Summary
La preparazione e il trapianto di tessuto adiposo derivato della cellula formativa (ASC) fogli sul insufficientemente suturate anastomosi colorettale in un modello del ratto è presentata. Questa applicazione romanzo mostra che fogli di ASC possono ridurre le perdite di anastomosi colorettale.
Abstract
Anastomotiche è una complicazione disastrosa dopo la chirurgia del colon-retto. Sebbene metodi correnti per la prevenzione di perdite hanno diversi livelli di efficacia clinica, sono fino a questo momento imperfette soluzioni. Terapia con cellule staminali utilizzando fogli di ASC potrebbe fornire una soluzione a questo problema. ASC sono considerati come promettenti candidati per la promozione del tessuto di guarigione a causa delle loro proprietà trofiche e immunomodulatori. Qui, mettiamo a disposizione metodi per produrre fogli ASC ad alta densità, che vengono trapiantate su un'anastomosi colorettale in un modello del ratto per ridurre la perdita. ASC formano strati delle cellule in piastre di coltura termo-sensibile che potrebbero essere facilmente smontati. Il giorno del trapianto, è stata eseguita una colectomia parziale con un'anastomosi colorettale 5-sutura. Gli animali sono stati trapiantati immediatamente con 1 foglio ASC per ratto. Fogli di ASC aderito spontaneamente all'anastomosi senza alcun collante, sutura o qualsiasi biomateriale. Gruppi di animali sono stati sacrificati 3 e 7 giorni postoperatorio. Confrontato agli animali trapiantati, l'incidenza degli ascessi anastomotic e perdita era maggiore negli animali di controllo. Nel nostro modello, il trapianto di fogli ASC dopo l'anastomosi colorettale è stata associata con un tasso di perdite inferiore e di successo.
Introduction
Colectomia parziale con un'anastomosi primaria è un intervento chirurgico comunemente effettuato che può essere fatto per molte malattie che colpiscono il colon come cancro colorettale, morbo di Crohn e diverticolite1,2. Il più temuto complicazione dopo l'anastomosi colorettale è anastomotiche3. Sebbene siano stati identificati diversi fattori di rischio connessi con perdite anastomotiche, soluzioni per prevenire perdite rimangono unkown4,5.
Delle cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASCs) sono associate con le proprietà antinfiammatorie e trofiche6,7, che rende queste cellule promettenti candidati per terapie rigenerative8. L'efficacia di ASCs per promuovere la guarigione dei tessuti è stata dimostrata in vari tessuti quali il muscolo cardiaco, pelle ed esofago9,10,11,12,13. Tuttavia, ci sono pochi rapporti sull'uso di ASCs per promuovere la guarigione intestinale. Trapianto locale di ASCs per anastomosi colorettale sperimentale via rivestite con ASC biosutures o iniezioni serosal dell'ASC ha mostrato entrambi nessun miglioramento nella guarigione14 o non impedì anastomotiche nonostante una più favorevole anastomotica 15la guarigione.
Il trapianto locale di ASC in sospensione o in combinazione con biomateriali potrebbero essere associati con la conservazione delle cellule insufficiente o un'inadeguata distribuzione delle cellule trapiantate11. Cella foglio tecnologia16,17 offre un innovativo metodo di consegna ASC18,19. Pertanto, in uno studio precedente, un nuovo approccio è stato proposto in cui ASCs organizzato in una cella foglio potrebbe essere applicata su anastomosi colorettale sperimentale20. Questo studio ha dimostrato che il trapianto di foglio ASC è riuscito a ridurre le perdite di anastomosi colorettale dopo colectomia parziale in un modello del ratto. Questo articolo segnala ASC foglio preparazione e tecnica chirurgica di trapianto.
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Protocol
Il tessuto adiposo sottocutaneo addominale è stato ottenuto da donatori umani con approvazione della Commissione etica medica (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassi. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico della sperimentazione animale, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Paesi Bassi (133-14-01).
1. umani ASCs isolamento e coltura
- Preparare 3 mL di terreno di isolamento per 1 g di tessuto adiposo. Mix basso glucosio Dulbecco di medie dell'Aquila per volta (LG-DMEM) con 10 g/L Bovine Serum Albumin (BSA) e della collagenosi 1 g/L di tipo 1.
- Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo umano addominale (n = 8, tutte le donne, età media 40 ± 9 anni) in piccoli pezzi (0,5 cm) utilizzando una dimensione lama chirurgica sterile 10, pinze Adson-Brown e forbici Metzenbaum in una sterile SafetyCabinet biologici.
- Conservare il tessuto dissecato in una bottiglia di archiviazione supporti vetro sterile. Pesare la quantità totale di tessuto dissecato e avviare la digestione con il mezzo di isolamento preparati (50 g di tessuto adiposo con 150 mL di terreno di isolamento per bottiglia). Il protocollo può essere sospesa qui memorizzando la bottiglia con il tessuto adiposo dissecato e mezzo di isolamento a 4 ° C durante la notte su un mixer a rulli. Quindi preriscaldare la bottiglia il giorno successivo a temperatura ambiente 25 ° C per 15 min prima di continuare con il passaggio successivo.
Nota: Il tessuto adiposo sottocutaneo addominale è stato ottenuto come materiale rimasto da donatori sottoposti ad intervento chirurgico di ricostruzione del seno con approvazione del Erasmus MC medica comitato etico (# MEC-200) e secondo il codice di condotta: "corretto utilizzo secondario di tessuto umano"(< http://www.federa.org>). Avanzi di tessuto adiposo è stato utilizzato solo da donatori che ha fatto non opt-out per uso secondario. - Digerire il tessuto adiposo dissecato in una bottiglia di archiviazione media di vetro sterile in un agitatore-incubatore a 150 giri/min e 37 ° C per 1 h.
- Dividere la soluzione digerita in provette da 50 mL e centrifugare le provette per 10 min a 390 x g.
- Preparare il terreno di coltura: LG-DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B). Centrifugare le cellule ancora per 5 min a 390 x g e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 100 µm.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di 3% acido acetico/metilene blu (per la lisi di globuli rossi) a 50 µ l di sospensione cellulare, miscelare la soluzione e utilizzare 10 µ l per contare le celle. Eseguire cella contando con un emocitometro. Quindi piastra le cellule ad una densità di 40.000 cellule/cm2 in terreno di coltura (LG-DMEM completate con 30% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
- Incubare le cellule a 37 ° C in un'atmosfera umida con 5% CO2 per 24 h.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule con fosfato di caldo (37 ° C) tampone salino (PBS) per rimuovere i detriti cellulari e sostituire il supporto con 10% FBS terreno di coltura con appena aggiunto acido ascorbico-2-fosfato (25 µ g/mL) e crescita fibroblastico ricombinante umano fattore 2 (FGF2, 1 ng/mL).
- Sottocultura ASCs confluenza 90% utilizzando la soluzione di standard 0,25% tripsina EDTA (3 mL per un pallone T175). Dopo 3-5 min, neutralizzare la soluzione di EDTA 0,25% tripsina con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM completati con 10% FBS, 50 µ g/mL Gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
Nota: Flusso cytometry analisi utilizzando marcatori di superficie comuni di ASC e differenziazione di tri stirpe saggi erano eseguite in precedenza e ha rivelati che ASCs isolati utilizzando questo protocollo visualizzato ASC caratteristiche specifiche21,22. - Lavare le cellule con 10 mL di terreno di coltura (LG-DMEM supplementato con 10% FBS, gentamicina 50 µ g/mL e 1,5 µ g/mL ampothericin B) per un pallone T175 e centrifugare le cellule per 8 min a 250 x g. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura. Contare le celle con un emocitometro.
- Piastra le cellule nel T175 matracci di cultura ad una densità di 8.000 cellule/cm2.
- Congelare le rimanenti ASC in azoto liquido con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) nel terreno di coltura prima dell'ulteriore uso.
2. ASC foglio preparazione
- Pre-cappotto termo-attivabile Petri (diametro 3,5 cm) con 1 mL di FBS, quindi posizionare le stoviglie in un incubatore a 37 ° C per almeno 30 min prima della semina delle cellule.
- Tripsinizzano ASC utilizzando standard 0,25% tripsina EDTA soluzione per 3-5 min (3 mL per un matraccio di cultura T175). Se ci sono eventuali grumi di cellule dopo trypsinization, filtrare le cellule attraverso un filtro 100 µm prima del conteggio.
- Neutralizzare la soluzione di tripsina con LG-DMEM supplementato con 10% FBS (10 mL per una boccetta di T175) e centrifugare la sospensione cellulare per 8 min x 250 g. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di LG-DMEM supplementato con 10% FBS.
- Dopo il rivestimento i piatti di cultura termo-attivabile con FBS, spostare i piatti dall'incubatrice una piastra riscaldante a 37 ° C e rimuovere FBS dal piatto.
- ASC di seme a 400.000 cellule/cm2 (in totale, 3,52 × 106 cellule diluite in 2 mL di terreno di coltura per ogni piatto).
- Accuratamente di distribuire più uniformemente possibile le cellule facendo oscillare delicatamente il piatto.
- Fogli ASC di cultura per 48 h a 37 ° C in un'atmosfera umida con 5% CO2.
Nota: Cercare di minimizzare l'apertura della porta dell'incubatore dopo la semina ASCs per prevenire cadute di temperatura che potrebbero interferire con la formazione del foglio ASC o prematuro distacco di formato lastre ASC.
3. parziale colectomia e l'anastomosi colorettale
- Indurre e mantenere ratti maschii di Wistar (peso compreso tra 250-350 g) con 1 L/min di isoflurane (inalazione di 1.5-5%)/oxygen e iniettare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via intramuscolare.
- Una volta che gli animali sono in anestesia generale, valutare profondità anestetica utilizzando reflex test. Applicare unguento oculare contenente vitamina agli occhi per prevenire la secchezza. Quando l'anestesia è considerata sufficiente per la chirurgia, preparare asetticamente l'addome rasatura peli e spruzzare l'area chirurgica due volte con etanolo al 70%. Drappo l'addome con drappi di carta sterile. Utilizzare una tecnica asettica e mantenere il campo sterile durante l'intero intervento chirurgico.
- Fare un'incisione addominale del midline di 5 cm con una dimensione di lama chirurgica sterile 10 ed estendere l'incisione con le forbici Metzenbaum. Identificare ed esternare il colon e pack colon fuori dal resto della cavità addominale con salina garza inumidita. Identificare la metà destra e sinistra arterie coliche nel mesentery, senza mezzi termini sezionare intorno ogni vaso usando Halsted mosquito e legare ogni singolo recipiente con non assorbibile intrecciata seta 4/0.
- Isolare il segmento colico tra 1,0 cm aborally al cieco e 0,5 cm di sopra dell'arteria mesenterica caudale. Transetto attraverso colon sano utilizzando forbici Metzenbaum. Dopo la resezione del segmento colico, unire le estremità prossimale e distale del colon introducendo due tamponi di cotone lunga trans-analmente attraverso il colon distale e quindi nell'estremità prossimale del colon.
- Utilizzando un microscopio operatorio, creare un'anastomosi to-end insufficientemente suturata invertendo uno strato sutura usando i suturare interrotti 5 (poliammide monofilamento non riassorbibile 8/0). Collocare le suture interrotte attraverso tutti gli strati della parete del colon e posizionare i nodi extraluminally.
- Dividere i ratti in modo casuale in controllo o gruppo di foglio ASC.
4. ASC foglio trapianto
- Consentire i piatti di cultura raffreddare a temperatura ambiente 40 min prima di trapianto in vivo , per facilitare il distacco del foglio ASC.
Nota: Dopo la separazione, fogli di ASC ridursi a circa 2 cm di diametro. Attuabilità foglio ASC rimane alta per almeno 3-6 h dopo il distacco20. - Rimuovere il terreno di coltura e sostituire con 1 mL di siero gratis LG-DMEM.
- Delicatamente afferrare i bordi del foglio ASC con pinza atraumatica e posizionare il lato piatto del foglio ASC in cima alla linea anastomotica.
- Con attenzione tratto fuori l'ASC foglio circa 0,25 cm sopra e sotto la linea anastomotica utilizzando la pinza atraumatica e avvolgere il foglio intorno i due punti. Sollevare il colon fino ad avvolgere il foglio ASC intorno al lato dorsale.
Nota: Fogli di ASC aderiscano spontaneamente alla linea anastomotica, non c'è alcuna necessità di utilizzare colla tessuto o qualsiasi altri biomateriali. Il gruppo di controllo non riceve alcun trattamento supplementare. - Rimuovere i tamponi di cotone e cambiare i guanti e gli strumenti. Sostituire i due punti nell'addome. Chiudi l'addome-linea alba con uno strato di in esecuzione utilizzando suture assorbibili intrecciato 5/0 acido poliglicolico. Suturare subcutis e cutis insieme in un unico strato di eseguire suture utilizzando poliglicolico intrecciato riassorbibile acido 5/0.
5. post-operatorio valutazione e follow-up
- Immediatamente reidratare gli animali con un'iniezione sottocutanea di soluzione salina calda 5ml postoperatorio. Sistemare gli animali sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea e monitorare i segni vitali fino a quando gli animali riprenda conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
Nota: Gli animali che avevano subito la chirurgia non sono stati restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato. Dopo il recupero, consentire il libero accesso all'acqua e cibo regolare del ratto. Per alleviare il dolore post-chirurgico, amministrare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea ogni 6-8 h per 3 giorni. Senza antibiotici sono stato amministrato in qualsiasi momento in questo studio. - Ottenere valutazioni giornaliere cliniche del benessere e del peso. In caso di un punteggio molto basso benessere o grave perdita di peso, gli animali dovrebbero essere euthanized dal exsanguination via la puntura cardiaca mentre ancora sotto anestesia.
- Il giorno postoperatorio 7 giorni o 3, anestetizzare i ratti nuovo con 1 L/min di isoflurane (inalazione di 1.5-5%)/oxygen senza il buprenorphine ed eseguire una re-laparotomia con un'incisione a forma di U. Verificare l'addome per i segni di peritonite, stenosi, aderenze fibrose e la presenza di ascessi. Segnare la severità delle aderenze e ascesso sia nell'addome e nella zona anastomotica.
- Determinare la pressione di scoppio anastomotic mediante l'insufflazione di aria in un segmento chiuso del colon compreso l'anastomosi. Registrare la pressione dell'aria e il luogo della rottura, quando l'aria prima di perdite come pressione di scoppio.
- Rimuovere i due punti da ogni animale sacrificato e fissare il segmento taglio del colon - contenente l'anastomosi colorettale - con formaldeide 4% tamponato, seguito da paraffina incorporamento e tagliando i due punti in 4 sezioni spesse μm.
- Eutanasia degli animali mentre sotto anestesia direttamente dopo la raccolta del segmento anastomosi dal exsanguination via puntura cardiaca. Confermare la morte degli animali con l'assenza di respirazione, movimento e un battito cardiaco.
- Eseguire colorazioni istochimiche quali ematossilina ed eosina e Picro Sirius rosso e gli stainings di immunohistochemical con gli anticorpi contro mitocondri umani, cellule endoteliali del ratto (anti-CD34) e cellule del sistema immunitario (CD3 +, CD163 +).
- Digitalizzare le diapositive per analisi computerizzata e confrontare i gruppi di animali.
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Representative Results
Un diagramma di flusso di questo studio raffigurante sia cultura foglio ASC e la procedura di resezione del colon e l'anastomosi è illustrato nella Figura 1. La figura 2 Mostra la morfologia microscopica foglio ASC e l'apparenza macroscopica del foglio ASC durante e dopo la separazione. La figura 3 Mostra le diverse fasi di distacco del foglio ASC e trapianto. La figura 4 Mostra la presenza del foglio ASC alla linea anastomotic e prevenzione dalla perdita di 3 giorni postoperatorio.
Il periodo di follow-up ha permesso per la valutazione di anastomosi colorettale. Le diverse valutazioni sono riportate nella tabella e figure. Rispetto agli animali di controllo, i gruppi di animali trapiantati hanno mostrato meno frequente deiscenza anastomotica e perdite il giorno postoperatorio 3 e meno formazione di ascesso frequente giorno postoperatorio 7. Rispetto agli animali di controllo, gli animali trapiantati non hanno sviluppato significative aderenze o formazione della critica. La tabella 1 Mostra i risultati macroscopici alla fine del follow-up periodi negli animali trapiantati e non trapiantato.
Figura 1: diagramma di flusso Studio. A) ASC sono stati isolati e ampliato prima della semina su piastre di coltura thermo-sensible a reagire. ASC sono state seminate ad una densità di 400.000 cellule/cm2 e coltivate per 48 h prima del trapianto. Il giorno del trapianto, foglio di ASC sono stati staccati consentendo il piatto di termo-sensibile cultura raffreddare a temperatura ambiente per 30 min. B) schema della procedura chirurgica; Dopo la legatura dei vasi di fornitura viene eseguita una colectomia parziale e l'anastomosi colorettale. Un foglio di ASC è stato avvolto intorno all'anastomosi nel gruppo ASC foglio; a) intestino cieco, b) terminale ileo, c) ano. La descrizione schematica della procedura chirurgica è stata parzialmente adattato con permesso da Wu Z. et al. 24 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: foglio ASC prima e dopo il distacco. A) foglio ASC in piastre di coltura thermo-sensible a reagire dopo 48 h di ingrandimento 40x cultura. Fogli di ASC sono state ottenute coltivando ASCs su piatti di cultura commerciale termo-sensible a reagire. B) foglio di ASC durante (B) e dopo il distacco (C). Quando i piatti di cultura termo-sensibili sono stati ammessi raffreddare a temperatura ambiente, il foglio ASC staccato spontaneamente dalla superficie del piatto come uno strato ASC intatto. Nessun trattamento enzimatico era necessario. Le dimensioni del foglio ASC ridotte dopo il distacco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: trapianto di foglio ASC. A) rappresentazione dell'orientamento del foglio ASC nella piastra di coltura thermo-sensible a reagire. Foglio di orientamento di ASC 26 B) dopo il trapianto. Il lato piatto del foglio ASC è stato disposto in cima alla superficie serosal della linea anastomotica (linea anastomotica è indicata con croci). C) intra-operative viste le diverse fasi del trapianto. Due Pinze atraumatiche sono state utilizzate per sollevare il foglio ASC e avvolgerlo intorno alla linea anastomotica. Frecce bianche indicano il percorso del foglio di ASC. Le immagini di trapianto sono stati parzialmente adattate con il permesso da Sukho, P., et al. 20 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: valutazione macroscopico ed istologico l'anastomosi colorettale. A-b) rispetto al gruppo di controllo, osservazione macroscopica ha mostrato ridotta formazione di ascesso e di perdita al giorno postoperatorio 3 (A) e 7 (B), rispettivamente. Frecce bianche puntano presso area anastomotic e frecce nere puntano ai trapiantati fogli ASC. C) rappresentante sezioni trasversali del sito l'anastomosi colorettale negli animali trapiantati macchiato con H & E. La struttura del foglio potrebbe essere identificata presso il sito di anastomosi fino a 7 giorni postoperatorio. Le immagini sono state parzialmente adattate con il permesso da Sukho, P., et al. 20 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 3 ° giorno post-operatorio | 7 ° giorno post-operatorio | |||||
| Controllo (%) | Foglio di ASC (%) | p-valore | Controllo (%) | Foglio di ASC (%) | p-valore | |
| Peritonite | 1/14(7.1) | 0/14(0) | NS | 0/15(0) | 0/14(0) | NS |
| Rottura anastomotic | 10/14(71.4) | 2/14(14.3) | 0,002 | 3/15(20) | 2/14(14.3) | NS |
| Critica | 2/14(14.3) | 2/14(14.3) | NS | 2/15(13) | 2/14(14.3) | NS |
| Ascesso all'anastomosi | 14/14(100) | 12/14(85.7) | NS | 10/15(66.7) | 4/14(28.6) | 0,04 |
| Adesione all'anastomosi | 14/14(100) | 14/14(100) | NS | 15/15(100) | 14/14(100) | NS |
| Ascesso altrove | 11/14(78.5) | 8/14(57.1) | NS | 6/15(40) | 4/14(28.6) | NS |
| Adesione altrove | 8/14(57.1) | 3/14(21.42) | NS | 9/15(60) | 7/14(50) | NS |
Tabella 1: Risultati macroscopici post-operatori.
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Discussion
Anastomotiche è l'evento avverso più grave a seguito di resezione del colon con un'anastomosi primaria. Tecniche ottimali per prevenire perdita e rottura anastomotic sono ancora carenti. Applicazione locale di una matrice di biomateriali è stata condotta, con diversi risultati25,26,27. L'obiettivo delle terapie di cellula è quello di facilitare la riparazione dei tessuti da sostituzione di tessuto o la stimolazione della guarigione locale attraverso secrezione paracrina.
In questo modello di ratto, ASC foglio trapianto era tecnicamente riuscito. Valutazioni cliniche ed istologiche hanno dimostrato l'efficacia del foglio ASC a ridurre perdite dopo resezione del colon con l'anastomosi primaria.
Il trapianto di un foglio di ASC da anastomosi colorettale è un nuovo approccio in chirurgia colo-rettale. In questo studio, per la prima volta, è stato trapiantato un foglio ad alta densità di ASC. La scelta per ASC consegnato come un foglio di cella si basava sui vantaggi precedentemente segnalati di cella foglio tecnologia28,29 rispetto alle tecniche di trapianto cellulare convenzionale. Inoltre, la scelta per ASCs è basata su diversi studi che hanno dimostrato le loro capacità antinfiammatorie e trofiche, specialmente nel muscolo cardiaco e pelle-guarigione11,12,19,32 .
Distacco e preparazione del foglio ASC può essere impegnativo. In alcuni donatori ASC, ASC fogli staccata prematuramente dalla piastra di coltura e piegati, precludendo loro uso. In questo studio, la causa esatta di questo problema in questi donatori specifici non è stata identificata. Poiché un elevato consumo di terreno di coltura è stato notificato in questi donatori, si è ipotizzato che diverse variazioni nel tasso di proliferazione possono svolgere un ruolo importante. Rivestimento del siero assistito nell'adesione delle cellule alla superficie. Insieme ad un'attenta distribuzione delle cellule nella cultura piatto e minimizzando l'apertura della porta incubatore dopo la semina ASCs (impedendo gocce di temperatura), meno pieghevole dei fogli ASC si è verificato. In questo modo, fogli ASC da tutti i donatori sono stati trapiantati con successo, confermando la fattibilità della tecnica.
Il giorno del trapianto, maggior parte dei fogli ASC staccato spontaneamente dopo permettendo il piatto di termo-sensibile cultura raffreddare a temperatura ambiente. Tuttavia, un numero limitato di fogli non ha fatto staccare completamente. Agitazione delicata della piastra di coltura o vampate di calore morbido al cerchio utilizzando una pipetta alla fine assistito nei distaccamenti complete.
Per trapianto riuscito di foglio ASC per anastomosi colorettale, diversi passaggi critici devono essere affrontate. In primo luogo, eccessivo sangue presso il sito di anastomosi dovrebbe essere rimosso per assicurare il contatto tra il foglio ASC e alla superficie serosal. In secondo luogo, il lato piatto del foglio ASC deve trovarsi sulla superficie serosal dell'anastomosi. È postulato che la funzione di strati delle cellule dopo il raccolto viene mantenuta grazie alla conservazione delle proteine di superficie delle cellule e proteine di giunzione cellula--cellula. Inoltre, la capacità di fogli ASC di aderire spontaneamente alla superficie serosal in breve tempo potrebbe essere facilitata dalla presenza di depositati ECM che viene prodotta durante la coltura in vitro19,20,21. In terzo luogo, le dimensioni del foglio ASC e il diametro del colon dovrebbero essere paragonabile per consentire una copertura completa del sito anastomosi. Quando più grandi superfici devono essere coperti, può essere considerato l'uso di diversi fogli.
Ci sono alcune limitazioni di questo protocollo per la preparazione del foglio ASC e trapianto. Quando si utilizza piastre di coltura termo-attivabile per preparare il foglio ASC, la temperatura dovrebbe essere rigorosamente mantenuta a 37 ° C durante l'intero processo per evitare il distacco prematuro. Dopo il trapianto, il tasso di sopravvivenza del foglio ASC è sconosciuto. Anche se gli esperimenti precedenti hanno mostrato che ASCs erano vitali alle 3 giorni postoperatorio, attività mitocondriale di questi ASCs è stato diminuito a 7 giorni postoperatorio17. L'effetto tasso e la dose di sopravvivenza delle cellule del trapianto sono importanti domande che devono essere affrontati in futuro studi. Polarizzazione di osservatore non può essere completamente esclusa poiché il foglio ASC può essere identificato in modo macroscopico che microscopicamente alle valutazioni post-operatorie. Anche se gli animali trapiantati non hanno mostrato postoperatori più formazione di aderenze rispetto per controllare gli animali17, la valutazione dell'anastomosi colorettale può essere ostacolato dalla presenza di queste adesioni intra-addominali.
Un vantaggio di questa tecnica di applicazione è che è semplice e facile da eseguire. Con solo una piccola quantità di pratica e l'utilizzo universale atraumatica, chirurghi intestinali dovrebbero essere in grado di avvolgere il foglio ASC intorno all'anastomosi. Inoltre, il tempo di chirurgia non è condizionato notevolmente poiché fogli ASC immediatamente aderiscano ai tessuti dell'ospite. Inoltre, quando si utilizzano fogli ASC, nessun biomateriale sintetico rimane nel corpo riducendo al minimo il rischio di una reazione da corpo estraneo.
ASCs trapiantati organizzati in strati delle cellule dimostrato la capacità di ridurre le perdite di anastomosi colorettale. Alla luce di tali risultati promettenti, gli studi futuri dovrebbero essere condotti per valutare gli effetti a lungo termine sia per terapeutico e motivi di sicurezza. Oltre a ciò, sono stati descritti diversi metodi per modificare gli effetti terapeutici di fogli ASC come indurre iperespressione di fattore di crescita endoteliale vascolare30. Questi metodi possono migliorare ulteriormente la riparazione tissutale utilizzando fogli di ASC e dovrebbero essere considerati in futuro studi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi rapporto commerciale o finanziario che potrebbe essere interpretato come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al Dr. s.e.r. Hovius, Dr. M.A.M. Mureau e tutti i chirurghi del reparto di chirurgia plastica per la raccolta del tessuto adiposo sottocutaneo. P. Sukho è sostenuta da una sovvenzione dal programma The Netherlands Fellowship (NFP-12/435), durante lo svolgimento dello studio. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens è supportato da sovvenzioni da olandese Arthritis Foundation (LP11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LG DMEM | Gibco, Life technologies | 22320022 | ASC isolation and culture |
| Collagenase type I | Gibco, Life technologies | 17100-01 | ASC Isolation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | ASC Isolation |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life technologies | 10270-106 | FBS, ASC isolation and culture |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 7060 | ASC Isolation |
| Gentamicin | Gibco, Life technologies | 15750-037 | ASC isolation and culture |
| Ampothericin B | Gibco, Life technologies | 15290-018 | ASC isolation and culture |
| Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) | Akribis Scientific | F240 | ASC Isolation |
| Centrifuge | Hettichlab | Rotina380 | ASC isolation and culture |
| Phosphate buffer saline | Gibco, Life technologies | 14190-094 | PBS, ASC isolation and culture |
| Ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | ASC isolation and culture |
| Human recombinant fibroblast growth factor 2 | AbD Serotec | AF-100-15 | FGF2, ASC isolation and culture |
| Trypsin EDTA | Gibco, Life technologies | 25200-056 | ASC culture |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650-5x | DMSO, ASC freezing |
| Thermo-responsive culture dishes | Nunc Thermo scientific | 174904 | ASC sheet preperation |
| Non-absorbable braided silk 4/0 | B Braun | 21151042 | surgery |
| Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 | B Braun | G1118170 | surgery |
| Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 | B Braun | C1048207 | surgery |
References
- Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
- Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
- Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
- Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
- Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
- Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
- Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
- Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
- Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
- Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
- Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
- Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
- Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
- Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
- Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
- Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
- Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
- Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
- Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
- Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
- Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
- Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
- Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
- Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
- Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).
