: 50 μ m 矢: 低蛍光繊維から SCs。高蛍光繊維から矢印: SCs。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 若いマウスの筋肉組織に MF20 やラミニン Pax7 蛍光像。若いマウスの筋肉セクションを TA/EDL MF20 (マゼンタ) 抗体やラミニン (赤) (緑) Pax7 と immunostained、カウンター染色 DAPI (青)。(A) 生後 8 (P8) 筋セクション共焦点顕微鏡下で捕獲します。(B) 日 17.5 (E17.5) 筋セクション全体フィールド蛍光顕微鏡下で捕獲します。スケール バー 50 μ m 矢印を =: SCs の P8 筋 (A);。代表 Pax7 + 筋前駆体 E17.5 筋では、画像 (B) のより多くがある間。これらの 2 つの画像も公開論文13 (s図 3 D) と (s図 1 b) にそれぞれ画像を生成した生のデータから変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 負傷した大人の筋組織に Pax7 とラミニン蛍光抗体法の代表的なイメージです。TA/EDL 筋部負傷した大人の筋組織 (受傷後 7 日) Pax7 (緑) とラミニン (赤) 抗体、immunostained、カウンター染色 DAPI (青)。画像は、共焦点顕微鏡の下で捕獲されました。スケールバー = 50 μ m 矢: SCs のセクションで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルは、ゼブラフィッシュ骨格筋12Pax7/MF20 染色法に基づいていた。ソリューションの使用手順をブロックが同じまたは類似しました。使用抗体は同一です。調整手順は、マウスの筋肉組織と SCs の機能に基づいていた。まず、ラミニン抗体は、視覚化し、SCs の位置を確認するためにミックスに追加されました。それは 488/555; のデュアル フィルター キューブを使用して顕微鏡下で Sc の数をカウントする特に有用だったこれは、騒々しいされる背景から目立つように SC 派生 Pax7 信号を大幅に強化。第二に、使用 Pax7 抗体はマウス抗体なので、マウス igg 抗体の非特異的結合から生じる背景を減らすためにマウスでブロック ステップ (ステップ 5.3) を追加しました。第三に、抗原検索ステップ (ステップ 5.2) は固定ティッシュ PFA Pax7 抗体の汚損のために批判的であった。
(子犬と胚) 若いマウスの筋肉組織で使用された同じプロトコル (図 2)。実際には、同じプロトコルによって成体マウスより子犬で SCs を視覚化する比較的簡単だった。それは大人の筋組織を進める前に経験を得るために子犬に SCs を染色を開始することができます。一次抗体 (ステップ 5.4) なしのネガティブ コントロールもすべての実験で必要です。同様のプロトコルはパラフィン切片に余分なパラフィン処理手順で正常に使用されました。ただし、パラフィン切片は、蛍光のバック グラウンドが高い、比較的弱い Pax7 式を持つ SCs からの信号をマスクを持っている傾向があります。可能であれば、パラフィン切片を使用しないでください。多数の SCs と子犬の筋肉組織 (図 3) で得られた人に同様の結果を与えた損傷した筋肉組織に同じプロトコルを採用しました。
筋肉組織の蛍光は、きれいな蛍光結果14を得ることに主要な障害を表します。蛍光を減らすことができます低温セクションの乾燥時間の短縮と新鮮低温セクションを使用を強く推奨します。15その他のプロトコルと同様に、マウスにブロッキングが背景をさらに減らすために必要です。
ワイド フィールド蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡の目の部分を介して SCs 可視化に有用であった、高品質の画像をキャプチャする共焦点顕微鏡の使用はお勧めします。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
NIAMS 光イメージング セクション顕微鏡と技術的なサポートを提供するために感謝いたします。MF20 Pax7 抗体は、発育の後援の下で開発され、アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ シティで維持発達研究ハイブリドーマの銀行から得られました。この作品は、国立衛生研究所の NIAMS の学内研究プログラムによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
