Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantatie van stamcellen adipeus weefsel afkomstige blad om lekkage na gedeeltelijke Colectomy in een Rat-Model

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

De voorbereiding en de transplantatie van vetweefsel afgeleid cel van de stam (ASC) bladen op onvoldoende ingehecht colorectal anastomoses in een rat-model wordt gepresenteerd. Deze nieuwe aanvraag blijkt dat ASC bladen colorectal wapendrager lekkage kunnen verminderen.

Abstract

Anastomotic lekkage is een rampzalige complicatie na colorectale chirurgie. Hoewel de huidige methoden voor de preventie van de lekkage hebben verschillende niveaus van klinische werkzaamheid, zijn ze tot nu onvolmaakte oplossingen. Stamcel therapie met behulp van ASC bladen kan een oplossing bieden voor dit probleem. ASC's worden beschouwd als zo veelbelovende kandidaten voor de bevordering van genezing vanwege hun trofische en immunomodulerende eigenschappen weefsel. Hier bieden we methoden voor het produceren van high-density ASC bladen, die op een colorectale anastomosis in een rat-model om de lekkage worden getransplanteerd. ASC's gevormd cel bladen in thermo-responsieve cultuur gerechten die gemakkelijk kunnen worden losgemaakt. Op de dag van de transplantatie, werd een gedeeltelijke colectomy met een 5-hechtdraad colorectal wapendrager uitgevoerd. Dieren werden onmiddellijk getransplanteerd met 1 ASC blad per rat. ASC bladen nageleefd spontaan de wapendrager zonder lijm, Sutuur (geologie) of een biomaterial. Dierlijke groepen werden opgeofferd 3 en 7 dagen postoperatief. Vergeleken met getransplanteerde dieren, was de incidentie van anastomotic abcessen en lekkage hoger in de controledieren. In ons model de transplantatie van ASC vellen na colorectale wapendrager was succesvol en gekoppeld aan een lager tarief van de lekkage.

Introduction

Gedeeltelijke colectomy met een primaire anastomose is een vaak uitgevoerde operatie die kan worden gedaan voor vele ziekten van de dikke darm zoals colorectal kanker, ziekte van Crohn en diverticulitis1,2. De meest gevreesde complicatie na colorectale wapendrager anastomotic lekkage3 is. Hoewel verschillende risicofactoren die met anastomotic lekken zijn vastgesteld, blijven oplossingen ter voorkoming van lekkage unkown4,5.

Adipeus weefsel-afgeleide stromale cellen (ASC's) worden geassocieerd met anti-inflammatoire en trofische eigenschappen6,7, waardoor deze cellen veelbelovende kandidaten voor regeneratieve therapie8. De effectiviteit van ASC's ter bevordering van genezing van weefsel was te zien in verschillende weefsels zoals cardiale spier, huid en slokdarm9,10,11,12,13. Echter, er zijn weinig rapporten over het gebruik van ASC's ter bevordering van de intestinale genezing. Lokale transplantatie van ASC's aan experimentele colorectal anastomoses via ASC beklede biosutures of serosal injecties van ASC's belette niet dat anastomotic lekkage ondanks een gunstiger anastomotic toonden ofwel geen verbetering in de genezing van14 genezing van15.

Lokale transplantatie van ASC's in suspensie of gecombineerd met biomaterialen kunnen worden gekoppeld aan onvoldoende cel retentie of een gebrekkige verdeling van getransplanteerde cellen11. Cel blad technologie16,17 biedt een innovatieve methode van ASC levering18,19. Dus, in een eerdere studie, een nieuwe benadering werd voorgesteld in welke ASC's georganiseerd in een cel blad kan worden toegepast op experimentele colorectal wapendrager20. Deze studie aangetoond dat ASC blad transplantatie succesvol is in het terugdringen van colorectale wapendrager lekkage na gedeeltelijke colectomy in een rat-model. Dit artikel meldt ASC blad voorbereiding en chirurgische transplantatie techniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Subcutane abdominale adipeus weefsel is verkregen uit menselijke donors met goedkeuring van de medisch ethische Commissie (MEC-2014-092 van de #), Erasmus MC universitair medisch centrum, Rotterdam, Nederland. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van dier experimenten, Erasmus MC, universitair medisch centrum, Rotterdam, Nederland (133-14-01).

1. menselijke ASC's isolatie en cultuur

  1. 3 mL van isolatie medium voorbereiden op 1 g van vetweefsel. Mix lage glucose Dulbecco is bewerkt Eagle's medium (LG-DMEM) met 10 g/L boviene Serum albumine (BSA) en 1 g/L collagenase type 1.
  2. Ontleden van menselijke buik onderhuids vetweefsel (n = 8, alle vrouwelijke, gemiddelde leeftijd 40 ± 9 jaar oud) te kleine stukken (0.5 cm) met behulp van een steriele chirurgische mes grootte 10, Adson-bruine weefsel pincet en Metzenbaum schaar in een steriele biologische SafetyCabinet.
  3. Bewaar het ontleed weefsel in een steriele glazen fles voor de opslag van de media. Weeg de totale hoeveelheid ontleed weefsel en de spijsvertering te beginnen met het medium bereid isolatie (50 g adipeus weefsel met 150 mL van isolatie medium per fles). Het protocol kan hier worden onderbroken doordat de fles met de ontleed adipeus weefsel en isolatie medium bij 4 ° C op een mixer roller's nachts. Dan prewarm de fles de volgende dag naar kamer temperatuur 25 ° C gedurende 15 minuten voordat u verdergaat met de volgende stap.
    Opmerking: Subcutane abdominale adipeus weefsel was als overgebleven materiaal van donors verlangde een borst reconstructie-operatie ondergaan met goedkeuring van het Erasmus MC medisch ethische Commissie (# MEC-200) en volgens de Code of Conduct: "goede secundaire gebruik van menselijk weefsel"(< http://www.federa.org>). Overgebleven adipeus weefsel werd alleen gebruikt van donoren die niet opt-out naar secundair gebruik.
  4. Verteren de ontleed adipeus weefsel in een steriele media opslag fles in een shaker-incubator bij 150 rpm en 37 ° C gedurende 1 uur.
  5. Verdeel de verteerd oplossing in 50 mL tubes en de buizen voor 10 min op 390 x g centrifugeren.
  6. Bereiden kweekmedium: LG-DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B.
  7. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 20 mL gestolde voedingsbodem (LG-DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B). De cellen opnieuw voor 5 min op 390 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
  8. Resuspendeer de pellet cel met 10 mL gestolde voedingsbodem (LG-DMEM aangevuld met 10% FBS en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B) en filtreer de celsuspensie door een 100 µm filter.
  9. 50 µL van 3% azijnzuur/methyleen blauw oplossing (voor lysis van de rode bloedcellen) toevoegen aan 50 µL celsuspensie, meng de oplossing en de cellen tellen met 10 µL. Cel tellen met een hemocytometer uit te voeren. Vervolgens plaat de cellen bij een dichtheid van 40.000 cellen/cm2 in een kweekvloeistof (LG-DMEM aangevuld met 30% FBS en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B).
  10. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  11. Na de incubatie, wassen de cellen met warm (37 ° C) fosfaat zoutoplossing (PBS) cel puin verwijderen en vervangen van de media met 10% FBS kweekmedium gebufferde met vers toegevoegd ascorbinezuur-2-fosfaat (25 µg/mL) en menselijke recombinante fibroblast groei factor 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subcultuur ASC's bij 90% samenvloeiing met behulp van de standaard 0.25% trypsine EDTA-oplossing (3 mL voor een T175 kolf). Na 3-5 min, neutraliseren de 0,25% trypsine EDTA-oplossing met 10 mL gestolde voedingsbodem (LG-DMEM aangevuld met 10% FBS en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B).
    Opmerking: Stroom cytometry analyse met behulp van gemeenschappelijke ASC oppervlakte markeringen en tri-bloedlijn differentiatie testen werden uitgevoerd eerder en geopenbaard dat ASC's geïsoleerd met behulp van dit protocol weergegeven ASC specificiteit21,22.
  13. De cellen met 10 mL gestolde voedingsbodem (LG-DMEM aangevuld met 10% FBS en 50 µg Mo/mL gentamicine 1,5 µg/mL ampothericin B) voor een T175 kolf wassen en centrifugeren van de cellen gedurende 8 minuten op 250 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL gestolde voedingsbodem. Telt de cellen met een hemocytometer.
  14. Plaat van de cellen in de T175 cultuur kolven bij een dichtheid van 8.000 cellen/cm2.
  15. Het bevriezen van de resterende ASC's in vloeibare stikstof met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in een kweekvloeistof voor verder gebruik.

2. ASC blad voorbereiding

  1. Vooraf jas thermo-responsieve cultuur gerechten (3,5 cm doorsnede) met 1 mL FBS, dan plaatst u de gerechten in een incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór het zaaien van de cel.
  2. Trypsinize ASC's met behulp van de standaard 0.25% trypsine EDTA-oplossing gedurende 3-5 min. (3 mL voor een T175 cultuur kolf). Als er klontjes cel na trypsinebehandeling, filteren de cellen door een 100 µm filter voordat het tellen.
  3. Neutraliseren van de trypsine oplossing met LG-DMEM aangevuld met 10% FBS (10 mL voor een T175 kolf) en centrifuge de celsuspensie voor 8 min op 250 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL LG-DMEM aangevuld met 10% FBS.
  4. Na de coating van de thermo-responsieve cultuur-gerechten met de FBS, de gerechten uit de incubator naar een opwarming van de aarde plaat bij 37 ° C en FBS verwijderen uit de schotel.
  5. Zaad ASC's op 400.000 cellen/cm2 (in totaal, 3,52 × 106 cellen verdund in 2 mL gestolde voedingsbodem per schotel).
  6. Zorgvuldig de cellen zo gelijkmatig verdelen mogelijk door zachtjes swingende de schotel.
  7. Cultuur ASC bladen voor 48 uur bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2.
    Opmerking: Probeer te minimaliseren de deur van de incubator na het zaaien van ASC's om te voorkomen dat de temperatuur druppels die kunnen interfereren met ASC vel vorming of voortijdige detachement van gevormde ASC vellen.

3. gedeeltelijke Colectomy en colorectale wapendrager

  1. Induceren en onderhouden van mannelijke Wistar ratten (gewicht tussen 250-350 g) met 1 L/min van Isofluraan (1.5-5%)/oxygen inademing en injecteren van 0,05 mg/kg buprenorfine intramuscularly.
  2. Zodra de dieren onder narcose zijn, verdoving diepte met behulp van reflex testen te beoordelen. Vitamine A met oog zalf toepassen in de ogen te voorkomen van droogte. Wanneer de verdoving wordt beschouwd als voldoende voor chirurgie, aseptisch bereiden de buik door scheren haren en bespuiting van het chirurgische gebied tweemaal met 70% ethanol. Drape de buik met steriel papier gordijnen. Gebruik een aseptische techniek en handhaven van de steriele veld tijdens de hele chirurgische ingreep.
  3. Maken van een incisie middellijn abdominale van 5 cm met een steriele chirurgische mes grootte 10 en uitbreiden van de incisie met Metzenbaum schaar. Identificeren en exteriorize van de dikke darm en verpakken van de dikke darm af van de rest van de buikholte met zoute bevochtigd gauzes. Identificeren van de juiste, Midden en onverbloemd koliek slagaders in het mesenterium verliet ontleden rond elk vaartuig met behulp van Halsted mug en afbinden van individuele vaartuigen met niet-absorbeerbare gevlochten zijde 4/0.
  4. Isoleren van het Colon segment tussen 1,0 cm aborally tot de blindedarm en 0,5 cm boven de caudal mesenterische slagader. Transect via gezonde dubbelpunt met behulp van Metzenbaum-schaar. Na de resectie van het Colon segment, samenbrengen van de proximale en distale uiteinden van de dikke darm door de invoering van twee lange katoenen wissers trans-anaal door de distale dikke darm en vervolgens naar het einde van de proximale dikke darm.
  5. Maak een chirurgische Microscoop met een onvoldoende sutured end-to-end wapendrager door één-laag omkeren wordt met behulp van 5 onderbroken hechtingen (niet-absorbeerbare monofilamenten polyamide 8/0). Plaats de onderbroken hechtingen door alle lagen van de wand van de dikke darm en plaats de knopen extraluminally.
  6. Verdeel de rats willekeurig in de controle of ASC blad groep.

4. ASC blad transplantatie

  1. Laat de gerechten van de cultuur om af te koelen tot kamertemperatuur 40 min vóór in vivo transplantatie, ter vergemakkelijking van de ASC blad detachement.
    Opmerking: Na het Detachement, ASC bladen krimpen tot ongeveer 2 cm in diameter. ASC blad levensvatbaarheid blijft hoog voor ten minste 3-6 uur na de detachement20.
  2. Verwijder de kweekmedium en vervang het met 1 mL serum Gratis LG-DMEM.
  3. Zachtjes pak van de randen van het ASC blad met een atraumatische Tang en plaats de schotel-kant van het blad van de ASC op de top van de anastomotic lijn.
  4. Zorgvuldig stuk uit de ASC blad ongeveer 0,25 cm boven en onder de anastomotic lijn met behulp van de atraumatische pincet en wrap het blad rond de dikke darm. Til de dikke darm tot wrap de ASC blad rond de dorsale zijde.
    Opmerking: ASC vellen aanhangen spontaan de anastomotic lijn, er is geen noodzaak om het gebruik van weefsel lijm of elke andere biomaterial. De controlegroep krijgt geen extra behandeling.
  5. Verwijder de swabs van katoen en wijzigen van de handschoenen en instrumenten. Vervang de dubbele punt in de buik. Sluiten de buik-linea alba met één laag uitgevoerd met behulp van hechtingen absorbeerbare gevlochten polyglycolic zuur 5/0. Suture van de subcutis en de cutis samen in één laag uitgevoerd met behulp van hechtingen absorbeerbare gevlochten polyglycolic zuur 5/0.

5. post-operatieve evaluatie en Follow-up

  1. Onmiddellijk hydrateren de dieren met een subcutane injectie 5 mL warme zoutoplossing postoperatief. Plaats de dieren onder een warmte lamp te handhaven van de lichaamstemperatuur en de vitale tekenen volgen totdat dieren weer voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding.
    Opmerking: Dieren die een operatie had ondergaan werden niet teruggegeven aan het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld. Na herstel, kunt u gratis toegang tot water en gewone rat chow. Voor post chirurgische pijn, beheren buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan elke 6-8 h voor 3 dagen. Geen antibiotica werden toegediend op elk gewenst moment in deze studie.
  2. Dagelijkse klinische evaluaties van wellness- en gewicht te verkrijgen. In geval van een zeer lage Wellness-score of ernstig gewichtsverlies, moeten de dieren worden euthanized door exsanguination via cardiale punctie terwijl nog steeds onder verdoving.
  3. Op postoperatieve dag 3 of dag 7, anesthetize de ratten weer met 1 L/min. van Isofluraan (1.5-5%)/oxygen inademing zonder buprenorfine, en het uitvoeren van een re-laparotomie met een U-vormige insnijding. Controleer de buik op de tekenen van peritonitis, strictuur, vezelig verklevingen en de aanwezigheid van abcessen. Score van de ernst van verklevingen en abces in de buik en op het anastomotic gebied.
  4. Bepaal de anastomotic barst druk door de toediening van lucht in een gesloten segment van de dikke darm met inbegrip van de anastomose. Het opnemen van de luchtdruk en de plaats van de breuk wanneer de eerste lucht lekken als barstdruk.
  5. De dikke darm uit elk geofferde dier te verwijderen en monteren van het gesneden segment van de dikke darm - bevattende de colorectale wapendrager - met 4% gebufferd formaldehyde, na door paraffine insluiten en snijden van de dikke darm in 4 μm dik secties.
  6. De dieren terwijl onder verdoving euthanaseren direct na het verzamelen van de anastomose segment door exsanguination via cardiale punctie. Dier dood met de afwezigheid van de ademhaling, beweging en een hartslag te bevestigen.
  7. Histochemische technieken zoals haematoxyline en eosine en Picro Sirius rode en immunohistochemische technieken met antilichamen tegen menselijke mitochondriën, rat endotheliale cellen (anti-CD34) en de cellen van het immuunsysteem (CD3 +, CD163 +) uitvoeren.
  8. Digitaliseren van de dia's voor geautomatiseerde analyse en vergelijk de dierlijke groepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een stroomschema van deze studie afschilderend zowel ASC blad cultuur en de procedure voor dubbele punt resectie en wapendrager is afgebeeld in Figuur 1. Figuur 2 toont ASC blad microscopische morfologie en het macroscopische uiterlijk van de ASC-vel tijdens en na het detachement. Figuur 3 toont de verschillende stappen van ASC blad detachement en -transplantatie. Figuur 4 toont de aanwezigheid van het ASC blad op de anastomotic lijn en voorkoming van lekkage 3 dagen postoperatief.

De follow-up termijn voor colorectal wapendrager evaluatie. De verschillende beoordelingen worden in de cijfers en de tabel weergegeven. Vergeleken met de controledieren, getransplanteerde dieren vertoonden de frequente anastomotic dehiscentie en lekkage op postoperatieve dag 3 steeds minder frequent abces vorming op postoperatieve dag 7. Vergeleken met de controledieren, deed getransplanteerde dieren niet ontwikkelen aanzienlijke verklevingen of strictuur vorming. Tabel 1 toont de macroscopische bevindingen aan het einde van de follow-up van de periodes in getransplanteerde en niet-getransplanteerde dieren.

Figure 1
Figuur 1: studie stroomschema. A) ASC's werden geïsoleerd en uitgebreid vóór het zaaien op thermo-responsieve cultuur gerechten. ASC's waren zaadjes bij een dichtheid van 400.000 cellen/cm2 en gekweekte gedurende 48 uur vóór de transplantatie. Op de dag van transplantatie, ASC blad waren gescheiden doordat het thermo-responsieve cultuur schotel om af te koelen tot kamertemperatuur voor 30 min. B) regeling van de chirurgische procedure; na Afbinding van vaartuigen leveren wordt een gedeeltelijke colectomy en colorectale anastomose uitgevoerd. Een blad van ASC was gewikkeld rond de anastomosis in de ASC blad groep; b) terminal ileum, caecum a), c) de anus. Het schematisch overzicht van de chirurgische procedure werd deels aangepast met toestemming van Wu Z. et al. 24 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: ASC blad voor en na detachement. A) ASC blad in thermo-responsieve cultuur gerechten na 48u van cultuur 40 x vergroting. ASC bladen werden verkregen door het kweken van ASC's op commerciële thermo-responsieve cultuur gerechten. B-C) ASC blad tijdens (B) en na detachement (C). Wanneer het thermo-responsieve cultuur gerechten werden toegestaan om af te koelen tot kamertemperatuur, het blad van de ASC spontaan losgekoppeld van de schotel oppervlakte als één intact ASC blad. Geen enzymatische behandeling was noodzakelijk. De grootte van het blad van de ASC verminderd na het detachement. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: ASC blad transplantatie. A) afbeelding van ASC blad in de stand van de thermo-responsieve cultuur schotel. 26 B) oriëntatie van ASC blad na de transplantatie. De kant van de schotel van het ASC blad werd gelegd op de top van het serosal oppervlak van de anastomotic lijn (anastomotic lijn is met kruisjes aangegeven). C) intraoperatieve standpunten van de verschillende stappen van de transplantatie. Twee atraumatische pincet werden gebruikt om het verheffen van het ASC blad en wikkel het rond de anastomotic lijn. Witte pijlen geven aan ASC blad locatie. De beelden van transplantatie waren deels aangepast met toestemming van Sukho, P., et al.. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Colorectal wapendrager macroscopische en histologische evaluatie. A-B) in vergelijking met de controlegroep, macroscopische observatie toonde verminderd lekkage en abces vorming op postoperatieve dag 3 (A) en 7 (B), respectievelijk. Witte pijlen wijzen op anastomotic gebied en zwarte pijlen wijzen op getransplanteerde ASC bladen. C) vertegenwoordiger dwarsdoorsneden van de site van de colorectale anastomosis in getransplanteerde dieren gekleurd met H & E. De structuur van het blad kon worden geïdentificeerd op de site van de anastomose omhoog tot 7 dagen postoperatief. De beelden waren deels aangepast met toestemming van Sukho, P., et al.. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Postoperatieve dag 3 Postoperatieve dag 7
Controle (%) ASC blad (%) p-waarde Controle (%) ASC blad (%) p-waarde
Peritonitis 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Verstoring van de anastomotic 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0.002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Strictuur 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Abces bij wapendrager 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0.04
Hechting op wapendrager 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Abces elders 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Hechting elders 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tabel 1: Postoperatieve macroscopische bevindingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastomotic lekkage is de meest ernstig ongewenst voorval na resectie van de dikke darm met een primaire anastomose. Optimale technieken ter voorkoming van verstoring van de anastomotic en lekkage zijn nog steeds ontbreekt. Lokale toepassing van een matrix van biomaterialen verricht, met wisselende resultaten25,-26,27. Het doel van celtherapieën is om weefselherstel door vervanging van het weefsel of het stimuleren van lokale genezing door afscheiding van de paracrine te vergemakkelijken.

In dit model rat was ASC blad transplantatie technisch succesvol. Klinische en histologische evaluaties aangetoond dat de effectiviteit van het blad van de ASC vermindering van lekkage na resectie van de dikke darm met primaire anastomose.

De transplantatie van een blad van de ASC om colorectal anastomoses is een nieuwe benadering in de colorectale chirurgie. In deze studie, voor de eerste keer was een high-density ASC blad getransplanteerd. De keuze voor ASC's geleverd als een cellaag was gebaseerd op de eerder gerapporteerde voordelen van cel blad technologie28,29 ten opzichte van conventionele cel transplantatie technieken. Bovendien, was de keuze voor ASC's gebaseerd op meerdere studies die aangetoond van hun anti-inflammatoire en trofische capaciteiten, met name in de hartspier - en huid-healing11,12,19,32 .

ASC blad voorbereiding en detachement kan worden uitdagende. In sommige donoren ASC ASC bladen voortijdig losgekoppeld van de cultuur-schotel en gevouwen, zich verzet tegen het gebruik ervan. In deze studie werd de precieze oorzaak voor dit probleem in deze specifieke donors niet geïdentificeerd. Aangezien een hoge consumptie van kweekmedium was meegedeeld in deze donoren, er werd van uitgegaan dat de individuele variaties in proliferatie een belangrijke rol kunnen spelen. Serum coating bijgestaan in cel adhesie aan de oppervlakte. Samen met zorgvuldige verdeling van de cellen in de cultuur schotel en het minimaliseren van de opening van de incubator deur na het zaaien van ASC's (het voorkomen van temperatuur druppels), minder vouwen van de ASC-bladen is opgetreden. Op deze manier werden met succes ASC bladen van alle donoren getransplanteerd, bevestiging van de haalbaarheid van de techniek.

Op de dag van de transplantatie vrijstaande meeste ASC bladen spontaan na het toestaan van de thermo-responsieve cultuur schotel om af te koelen tot kamertemperatuur. Een beperkt aantal bladen deed echter niet volledig losgekoppeld. Zacht schudden van de cultuur schotel of zachte afboeken op de rand met behulp van een precisiepipet uiteindelijk bijgestaan in volledige detachementen.

Voor succesvolle ASC blad transplantatie aan colorectal anastomoses, verschillende kritische stappen moeten worden aangepakt. Eerste, overmatig bloed aan de wapendrager-site moet worden verwijderd zodat het contact tussen de ASC-blad- en het serosal oppervlak. Ten tweede, de kant van de schotel van het ASC blad moet worden gelegd op het serosal oppervlak van de anastomose. Het is gepostuleerd dat de functie van de cel bladen na de oogst wordt gehandhaafd vanwege het behoud van de oppervlakte eiwitten cel en cel-naar-cel junction eiwitten. Bovendien, kan de mogelijkheid van ASC vellen spontaan aan te houden het serosal oppervlak in een korte tijd worden vergemakkelijkt door de aanwezigheid van gedeponeerde ECM die wordt geproduceerd tijdens de in vitro cultuur19,20,21. Ten derde, moet de grootte van het ASC blad en de diameter van de dikke darm vergelijkbaar met volledige dekking van de anastomose site toestaan. Bij grotere oppervlakken worden gedekt moeten, kan het gebruik van meerdere bladen worden beschouwd.

Ziedaar zitten sommige beperktheid van dit protocol voor ASC blad voorbereiding en -transplantatie. Bij het gebruik van thermo-responsieve cultuur gerechten te bereiden van het blad van de ASC, moet de temperatuur strikt worden gehandhaafd bij 37 ° C gedurende het hele proces tot het voorkomen van voortijdige detachement. Na de transplantatie is de overlevingskansen van de ASC-blad onbekend. Hoewel eerdere experimenten toonden dat ASC's levensvatbare op 3 dagen postoperatief, mitochondriale activiteit van deze ASC's was afgenomen op 7 dagen postoperatief17. De cel overleving tarief en dosis effect van de transplantatie zijn belangrijke vragen die moeten worden aangepakt in de toekomst studies. Waarnemer bias te niet volledig uit sluiten, aangezien het ASC blad kan worden geïdentificeerd macroscopisch en microscopisch op post-operatieve evaluaties. Hoewel getransplanteerde dieren bleek niet meer postoperatieve kan hechting vorming in vergelijking met de controle van dieren17, de evaluatie van de colorectale wapendrager worden gehinderd door de aanwezigheid van deze intra-abdominale verklevingen.

Een voordeel van deze techniek van toepassing is dat het is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren. Met slechts een kleine hoeveelheid van de praktijk en met behulp van universele atraumatische pincet, moeten intestinale chirurgen zitten kundig voor wikkel het ASC blad rond de anastomose. Daarnaast is chirurgie tijd niet sterk beïnvloed omdat ASC bladen onmiddellijk aan host weefsels voldoen. Bovendien, wanneer met behulp van ASC sheets, geen synthetische biomaterial blijft in het lichaam minimaliseren van het risico van een vreemd lichaam reactie.

Getransplanteerde ASC's georganiseerd in cel bladen hun capaciteit om colorectal wapendrager lekkage aangetoond. Met het oog op deze veelbelovende resultaten, toekomstige studies moeten worden verricht om te evalueren van de effecten op lange termijn zowel voor therapeutische en veiligheidsredenen. Daarnaast zijn verschillende methoden beschreven om te wijzigen de therapeutische effecten van ASC bladen zoals inducerende overexpressie van vasculaire endotheliale groeifactor30. Deze methoden kunnen versterken met behulp van ASC sheets weefselherstel en in de toekomst studies moeten worden beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd bij gebrek aan een commerciële of financiële relatie die zou kunnen worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr. M.A.M. Mureau en alle chirurgen van de Vakgroep plastische chirurgie voor het verzamelen van onderhuids vetweefsel. P. Sukho wordt ondersteund door een subsidie van de Nederlandse Fellowship program (NFP-12/435), tijdens de uitvoering van de studie. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens wordt ondersteund door subsidies van de Nederlandse stichting van de artritis (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

Tags

Geneeskunde kwestie 138 Colectomy cellaag adipeus weefsel-afgeleide cellen van de stam cel transplantatie celtherapie wapendrager lekkage preventie in vivo
Transplantatie van stamcellen adipeus weefsel afkomstige blad om lekkage na gedeeltelijke Colectomy in een Rat-Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter