Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantation af fedtvæv-afledte stamceller ark til at reducere udsivningen efter delvis kolektomi i en rotte Model

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

Forberedelse og transplantation af fedtvæv afledte stamceller (ASC) plader på utilstrækkeligt syet kolorektal anastomoser i en rotte model præsenteres. Dette nye program viser, at ASC ark kan reducere kolorektal anastomose lækage.

Abstract

Anastomotiske lækage er en katastrofal komplikation efter kolorektal kirurgi. Selv om aktuelle metoder til forebyggelse af lækage har forskellige niveauer af klinisk effekt, er de indtil nu ufuldkommen løsninger. Stamcelleterapi bruger ASC plader kunne være en løsning på dette problem. ASCs betragtes som lovende kandidater til fremme af væv, healing på grund af deres trofiske og immunmodulerende egenskaber. Her, leverer vi metoder til at producere high-density ASC ark, der kan transplanteres til en kolorektal anastomose i en rotte model til at reducere udsivningen. ASCs dannet celle ark i thermo-responderende kultur retter, der nemt kunne afmonteres. På dagen for transplantation, blev en delvis kolektomi med en 5-sutur kolorektal anastomose udført. Dyrene blev straks transplanteret med 1 ASC ark pr. rotte. ASC ark overholdt spontant anastomose uden nogen lim, sutur eller enhver biomateriale. Dyregrupper blev ofret 3-7 dage efter operationen. I forhold til transplanterede dyr, var forekomsten af Anastomotiske bylder og lækage højere i kontroldyr. I vores model, transplantation af ASC plader efter kolorektal anastomose var vellykket og forbundet med en lavere lækage.

Introduction

Delvis kolektomi med en primær anastomose er en almindeligvis udføres kirurgi, der kan gøres for mange sygdomme, der påvirker tyktarmen som kolorektal cancer, Crohns sygdom og diverticulitis1,2. Mest frygtede komplikation efter kolorektal anastomose er Anastomotiske lækage3. Selv om flere risikofaktorer forbundet med Anastomotiske lækager er blevet identificeret, forblive løsninger for at forhindre lækage ukendt4,5.

Fedtvæv-afledte stromale celler (ASCs) er forbundet med anti-inflammatoriske og trofiske egenskaber6,7, hvilket gør disse celler lovende kandidater til regenerativ terapier8. Effektiviteten af ASCs til fremme af væv healing blev vist i forskellige væv såsom hjertemuskulaturen, hud og spiserøret9,10,11,12,13. Men der er få rapporter om anvendelsen af ASCs til fremme af intestinal healing. Lokale transplantation af ASCs til eksperimentelle kolorektal anastomoser via ASC-belagt biosutures eller serosal injektioner af ASCs viste enten ingen forbedring i healing14 eller forhindrede ikke Anastomotiske lækage på trods af et gunstigere Anastomotiske Healing15.

Lokale transplantation af ASCs i suspension eller kombineret med biomaterialer kan være forbundet med utilstrækkelig celle fastholdelse eller en mangelfuld fordeling af transplanterede celler11. Celle ark teknologi16,17 tilbyder en innovativ metode til ASC levering18,19. Derfor, i en tidligere undersøgelse, en ny tilgang blev foreslået i hvilke ASCs organiseret i en celle ark kan anvendes på eksperimentelle kolorektal anastomose20. Denne undersøgelse viste, at ASC ark transplantation har succes med at reducere kolorektal anastomose lækage efter delvis kolektomi i en rotte model. Denne artikel rapporter ASC ark forberedelse og kirurgisk transplantation teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Subkutane abdominal fedtvæv blev opnået fra menneskelige donorer med godkendelse af medicinsk etiske udvalg (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holland. Alle dyreforsøg blev godkendt af etiske udvalg af dyret eksperimenter, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holland (133-14-01).

1. menneskelige ASCs Isolation og kultur

  1. Forbered 3 mL af isolation medium for 1 g af fedtvæv. Mix lav glucose Dulbecco's modificerede Eagle's medium (LG-DMEM) med 10 g/L kvæg serumalbumin (BSA) og 1 g/L collagenase type 1.
  2. Dissekere menneskelige subcutan abdominal fedtvæv (n = 8, alle kvindelige, betyder alder 40 ± 9 år gamle) i små stykker (0,5 cm) med en steril kirurgiske kniv størrelse 10, Adson-brun væv pincet og Metzenbaum saks i en steril biologisk SafetyCabinet.
  3. Gemme dissekeret vævet i et sterilt glas medier opbevaring flaske. Vejer det samlede beløb af dissekerede væv og starte fordøjelsen med rede isolation medium (50 g af fedtvæv med 150 mL af isolation medium pr. flaske). Protokollen kan være standset her ved at gemme flasken med dissekeret fedtvæv og isolation medium ved 4 ° C på en valse mixer natten over. Derefter prewarm flasken den næste dag til stuetemperatur 25 ° C i 15 min før du fortsætter til næste trin.
    Bemærk: Subkutan abdominal fedtvæv blev fremstillet som sidesten materiale fra donorer gennemgår bryst genopbygning kirurgi med godkendelse af de Erasmus-MC medicinsk etiske udvalg (# MEC-200) og i overensstemmelse med adfærdskodeksen: "ordentlig sekundær anvendelse af menneskeligt væv"(< http://www.federa.org>). Sidesten fedtvæv blev kun brugt fra donorer, der ikke opt-out til sekundær brug.
  4. Fordøje dissekeret fedtvæv i et sterilt glas medier opbevaring flaske i en shaker-inkubator på 150 rpm og 37 ° C i 1 time.
  5. Opdele den fordøjede opløsning i 50 mL rør og centrifugeres rør til 10 min på 390 x g.
  6. Forberede næringssubstratet: LG-DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B.
  7. Efter centrifugering, Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 20 mL af næringssubstratet (LG-DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B). Centrifugeres cellerne igen for 5 min på 390 x g og Fjern supernatanten.
  8. Resuspenderes celle med 10 mL af næringssubstratet (LG-DMEM suppleret med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B) og filtreres cellesuspension gennem en 100 µm filter.
  9. Tilføje 50 µL af 3% eddikesyre/methylene blå løsning (for røde blodlegemer lysis) til 50 µL af cellesuspension, bland løsningen og anvendes 10 µL til at tælle cellerne. Udføre celle regner med en hemocytometer. Derefter plade celler med en tæthed på 40.000 celler/cm2 dyrkningsmedium (LG-DMEM suppleret med 30% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B).
  10. Inkuber celler ved 37 ° C i et fugtigt atmosfære med 5% CO2 i 24 timer.
  11. Efter inkubationen vask celler med varm (37 ° C) phosphat bufferet saltvand (PBS) at fjerne celle debris og erstatte medierne med 10% FBS næringssubstratet med frisk tilsat ascorbinsyre-2-fosfat (25 µg/mL) og humane rekombinante fibroblast vækst faktor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subkultur ASCs på 90% confluence ved hjælp af standard 0,25% trypsin EDTA-oploesning (3 mL til en T175 kolbe). Efter 3-5 min, neutralisere 0,25% trypsin EDTA-opløsning med 10 mL af næringssubstratet (LG-DMEM suppleret med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B).
    Bemærk: Flow flowcytometri analyse ved hjælp af fælles ASC overflade markører og tri-lineage differentiering assays blev udført tidligere og afslørede at ASCs isoleret ved hjælp af denne protokol vises ASC særpræg21,22.
  13. Cellerne vaskes med 10 mL af næringssubstratet (LG-DMEM suppleret med 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin og 1,5 µg/mL ampothericin B) for en T175 kolben og centrifugeres celler for 8 min ved 250 x g. Fjern supernatanten og resuspend celler i 1 mL af næringssubstratet. Tælle celler med en hemocytometer.
  14. Plade celler i T175 kultur kolber med en tæthed på 8.000 celler/cm2.
  15. Fryse de resterende ASCs i flydende kvælstof med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) dyrkningsmedium før yderligere brug.

2. ASC ark forberedelse

  1. Pre pels thermo-responderende kultur retter (3,5 cm i diameter) med 1 mL af FBS, og derefter placere retterne i en inkubator ved 37 ° C i mindst 30 min før celle såning.
  2. Trypsinize ASCs ved hjælp af standard 0,25% trypsin EDTA løsning for 3-5 min (3 mL til en T175 kultur kolbe). Hvis der er nogen celle klumper efter trypsinization, skal du filtrere cellerne gennem en 100 µm filter før tælle.
  3. Neutralisere trypsin løsning med LG-DMEM suppleret med 10% FBS (10 mL til en T175 kolbe) og centrifuger cellesuspension i 8 min. ved 250 x g. Fjern supernatanten og resuspend celler i 1 mL af LG-DMEM suppleret med 10% FBS.
  4. Efter belægning thermo-responderende kultur retter med FBS, flytte retterne fra rugemaskinen til en opvarmning plade ved 37 ° C og fjern FBS fra fadet.
  5. Frø ASCs på 400.000 celler/cm2 (i alt, 3,52 × 106 celler fortyndet i 2 mL af næringssubstratet pr. parabol).
  6. Omhyggeligt distribuere cellerne så jævnt som muligt ved at forsigtigt svinge fadet.
  7. Kultur ASC ark i 48 timer ved 37 ° C i et fugtigt atmosfære med 5% CO2.
    Bemærk: Forsøg at minimere åbne døren til rugemaskine efter såning ASCs for at forhindre temperatur dråber, der kan forstyrre ASC ark dannelse eller forårsage for tidlig detachement dannede ASC ark.

3. delvis kolektomi og kolorektal anastomose

  1. Fremkalde og vedligeholde mandlige Wistar rotter (vejer mellem 250-350 g) med 1 L/min for isofluran (1.5-5%)/oxygen indånding og injicere 0,05 mg/kg buprenorphin intramuskulært.
  2. Når dyrene er under generel anæstesi, vurdere bedøvelsesmiddel dybde ved hjælp af refleks test. Gælde a-vitamin indeholdende øjet salve øjnene at forhindre tørhed. Når anæstesi anses for tilstrækkelig for kirurgi, aseptisk forberede maven ved barbering hår og sprøjtning det kirurgiske område to gange med 70% ethanol. Drapere maven med steril papir gardiner. Bruge en aseptisk teknik og vedligeholde det sterile felt under den hele kirurgisk procedure.
  3. Gøre en midterlinjen abdominal snit på 5 cm med en steril kirurgiske kniv størrelse 10 og udvide snit med Metzenbaum saks. Identificere og exteriorize kolonet og pakke kolonet væk fra resten af bughulen med saltvand fugtede gauzes. Identificere den rigtige, midten, og venstre kolik arterier i mesenteriet, ligefremt dissekere omkring hvert fartøj ved hjælp af Halsted myg og ligate hvert enkelt fartøj med ikke-resorberbare flettet silke 4/0.
  4. Isolere Colon segmentet mellem 1,0 cm aborally til coecum og 0,5 cm over den caudale mesenterica arterie. Transekttællinger gennem Sund tyktarmen ved hjælp af Metzenbaum saks. Efter resektion af Colon segment, bringe de proksimale og distale ender af tyktarmen sammen ved at indføre to lange vatsvabere trans-anally gennem den distale colon, og derefter ind i den proksimale kolon ende.
  5. Ved hjælp af en kirurgisk mikroskop, oprette en utilstrækkeligt syet ende til anastomose af en-lags invertere sutur ved hjælp af 5 afbrudt suturer (ikke-resorberbare monofilamenter polyamid 8/0). Placer de afbrudte suturer gennem alle lag af kolon væg og Placer knob extraluminally.
  6. Opdele rotter tilfældigt i kontrol eller ASC ark gruppe.

4. ASC ark Transplantation

  1. Tillad kultur retter at køle ned til stuetemperatur 40 min før i vivo transplantation, at lette ASC ark detachement.
    Bemærk: Efter detachement skrumpe ASC ark til ca 2 cm i diameter. ASC ark levedygtighed forbliver højt for mindst 3-6 h efter udstationering20.
  2. Fjerne næringssubstratet og erstatte det med 1 mL serum gratis LG-DMEM.
  3. Forsigtigt grab fælge af ASC ark med atraumatisk pincet og læg i fad-side af arket ASC på toppen af linjen Anastomotiske.
  4. Forsigtigt strække ud ASC lagen ca. 0,25 cm over og under linjen Anastomotiske ved hjælp af atraumatisk pincet og wrap ark omkring tyktarmen. Løft kolon op til wrap arket ASC omkring den dorsale side.
    Bemærk: ASC ark overholde spontant Anastomotiske linjen, er der ingen grund til at bruge væv lim eller nogen andre biomateriale. Kontrolgruppen modtager ikke nogen yderligere behandling.
  5. Fjerne bomuld svaberprøver og ændre handsker og instrumenter. Erstatte tyktarmen i maven. Luk maven-linea alba med et lag af kører suturer bruger resorberbare flettet polyglycolic syre 5/0. Sutur underhuden og cutis sammen i ét lag af kører suturer bruger resorberbare flettet polyglycolic syre 5/0.

5. postoperative evaluering og opfølgning

  1. Straks rehydrere dyr med en subkutan injektion af 5 mL varm saltvand efter operationen. Placere dyr under en varmelampe til at opretholde kropstemperaturen og overvåge vitale indtil dyr genvinde tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency.
    Bemærk: Dyr, der havde gennemgået kirurgi blev ikke returneret til selskab med andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt. Efter inddrivelsen, tillade fri adgang til vand og regelmæssig rotte chow. Til post-kirurgiske smertelindring, administrere 0,05 mg/kg buprenorphin subkutant hver 6-8 h i 3 dage. Ingen antibiotika blev administreret til enhver tid i denne undersøgelse.
  2. Få daglige kliniske evalueringer af velvære og vægt. En meget lav wellness score eller svær vægttab, bør dyrene aflives ved exsanguination via hjerte punktering mens stadig under anæstesi.
  3. Postoperative dag 3 eller dag 7, bedøver rotter igen med 1 L/min for isofluran (1.5-5%)/oxygen indånding uden buprenorphin, og udføre en re-laparotomi med et U-formet snit. Kontrollere underlivet for tegn på bughindebetændelse, forsnævring, fibrøst sammenvoksninger og tilstedeværelsen af bylder. Score sværhedsgraden af sammenvoksninger og byld både i maven og på området Anastomotiske.
  4. Bestemme den Anastomotiske bristende pres ved oppustning af luft i en lukket segmentet af tyktarmen herunder anastomose. Optage lufttryk og i stedet for brud, når den første air sive som sprængfyldt pres.
  5. Fjerne tyktarmen fra hvert ofrede dyr og lave det cut segmentet af tyktarmen - holdige kolorektal anastomose - med 4% buffered formaldehyd, efter af paraffin indlejring og skære tyktarmen i 4 μm tykt sektioner.
  6. Aflive dyr samtidig under anæstesi direkte efter indsamling af anastomose segment af exsanguination via hjerte punktering. Bekræfte dyrs død med manglende vejrtrækning bevægelse og et hjerteslag.
  7. Udføre histokemiske stainings såsom hæmatoxylin og Eosin og Picro Sirius rød og immunhistokemiske stainings med antistoffer mod menneskelige mitokondrier, rotte endotelceller (anti-CD34) og celler i immunsystemet (CD3 +, CD163 +).
  8. Digital dias til edb analyse og sammenligne de dyregrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et flowdiagram af denne undersøgelse, skildrer både ASC ark kultur og proceduren for kolon resektion og anastomose er vist i figur 1. Figur 2 viser ASC ark mikroskopiske morfologi og det makroskopiske udseende af arket ASC under og efter udstationering. Figur 3 viser de forskellige trin i ASC ark detachment og transplantation. Figur 4 viser tilstedeværelsen af arket ASC på Anastomotiske linje og forebyggelse af lækage 3 dage efter operationen.

Den opfølgende frist til kolorektal anastomose evaluering. De forskellige vurderinger er vist i tal og tabel. I forhold til kontroldyr, de transplanterede dyregrupper viste mindre hyppige Anastomotiske opspringning og lækage postoperative dag 3 og mindre hyppige absces dannelse postoperative dag 7. I forhold til kontroldyr, udvikler transplanterede dyrene ikke betydelige sammenvoksninger eller forsnævring dannelse. Tabel 1 viser de makroskopiske fund ved udgangen af følgende perioder i transplanterede og ikke-transplanteret dyr.

Figure 1
Figur 1: undersøgelse flowdiagram. A) ASCs blev isoleret og udvidet før såning på thermo-responderende kultur retter. ASCs var seedet med en tæthed på 400.000 celler/cm2 og kulturperler for 48 h før transplantation. På dagen for transplantation, ASC ark blev løsrevet ved at tillade thermo-responderende kultur parabol til køle ned til stuetemperatur i 30 min. B) ordningen af kirurgisk procedure; efter ligatur af leverer fartøjer er en delvis kolektomi og kolorektal anastomose udført. En ASC ark var svøbt omkring anastomose i gruppen ASC ark; a) caecum, b) terminal ileum, c) anus. Den skematiske oversigt over den kirurgiske procedure blev delvis tilpasset med tilladelse fra Wu Z. mfl. 24 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ASC ark før og efter udstationering. A) ASC ark i thermo-responderende kultur retter efter 48 h kultur 40 x forstørrelse. ASC plader er fremstillet ved dyrkning af ASCs på kommercielle thermo-responderende kultur retter. B-C) ASC ark under (B) og efter udstationering (C). Når thermo-responderende kultur retter fik lov til at køle ned til stuetemperatur, ASC ark spontant løsrevet fra skålen overfladen som en intakt ASC ark. Ingen enzymatisk behandling var nødvendig. Arket ASC reduceret efter udstationering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ASC ark transplantation. A) skildring af ASC ark orientering i thermo-responderende kultur parabol. 26 B) orientering af ASC ark efter transplantation. Parabol side af arket ASC blev placeret på toppen af linjen Anastomotiske serosal overflade (Anastomotiske linje er angivet med Kors). C) intra-operative visninger af de forskellige trin af transplantation. To atraumatisk pincet blev brugt til at opløfte arket ASC og pak det omkring Anastomotiske linje. Hvide pile angiver ASC ark placering. Billeder af transplantation var delvis tilpasset med tilladelse fra Sukho, P., mfl. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kolorektal anastomose makroskopiske og histologiske evaluering. A-B) sammenlignet med kontrolgruppen, makroskopiske observation viste reduceret lækage og byld dannelse på postoperative dag 3 (A) og 7 (B), henholdsvis. Hvide pile peger på Anastomotiske område og sorte pile peger på transplanterede ASC ark. C) repræsentant tværsnit af webstedet kolorektal anastomose i transplanterede dyr plettet med H & E. Ark struktur kunne identificeres på webstedet anastomose op til 7 dage efter operationen. Billederne blev dels tilpasset med tilladelse fra Sukho, P., mfl. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Postoperative dag 3 Postoperative dag 7
Kontrol (%) ASC ark (%) p-værdi Kontrol (%) ASC ark (%) p-værdi
Peritonitis 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Anastomotiske forstyrrelser 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Forsnævring 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Byld på anastomose 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Vedhæftning på anastomose 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Byld andre steder 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Vedhæftning andetsteds 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tabel 1: Postoperativ makroskopiske fund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastomotiske lækage er den mest alvorlige hændelse efter kolon resektion med en primær anastomose. Optimal teknikker til at forhindre Anastomotiske forstyrrelser og lækage stadig mangler. Lokal applikation af en matrix med biomaterialer er gennemført med varierende resultater25,26,27. Celle terapier sigter mod at lette væv reparation af væv udskiftning eller stimulation af lokale helbredelse gennem paracrine sekretion.

I denne model, rat var ASC ark transplantation teknisk succes. Klinisk og histologisk vurdering viste effektiviteten af arket ASC at mindske lækage efter kolon resektion med primær anastomose.

Transplantation af en ASC ark til kolorektal anastomoser er en ny tilgang i kolorektal kirurgi. I denne undersøgelse, for første gang blev en high-density ASC ark transplanteret. Valg for ASCs leveret som en celle ark var baseret på de tidligere rapporterede fordele ved celle ark teknologi28,29 over konventionelle celle transplantation teknikker. Derudover var valg for ASCs baseret på flere undersøgelser, som viste deres anti-inflammatoriske og trofiske evner, især i hjertemuskulaturen - og hud-helbredende11,12,19,32 .

ASC ark forberedelse og udstationering kan være udfordrende. I nogle ASC donorer, ASC ark løsrevet for tidligt fra kultur parabol og foldet, udelukker deres brug. I denne undersøgelse, var den præcise årsag til dette problem i disse specifikke donorer ikke er identificeret. Da et højt forbrug af næringssubstratet blev anmeldt i disse donorer, blev det antaget, at individuelle variationer i spredning sats kan spille en vigtig rolle. Serum belægning bistået i celle vedhæftning til overfladen. Sammen med omhyggelig fordeling af cellerne i kulturen opstod parabol og minimere åbning af inkubator døren efter såning ASCs (forhindrer temperatur dråber), mindre folde ASC ark. På denne måde blev ASC ark fra alle donorer med held transplanteret, bekræfter muligheden for teknikken.

På dagen for transplantation, de fleste ASC ark spontant frakoblet efter at tillade thermo-responderende kultur parabol til køle ned til stuetemperatur. Et begrænset antal ark dog ikke fuldt ud frigøre. Blid ryster kultur parabol eller bløde rødmen på fælgen ved hjælp af en pipette til sidst bistået i komplet afdelinger.

For vellykket ASC ark transplantation til kolorektal anastomoser skal flere kritiske skridt tages. Første, overdreven blod på webstedet anastomose bør fjernes for at sikre kontakt mellem ASC ark og serosal overflade. Andet, fad side af arket ASC skal placeres på den serosal overfladen af anastomose. Det er postuleret, at funktionen celle ark efter høst opretholdes på grund af bevarelsen af celle overflade proteiner og celle til celle junction proteiner. Derudover kan ASC ark evne til at spontant tiltræde den serosal overflade på kort tid lettes af tilstedeværelsen af deponerede ECM, der er produceret ved in vitro-kultur19,20,21. For det tredje bør størrelsen af arket ASC og kolon diameter sammenlignes giver mulighed for fuldstændig dækning af webstedet til anastomose. Ved større flader skal dækkes, kan brug af flere ark overvejes.

Der er nogle begrænsninger i denne protokol for ASC ark forberedelse og transplantation. Når du bruger thermo-responderende kultur retter for at forberede ASC ark, bør temperaturen strengt opretholdes ved 37 ° C under hele processen for at forhindre for tidlig detachement. Efter transplantation er ASC ark overlevelsesraten ukendt. Selvom tidligere eksperimenter viste, at ASCs var levedygtige på 3 dage efter operationen, mitokondrie-aktivitet af disse ASCs var formindsket på 7 dage efter operationen17. Den celle overlevelse sats og dosis effekt af transplantation er vigtige spørgsmål, der har brug for at blive behandlet i fremtidige undersøgelser. Observatør bias kan ikke udelukkes helt, da arket ASC kan identificeres makroskopisk og mikroskopisk på postoperativ evalueringer. Selvom transplanterede dyr ikke viser mere postoperative kan vedhæftning dannelse i forhold til at kontrollere dyr17, evaluering af kolorektal anastomose blive hæmmet af tilstedeværelsen af disse intra-abdominalt sammenvoksninger.

En fordel ved denne ansøgning teknik er, at det er simpel og nem at udføre. Med kun en lille mængde af praksis og ved hjælp af universelle atraumatisk pincet, bør tarm kirurger kan ombryde arket ASC omkring anastomose. Derudover er kirurgi tid ikke stærkt påvirket da ASC ark straks tiltræde værten væv. Desuden, når du bruger ASC ark, ingen syntetiske biomateriale forbliver i kroppen minimere risikoen for en udenlandsk organ reaktion.

Transplanterede ASCs organiseret i celle ark demonstreret deres evne til at reducere kolorektal anastomose lækage. I betragtning af disse lovende resultater, fremtidige undersøgelser bør gennemføres for at vurdere langsigtede virkninger både for terapeutiske og sikkerhedsmæssige grunde. Udover det, er blevet beskrevet flere metoder til at ændre de terapeutiske virkninger af ASC ark som inducerende overekspression af vaskulær endotel vækstfaktor30. Disse metoder kan yderligere øge væv reparation ved hjælp af ASC ark og bør overvejes i fremtidige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev gennemført i mangel af nogen kommercielle eller finansielle forhold, der kan fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelig for, at Prof. Dr. ser Hovius, Dr. M.A.M. Mureau og alle kirurger plastikkirurgi departement for indsamling af subkutane fedtvæv. P. Sukho er støttet af en bevilling fra The Holland Fellowship program (NFP-12/435) under forsøgets gennemførelse. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens understøttes af tilskud fra hollandske Arthritis Foundation (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

Tags

Medicin spørgsmål 138 kolektomi celle ark fedtvæv-afledte stamceller celle transplantation celleterapi anastomose lækage forebyggelse i vivo
Transplantation af fedtvæv-afledte stamceller ark til at reducere udsivningen efter delvis kolektomi i en rotte Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter