Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

زرع صفحة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للحد من تسرب بعد Colectomy الجزئية في نموذج الفئران

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

ويرد في إعداد وزرع الأنسجة الدهنية المستمدة الخلايا الجذعية (ASC) أوراق على القدر الكافي خياطة أناستوموسيس القولون في نموذج الفئران. ويظهر هذا الطلب الرواية أن أوراق ASC يمكن الحد من تسرب ملامسة القولون والمستقيم.

Abstract

أناستوموتيك التسرب مضاعفات كارثية بعد جراحة القولون والمستقيم. على الرغم من أن الأساليب الحالية لمنع التسرب من مستويات مختلفة من الفعالية السريرية، وهم حتى الآن ناقصة الحلول. العلاج بالخلايا الجذعية باستخدام أوراق الرابطة يمكن أن توفر حلاً لهذه المشكلة. وتعتبر الخزفية المرشحين الواعدين، لتعزيز الأنسجة الشفاء بسبب خصائصها التغذوية وإيمونومودولاتوري. هنا، نحن نقدم طرق لإنتاج أوراق ASC عالي الكثافة، التي يتم زرعها على ملامسة القولون في نموذج الفئران للحد من التسرب. وشكلت الخزفية أوراق الخلية في الأطباق الحرارية المراعية الثقافة التي يمكن أن تفصل بسهولة. في اليوم لزرع الأعضاء، أنجز colectomy جزئي مع 5-خياطة مفاغره القولون والمستقيم. تم زرع الحيوانات فورا مع 1 ASC الورقة الواحدة والفئران. أوراق ASC الالتزام تلقائياً بملامسة دون أي الغراء أو خياطة أو أي مادة بيولوجية. المجموعات الحيوانية ضحى 3 و 7 أيام بعد. بالمقارنة مع الحيوانات المزروعة، حدوث تسرب والخراجات أناستوموتيك كان أعلى في مراقبة الحيوانات. في نموذجنا، زرع أوراق ASC بعد ملامسة القولون كانت ناجحة ومقترنة بانخفاض معدل تسرب.

Introduction

هو colectomy الجزئي مع ملامسة الأولية جراحة عادة يؤديها يمكن القيام به لكثير من الأمراض التي تؤثر على القولون مثل سرطان القولون ومرض كرون وانسدادات1،2. اللعين الأكثر تعقيداً بعد ملامسة القولون والمستقيم هو تسرب أناستوموتيك3. على الرغم من أن قد تم تحديد عدة عوامل الخطر المرتبطة بتسرب أناستوموتيك، لا تزال الحلول لمنع تسرب قاسي4،5.

الخلايا اللحمية المستمدة من الأنسجة الدهنية (الخزفية) ترتبط بخصائص مضادة للالتهابات والمستوى الغذائي6،7، مما يجعل هذه الخلايا واعدة المرشحين للعلاجات التجدد8. وأبدى فعالية الخزفية التئام الأنسجة في الأنسجة المختلفة مثل عضلة القلب، والجلد، والمريء9،،من1011،،من1213. مع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير عن استخدام الخزفية التئام الجروح المعوية. زرع الخزفية المحلية إلى أناستوموسيس القولون التجريبية عبر المغلفة بالرابطة بيوسوتوريس أو حقن سيرسال الخزفية أظهرت أما أي تحسن في شفاء14 أو لم يمنع التسرب أناستوموتيك وعلى الرغم من أكثر مواتاة أناستوموتيك شفاء15.

المحلية زرع الخزفية في تعليق أو جنبا إلى جنب مع المواد الحيوية يمكن أن تكون مرتبطة مع الإبقاء على خلية غير كافية أو بتوزيع غير كافية لزرع خلايا11. خلية ورقة التكنولوجيا16،17 يقدم طريقة مبتكرة للرابطة تقديم18،19. ولذلك، اقترح نهجاً جديداً في دراسة سابقة، في الخزفية التي نظمت في خلية ورقة يمكن تطبيقها على ملامسة القولون التجريبية20. أظهرت هذه الدراسة أن الرابطة ورقة زرع النجاح في الحد من تسرب ملامسة القولون والمستقيم بعد colectomy الجزئية في نموذج الفئران. تقارير هذه المقالة إعداد ورقة ASC وتقنية زرع جراحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد للبطن من المانحين البشرية بموافقة "لجنة الأخلاقيات الطبية" (#MEC-2014-092)، والمركز الطبي في جامعة إيراسموس مولودية، روتردام، هولندا. ووافقت "اللجنة الأخلاقية للتجارب الحيوانية"، المركز الطبي في جامعة إيراسموس مولودية، روتردام، "هولندا" (133-14-01) جميع التجارب على الحيوانات.

1-الإنسان الخزفية العزلة والثقافة

  1. إعداد 3 مل من العزلة متوسطة 1 غرام أنسجة الدهنية. مزيج منخفضة الجلوكوز دولبيكو للمتوسطة "تعديل النسر" (جي-دميم) مع 10 غرام/لتر الأبقار ألبومين المصل (BSA) وكولاجيناز 1 غرام/لتر، اكتب 1.
  2. تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد البطني البشرية (n = 8، جميع الإناث، متوسط العمر 40 ± 9 سنوات) إلى قطع صغيرة (0.5 سم) استخدام شفرة جراحية معقمة حجم 10، ملقط الأنسجة أدزون والبنى ومقص ميتزينبوم في "سافيتيكابينيت البيولوجية" العقيمة.
  3. تخزين الأنسجة تشريح في زجاجة تخزين وسائط زجاج عقيمة. تزن المبلغ الإجمالي لتشريح الأنسجة وتبدأ عملية الهضم العزلة استعداد المتوسطة (50 غ أنسجة الدهنية مع 150 مل من العزلة المتوسطة للزجاجة الواحدة). يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا عن طريق تخزين الزجاجة بتشريح الأنسجة الدهنية والمتوسطة العزلة في 4 درجات مئوية في خلاط اسطوانة بين عشية وضحاها. ثم بريوارم الزجاجة في اليوم التالي لدرجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: حصل الأنسجة الدهنية تحت الجلد للبطن كمواد متبقية من المانحين جراحية الثدي إعادة الإعمار مع موافقة إيراسموس مولودية الأخلاقية اللجنة الطبية (# MEC-200) ووفقا "مدونة السلوك": الاستخدام السليم الثانوية " الأنسجة البشرية "(< http://www.federa.org>). لا يستخدم إلا بقايا الأنسجة الدهنية من المانحين الذين عدم التقيد بها للاستخدام الثانوي.
  4. هضم تشريح الأنسجة الدهنية في زجاجة زجاج معقمة تخزين وسائط في شاكر حاضنة في 150 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ح 1.
  5. تقسيم الحل هضمها إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 390 س ز.
  6. تعد الثقافة المتوسطة: ال جي-دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين باء
  7. وعقب الطرد المركزي، إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل من الثقافة المتوسطة (جي-دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين ب). الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 390 س ز وإزالة المادة طافية.
  8. ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من الثقافة المتوسطة (جي-دميم وتستكمل مع 10% FBS و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين ب) وتصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر.
  9. إضافة 50 ميليلتر من محلول 3% حمض الخليك/الميثيلين الأزرق (لتحلل خلايا الدم الحمراء) إلى 50 ميليلتر من تعليق خلية ومزيج الحل واستخدام 10 ميليلتر لحساب عدد الخلايا. أداء خلية العد مع هيموسيتوميتير. ثم لوحة الخلايا في كثافة 40,000 الخلايا/سم2 في الثقافة المتوسطة (جي-دميم وتستكمل مع 30% FBS و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين ب).
  10. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5% CO2 ل 24 ساعة.
  11. بعد الاحتضان، غسل الخلايا مع الفوسفات الحارة (37 درجة مئوية) مخزنة المالحة (PBS) لإزالة الحطام خلية واستبدال وسائط الإعلام مع 10% FBS الثقافة المتوسطة مع طازجة إضافة حمض الأسكوربيك-2-الفوسفات (25 ميكروغرام/مل) والنمو البشري المؤتلف تنتجها الخلايا الليفية عامل 2 (FGF2، 1 نانوغرام/مليلتر).
  12. ثقافة فرعية الخزفية في التقاء 90% استخدام معيار 0.25% التربسين يدتا الحل (3 مل لقارورة T175). بعد 3-5 دقائق، تحييد الحل يدتا التربسين 0.25% مع 10 مل من الثقافة المتوسطة (جي-دميم وتستكمل مع 10% FBS و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين ب).
    ملاحظة: التدفق الخلوي التحليل باستخدام علامات سطح الرابطة المشتركة والتمايز ثلاثي النسب المنجز سابقا فحوصات وكشف عن أن الخزفية معزولة باستخدام هذا البروتوكول عرض ASC الخصائص المحددة21،22.
  13. تغسل الخلايا مع 10 مل من الثقافة المتوسطة (جي-دميم وتستكمل مع 10% FBS و 50 ميكروغرام/مل الجنتاميسين 1.5 ميكروغرام/مل أمبوثيريسين ب) لقارورة T175 والطرد المركزي الخلايا لدقيقة 8 في 250 x غ. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من الثقافة المتوسطة. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
  14. لوحة الخلايا في قوارير الثقافة T175 في كثافة 8,000 الخلايا/سم2.
  15. تجميد الخزفية المتبقية في النتروجين السائل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في المتوسط الثقافة قبل استخدامها مرة أخرى.

2-الرابطة إعداد ورقة

  1. قبل معطف أطباق الثقافة المراعية الحرارية (قطرها 3.5 سم) مع 1 مل FBS، ثم ضع الأطباق في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البذر الخلية.
  2. تريبسينيزي الخزفية استخدام معيار 0.25% التربسين يدتا حل لمدة 3-5 دقيقة (3 مل لقارورة ثقافة T175). إذا كان هناك أي كتل الخلايا بعد تريبسينيزيشن، تصفية الخلايا من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر قبل العد.
  3. تحييد الحل التربسين مع ال جي-دميم وتستكمل مع 10% FBS (10 مل لقارورة T175) والطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 8 دقائق في غ. س 250 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من ال جي-دميم وتستكمل مع 10% FBS.
  4. بعد طلاء أطباق الثقافة الحرارية-استجابة مع FBS، نقل الأطباق من الحاضنة لصفيحة الاحترار عند 37 درجة مئوية وإزالة FBS من الطبق.
  5. الخزفية البذور في 400,000 خلايا/سم2 (في المجموع، 3.52 × 106 خلايا تضعف في 2 مل متوسطة الثقافة الواحدة وطبق).
  6. عناية توزيع الخلايا بشكل متساو قدر الإمكان بلطف يتأرجح الطبق.
  7. الثقافة ASC أوراق عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع شركة 5%2.
    ملاحظة: محاولة التقليل من فتح الباب للحاضنة بعد البذر الخزفية لمنع قطرات درجة الحرارة التي قد تتداخل مع تشكيل ورقة ASC أو التسبب في مفرزة سابقا لأوانه تشكيل الرابطة الأوراق.

3-الجزئية Colectomy وملامسة القولون والمستقيم

  1. الحث والحفاظ على الذكور ويستار (وزنها بين 250-350 غ) مع 1 لتر في الدقيقة ل isoflurane (استنشاق 1.5-5%)/oxygen وحقن البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ عضليا.
  2. وبمجرد الحيوانات تحت التخدير العام، تقييم عمق مخدر باستخدام اختبار منعكس. تطبيق مرهم العين التي تحتوي على فيتامين (أ) للعين لمنع جفاف. عند التخدير يعتبر كافياً لإجراء عملية جراحية، إعداد أسيبتيكالي البطن بحلق الشعر والرش في مجال الجراحة مرتين مع الإيثانول 70%. ثني البطن مع الستائر ورقة عقيمة. استخدام أسلوب العقيم والحفاظ على مجال معقم أثناء العملية الجراحية كلياً.
  3. جعل شق البطن خط الوسط 5 سم بحجم 10 بليد جراحية معقمة وتمديد الشق بالمقص ميتزينبوم. تحديد واكستريورز القولون وحزمة القولون من ما تبقى تجويف البطن مع جاوزيس ترطب المالحة. تحديد الوسط الأيمن،، وتركت الشرايين مغص في مساريق، صراحة تشريح حول كل سفينة استخدام البعوض Halsted وسد كل سفينة الفردية مع عدم الامتصاص مجدول الحرير 4-0.
  4. عزل الجزء colonic بين 1.0 سم أبورالي للأعور و 0.5 سم فوق الشريان المساريقي العلوي والذيلية. قطاع من خلال القولون صحية باستخدام مقص ميتزينبوم. بعد بتر الجزء colonic، يجمع نهايات القولون الدانية والبعيدة عن طريق إدخال اثنين مسحات القطن طويل ترانس شرجيا من خلال النقطتين البعيدة، ومن ثم إلى نهاية القولون الدانية.
  5. استخدام مجهر جراحي، إنشاء ملامسة نهاية إلى نهاية ستورد غير كاف بعكس طبقة واحدة خياطة باستخدام خيوط توقف 5 (غير الامتصاص شعيرات بولي أميد 8-0). وضع خيوط متقطعة من خلال جميع طبقات جدار القولون وموقف اكسترالومينالي عقده.
  6. تقسيم الفئران عشوائياً إلى عنصر التحكم أو مجموعة ورقة ASC.

4-الرابطة ورقة الزرع

  1. تسمح أطباق الثقافة ليبرد لدرجة حرارة الغرفة 40 دقيقة قبل في فيفو الزرع، تيسيرا لمفرزة ورقة ASC.
    ملاحظة: بعد المفرزة، تقليص أوراق الرابطة إلى ما يقرب من 2 سم في القطر. الرابطة ورقة البقاء لا يزال مرتفعا على الأقل 3-6 ح بعد انفصال20.
  2. إزالة الثقافة المتوسطة واستبدال فإنه مع 1 مل مصل مجاناً جي-دميم.
  3. بلطف انتزاع دواليب الورقة ASC بالملقط أتروماتيك والطبق الجانب الورقة الرابطة على رأس الخط أناستوموتيك.
  4. بعناية ورقة تمتد خارج الرابطة حوالي 0.25 سم فوق وتحت الخط أناستوموتيك باستخدام الملقط أتروماتيك والتفاف الورقة حول القولون. رفع القولون حتى التفاف الورقة الرابطة حول الجانب الظهرية.
    ملاحظة: أوراق ASC الالتزام تلقائياً إلى السطر أناستوموتيك، وليس هناك أي حاجة لاستخدام الغراء الأنسجة أو أي مادة بيولوجية أخرى. مجموعة المراقبة لا تتلقى أي علاج إضافي.
  5. إزالة مسحات القطن وتغيير القفازات والصكوك. استبدال النقطتين في البطن. إغلاق البطن-ينيا ألبا مع طبقة واحدة من تشغيل باستخدام خيوط قابلة للامتصاص مزين polyglycolic حمض 5-0. خياطة subcutis والجلد معا في طبقة واحدة لتشغيل باستخدام خيوط قابلة للامتصاص مزين polyglycolic حمض 5-0.

5-بعد العمليات الجراحية التقييم والمتابعة

  1. فورا ترطيب الحيوانات مع حقن المحلول الملحي الدافئ 5 مل تحت الجلد بعد. وضع الحيوانات تحت مصباح حرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ومراقبة العلامات الحيوية حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية من الحيوانات.
    ملاحظة: الحيوانات التي قد خضع لعمليات جراحية لا أعيدت إلى شركة الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما. بعد الانتعاش، والسماح بحرية الوصول إلى المياه وتشو الفئران العادية. لتخفيف الألم بعد الجراحة، إدارة البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ كل ح 6-8 تحت الجلد لمدة 3 أيام. المضادات الحيوية لا تدار في أي وقت في هذه الدراسة.
  2. الحصول على تقييمات السريرية اليومية من العافية والوزن. في حالة درجة عافية منخفضة جداً أو فقدان الوزن الشديد، ينبغي أن euthanized الحيوانات التي اكسسانجوينيشن عبر ثقب القلب في حين لا يزال تحت التخدير.
  3. في يوم 7 3 أو يوم من الجراحة، تخدير الفئران مرة أخرى مع 1 لتر في الدقيقة ل isoflurane (استنشاق 1.5-5%)/oxygen دون البوبرينورفين، والقيام بإعادة فتح البطن مع شق على شكل U. فحص البطن لعلامات التهاب الصفاق، تضيق، والتصاقات ليفية، ووجود الخراجات. نقاط من شدة الالتصاقات وخراج في البطن وفي منطقة أناستوموتيك.
  4. تحديد ضغط انفجار أناستوموتيك عن طريق إينسوفليشن الهواء في شريحة مغلقة من القولون بما في ذلك ملامسة. تسجيل ضغط الهواء ومكان تمزق عند تسرب الهواء الأولى كانفجار الضغط.
  5. إزالة القولون من كل الحيوانات التضحية وإصلاح الجزء قطع القولون-تتضمن ملامسة القولون-مع فورمالدهايد 4% معزولة، عقب البارافين التضمين وقطع القولون أقسام 4 ميكرومتر سميكة.
  6. Euthanize الحيوانات بينما تحت التخدير مباشرة بعد جمع الجزء المتعلق بملامسة من اكسسانجوينيشن عن طريق ثقب القلب. تأكيد وفاة الحيوان مع عدم وجود ضربات قلب وحركة التنفس.
  7. أداء ستينينجس histochemical مثل الهيماتوكسيلين & ويوزين وبيكرو سيريوس الأحمر، وستينينجس المناعي مع أضداد الميتوكوندريا البشرية، الفئران خلايا بطانية (مكافحة-CD34) والخلايا في الجهاز المناعي (CD3 +، CD163 +).
  8. رقمنة الشرائح للتحليل المحوسبة ومقارنة المجموعات الحيوانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مخطط تدفق هذه الدراسة التي تصور الرابطة ورقة الثقافة وإجراء استئصال القولون وملامسة يرد في الشكل 1. ويبين الشكل 2 ASC ورقة مورفولوجيا المجهرية والعيانية مظهر الورقة ASC أثناء وبعد المفرزة. ويبين الشكل 3 الخطوات المختلفة لمفرزة ورقة ASC وزرع الأعضاء. ويبين الشكل 4 وجود ورقة ASC في خط أناستوموتيك والوقاية من التسرب 3 أيام بعد.

متابعة الفترة المسموح بها لتقييم ملامسة القولون والمستقيم. تقييمات مختلفة تظهر في الأرقام والجدول. مقارنة لمراقبة الحيوانات، أظهرت المجموعات الحيوانية المزروعة أقل ديهيسسينسي أناستوموتيك المتكرر والتسرب في يوم ما بعد الجراحة 3 وأقل تشكيل الخراج متكررة في اليوم بعد العملية الجراحية 7. بالمقارنة مع مراقبة الحيوانات، زرع الحيوانات لم تتطور التصاقات كبيرة أو تشكيل تضيق. ويبين الجدول 1 النتائج العيانية في نهاية متابعة فترات في زرع وعدم زرع الحيوانات.

Figure 1
رقم 1: دراسة الرسم البياني- A) الخزفية كانت معزولة وتوسعت قبل البذر على أطباق الثقافة الحرارية-استجابة. تبذر في كثافة 400,000 خلايا/سم2 الخزفية ومثقف عن 48 ساعة قبل زرع الأعضاء. في اليوم لزرع الأعضاء، تم فصل ورقة ASC بالسماح للطبق الثقافة الحرارية المراعية ليبرد لدرجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة ب) مخطط لإجراء العمليات الجراحية؛ بعد ربط لتزويد السفن يتم كوليكتومي الجزئية وملامسة القولون والمستقيم. ورقة الرابطة كانت ملفوفة حول ملامسة في الفريق ورقة الرابطة؛ أ) الأعور، ب) المحطة الطرفية الدقاق، ج) فتحه الشرج. وكان تكييف التخطيطي نظرة عامة على العملية الجراحية جزئيا بإذن من وو Z. et al. 24 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: ورقة ASC قبل وبعد انفصال. A) ورقة الرابطة في أطباق الثقافة الحرارية-استجابة بعد 48 ساعة من الثقافة 40 x التكبير. تم الحصول على أوراق ASC باستزراع الخزفية على أطباق الثقافة التجارية المراعية الحرارية. بك) ورقة الرابطة خلال (ب) وبعد انفصال (ج). عندما سمح أطباق الثقافة الحرارية المراعية ليبرد لدرجة حرارة الغرفة، ورقة ASC عفوية بعيدة عن سطح الطبق كورقة ASC سليمة واحدة. ومن الضروري عدم المعالجة الانزيمية. تقليل حجم الورقة ASC بعد المفرزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: زرع ورقة ASC. A) تصوير لاتجاه الورقة ASC في الطبق الثقافة الحرارية-استجابة. 26 ب) الورقة "اتجاه تصاعدي" بعد زرع الأعضاء. وضعت إلى جانب طبق الورقة ASC فوق السطح سيرسال خط أناستوموتيك (يشار إلى خط أناستوموتيك مع الصلبان). ج) داخل منطوق آراء الخطوات المختلفة لزرع الأعضاء. واستخدمت اثنين أتروماتيك الملقط لرفع الورقة ASC والتفاف حول خط أناستوموتيك. تشير الأسهم البيضاء موقع ورقة ASC. صور زرع تم تكييف جزئيا بإذن من سوكو، ص، وآخرون. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التقييم العيانية وغذائها ملامسة القولون. A-B) مقارنة بمجموعة المراقبة، أظهرت المراقبة العيانية خفض التسرب والخراج تشكيل في اليوم بعد العمليات الجراحية 3 (أ) و 7 (ب)، على التوالي. تشير الأسهم البيضاء في منطقة أناستوموتيك والسهام السوداء نقطة في زرع ASC أوراق. المقاطع العرضية ج) ممثل موقع مفاغره القولون بزرع الحيوانات الملون مع ح & هاء بنية ورقة يمكن تحديد موقع ملامسة يصل إلى 7 أيام بعد. الصور تم تكييف جزئيا بإذن من سوكو، ص، وآخرون. 20 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

بعد العمليات الجراحية يوم 3 بعد العمليات الجراحية يوم 7
عنصر التحكم (%) ورقة ASC (%) فالقيمه عنصر التحكم (%) ورقة ASC (%) فالقيمه
التهاب الصفاق 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
اضطراب أناستوموتيك 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0.002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
تضيق 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
خراج في ملامسة 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0.04
الالتصاق في ملامسة 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
خراج في مكان آخر 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
الالتصاق في مكان آخر 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

الجدول 1: النتائج العيانية بعد العمليات الجراحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أناستوموتيك التسرب هو أخطر حادث المعاكسة بعد استئصال القولون مع ملامسة الأولية. تزال تفتقر إلى الأساليب المثلى للحيلولة دون انقطاع أناستوموتيك والتسرب. وأجرى التطبيق المحلي لمجموعة واسعة من المواد الحيوية، مع نتائج متفاوتة25،،من2627. خلية العلاج يهدف إلى تسهيل إصلاح الأنسجة باستبدال الأنسجة أو الحث على شفاء المحلية عن طريق إفراز باراكريني.

في هذا النموذج الفئران، ASC ورقة الزرع كان ناجحاً من الناحية الفنية. تقييمات سريرية ونسيجية أثبتت فعالية الورقة ASC في تقليل التسرب بعد استئصال القولون مع ملامسة الأولية.

زرع ورقة ASC إلى أناستوموسيس المستقيم نهجاً جديداً في جراحة القولون والمستقيم. في هذه الدراسة، للمرة الأولى، تم زرع ورقة ASC عالي الكثافة. كان اختيار الخزفية تسليمها كورقة خلية استناداً إلى المزايا سبق الإبلاغ عنها خلية ورقة التكنولوجيا28،29 أكثر تقنيات زرع الخلايا التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، كان اختيار الخزفية استناداً إلى دراسات متعددة أن يثبت قدراتهم للالتهابات والمستوى الغذائي، لا سيما في عضلة القلب والجلد شفاء11،12،،من1932 .

يمكن أن يكون إعداد ورقة ASC ومفرزة تحديا. في بعض الجهات المانحة ASC، أوراق ASC منفصلة قبل الأوان من طبق الثقافة ومطوية، يحول دون استخدامها. وفي هذه الدراسة، لا حددت السبب الدقيق لهذه المشكلة في هذه الجهات المانحة محددة. نظراً لأخطار عالية استهلاك الثقافة المتوسطة في هذه الجهات المانحة، كان من المفترض أن الاختلافات الفردية في معدل الانتشار قد تلعب دوراً هاما. وساعدت طلاء المصل في التصاق الخلية إلى السطح. جنبا إلى جنب مع التوزيع الدقيق للخلايا في الثقافة وقع طبق والتقليل إلى أدنى حد فتح الباب حاضنة بعد البذر الخزفية (منع قطرات درجة الحرارة) أقل قابلة للطي الأوراق ASC. وبهذه الطريقة، تم بنجاح زرع أوراق الرابطة من جميع الجهات المانحة تؤكد جدوى هذا الأسلوب.

في اليوم لزرع الأعضاء، فصل معظم ASC أوراق تلقائياً بعد السماح للطبق الثقافة الحرارية المراعية ليبرد لدرجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، لا فصل عدد محدود من الأوراق تماما. تهز لطيف صحن الثقافة أو التنظيف الناعمة على الحافة في نهاية المطاف باستخدام ماصة ساعد في مفارز كاملة.

لنجاح زرع ورقة ASC إلى أناستوموسيس القولون والمستقيم، عدة خطوات حاسمة تحتاج إلى معالجتها. يجب إزالة الدم الأول، والإفراط في موقع ملامسة لضمان الاتصال بين الورقة ASC والسطح سيرسال. ثانيا، ينبغي أن توضع إلى جانب طبق الورقة الرابطة على سطح سيرسال ملامسة. هو افترض الإبقاء على وظيفة أوراق الخلية بعد الحصاد بسبب الحفاظ على الخلية البروتينات السطحية والبروتينات مفرق خلية إلى خلية. بالإضافة إلى ذلك، قد يسرت قدرة أوراق الرابطة التمسك بصورة عفوية سيرسال السطح في فترة زمنية قصيرة بوجود أودعت إدارة المحتوى في المؤسسة الذي يتم إنتاجه من خلال الثقافة في المختبر19،،من2021. ثالثا، ينبغي أن يكون حجم الورقة ASC وقطر القولون قابلة للمقارنة للسماح بتغطية كاملة للموقع ملامسة. عند الأسطح الكبيرة تحتاج إلى تغطية، يمكن النظر في استخدام عدة أوراق.

وهناك بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول لإعداد ورقة ASC وزرع الأعضاء. عند استخدام أطباق الثقافة الحرارية المراعية لإعداد الورقة ASC، ينبغي دقة المحافظة درجة الحرارة في 37 درجة مئوية خلال العملية بأكملها لمنع انفصال سابق لأوانه. بعد زرع الأعضاء، أن معدل البقاء على قيد الحياة ورقة ASC غير معروف. على الرغم من أن التجارب السابقة بينت أن الخزفية قابلة للتطبيق في 3 أيام بعد، تضاءل نشاط الميتوكوندريا من هذه الخزفية في 7 أيام بعد17. خلية بقاء معدل والجرعة تأثير الزرع مهمان من الأسئلة التي تحتاج إلى أن تعالج في المستقبل دراسات. التحيز المراقب لا يمكن استبعاده تماما، حيث يمكن تحديد الورقة ASC الميكروسكوب ومجهريا في التقييمات اللاحقة للعمليات الجراحية. على الرغم من أن زرع الحيوانات لم تظهر بعد العملية الجراحية أكثر يمكن أن تعوق تشكيل التصاق مقارنة بالسيطرة على الحيوانات17، تقييم ملامسة القولون والمستقيم بوجود هذه الالتصاقات داخل البطن.

ميزة هذا الأسلوب تطبيق أنها بسيطة وسهلة لتنفيذ. مع كمية صغيرة فقط من الممارسة واستخدام الملقط أتروماتيك العالمي، ينبغي أن يتمكن الجراحين المعوية من التفاف الورقة ASC حولها ملامسة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتأثر وقت الجراحة إلى حد كبير منذ أوراق ASC التقيد فورا بأنسجة المضيف. وعلاوة على ذلك، عند استخدام أوراق ASC، لا مادة بيولوجية الاصطناعية لا تزال في الجسم تقليل مخاطر رد فعل جسم غريب.

زرع الخزفية نظمت في خلايا أوراق أظهرت قدرتها على الحد من تسرب ملامسة القولون والمستقيم. وفي ضوء هذه النتائج واعدة، ينبغي إجراء دراسات المستقبل لتقييم الآثار الطويلة الأجل للعلاج وأسباب تتعلق بالسلامة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد وصف عدة طرق تعديل الآثار العلاجية لأوراق ASC مثل حمل overexpression من الأوعية الدموية غشائي عامل النمو30. هذه الطرق يمكن مواصلة تعزيز إصلاح النسيج باستخدام أوراق الرابطة، وينبغي النظر في المستقبل في الدراسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن أجرى هذا البحث نظراً لعدم وجود أي علاقة تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.

Acknowledgments

الكتاب نشعر بالامتنان للأستاذ الدكتور هوفيوس S.E.R.، والدكتور M.A.M. ماريو وجميع الجراحين في قسم الجراحة التجميلية لجمع الأنسجة الدهنية تحت الجلد. ص سوكو معتمد من قبل منحة من برنامج "الزمالة هولندا" (البرامج الوطنية للغابات-12/435)، أثناء إجراء الدراسة. Y.M. باستيانسين-جينيسكينس معتمد من المنح المقدمة من "مؤسسة التهاب المفاصل الهولندية" (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

Tags

الطب، 138 قضية، كوليكتومي، خلية ورقة، الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية، زرع الخلايا، خلية العلاج، ومنع التسرب، وملامسة في فيفو
زرع صفحة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للحد من تسرب بعد Colectomy الجزئية في نموذج الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter