Summary
تحديد دقيق للخلايا الأقمار الصناعية أمر ضروري لدراسة مهامهم تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. تعرض هذه المقالة بروتوكول لتحديد الخلايا الأقمار الصناعية على أقسام الكبار الهيكل العظمى والعضلات التي تستند إلى الفلورة تلطيخ.
Abstract
الفلورة هو وسيلة فعالة تساعد على التعرف على أنواع الخلايا المختلفة في أقسام الأنسجة. من أجل دراسة السكان الخلايا المطلوب، والأجسام المضادة لعلامات خلية محددة تطبق على أقسام الأنسجة. في الهيكل العظمى والعضلات الكبار، خلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة) هي الخلايا الجذعية التي تسهم في إصلاح العضلات والتجدد. ولذلك، من المهم أن تصور وتتبع السكان خلية الأقمار الصناعية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة. في استراحة الهيكل العظمى والعضلات، يقيم المنبوذة بين الصفيحة القاعدية وغشاء البلازما ميوفيبير. علامة شائعة استخدام لتحديد الطوائف المنبوذة في ميوفيبيرس أو في خلية ثقافة من البروتين مربع إقران Pax7. في هذا المقال، يقدم بروتوكولا الفلورة Pax7 أمثل في أقسام الهيكل العظمى والعضلات تقلل إلى أدنى حد تلطيخ غير محددة وأساسية. كما أضيف جسم آخر يعترف بروتين (لامينين) الصفيحة القاعدية للمساعدة في تحديد بروتوكولات مماثلة المنبوذة. يمكن أيضا استخدامها لأداء ضعفين أو ثلاثة إضعاف وضع العلامات مع Pax7 والأجسام المضادة للبروتينات إضافية للفائدة.
Introduction
الهيكل العظمى والعضلات مكونة من خلايا العضلات مولتينوكليتيد، ويسمى ميوتوبيس، نظمت في ميوفيبيرس، التي تولد القوة والحركات من خلال الانكماش. معظم عضلات الهيكل العظمى، باستثناء بعض عضلات الجمجمة، مستمدة من بنية جنينية مؤقتة تسمى سميط1. ديلاميناتي الخلايا السليفة شذوذ من سميط الظهارية لتصبح ميوبلاستس. ميوبلاستس كذلك تفرق في myocytes الصمامات لتصبح ميوتوبيس لتشكيل ميوفيبيرس متعدد الأنوية. العملية المذكورة أعلاه تسمى ميوجينيسيس وتتميز بالتحكم ينظم وقتيا من التعبير الجيني. السلائف شذوذ التعبير عن Pax3 و Pax7، بينما myoblasts التعبير عن دخولها و/أو Myf5 وميوسيتيس عن2،ميوجينين وميوسينس3. نمو العضلات هو عملية التي ميوفيبيرس تصبح أكبر من خلال دمج ميونوكلي أكثر في الألياف الموجودة (تضخم) وزيادة في الألياف العضلية الحجم (تضخم)4. وخلال نمو العضلات، هناك مصدرا مستداماً لشذوذ الخلايا التي تحتوي على خصائص الخلايا الجذعية حيث يمكن التفريق وتجديد ذاتي. وتسمى هذه الخلايا خلايا الأقمار الصناعية استناداً إلى موقعها الفعلي بين ساركوليما (غشاء الخلية ميوفيبير) و الصفيحة القاعدية5. نشاط الطوائف المنبوذة تسهم في نمو العضلات في مرحلة الأحداث (أول 2-3 أسابيع من الفئران بعد الولادة)، ولكن أصبحت هادئة في استراحة العضلات الكبار6. بشكل ملحوظ، يمكن أن تكون إعادة تنشيط استجابة للعضلات يجرح وتفرق في خلايا العضلات جديدة لإصلاح العضلات التالفة7.
خصائص الخلية الجذعية جعل دراسة الطوائف المنبوذة ذات الصلة للبيولوجيا العضلات الأساسية والعلاج من أمراض العضلات8. نتيجة لذلك كان مجالاً لتحقيقات مكثفة في العقود الماضية. أحرز تقدم هائل في تشريح علم الوراثة والتخلق من الطوائف المنبوذة9،10. التقنيات المستخدمة في عزل وتحديد الطوائف المنبوذة في الموقع ووضعت والأمثل على طول الطريق11. تلوين إيمونوفلوريسسينت يسمح تحديد اللجان الدائمة من خلال استخدام أجسام مضادة محددة، بما في ذلك Pax7. بيد أن ندرة وصغر حجم الطوائف المنبوذة جنبا إلى جنب مع سيارات-الأسفار قوية من أنسجة العضلات الهيكلية الكبار تقدم التصور الصعبة. وهنا يصف لنا بروتوكولا المصبوغة إيمونوفلوريسسينت الأمثل لانسجة العضلات الماوس ل Pax7، واستنادا إلى أسلوب موجود لالزرد العضلات12. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل جسم Laminin المسمى مع فلوروفوري متميزة التعرف على الصفيحة القاعدية التي تقع الطوائف المنبوذة. يسمح هذا البروتوكول استمرار التصور من الطوائف المنبوذة Pax7 الإيجابية والسلائف شذوذ تحت اختبار جميع الظروف الفسيولوجية ومراحل النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذا البروتوكول، يعملن العضلات الأمامية هند أطرافهم من الفئران الكبار (2-6 أشهر)، الظنبوبي الأمامي (تا) وباسطة أصابع طويلة (مؤسسة كهرباء لبنان)، كمثال لأداء الفلورة تلطيخ على هذه الطوائف المنبوذة. جميع الخطوات التعامل مع الفئران والعضلات تشريح الأنسجة عليها "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (ACUC) من نيامس/المعاهد الوطنية للصحة.
1-تشريح العضلات تا/مؤسسة كهرباء لبنان من أطرافهم هند الفأر
- Euthanize الماوس في دائرة القتل رحيم شغلها2 CO في إطار المبادئ التوجيهية أكوك من المعاهد الوطنية للصحة. أداء التفكك عنق الرحم إذا لزم الأمر.
- وضع الماوس الوجه الأعلى على لوح تشريح (ضعيف). رذاذ الإيثانول 70% على جلدها البطن. قطع من 1-2 سم فتح أفقياً في وسط الجلد البطن الماوس، ثم ديسكين الماوس عن طريق سحب الافتتاح نحو القدمين الماوس. يعرض جانب واحد من أطرافهم هند الماوس.
- استخدام الملقط حادة هما: استخدام إحدى عقد الأوتار التي توليها تا/مؤسسة كهرباء لبنان إلى الكاحل، واستخدام واحدة أخرى لكسر والقص لفافة تغطي تا/مؤسسة كهرباء لبنان. متى يتم خلع اللفافة، استخدام تلميح الملقط حادة لفصل تا/مؤسسة كهرباء لبنان من عظم الساق عن طريق تشغيل التلميح تحت العضلات تا/مؤسسة كهرباء لبنان.
- قطع الأوتار الكاحل مع مقص بينما مازالت تحتجز منهم مع الملقط. تقليم العضلات مع المقص على طول الخط الطولي تا/مؤسسة كهرباء لبنان من الكاحل إلى الركبة بينما رفع تا/مؤسسة كهرباء لبنان من جانب الكاحل مع الملقط. قطع الأوتار الركبة-الجانب لفصل أكمله تا/مؤسسة كهرباء لبنان من الساق.
2-تضمين Cryo عضلة تا/مؤسسة كهرباء لبنان
- إعداد حمام النتروجين سائل في حاوية، على سبيل المثال-، النتروجين سائل قارورة ديوار. صب ميثيلبوتاني في كوب بلاستيكي صغير (حوالي 20 مل) إلى نصف كاملة. ثم وضع في الكأس في حمام النتروجين السائل تجميد. بعد بضع دقائق، تحقق من أن يتم تجميد في ميثيلبوتاني.
ملاحظة: يمكن استبدال النيتروجين السائل بدلو من الجليد الجاف، ولكن الوقت التجميد أبطأ. - وتكمن تشريح تا/مؤسسة كهرباء لبنان على سطح مسطح من المكبس حقنه بلاستيكية صغيرة. تغطي تماما تا/مؤسسة كهرباء لبنان مع بضع قطرات من الأمثل خفض درجة الحرارة (O.C.T.) مجمع (المتوسطة التجميد).
- تأخذ كوب ميثيلبوتاني خارج الحمام النتروجين السائل وذوبان السطح مع كائن حارة (مثلاً.، مقبض مقص). بسرعة غطت تراجع O.C.T. تا/مؤسسة كهرباء لبنان على المكبس إلى ميثيلبوتاني ذاب الأداة الإضافية-تجميد الأنسجة.
- فصل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من المكبس مع الملقط، ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. ضع الأنبوبة في النتروجين السائل لتخزينها أثناء التعامل مع مزيد من العينات.
ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة المضمنة في-80 درجة مئوية لمدة طويلة (سنتين) أو-20 درجة مئوية للمدى القصير (6 أشهر).
3-كريوستات تقطيع
- إضافة قطره O.C.T. مجمع في وسط حامل كريوستات عينة. انتظر حتى تقريبا هو توطد المجمع O.C.T.. بسرعة العصا مضمن تا/كهرباء لبنان إلى مجمع O.C.T.، عمودياً مع الكاحل-الجانب الأسفل والجانب الركبة حتى.
- جبل صاحب العينة على كريوستات، وقطع الأنسجة في 10 ميكرون الفاصل، وجمع cryo-المقاطع على الشرائح الصقيع المغلفة مع حول الأقسام 4-8 على شريحة واحدة.
- الجاف للمقاطع في درجة حرارة الغرفة على الأقل 3 (ح) بين عشية وضحاها.
ملاحظة: على الرغم من أن تجفيف المقاطع في الثلاجة ليلة وضحاها، أو لم يعد مقبولاً، حتما سيزيد في أوتوفلوريسسينسي. للحصول على أفضل النتائج، الجافة المقاطع ح 0.5، ثم المتابعة مع التثبيت والخطوات المصبوغة فورا. - جمع الشرائح في مربع شريحة واستخدامها فورا، أو تخزين الشرائح في-80 درجة مئوية أو-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
4-إعداد المواد الكاشفة لتلطيخ الفلورة
-
تجهيز المخازن المؤقتة:
- إعداد ل 2 1 x الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من برنامج تلفزيوني 10 x.
- إعداد 40 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x من 16% منهاج عمل بيجين.
- إعداد 2 لتر ببست: 1 x برنامج تلفزيوني مع تريتون 0.1%-100.
- إعداد 50 مل من "ببست" ببست-باء: مع 2% ألبومين المصل البقري (BSA).
- إعداد 10 مل ببست ببست-ب-ز بمصل الماعز العادي جيش صرب البوسنة و 5% 2%.
- إعداد 1 مل من محلول حجب. مفتش تمييع أفينيبوري القوات المسلحة البوروندية يفتت الماعز المضادة الماوس (H + L) (01:10) في ببست-باء.
- إعداد 200 مل س 1 سترات المخزن المؤقت.
ملاحظة: وحدات تخزين الحلول المذكورة أعلاه كافية للشرائح على الأقل 5. وينبغي تعديل وحدات التخزين طبقاً لعدد الشرائح وحجم الحاويات الشريحة.
-
إعداد البقع جسم:
- الأجسام الأولية (تركيز العامل): تعد 1.2 مل مزيج الأجسام المضادة الأساسي بإضعاف Pax7 الماوس [مونوكلونل] جسم (IgG1) (1-5 ميكروغرام/مل) + Laminin أرنب [بولكلونل] جسم (0.5-2 ميكروغرام/مل) + MF20 الماوس [مونوكلونل] جسم (IgG2ب) (0.5-2.5 ميكروغرام/ مل) في ببست-ب-غ.
ملاحظة: MF20 الماوس [مونوكلونل] جسم (IgG2ب) اختياري. - الأجسام المضادة الثانوية (تركيز العامل): تعد 1.2 مل مزيج الأجسام المضادة الثانوية بتمييع الماعز الماوس المضادة IgG1 تمتز الصليب الثانوية جسم، أليكسا فلور 488 (0.5-2 ميكروغرام/مل) + الماعز الأرنب المضادة مفتش (H + L) عالية عبر تمتز الثانوي الأجسام المضادة، أليكسا فلور بالإضافة إلى 555 (0.5-2 ميكروغرام/مل) + الماعز الماوس المضادة IgG2ب تمتز الصليب الثانوية جسم، 647 فلور أليكسا (0.5-2 ميكروغرام/مل) في ببست-ب-غ.
ملاحظة: أليكسا فلور 647 اختيارية.
- الأجسام الأولية (تركيز العامل): تعد 1.2 مل مزيج الأجسام المضادة الأساسي بإضعاف Pax7 الماوس [مونوكلونل] جسم (IgG1) (1-5 ميكروغرام/مل) + Laminin أرنب [بولكلونل] جسم (0.5-2 ميكروغرام/مل) + MF20 الماوس [مونوكلونل] جسم (IgG2ب) (0.5-2.5 ميكروغرام/ مل) في ببست-ب-غ.
5-الفلورة تلطيخ الخطوات
-
ترطيب وإصلاح cryo-المقاطع مع منهاج عمل بيجين.
- إزالة عدد قليل من الشرائح cryo-قسم تا/مؤسسة كهرباء لبنان من مربع الشريحة. الحارة الشرائح في علبة الشريحة-عقد في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام قلم مانع سائل (PAP القلم) لرسم منطقة أن يتضمن جميع cryo-الأقسام على الشريحة. سيمنع هذا الدائرة الحلول من تتدفق خارج الشريحة.
- تأخذ العلبة بغطاء دخان مختبر. إضافة 300-500 ميليلتر من 4% منهاج عمل بيجين على شريحة داخل المنطقة تحليقا لإصلاح الأجزاء في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة أغسل بها منهاج عمل بيجين مع برنامج تلفزيوني 1 x 3 x 5 دقيقة على الأقل في حاوية شريحة.
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ونفايات الخطرة؛ ينبغي أن تعمل بعناية ويتم التخلص منها في حاوية نفايات الخطرة.
-
استرجاع مستضد
- ملء حاوية شريحة أخرى مع 200 مل من سترات المخزن المؤقت.
- نقل الشرائح إلى الحاوية. نقل الحاوية مع الشرائح إلى طنجرة الضغط لطهي الشرائح في وضع عالي الضغط لمدة 10 دقائق.
- تهدئة الحاوية مع تصريف المياه عن 10 دقيقة نقل كافة الشرائح إلى حاوية جديدة مع ببست (200 مل)، شطف الشرائح مع ببست لمالا يقل عن 3 × 5 دقيقة.
-
حظر
- إضافة كيمويبيس غارقة في المياه إلى علبة عقد الشرائح لخلق بيئة رطبة لتجنب تجفيف الشرائح.
- نقل الشرائح مرة أخرى إلى علبة الورق، وإضافة 200 ميليلتر من عرقلة الحل على كل شريحة. تغطية العلبة مع غطاء والسماح بحظر تطوير لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: جسم Pax7 جسم [مونوكلونل] ماوس، حتى لا يكون هناك ملزمة غير محدد من الماوس مفتش في أنسجة العضلات الماوس أن يخلق خلفية عالية. في أفينيبوري القوات المسلحة البوروندية يفتت الماعز الماوس المضادة "مفتش" (H + L) باستخدام كتل الماوس على الربط غير محدد.
-
تطبيق الأجسام الأولية.
- شطف الشرائح مع ببست مرة في حاوية الشريحة. ثم نقل الشرائح مرة أخرى إلى علبة الورق المصبوغة.
- تطبيق 200 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة، تغطي العلبة مع غطاء وترك رد الفعل وضع في درجة حرارة الغرفة ح 1 أو 4 درجات مئوية لبين عشية وضحاها.
ملاحظة: رد فعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية يعطي نتيجة أفضل، على الرغم من أن تطوير التفاعل في درجة حرارة الغرفة ويعطي نتائج مرضية. يمكن إضافة جسم MF20 الميوسين في مزيج للقيام وصفها الثلاثي (Pax7، لامينين، MF20). البقع MF20 متباينة ألياف العضلات. هذه الخطوة أيضا بمثابة خطوة حظر أخرى مع ببست-ب-ز لتقليل احتمال الربط غير محدد من الثانوي الأجسام المضادة (الأجسام المضادة للماعز) في الخطوة التالية.
-
تطبيق الأجسام المضادة الثانوية.
- أغسل بها الأجسام المضادة الأولية مع ببست في درجة حرارة الغرفة على الأقل 3 x 5 دقيقة.
- إضافة 200 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية لكل شريحة، والسماح برد فعل على وضع في درجة حرارة الغرفة على الأقل ح 1.
ملاحظة: ل Pax7 + لامينين، استخدام الماعز الماوس المضادة IgG1 أليكسا 488 والماعز الأرنب المضادة أليكسا 555.
ل Pax7 + لامينين + MF20، إضافة IgG2 الماوس المضادة الماعزب 647 أليكسا في المزيج. - أغسل بها الأجسام المضادة الثانوية مع ببست على الأقل 3 x 5 دقيقة.
-
DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) مكافحة وصمة عار وتصاعد
- تمييع DAPI (01:20، 000) في ببست في حاوية الشريحة، مثلاً، 10 ميليلتر من DAPI في 200 مل ببست.
- وصمة عار الشرائح في حاوية DAPI لمدة 3 دقائق.
- تغسل DAPI مع ببست لمالا يقل عن 5 × 5 دقيقة.
- تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة. تغطي الشرائح مع كوفيرسليبس.
تنبيه: DAPI السامة والخطرة؛ ينبغي التعامل معها بحذر والتخلص منها في زجاجة النفايات الخطرة.
6. فلوري مجهرية
ملاحظة: بروتوكول المصبوغة إيمونوفلوريسسينت التي ذكرت أعلاه تسمح المنبوذة التصور مع أما واسع المجال الفلورسنت أو [كنفوكل] مجهر. وقد يكون تحديا في البداية لتحديد اللجان الدائمة. وإليك بعض الخطوات الموصى بها التي يمكن أن تساعد.
- استخدام قناة DAPI وأهداف تضخم منخفضة لتصور المقاطع على الشرائح.
- تبديل التكبير من منخفض إلى عالي. لمراقبة الطوائف المنبوذة، على الأقل هدفا X 20 مطلوب).
- استخدام المكعب تصفية مزدوجة ل 488 (فيتك)/555 إشارات (والرودامين) لمراقبة Pax7 ولامينين في نفس الوقت لتحديد اللجان الدائمة. ضمن هذا الإعداد، قد الإشارة لتلطيخ Pax7 على النقيض أفضل من ضجيج الخلفية.
- المناوب بسرعة القناة من فيتك إلى DAPI التعرف بشكل صحيح على الطوائف المنبوذة. يجب أن تكون جميع الطوائف المنبوذة Pax7/DAPI-إيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اتباع الخطوات المذكورة أعلاه، يمكن تصور المنبوذة بنجاح في أقسام العضلات يستريح الكبار تحت مجهر فلوري (الشكل 1). وبالرغم من النسيج العضلي الكبار fluorescence السيارات القوية في نوع معين من الألياف، الأصباغ سلسلة أليكسا مشرق يمكن التغلب على ضجيج الخلفية وتبرز الإشارة (الشكل 1 أ، ب؛ رؤساء السهم). المجهرية [كنفوكل] اثنين-فوتون يلتقط صورة أنظف نسبيا (الشكل 1B) من مجهر فلوري واسع المجال (الشكل 1A). البروتوكول نفسه كما عملت أيضا على أنسجة العضلات الفئران الأحداث (الشكل 2A)، الماوس الأجنة (الشكل 2)، وإصابة أنسجة العضلات الكبار (الشكل 3). في أنسجة العضلات الأحداث والجنينية، هناك أكثر من الطوائف المنبوذة المنشط (الشكل 2A، أسهم) أو Pax7-إيجابية السلائف شذوذ (الشكل 2B، أسهم) وقد نوى أكبر نسبيا؛ ولذلك، من الأسهل نسبيا لتصور المنبوذة فئران أصغر سنا من الفئران الكبار (الشكل 2 مقابل 1 الشكل). في النسيج العضلي المصاب، وهناك أيضا أكثر تنشيط المنبوذة الإيجابية Pax7 (الشكل 3).
رقم 1: صور الفلورة Pax7 ولامينين على الماوس الكبار يستريح أنسجة العضلات. أقسام العضلات تا/مؤسسة كهرباء لبنان من الفئران الكبار إيمونوستينيد مع Pax7 (الأخضر) والأجسام المضادة لامينين (أحمر)، ومكافحة ملطخة DAPI (أزرق). (أ) الصورة التقاطها تحت مجهر فلوري واسع المجال. (ب) صورة أسر تحت مجهر [كنفوكل]. تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرومتر. الأسهم: الطوائف المنبوذة من الألياف مع أوتوفلوريسسينسي منخفضة. رؤوس الأسهم: الطوائف المنبوذة من الألياف مع أوتوفلوريسسينسي عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: صور الفلورة Pax7 ولامينين أو MF20 على أنسجة العضلات من الفئران الشابة. أقسام العضلات تا/مؤسسة كهرباء لبنان من الفئران الشابة إيمونوستينيد مع Pax7 (أخضر) ولامينين (أحمر) أو الأجسام المضادة MF20 (أرجواني)، ومكافحة ملطخة DAPI (أزرق). (أ) بعد الولادة اليوم القبض على 8 من القسم العضلات (P8) تحت مجهر [كنفوكل]. (ب) الجنينية اليوم القبض على 17.5 قسم العضلات (E17.5) تحت مجهر فلوري واسع المجال. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الأسهم: الطوائف المنبوذة في قسم العضلات P8 (A)؛ الممثل Pax7 + شذوذ السلائف في قسم العضلات E17.5، في حين توجد أكثر في الصورة (ب). تم تعديل هذه الصور اثنين من البيانات الخام التي ولدت أيضا الصور في ورقة نشرت13 (s3D الشكل) و (sالشكل 1B)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: صورة تمثيلية من الفلورة Pax7 ولامينين على أنسجة العضلات البالغين المصابين. أقسام العضلات تا/مؤسسة كهرباء لبنان أنسجة العضلات البالغين المصابين (7 أيام بعد الإصابة) إيمونوستينيد مع Pax7 (الأخضر) والأجسام المضادة لامينين (أحمر)، ومكافحة ملطخة DAPI (أزرق). تم القبض على الصورة تحت مجهر [كنفوكل]. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الأسهم: الطوائف المنبوذة في القسم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول أعلاه يستند إلى أسلوب لتلطيخ Pax7/MF20 في الهيكل العظمى والعضلات الزرد12. الحلول التي تستخدم وعرقلة خطوات مماثلة أو مشابهة. الأجسام المضادة التي تستخدم متطابقة. الخطوات المعدلة التي استندت إلى ميزات أنسجة العضلات الماوس والطوائف المنبوذة. أولاً، تم إضافة جسم لامينين في مزيج للمساعدة في وضع تصور وتأكيد موقف الطوائف المنبوذة. كان مفيداً بصفة خاصة لحساب العدد من اللجان الدائمة تحت المجهر عند استخدام المكعب تصفية مزدوجة من 488/555؛ وهذا يعزز إشارة Pax7 المستمدة من اتفاقية استكهولم لتبرز من الخلفية أوتوفلوريسسينت صاخبة. ثانيا، نظراً لجسم Pax7 يستخدم جسم الفأر، أضفنا الماوس على خطوة حظر (الخطوة 5.3) للحد من الخلفية الناتجة عن الربط غير محدد من الماوس مفتش. وثالثاً، كان خطوة استرجاع مستضد (الخطوة 5، 2) الحرجة لتلطيخ بجسم Pax7 في منهاج العمل الثابتة الأنسجة.
تم استخدام البروتوكول نفسه على أنسجة العضلات من الفئران الأصغر سنا (الجراء والأجنة) (الشكل 2). في الواقع، كان من الأسهل نسبيا تمثيل الطوائف المنبوذة في الجراء من الفئران الكبار بالبروتوكول نفسه. قد يكون من المفيد أن ابدأ تلطيخ المنبوذة في الجراء لاكتساب الخبرة قبل الشروع في أنسجة العضلات الكبار. من الضروري أيضا عنصر تحكم سلبية دون الأجسام الأولية (الخطوة 5.4) في كل تجربة. بروتوكول مماثل استخدمت بنجاح في أقسام البارافين مع البارافين إضافية خطوات معالجة. ومع ذلك، مقاطع البارافين تميل إلى أن تكون خلفية أوتوفلوريسسينسي أعلى، مما حجب الإشارات الصادرة عن اللجان الدائمة التي لديها أضعف نسبيا Pax7 التعبير. إذا كان ذلك ممكناً، تجنب استخدام مقاطع البارافين. واستخدمت نفس البروتوكول أيضا على أنسجة العضلات المتضررة التي لديها العديد من الطوائف المنبوذة، وأعطت نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع أنسجة ألجرو العضلات (الشكل 3).
أوتوفلوريسسينسي أنسجة العضلات يمثل العقبة الرئيسية في الحصول على نتائج الفلورة نظيفة14. تقليل وقت تجفيف الأقسام البرد يمكن إنقاص أوتوفلوريسسينسي واستخدام المقاطع البرد الطازجة ينصح بشدة. مماثلة لغيرها من البروتوكولات15، مطلوب الخطوة الماوس على حظر لمواصلة الحد من الخلفية.
بينما فعالة للتصور المنبوذة من خلال قطع العين مجهر فلوري واسع المجال ومجهر [كنفوكل]، يوصي باستخدام مجهر [كنفوكل] لالتقاط صور عالية الجودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر "قسم التصوير نيامس الضوء" لتوفير المجاهر والمساعدة التقنية. وتم الحصول على أجسام MF20 و Pax7 من الضفة هيبريدوما الدراسات التنموية المتقدمة تحت إشراف NICHD ويحتفظ بها قسم "العلوم البيولوجية"، جامعة آيوا، مدينة آيوا. وأيد هذا العمل "برنامج البحوث الداخلية من نيامس" من "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
