Summary
준비와 쥐 모델에서 부족 하 게 봉합 대 장 anastomoses에 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC) 시트의 이식 제공 됩니다. 이 새로운 응용 프로그램은 ASC 시트 대 장 문 합 누출을 줄일 수 있습니다 보여줍니다.
Abstract
Anastomotic 누설 대 장 수술 후 비참 한 합병증은 이다. 누출 방지에 대 한 현재 메서드는 임상 효능의 다른 수준, 그들은 지금 불완전 한 솔루션까지 있습니다. 줄기 세포 치료 ASC 시트를 사용 하 여이 문제에 대 한 솔루션을 제공할 수 있습니다. ASCs 조직 그들의 영양 및 immunomodulatory 속성 때문에 치유를 승진 시키기를 위한 유망 후보자 이라고 여겨진다. 여기, 우리는 누설을 줄이기 위해 쥐 모델에서 대 장 문 합에 이식 하는 고밀도 ASC 시트를 생산 하는 방법을 제공 합니다. ASCs 셀 시트 쉽게 분리 될 수 있는 온도 응답 문화 요리에 형성. 이식의 날, 5 봉합 대 장 문 합으로 부분 colectomy 수행 되었다. 동물 쥐 당 1 ASC 시트와 함께 즉시 이식 했다. ASC 시트 없이 어떤 접착제, 봉합 사, 또는 어떤 소재 문 합을 자발적으로 준수 됩니다. 동물 그룹 3 ~ 7 일을 희생 했다 postoperatively. 이식된 동물에 비해, anastomotic 농 양 및 누설의 부각 더 높았다 제어 동물. 우리의 모델에서 대 장 문 합 후 ASC 시트 이식 성공적이 고 낮은 누설 율으로 연결 했다.
Introduction
기본 문 합으로 부분 colectomy는 대 장 암, 크 론 병, 계실 염1,2등 콜론에 영향을 미치는 많은 질병에 대 한 할 수 있는 일반적으로 수행된 수술입니다. 가장 후 대 장 문 합은 anastomotic 누설3합병증을 겁 나. 비록 anastomotic 누수와 관련 된 몇 가지 위험 요소 확인 되었습니다, 누설을 방지 하기 위한 솔루션 알4,5남아 있습니다.
지방 조직 유래 stromal 세포 (ASCs) 염증 및 영양 특성6,7, 이러한 세포 재생 요법8에 대 한 후보를 유망 하 게 연결 되어 있습니다. 조직 치유를 촉진 하는 ASCs의 효과 심장 근육, 피부, 식도9,,1011,,1213등 다양 한 조직에 표시 했다. 그러나, 장 치유를 촉진 하는 ASCs 사용 하 여에 몇 가지 보고 있다. ASC 코팅 biosutures 통해 실험 대 장 anastomoses에 ASCs의 지방 이식 또는 ASCs serosal 주사14 치유 하거나 개선 보였다 anastomotic 더 유리한도 불구 하 고 anastomotic 누설을 방지 하지 않았다 치유15.
정지에서 ASCs의 지방 이식 함께 또는 생체 부족 세포 보존 또는 이식된 세포11의 부적 절 한 배포에 연관 될 수도 있습니다. 셀 시트 기술16,17 ASC 배달18,19의 혁신적인 방법을 제공합니다. 따라서, 이전 연구에 새로운 접근 방식은 어느 ASCs 셀에 시트 실험 대 장 문 합20에 적용 수 있는 제안 했다. 이 연구는 ASC 시트 이식 쥐 모델에서 부분 colectomy 후 대 장 문 합 누출을 감소 시키기에서 성공적 증명. 이 기사 보고 ASC 시트 준비 및 외과 이식 기술 합니다.
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Protocol
복 부 피하 지방 조직 승인 의료 윤리 위원회 (#MEC-2014-092), 에라스무스 엠씨 대학 의료 센터, 로테르 담, 네덜란드의 인간 기증자 로부터 얻은 것입니다. 모든 동물 실험 윤리 위원회의 동물 실험, 에라스무스 엠씨 대학 의료 센터, 로테르 담, 네덜란드 (133-14-01)에 의해 승인 되었다.
1. 인간의 ASCs 격리와 문화
- 1g의 지방 조직에 대 한 절연 매체의 3 mL를 준비 합니다. 혼합 낮은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) 10 g/L 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 콜라 1 g/L 입력 1.
- 인간의 피하 복 부 지방 조직 해 부 (n = 8, 모든 여성, 평균 나이 40 ± 9 살) 살 균 생물 SafetyCabinet의 메 마른 외과 블레이드 크기 10, Adson 브라운 조직 집게와 Metzenbaum가 위를 사용 하 여 작은 조각 (0.5 cm).
- 메 마른 유리 미디어 저장 병에 해 부 조직을 저장 합니다. 해 부 조직 총 양의 무게 고 준비 절연 매체 병 당 절연 매체의 150 mL와 함께 지방 조직 (50 g)와 소화를 시작 합니다. 프로토콜 롤러 믹서에 하룻밤 해 부 지방 조직 및 4 ° C에서 절연 매체 병을 저장 하 여 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 그런 다음 다음 단계를 계속 하기 전에 15 분 동안 실내 온도 25 ° C에 다음 날 병 prewarm.
참고: 복 부 피하 지방 조직 기증자 승인 에라스무스 MC 의료 윤리 위원회 (# 멕-200)의 규범에 따라 유 방 재건 수술에서 남은 자료로 얻어 졌다: "적절 한 보조 사용 인간의 조직"의 (< http://www.federa.org>). 남은 지방 조직만 기증자 않았다 하지 탈퇴 보조 사용에서 사용 되었다. - 다이제스트 150 rpm에서 1 h 동안 37 ° C 배양 기 통에에서 멸 균 유리 미디어 저장 병에 해 부 지방 조직.
- 50 mL 튜브로 소화 솔루션을 분할 하 고 튜브 390 x g에서 10 분 원심.
- 문화 매체를 준비: LG DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B. 보충
- 원심 분리, 다음은 상쾌한을 제거 하 고 배양 (LG-DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충) 20 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 390 x g에 5 분 동안 다시 세포를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 문화 매체 (LG-DMEM 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충)의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 세포 현 탁 액 100 µ m 필터를 통해 필터링.
- 세포 현 탁 액의 50 µ L을 (적혈구 세포)에 대 한 3% 초 산/메 틸 렌 블루 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 솔루션을 섞어 10 µ L를 사용 하 여 셀을 계산. 세포는 hemocytometer와 계산을 수행 합니다. 다음 문화 매체 (LG-DMEM 30 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보완)에 40, 000 셀/c m2 의 조밀도에 세포 격판덮개.
- 24 시간 5% CO2 와 다습 한 대기권에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 갓 부 화, 워시와 따뜻한 (37 ℃) 성 세포와 식 염 수 (PBS) 세포 파편을 제거 하 고 10 %FBS 문화 매체와 미디어를 대체 버퍼링을 다음 추가 ascorbic 산-2-인산 염 (25 µ g/mL)와 인간의 재조합 섬유 아 세포 성장 요인 2 (FGF2, 1 ng/mL).
- Subculture ASCs 표준 0.25% trypsin EDTA 솔루션 (3 mL T175 플라스 크에 대 한)를 사용 하 여 90% 합류에. 3-5 분 후 중화 문화 매체 (LG-DMEM 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B 보충)의 10 mL와 0.25% trypsin EDTA 솔루션.
참고: 일반적인 ASC 표면 마커 및 트라이-혈통 차별화 분석 수행 이전 그리고 발표 ASCs이 프로토콜 표시 ASC 특정 특성21,22를 사용 하 여 격리를 사용 하 여 cytometry 분석 흐름. - T175 플라스 크에 대 한 문화 매체 (LG DMEM 보충 10 %FBS, 50 µ g/mL gentamicin 및 1.5 µ g/mL ampothericin B)의 10 mL로 세포 세척 하 고 원심 250 x g. 제거에서 8 분에 대 한 셀은 상쾌한 문화 매체의 1 mL에 셀 resuspend. hemocytometer 셀을 계산 합니다.
- 8, 000 셀/c m2의 조밀도에 T175 문화 플라스 크에 세포 격판덮개
- 더 사용 하기 전에 문화 매체에서 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 액체 질소에 나머지 ASCs를 고정.
2. ASC 시트 준비
- FBS의 1 mL와 함께 온도 응답 문화 요리 (3.5 c m 직경)를 미리 coat 다음 셀 뿌리기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 요리를 놓습니다.
- 3-5 분 (3 mL T175 문화 플라스 크에 대 한) 표준 0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 ASCs trypsinize Trypsinization 후 어떤 셀 수 풀 경우 계산 전에 100 µ m 필터를 통해 셀을 필터링 합니다.
- 트립 신 솔루션을 무력화 LG DMEM 10% 보충 FBS (T175 플라스 크에 10 mL) 250 x g. 8 분 대 세포 현 탁 액 분리기는 상쾌한 제거와 LG DMEM 10% 보충의 1 mL에 셀 resuspend FBS.
- FBS와 온도 응답 문화 요리 코팅, 후 37 ° C에서 지구 온난화 접시에 인큐베이터에서 요리를 이동 하 고 접시에서 FBS를 제거 합니다.
- 씨앗 ASCs 400000 셀/cm2 (총, 3.52 × 106 세포 배양 접시 당 2 mL에 희석).
- 신중 하 게 가능한 균등 하 게 요리를 부드럽게 스윙 하 여 세포를 배포 합니다.
- 5% CO2와 다습 한 대기권에서 37 ° C에서 48 h에 대 한 문화 ASC 시트.
참고: 문을 여는 인큐베이터의 온도 강하를 ASC 시트 형성을 방해할 수 있습니다 또는 구성 된 ASC 시트의 조기 분리를 방지 하기 위해 ASCs 시드 후 최소화 하십시오.
3. 부분 Colectomy 및 대 장 문 합
- 유발 하 고 남성 Wistar 쥐 (250-350 g 사이 무게) 1 L/min isoflurane의 유지 (1.5-5%)/oxygen 흡입 buprenorphine 0.05 mg/kg을 피하 주사 하 고.
- 일단 동물 일반 마 취, 마 취 깊이 반사 테스트를 사용 하 여 평가 합니다. 건조를 방지 하기 위해 눈에 비타민 A 포함 눈 연 고를 적용 합니다. 마 취는 수술에 대 한 충분 한 것으로 간주, aseptically 머리를 면도 하 고 외과 영역 70% 에탄올으로 두 번 살포 하 여 복 부를 준비 합니다. 살 균 종이 커튼으로 복 부 드러 워 진. 무 균 기술을 사용 하 고 전체 수술 중 살 균 분야를 유지 합니다.
- 메 마른 외과 블레이드 크기 10으로 5 cm의 중간 선 복 부 절 개를 만들고 Metzenbaum가 위 절 개를 확장. 확인 하 고 콜론 exteriorize 염 분 moistened gauzes와 복 부 구멍의 나머지에서 결 팩. 오른쪽, 중간, 식별 하 고 퉁 명 스럽게 Halsted 모기를 사용 하 여 각 선박 주위 해 부는 mesentery에서 산 통 동맥을 왼쪽, 고 흡수 비 꼰 실크 4/0 각 개별 선박 선.
- 맹 하 aborally 1.0 cm 사이 꼬리 mesenteric 동맥 위에 0.5 cm 저 승 세그먼트를 격리 합니다. 건강 한 콜론 Metzenbaum가 위를 사용 하 여 통해 transect. 저 승 세그먼트의 절제술, 후 두 긴 면봉, 원심 결 통해 트랜스 anally 그리고 근 위 결 장 끝에 도입 하 여 콜론의 인접 하 고 원심 끝을 함께 가져.
- 수술 현미경을 사용 하 여, 한 레이어 반전 5 중단된 봉합 (비 흡수 monofilament 폴 리아 미드 8/0)를 사용 하 여 봉합에 의해 부족 하 게 sutured 엔드-투-엔드 문 합을 만듭니다. 결 장 벽의 모든 레이어를 통해 중단된 봉합 놓고 노트 extraluminally 위치.
- 컨트롤 또는 ASC 시트 그룹으로 무작위로 쥐를 나눕니다.
4. ASC 시트 이식
- 40 분 비보에 이식, ASC 시트 분리를 촉진 하기 전에 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 문화 요리를 하실 수 있습니다.
참고:는 초연 후 약 2 cm 직경에서 축소 ASC 시트. ASC 시트 생존 분리20후 최소한 3-6 h에 대 한 높은 남아 있습니다. - 문화 매체와 혈 청 1 mL와 함께 그것은 lg 전자 DMEM 무료 교체를 제거 합니다.
- 부드럽게 atraumatic 집게와 ASC 시트의 테두리를 잡아 고 anastomotic 라인 위에 ASC 시트의 요리 측을 두십시오.
- 신중 하 게 ASC에 밖으로 스트레칭 약 0.25 cm 위와 아래 anastomotic 라인 atraumatic 집게 랩 콜론 주위 시트를 사용 하 여 시트. 랩 등 측면 주위 ASC 시트까지 콜론을 들어올립니다.
참고: ASC 시트는 anastomotic 라인을 자발적으로 준수, 조직 접착제를 사용 하는 필요 또는 다른 소재. 제어 그룹 추가 치료에 영향을 받지 않습니다. - 목화 면봉을 제거 하 고 장갑과 악기를 변경. 복 부에 콜론을 바꿉니다. 흡수 되기 쉬운 봉합을 사용 하 여 실행 한 레이어와 닫기 복 부-교육 알바 꼰 polyglycolic 산 5/0. 봉합은 subcutis와 함께 흡수 봉합을 사용 하 여 실행의 한 계층에서 커티스 꼰 polyglycolic 산 5/0.
5. 수술 후 평가 및 후속
- 즉시 5 mL 따뜻한 식 염 수의 피하 주사로 동물 postoperatively rehydrate. 체온을 유지 하 고 동물을 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 생체 신호를 모니터링 하는 열 램프 아래에서 동물을 놓습니다.
참고: 수술을 받은 했다 동물 했다 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 되지 않습니다. 복구, 후 물에 자유 접근 및 일반 쥐 차 수 있도록. 수술 후 통증 완화를 위해 관리 0.05 mg/kg buprenorphine 피하 모든 6-8 h 3 일 동안. 이 연구에서 언제 든 지 아무 항생제 관리 되었다. - 웰빙 무게의 일일 임상 평가 얻을. 매우 낮은 웰빙 점수 또는 심한 체중 감소, 동물 마 취 아래 심장 찔린 통해 exsanguination에 의해 안락사 해야 한다.
- 수술 후 당일 또는 하루 3 7 anesthetize 1 L/min isoflurane의와 다시 쥐 (1.5-5%)/oxygen 흡입 buprenorphine, 없이 U 자 모양의 절 개를 다시 개복 술을 수행 하 고. 복 부 복 막 염만, 섬유 유착, 그리고 농의 존재의 표시를 확인 하십시오. 유착의 심각도 점수와 복 부와 anastomotic 지역에서 농 양.
- 문 합을 포함 하 여 콜론의 닫힌된 세그먼트에 공기 insufflation에 의해 anastomotic 파열 압력을 결정 합니다. 첫 번째 공기 파열 압력으로 누설 하는 때 공기 압력과 파열의 장소를 기록 합니다.
- 각 희생된 동물에서 콜론을 제거 하 고-장 문 합을 포함 하는-콜론의 컷된 세그먼트 버퍼링 4% 포름알데히드, 파라핀 포함 및 콜론 4 μ m 두꺼운 부분으로 절단에 의해 해결.
- 심장 찔린 통해 exsanguination에 의해 직접 문 합 세그먼트의 컬렉션 후 마 취 동안 동물을 안락사. 호흡 운동과 심장 박동의 부재와 함께 동물 죽음을 확인 합니다.
- 되며 & 오신 빨강, Picro 시리우스 등 조직화 학적인 stainings 및 인간 미토 콘 드리 아, 쥐 내 피 세포 (CD34 안티) 및 (CD3 +, CD163 +) 면역 체계의 세포에 대하여 항 체와 immunohistochemical stainings 수행 합니다.
- 컴퓨터 분석에 대 한 슬라이드를 디지털화 하 고 동물 그룹을 비교.
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Representative Results
ASC 시트 문화 및 결 장 절제술 및 문 합 절차를 묘사 하는이 연구의 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 는 ASC 시트 현미경 형태학 및 중 고 분리 후 ASC 시트의 거시적인 외관. 그림 3 ASC 시트 분리 및 이식의 다른 단계를 보여 줍니다. 그림 4 는 anastomotic 선 및 누설 방지에 ASC 시트의 존재 3 일 postoperatively.
후속 기간 대 장 문 합 평가 대 한 허용입니다. 다른 평가 수치와 테이블에 표시 됩니다. 제어 동물에 비해, 이식된 동물 그룹 덜 자주 anastomotic dehiscence과 수술 후 제 3 일에 누설 및 수술 후 제 7 일에 자주 농 양 형성 덜 보였다. 제어 동물에 비해, 이식된 동물 개발 하지 않았다 중요 한 유착 또는 형성. 표 1 이식 및 이식 비 동물에 기간 후속 조치의 끝에서 거시적인 결과 보여준다.
그림 1: 연구 흐름 차트. A) ASCs 고립 되었고 온도 응답 문화 요리에 뿌리기 전에 확장. ASCs 400000 셀/c m2 의 조밀도에 씨를 뿌리고 그리고 이식 전에 48 h에 대 한 교양 했다. 이식의 날, ASC 시트 30 분 B에 대 한 실내 온도에 냉각 온도 응답 문화 요리 함으로써 분리 했다) 당연히 수술; 공급 하는 혈관의 결 찰 후 부분 colectomy 및 대 장 문 합 수행 됩니다. ASC 시트는 ASC 시트 그룹;에 문 합을 감싸 a) caecum, b) 터미널 회장, c) 항문. 수술 절차의 개요 개요 우 Z. 외허가 부분적으로 적응 했다. 24 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ASC 시트 분리 전후. A) ASC 시트 온도 응답 문화 요리 문화 40 배 확대의 48 h 후에. ASC 시트는 상용 온도 응답 문화 요리 ASCs를 경작 하 여 얻은 했다. B-C) (B) 동안 ASC 시트 분리 (C) 후. 때 온도 응답 문화 요리는 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 허용 되었다, ASC 시트 저절로 분리 접시 표면에서 한 그대로 ASC 시트. 효소 치료 필요 했다입니다. 분리 후 감소 하는 ASC 시트의 크기입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ASC 시트 이식. A) 온도 응답 문화 접시에 ASC 시트 방향의 묘사. 이식 후 26 B) 방향의 ASC 시트. ASC 시트의 접시 쪽 anastomotic 라인의 serosal 표면 위에 배치 했다 (anastomotic 라인 십자가 표시 됩니다). 이식의 다른 단계의 C) 내부 요원 전망. 2 개의 atraumatic 집게 ASC 시트를 올리고 anastomotic 라인 감싸기 사용 되었다. 흰색 화살표는 ASC 시트 위치를 나타냅니다. 이식의 이미지는 Sukho, P., 외허가 부분적으로 적응 했다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대 장 문 합 거시적인 및 조직학 평가. A-B) 컨트롤 그룹에 비해, 거시적인 관찰 각각 수술 하루 3 (A) 및 7 (B)에서 누설 및 농 양 형성을 감소 했다. 흰색 화살표 anastomotic 지역에서 가리키고 검은색 화살표 지점 이식된 ASC 시트에. H & e.로 얼룩진 이식 동물에서 대 장 문 합 사이트의 C) 대표 횡단면 시트 구조 수 식별할 수 문 합 사이트에서 최대 7 일 postoperatively. 이미지 분할 Sukho, P., 외허가 적응 했다. 20 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 수술 후 3 일 | 수술 하루 7 | |||||
| 컨트롤 (%) | ASC 시트 (%) | p-값 | 컨트롤 (%) | ASC 시트 (%) | p-값 | |
| 복 막 염 | 1/14(7.1) | 0/14(0) | NS | 0/15(0) | 0/14(0) | NS |
| Anastomotic 중단 | 10/14(71.4) | 2/14(14.3) | 0.002 | 3/15(20) | 2/14(14.3) | NS |
| 준한 | 2/14(14.3) | 2/14(14.3) | NS | 2/15(13) | 2/14(14.3) | NS |
| 문 합에 농 양 | 14/14(100) | 12/14(85.7) | NS | 10/15(66.7) | 4/14(28.6) | 0.04 |
| 문 합에 접착 | 14/14(100) | 14/14(100) | NS | 15/15(100) | 14/14(100) | NS |
| 다른 곳에서 농 | 11/14(78.5) | 8/14(57.1) | NS | 6/15(40) | 4/14(28.6) | NS |
| 다른 곳에 접착 | 8/14(57.1) | 3/14(21.42) | NS | 9/15(60) | 7/14(50) | NS |
표 1: 수술 거시적인 결과
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Discussion
Anastomotic 누설은 기본 문 합으로 결 장 절제술을 다음과 같은 가장 심각한 불리 한 이벤트 이다. Anastomotic 장애 및 누설을 방지 하기 위해 최적의 기술을 여전히 부족 한. 다양 한 생체 재료의 로컬 응용 프로그램, 다양 한 결과25,,2627실시 되어 있다. 세포 치료의 목표는 조직 대체 하 여 조직 복구 또는 로컬 치유 통해 paracrine 분 비의 자극을 촉진 하기 위하여 이다.
이 쥐 모델에서 ASC 시트 이식 기술적으로 성공적 이었다. 임상 및 조직학 기본 문 합으로 결 장 절제술 후 누설을 감소에서 ASC 시트의 효과 설명 했다.
대 장 anastomoses에 ASC 시트 이식 대 장 수술에 새로운 접근 이다. 처음으로,이 연구에서 고밀도 ASC 시트 이식 했다. ASCs 셀 시트 전달에 대 한 선택은 기존의 세포 이식 기법을 통해 셀 시트 기술28,29 의 이전에 보고 된 장점에 근거 했다. 더하여, ASCs 적합 심장 근육 및 피부 치유11,12,,1932 에 (서) 특히 그들의 항 염증 제 및 영양 능력을 증명 하는 여러 연구에 근거 했다 .
ASC 시트 준비와 분리도 전하실 수 있습니다. 일부 ASC 기증자에서 ASC 시트 중간 문화 접시에서 분리 하 고 접혀, 그들의 사용을 제외. 이 연구에서 이러한 특정 기증자에서이 문제에 대 한 정확한 원인은 확인 하지 했다. 이후 문화 매체의 높은 소비는 이러한 기증자에 통보 했다, 그것은 개인 변화 확산 속도에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 간주 되었다. 혈 청 코팅 표면에 세포 접착에 도움. 문화에 있는 세포의 주의 분배 함께 요리와 ASCs (온도 하락 방지), 접는 덜 ASC 시트의 시드 후 인큐베이터 문 개방을 최소화 발생 했습니다. 이 방법에서는, 모든 기증자에서 ASC 시트 했다 성공적으로 이식, 기술의 타당성을 확인.
이식의 날, 대부분 ASC 시트는 자발적으로 실내 온도에 냉각 온도 응답 문화 접시 허용 후 분리. 그러나, 제한 된 수의 시트 완전히 분리 하지 않았다. 완전 한 분리에 도움 문화 접시 또는 결국 한 피 펫을 사용 하 여 테두리에서 부드러운 홍의 부드러운 떨고.
대 장 anastomoses에 성공적인 ASC 시트 이식에 대 한 몇 가지 중요 한 단계 해결 될 필요가 있다. 문 합 사이트에서 첫 번째, 과도 한 혈액 ASC 시트와 serosal 표면 사이의 접촉을 보장 하기 위해 제거 되어야 한다. 둘째, ASC 시트의 요리 쪽은 문 합 serosal 표면에 배치 되어야 합니다. 그것은 수확 후 셀 시트의 기능 때문에 세포 표면 단백질 및 세포-세포 접합 단백질의 보존 유지 됩니다 가정 했다. 또한, 짧은 시간에 serosal 표면에 자발적으로 준수 하는 ASC 시트의 기능 생체 외에서 문화19,,2021동안 생산 되는 입금된 ECM의 존재에 의해 촉진 수 있습니다. 셋째, ASC 시트와 콜론 직경의 크기 비교 문 합 사이트의 완전 한 범위를 허용 해야 합니다. 더 큰 표면 커버 될 필요가 있을 때 여러 시트를 사용 하 여 여겨질 수 있다.
이의 정서의 ASC 시트 준비 및 이식에 대 한 몇 가지 제한이 있습니다. 온도 반응 문화 요리를 사용 하 여 ASC 시트를 준비, 온도 엄격 하 게 유지 되어야 한다 37 ° C에서 조기 분리를 방지 하기 위해 전체 과정 동안. 이식 후 ASC 시트 생존 율 불명 하다. 이전 실험 것으로 나타났다 ASCs 가능한 3 일 postoperatively, 비록 이러한 ASCs의 미토 콘 드리 아 활동 7 일 postoperatively 점감 되었다17. 이식의 세포 생존 율 및 복용량 효과 될 필요가 있는 질문 해결에 미래 연구 중요 하다. 관찰자 편견 수 없습니다 완전히 배제할 수 있기 때문에 ASC 시트 확인 될 수 있다 거시적 및 미세 수술 평가에서. 이식된 동물 수술 후 더 보여주지 않았다 비록 제어 동물17, 장 문 합의 평가에 비해 접착 형성이 내부-복 부 유착의 존재에 의해 방해 수 있습니다.
이 응용 프로그램 기법의 장점은 간단 하 고 쉽게 수행 하는 것입니다. 단지 작은 양의 연습과 보편적인 atraumatic 집게를 사용 하 여, 장 외과 ASC 시트는 문 합 주위를 래핑할 수 있어야 합니다. 또한, 수술 시간이 크게 영향지 않습니다 ASC 시트 즉시 호스트 조직에 고착 하는 이후. 또한, ASC 시트를 사용할 경우 합성 소재 아니 이물질 반응의 위험을 최소화 하는 신체에 남아 있습니다.
이식된 ASCs 셀 시트에 조직 대 장 문 합 누출을 줄이기 위해 그들의 능력을 설명 했다. 이러한 결과 약속, 보기 모두에 대 한 장기적인 효과 평가 하기 위해 미래 연구를 실시 치료 및 안전 상의 이유로. 게다가, 여러 가지 방법은 ASC 시트 혈관 내 피 성장 인자30의 overexpression 유도 등의 치료 효과 수정 하려면 설명 했습니다. 이러한 메서드 추가 ASC 시트를 사용 하 여 조직 복구를 향상 시킬 수 있습니다 그리고 고려해 야 미래에 연구.
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Disclosures
저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 교수 박사 S.E.R. Hovius, 박사 M.A.M. Mureau 및 모든 외과 피하 지방이 많은 직물의 컬렉션에 대 한 성형 수술의 부의 감사. P. Sukho 연구의 행위 동안에 네덜란드 친목 프로그램 (NFP-12/435)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 사원 Bastiaansen Jenniskens 네덜란드 관절염 재단 (LP11)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LG DMEM | Gibco, Life technologies | 22320022 | ASC isolation and culture |
| Collagenase type I | Gibco, Life technologies | 17100-01 | ASC Isolation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | ASC Isolation |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life technologies | 10270-106 | FBS, ASC isolation and culture |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 7060 | ASC Isolation |
| Gentamicin | Gibco, Life technologies | 15750-037 | ASC isolation and culture |
| Ampothericin B | Gibco, Life technologies | 15290-018 | ASC isolation and culture |
| Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) | Akribis Scientific | F240 | ASC Isolation |
| Centrifuge | Hettichlab | Rotina380 | ASC isolation and culture |
| Phosphate buffer saline | Gibco, Life technologies | 14190-094 | PBS, ASC isolation and culture |
| Ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | ASC isolation and culture |
| Human recombinant fibroblast growth factor 2 | AbD Serotec | AF-100-15 | FGF2, ASC isolation and culture |
| Trypsin EDTA | Gibco, Life technologies | 25200-056 | ASC culture |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650-5x | DMSO, ASC freezing |
| Thermo-responsive culture dishes | Nunc Thermo scientific | 174904 | ASC sheet preperation |
| Non-absorbable braided silk 4/0 | B Braun | 21151042 | surgery |
| Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 | B Braun | G1118170 | surgery |
| Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 | B Braun | C1048207 | surgery |
References
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