Summary
对大鼠模型中脂肪组织衍生干细胞 (ASC) 的制备和移植进行了未充分缝合的结直肠吻合。这项新的应用表明, ASC 片可以减少结直肠吻合口漏。
Abstract
吻合口瘘是结直肠手术后的灾难性并发症。虽然目前的防渗漏方法有不同的临床疗效水平, 但目前尚不完善的解决方案。干细胞治疗使用 ASC 表可以提供一个解决这个问题。陶瓷被认为是有希望的候选者, 促进组织愈合, 因为他们的营养和免疫调节性能。在这里, 我们提供的方法, 以生产高密度 ASC 表, 移植到结肠直肠吻合的大鼠模型, 以减少渗漏。陶瓷形成的细胞表在热反应的文化菜肴, 可以很容易地分离。在移植当天, 进行了5缝合结直肠吻合的部分结肠切除术。动物被立即移植与 1 ASC 表每鼠。ASC 床单自发地附着在没有任何胶水, 缝合, 或任何生物材料的吻合。动物群在术后3和7天被献祭。与移植动物相比, 控制动物的吻合口脓肿和渗漏率较高。在本模型中, 结肠吻合术后的 ASC 片移植成功, 并伴有较低的漏率。
Introduction
部分结肠切除与原发性吻合术是一个常见的手术, 可以做许多疾病, 如结肠直肠癌, 克罗恩病和憩1,2。结直肠吻合术后最可怕的并发症是吻合口漏3。虽然已经确定了与吻合口漏相关的几个危险因素, 但防止渗漏的解决方案仍然未知4,5。
脂肪组织衍生基质细胞 (陶瓷) 与抗炎和营养性质的6,7, 使这些细胞有望候选的再生疗法8。陶瓷促进组织愈合的有效性表现在各种组织, 如心肌, 皮肤, 食管9,10,11,12,13。然而, 很少有关于使用陶瓷促进肠道愈合的报道。陶瓷局部移植通过 ASC 包膜 biosutures 或浆膜注射陶瓷的实验性结直肠吻合术14的愈合或没有预防吻合口瘘, 尽管更有利的吻合口愈合15。
局部移植陶瓷悬浮或与生物材料结合可能与细胞保留不足或移植细胞分配不足11。细胞板技术16,17提供了一个创新的方法, ASC 交付18,19。因此, 在以前的研究中, 提出了一种新的方法, 其中陶瓷组织在细胞片可以应用于实验性结直肠吻合20。本研究表明, ASC 片移植成功地减少了大鼠部分结肠切除术后结直肠吻合口渗漏。本文报告了 ASC 板的制备和手术移植技术。
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Protocol
皮下腹部脂肪组织是由人类捐赠者获得的医学伦理委员会 (#MEC 2014-092), 荷兰鹿特丹的伊拉斯谟 MC 大学医疗中心批准。所有动物实验均经动物实验伦理委员会批准, 荷兰鹿特丹伊拉大学医学中心 (133-14-01)。
1. 人类陶瓷隔离和文化
- 为1克脂肪组织准备3毫升的隔离培养基。混合低葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (LG-DMEM) 与10克/升牛血清白蛋白 (BSA) 和1克/升胶原酶1型。
- 解剖人皮下腹部脂肪组织 (n = 8, 所有女性, 平均年龄 40 9 岁) 到小块 (0.5 厘米) 使用无菌手术刀片大小 10, Adson 棕色组织钳和 Metzenbaum 剪刀在一个无菌的生物 SafetyCabinet。
- 将解剖过的组织保存在无菌玻璃培养基储存瓶中。用准备好的隔离培养基 (每瓶50克脂肪组织150毫升的隔离培养基) 来衡量解剖组织的总数量, 开始消化。该协议可以暂停在这里通过储存与解剖脂肪组织和隔离介质在一个滚筒搅拌机4°c 过夜。然后 prewarm 瓶第二天的室温25°c 为15分钟, 然后继续下一步。
注: 皮下腹部脂肪组织是由捐赠者进行乳房重建手术的剩余材料获得的, 并经伊拉兹 MC 医学伦理委员会 (MEC-200) 批准, 并根据行为守则: "适当的二次使用人的组织 "(< http://www.federa.org >)。剩下的脂肪组织只用于不选择二次使用的捐赠者。 - 消化在一个无菌玻璃培养基储存瓶中的解剖脂肪组织在 150 rpm 和37°c 1 小时的振动筛孵化器。
- 将所消化溶液分为50毫升管, 离心管10分钟 390 x 克。
- 制备培养基: LG-DMEM 辅以10% 胎牛血清 (血清), 50 µg/毫升庆大霉素, 1.5 µg/毫升 ampothericin B。
- 离心后, 去除上清和并用重悬细胞颗粒在20毫升培养基 (LG-DMEM 补充10% 胎牛血清 (血清), 50 µg/毫升庆大霉素和1.5 µg/毫升 ampothericin B)。再次离心细胞5分钟在 390 x g 和删除上清。
- 并用重悬细胞颗粒与10毫升培养基 (LG-DMEM 补充10% 血清, 50 µg/毫升庆大霉素和1.5 µg/毫升 ampothericin B) 和过滤细胞悬浮通过100µm 过滤器。
- 添加50µL 3% 醋酸/亚甲基蓝溶液 (用于红细胞裂解) 到50µL 细胞悬浮液, 混合溶液并使用10µL 计数细胞。使用 hemocytometer 执行单元格计数。然后板细胞在密度4万细胞/cm2在培养基 (LG-DMEM 补充30% 血清, 50 µg/毫升庆大霉素和1.5 µg/毫升 ampothericin B)。
- 在潮湿的大气层中孵化出37摄氏度的细胞, 5% CO2为24小时。
- 孵化后, 用温 (37 °c) 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 冲洗细胞, 去除细胞碎片, 用新鲜添加的抗坏血酸 acid-2-phosphate (25 µg/毫升) 和人重组成纤维细胞生长的10% 只血清培养基取代培养基。因子 2 (FGF2, 1 ng/毫升)。
- 亚文化陶瓷在90% 汇合使用标准0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液 (3 毫升为 T175 瓶)。3-5 分钟后, 中和0.25% 胰蛋白酶的 EDTA 溶液与10毫升培养基 (LG-DMEM 补充10% 血清, 50 µg/毫升庆大霉素和1.5 µg/毫升 ampothericin B)。
注: 使用常见的 ASC 表面标记和三谱系分化检测的流式细胞术分析表明, 陶瓷隔离使用此协议显示 ASC 特定特性21,22。 - 用10毫升培养基 (LG-DMEM 补充10% 的血清) 冲洗细胞, 50 µg/毫升庆大霉素和1.5 µg/毫升 ampothericin B) 为 T175 瓶和离心机的细胞为8分钟在 250 x g. 移除上清, 并在1毫升培养基中并用重悬细胞。用 hemocytometer 计数单元格。
- T175 培养皿中的细胞以8000细胞/厘米2的密度为单位。
- 在进一步使用前, 在培养基中用10% 二甲基亚砜 (亚砜) 冻结液氮中剩余的陶瓷。
2. ASC 板材的制备
- 预涂层热响应培养皿 (3.5 厘米直径) 与1毫升的血清, 然后将菜肴放在一个孵化器37°c 至少30分钟之前, 细胞播种。
- 胰蛋白酶处理陶瓷使用标准的0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液3-5 分钟 (3 毫升的 T175 培养瓶)。如果 trypsinization 后有任何细胞团簇, 请在计数前通过100µm 过滤器过滤细胞。
- 中和的胰蛋白酶溶液与 LG-DMEM 补充10% 的血清 (10 毫升的 T175 瓶) 和离心机的细胞悬浮8分钟在 250 x g. 去除上清和并用重悬的细胞在1毫升 LG-DMEM 补充10% 血清。
- 涂上热响应的文化菜肴与血清, 移动从孵化器的菜肴, 以37摄氏度的暖板, 并从盘子中删除的血清。
- 种子陶瓷在40万个细胞/cm2 (总, 3.52 x 106细胞稀释在2毫升培养基每菜)。
- 通过轻轻摆动盘子, 尽可能均匀地分配细胞。
- 文化 ASC 板材为48小时在37°c 在潮湿的大气与 5% CO2。
注: 尽量减少在播种陶瓷后打开孵化器的门, 以防止可能干扰 ASC 板形成或导致形成的 asc 板过早脱离的温度下降。
3. 部分结肠切除和结直肠吻合术
- 诱导和维持雄性大鼠 (重量在250-350 克之间) 与1升/分异氟醚 (1.5-5%)/吸入氧和注射0.05 毫克/千克丁丙诺啡肌肉。
- 一旦动物全身麻醉, 使用反射测试评估麻醉深度。将含有眼膏的维生素 a 应用于眼部, 以防止干燥。当麻醉被认为是足够的手术, 灌装准备腹部剃须毛和喷洒手术面积两次与70% 乙醇。用不育的纸帘遮住腹部。使用无菌技术, 在整个手术过程中保持无菌场。
- 做一个5厘米的中线腹部切口与无菌手术刀片大小10和延伸切口用 Metzenbaum 剪刀。鉴别并 exteriorize 结肠, 用生理盐水湿润的纱布将结肠从腹腔的其余部分包裹起来。确定肠系膜的右、中、左绞痛动脉, 用霍尔斯特德蚊子直接解剖每条血管, 并结扎每条单独的血管, 不吸收编织丝4/0。
- 将结肠段从1.0 厘米 aborally 到盲肠, 在肠系膜上动脉的0.5 厘米之间分离。用 Metzenbaum 剪刀通过健康的结肠样带。结肠段切除后, 将两条长的棉拭子通过远端结肠肛门, 然后进入近端结肠末端, 将结肠的近端和远端端一起引入。
- 使用手术显微镜, 通过5条间断缝合 (不可吸收的单丝聚酰胺 8/0), 通过一层反转缝合, 建立一个不够缝合的端到端吻合术。将被打断的缝线穿过结肠壁的所有层, 并将结 extraluminally。
- 将大鼠随机分成对照组或 ASC 表。
4. ASC 表移植
- 在体内移植前, 允许培养皿降温至室温40分钟, 以促进 ASC 板脱离。
注: 在支队后, ASC 床单收缩到约2厘米直径。在支队20之后, ASC 板的生存能力仍然高至少3-6 小时。 - 去除培养基, 用1毫升的血清游离 LG DMEM 代替。
- 用非创伤性钳轻轻抓住 asc 板的轮辋, 将 asc 片的盘面放在吻合线的顶端。
- 仔细伸展的 ASC 表约0.25 厘米以上和下方的吻合线使用非创伤性钳和包装的床单周围的结肠。提起冒号, 将 ASC 片环绕在背侧。
注意: ASC 床单自发地附着在吻合线上, 不需要使用组织胶水或任何其他生物材料。对照组不接受任何额外治疗。 - 取出棉签, 更换手套和器械。替换腹部的结肠。用可吸收的编织羟基酸5/0 关闭腹部 linea 和一层连续缝合线。用可吸收的编织羟基酸5/0 将皮下组织和皮肤缝合在一层连续缝合线上。
5. 术后评价和后续行动
- 立即水化动物的皮下注射5毫升温盐水术后。将动物置于热灯下, 保持体温, 监测生命体征, 直到动物恢复足够的意识以维持胸骨卧床。
注意: 经过手术的动物直到完全恢复后才返回其他动物公司。恢复后, 允许免费进入水和常规鼠周。手术后止痛, 每6-8 小时管理0.05 毫克/千克丁丙诺啡, 3 天。本研究中任何时候都没有使用抗生素。 - 获得健康和体重的每日临床评估。如果有很低的健康评分或严重的体重下降, 动物应该被放血通过心脏穿刺, 而仍然在麻醉下安乐死。
- 术后3天或7天, 麻醉大鼠再用1升/分异氟醚 (1.5-5%)/氧吸入无丁丙诺啡, 并进行再剖腹手术的 U 形切口。检查腹部是否有腹膜炎、狭窄、纤维粘连和脓肿的出现。评分在腹部和吻合区的粘连和脓肿的严重性。
- 在结肠闭合段包括吻合术中, 确定喷洒的吻合口破裂压力。当第一次空气泄漏为爆破压力时, 记录气压和破裂处。
- 从每只牺牲的动物中取出结肠, 固定结肠结直肠吻合的切口段--用4% 缓冲的甲醛, 下面是石蜡嵌入, 将结肠切成4微米厚的部分。
- 弄死通过心脏穿刺放血采集吻合段后直接麻醉下的动物。在没有呼吸运动和心跳的情况下确认动物死亡。
- 执行组织化学染色, 如苏木精 & 血红素和 Picro 天狼星红, 免疫组化染色抗体抗人线粒体, 大鼠内皮细胞 (anti-CD34) 和细胞 (CD3+, CD163+)。
- 数字化电脑分析的幻灯片, 并比较动物组。
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Representative Results
图 1显示了这项研究的流程图, 其中描述了 ASC 片培养和结肠切除吻合的过程。图 2显示了 asc 板的显微形貌和在分离期间和之后的 asc 片的宏观外观。图 3显示了 ASC 板剥离和移植的不同步骤。图 4显示了 ASC 表在吻合线上的存在, 并在术后3天内预防渗漏。
随访期可用于结直肠吻合口的评估。不同的评估结果显示在数字和表格中。与对照动物相比, 移植后的动物组在术后3天的吻合口裂开和渗漏较少, 术后7天脓肿形成较不常见。与对照动物相比, 移植的动物没有形成明显的粘连或狭窄。表 1显示了移植和非移植动物随访期结束时的宏观结果。
图 1: 学习流程图.A) 陶瓷的分离和扩展, 然后播种到热反应的培养皿。陶瓷的密度为40万细胞/厘米2 , 在移植前培养为48小时。在移植当天, 通过允许热反应培养皿冷却到室温30分钟的手术方案, 使 ASC 片分离出来;在结扎血管后, 进行部分结肠切除和结直肠吻合术。在 asc 板组的吻合口周围包裹有一个 asc 片;a) 盲肠, b) 末端回肠, c) 肛门。手术过程的示意图概要部分被适应了以允许从吴 Z.等等。24请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在脱离前和之后的 ASC 板.A) 在48小时的文化40x 放大后, 在热响应培养皿中的 ASC 表单。通过在商用热反应培养皿上培养陶瓷, 获得了 ASC 片。b c) 在 (b) 和脱离后 (C) 期间的 ASC 表。当温度响应的培养基被允许冷却到室温时, asc 片自发地从盘子表面分离出来作为一个完整的 asc 表。没有酶治疗是必要的。在脱离后, ASC 板的尺寸减少了。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: ASC 表移植.A) 在热响应培养皿中描述 ASC 片方向。26 B) 移植后的 ASC 片方向。ASC 片的碟侧放置在吻合线的浆膜表面的顶端 (吻合线用十字架表示)。C) 对不同移植步骤的手术内意见。两个非创伤性钳被用来举起的 ASC 表和包装它周围的吻合线。白色箭头指示 ASC 页面位置。移植的图像部分适应了 Sukho, P, et的许可。20请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 结直肠吻合术的宏观和组织学评价.A B) 与对照组比较, 宏观观察显示, 术后 3 (A) 和 7 (B) 后的渗漏和脓肿的形成分别减少。白色箭头点在吻合区和黑色箭头点在移植的 ASC 床单。C) 与 H & E 染色的移植动物大肠吻合部位的代表性断面。术后7天可在吻合部位辨认出片状结构。这些图像部分是根据 Sukho、P、 et的许可改编的。20请单击此处查看此图的较大版本.
| 术后3天 | 术后7天 | |||||
| 控件 (%) | ASC 表 (%) | p值 | 控件 (%) | ASC 表 (%) | p值 | |
| 性 腹膜 炎 | 1/14 (7.1) | 0/14 (0) | Ns | 0/15 (0) | 0/14 (0) | Ns |
| 吻合口中断 | 10/14 (71.4) | 2/14 (14.3) | 0.002 | 3/15 (20) | 2/14 (14.3) | Ns |
| 狭窄 | 2/14 (14.3) | 2/14 (14.3) | Ns | 2/15 (13) | 2/14 (14.3) | Ns |
| 吻合口脓肿 | 14/14 (100) | 12/14 (85.7) | Ns | 10/15 (66.7) | 4/14 (28.6) | 0.04 |
| 吻合时粘连 | 14/14 (100) | 14/14 (100) | Ns | 15/15 (100) | 14/14 (100) | Ns |
| 其他地方脓肿 | 11/14 (78.5) | 8/14 (57.1) | Ns | 6/15 (40) | 4/14 (28.6) | Ns |
| 其他地方的附着力 | 8/14 (57.1) | 3/14 (21.42) | Ns | 9/15 (60) | 7/14 (50) | Ns |
表 1: 术后宏观调查结果。
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Discussion
吻合口漏是结肠切除术后最严重的不良事件。目前还缺乏预防吻合口破裂和渗漏的最佳技术。对生物材料阵列的局部应用进行了研究, 结果25、26、27不同。细胞疗法的目的是通过组织置换或通过分泌分泌刺激局部愈合来促进组织修复。
在这个大鼠模型中, ASC 片移植技术上是成功的。临床和组织学评价表明, ASC 表在减少结肠切除术后, 原发性吻合术的效果。
一期手术治疗结肠直肠吻合术是一种新的方法。本研究首次将高密度 ASC 片移植。陶瓷作为细胞表提供的选择是基于以前报告的细胞板技术28,29在常规细胞移植技术的优势。此外, 陶瓷的选择是基于多项研究, 显示他们的抗炎和营养能力, 特别是在心脏肌肉-和皮肤愈合11,12,19,32.
ASC 板的准备和剥离可能是一个挑战。在一些 asc 捐赠者, asc 板料过早地脱离文化盘并且折叠, 排除他们的用途。在这项研究中, 没有确定这些具体捐助者的这一问题的确切原因。由于在这些捐助者中通知了高消费量的培养基, 人们认为, 扩散率的个别变化可能起重要作用。血清涂层有助于细胞黏附在表面。连同在培养皿中的细胞的仔细的发行和最小化孵化门的开放在播种陶瓷以后 (防止温度下降), 更小的折叠的 ASC 板材发生了。这样, 所有捐赠者的 ASC 表都成功移植, 证实了该技术的可行性。
在移植的当天, 大多数 ASC 床单自发地分离后, 允许热反应的培养皿降温到室温。但是, 有限数量的工作表没有完全分离。轻轻摇动的文化盘或软冲洗在边缘使用吸管最终协助完全分遣队。
为成功的 ASC 表移植到结直肠吻合, 需要解决几个关键步骤。首先, 应清除吻合部位的过量血液, 以确保 ASC 片与浆膜表面的接触。第二, ASC 片的碟侧应放置在浆膜表面的吻合。据推测, 由于保存细胞表面蛋白和细胞对细胞结蛋白, 在收获后细胞的功能得到维持。此外, 在离体培养19、20、21期间生产的沉积 ECM 的存在下, ASC 单板在短时间内自发地附着在浆膜表面的能力可能会得到促进。第三, ASC 片的大小和结肠的直径应该是可比的, 允许完整覆盖的吻合部位。当需要覆盖较大的表面时, 可以考虑使用几张纸。
该协议对 ASC 表的制备和移植有一定的局限性。当使用热响应培养皿准备 ASC 表时, 在整个过程中, 温度应严格保持在37摄氏度, 以防止过早脱离。移植后, ASC 片存活率未知。虽然以前的实验表明, 陶瓷在术后3天是可行的, 但这些陶瓷的线粒体活性在术后7天内减少17。移植的细胞存活率和剂量效应是今后研究中需要解决的重要问题。观察者的偏倚不能完全排除, 因为在术后评价中可以从宏观和微观上确定 ASC 表。虽然移植的动物没有显示更多的术后粘连形成与控制动物17, 结直肠吻合的评估可能由这些腹腔内粘连的存在阻碍。
这种应用技术的优点是它简单, 易于执行。只有少量的练习和使用万能非创伤性钳, 肠道外科医生应该能够包装的 ASC 表周围的吻合。此外, 手术时间没有很大的影响, 因为 ASC 表立即坚持宿主组织。此外, 当使用 ASC 床单, 没有合成生物材料保持在身体最小化的风险, 外来的身体反应。
移植陶瓷组织在细胞表显示他们的能力减少结直肠吻合口漏。鉴于这些可喜的结果, 今后应进行研究, 以评估治疗和安全方面的长期效果。此外, 还介绍了几种方法来改变 ASC 片的治疗效果, 如诱导血管内皮生长因子30的过度表达。这些方法可以进一步加强组织修复使用 ASC 表, 并应考虑在今后的研究。
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Disclosures
提交人声明, 这项研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的, 这可能被理解为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢 S.E.R. Hovius 博士, M.A.M. 博士 Mureau 和整形外科部的所有外科医生, 以收集皮下脂肪组织。p. Sukho 得到荷兰研究金计划 (NFP-12/435) 的赠款支持, 在进行这项学习期间。Y.M. Bastiaansen-Jenniskens 由荷兰关节炎基金会 (LP11) 提供资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LG DMEM | Gibco, Life technologies | 22320022 | ASC isolation and culture |
| Collagenase type I | Gibco, Life technologies | 17100-01 | ASC Isolation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | ASC Isolation |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life technologies | 10270-106 | FBS, ASC isolation and culture |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 7060 | ASC Isolation |
| Gentamicin | Gibco, Life technologies | 15750-037 | ASC isolation and culture |
| Ampothericin B | Gibco, Life technologies | 15290-018 | ASC isolation and culture |
| Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) | Akribis Scientific | F240 | ASC Isolation |
| Centrifuge | Hettichlab | Rotina380 | ASC isolation and culture |
| Phosphate buffer saline | Gibco, Life technologies | 14190-094 | PBS, ASC isolation and culture |
| Ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | ASC isolation and culture |
| Human recombinant fibroblast growth factor 2 | AbD Serotec | AF-100-15 | FGF2, ASC isolation and culture |
| Trypsin EDTA | Gibco, Life technologies | 25200-056 | ASC culture |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650-5x | DMSO, ASC freezing |
| Thermo-responsive culture dishes | Nunc Thermo scientific | 174904 | ASC sheet preperation |
| Non-absorbable braided silk 4/0 | B Braun | 21151042 | surgery |
| Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 | B Braun | G1118170 | surgery |
| Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 | B Braun | C1048207 | surgery |
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