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Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Published: August 11, 2018 doi: 10.3791/57213
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 4, 1,6, 1, 5, 1,5
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

Summary

A preparação e a transplantação de lençóis de células-tronco (ASC) derivado de tecido adiposo para anastomoses Colorretais insuficientemente suturados em um modelo do rato é apresentado. Esta aplicação romance mostra que folhas ASC podem reduzir o vazamento de anastomose colorretal.

Abstract

Anastomótica escapamento é uma complicação catastrófica após cirurgia colorectal. Embora os métodos atuais para prevenção de vazamento tem diferentes níveis de eficácia clínica, eles são até agora imperfeitas soluções. Terapia de células-tronco, usando folhas de ASC poderia fornecer uma solução para este problema. ASCs são considerados candidatos mais promissores para a promoção do tecido de cicatrização devido às suas propriedades tróficas e imunomoduladores. Aqui, nós fornecemos métodos para produzir folhas ASC de alta densidade, que são transplantadas para uma anastomose colorretal em um modelo do rato para reduzir o vazamento. ASCs formaram folhas de célula em pratos de cultura thermo-responsivo que poderiam facilmente ser desanexados. No dia do transplante, foi realizada uma colectomia parcial com uma anastomose colorretal 5-sutura. Os animais foram transplantados imediatamente com 1 folha ASC por rato. Folhas ASC aderiram espontaneamente para a anastomose sem qualquer cola, sutura ou qualquer biomaterial. Grupos de animais foram sacrificados 3 a 7 dias no pós-operatório. Em comparação com animais transplantados, a incidência de abscessos anastomótica e escapamento foi maior nos animais controle. Em nosso modelo, o transplante de folhas ASC após anastomose colorretal foi bem sucedida e associado uma menor taxa de fugas.

Introduction

Colectomia parcial com uma anastomose primária é comumente realizada cirurgia que pode ser feita para muitas doenças que afetam o cólon como câncer colorretal, doença de Crohn e diverticulite1,2. A mais temida complicação após anastomose colorretal é fuga anastomótica3. Embora tenham sido identificados vários factores de risco associados a vazamentos anastomótica, soluções para a prevenção de vazamento permanecem unkown4,5.

Tecido adiposo-derivado de células do estroma (ASCs) estão associadas com propriedades anti-inflamatórias e trófico6,7, que faz com que estas células prometendo candidatos para terapias regenerativas8. A eficácia de ASCs para promover a cicatrização tecidual foi mostrada em vários tecidos como o músculo cardíaco, pele e esôfago9,10,11,12,13. No entanto, existem poucos relatos sobre o uso de ASCs para promover a cicatrização intestinal. Transplante de local de ASCs para anastomoses Colorretais experimentais através de biosutures ASC-revestido ou serosas injeções de ASCs não mostraram nenhuma melhora ou na cura de14 ou não impediu a fuga anastomótica apesar de um mais favorável anastomótica cura de15.

Transplante de local de ASCs em suspensão ou combinado com biomateriais podem ser associados com retenção insuficiente ou uma distribuição inadequada de células transplantadas11. Célula folha tecnologia16,17 oferece um método inovador de ASC entrega18,19. Portanto, em um estudo anterior, uma nova abordagem foi proposta na quais ASCs organizados em uma célula de folha poderá ser aplicada na anastomose colorretal experimental20. Este estudo demonstrou que o transplante de folha ASC é bem sucedido em reduzir o vazamento de anastomose colorretal após colectomia parcial em um modelo do rato. Este artigo relata a elaboração de folha ASC e técnica cirúrgica de transplante.

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Protocol

Tecido adiposo abdominal subcutâneo foi obtido de doadores humanos com aprovação do Comité de ética médica (#MEC-2014-092), Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Holanda. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê ético da experimentação Animal, Erasmus MC University Medical Center, Rotterdam, Países Baixos (133-14-01).

1. cultura e isolamento de ASCs humana

  1. Prepare-se 3 mL de meio de isolamento para 1 g de tecido adiposo. Mix baixa glicose Dulbecco está meio modificado águia (LG-DMEM) com 10 g/L bovina albumina de soro (BSA) e colagenase 1 g/L do tipo 1.
  2. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo abdominal de humano (n = 8, todos do sexo feminino, média de idade 40 ± 9 anos de idade) em pedaços pequenos (0,5 cm) usando um tamanho de lâmina cirúrgica estéril 10, pinça de Adson-Brown tecido e tesoura Metzenbaum em uma SafetyCabinet biológica estéril.
  3. Armazene o tecido dissecado em uma garrafa de armazenamento de mídia de vidro estéril. Pesar a quantidade total de tecido dissecado e iniciar a digestão com o meio de isolamento preparado (50 g de tecido adiposo com 150 mL de meio de isolamento por garrafa). O protocolo pode ser pausado aqui armazenando a garrafa com a dissecado de tecido adiposo e meio de isolamento a 4 ° C durante a noite em um misturador de rolos. Em seguida escaldar a garrafa no dia seguinte à temperatura de 25 ° C durante 15 minutos antes de continuar com a próxima etapa.
    Nota: Tecido adiposo abdominal subcutâneo obteve-se como material de sobra de doadores submetidos à cirurgia de reconstrução de mama com aprovação do Erasmus MC médica ética Comitê (# MEC-200) e de acordo com o código de conduta: "uso secundário adequado de tecido humano"(< http://www.federa.org>). Utilizou-se apenas restos de tecido adiposo de doadores que não opt-out para uso secundário.
  4. Digeri o tecido adiposo dissecado em uma garrafa de armazenamento de mídia de vidro estéril em uma abanador-incubadora a 150 rpm e 37 ° C, durante 1 h.
  5. Divida a solução digerida em tubos de 50 mL e centrifugar os tubos por 10 min a 390 x g.
  6. Preparar o meio de cultura: LG-DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), a 50 µ g/mL gentamicina e a 1,5 µ g/mL ampothericin B.
  7. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), a 50 µ g/mL gentamicina e a 1,5 µ g/mL ampothericin B). Centrifugar as células novamente por 5 min a 390 x g e remover o sobrenadante.
  8. Ressuspender as células com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) e filtrar a suspensão através de um filtro de 100 µm.
  9. Adicionar 50 µ l de solução de ácido acético 3% / azul de metileno (para lise de células vermelhas do sangue) de 50 µ l de suspensão de células, misturar a solução e usar 10 µ l para contar as células. Execute célula contando com um hemocytometer. Então as células em uma densidade de 40.000 células/cm2 em meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 30% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) da placa.
  10. Incube as células a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO2 por 24 h.
  11. Após a incubação, lavar as células com fosfato quente (37 ° C) tampão salino (PBS) para remover detritos celulares e substituir os meios de comunicação com meio de cultura FBS 10% com recém adicionaram ácido ascórbico-2-fosfato (25 µ g/mL) e crescimento do fibroblasto recombinante humana fator 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. Subcultura ASCs na confluência de 90% usando padrão solução de EDTA de tripsina 0,25% (3 mL para um balão de T175). Após 3-5 min, neutralize a solução de EDTA de tripsina 0,25% com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B).
    Nota: Flow cytometry análise usando marcadores de superfície comuns ASC e diferenciação de tri-linhagem ensaios foram realizados anteriormente e revelou que ASCs isolaram usando este protocolo exibido ASC características específicas21,22.
  13. Lavar as células com 10 mL de meio de cultura (LG-DMEM suplementado com 10% FBS, 50 µ g/mL gentamicina e 1,5 µ g/mL ampothericin B) para um balão de T175 e centrifugar as células durante 8 min em x 250 g remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura. Conte as células com um hemocytometer.
  14. As células em frascos de cultura T175 em uma densidade de 8.000 células/cm2da placa.
  15. Congele os restantes ASCs em nitrogênio líquido, com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) em meio de cultura antes de nova utilização.

2. preparação de folha de ASC

  1. Pre-casaco pratos de cultura thermo-responsivos (3,5 cm de diâmetro) com 1 mL de FBS e, em seguida, coloque os pratos em uma incubadora a 37 ° C durante pelo menos 30 minutos antes da semeadura de célula.
  2. Trypsinize ASCs usando a solução padrão de EDTA de tripsina 0,25% para 3-5 min (3 mL para um frasco de cultura T175). Se houver qualquer aglomerados de células após tripsinização, filtre as células através de um filtro de 100 µm antes da contagem.
  3. Neutralizar a solução de tripsina com LG-DMEM suplementado com 10% FBS (10 mL para um balão de T175) e centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 8 min em x 250 g. remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de DMEM-LG suplementado com 10% FBS.
  4. Após o revestimento os pratos de cultura thermo-responsivo com FBS, mover os pratos de incubadora para uma placa de aquecimento a 37 ° C e remover FBS do prato.
  5. Sementes ASCs em 400.000 células/cm2 (no total, 3,52 × 106 células diluídas em 2 mL de meio de cultura por prato).
  6. Cuidadosamente, distribua as células mais uniformemente possível balançando suavemente o prato.
  7. Folhas ASC cultura por 48 h a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO2.
    Nota: Tente minimizar a abrir a porta de incubadora após semeadura ASCs para evitar quedas de temperatura que possam interferir com a formação de folha ASC ou causar descolamento prematuro de folhas ASC formados.

3. parcial colectomia e anastomose colorretal

  1. Induzir e manter ratos machos Wistar (pesando entre 250-350 g) com 1 L/min de isoflurano (inalação de 1.5-5%)/oxygen e injetar buprenorfina 0,05 mg/kg por via intramuscular.
  2. Uma vez que os animais estão sob anestesia geral, avalie a profundidade anestésica usando testes de reflexo. Aplica a pomada contendo vitamina A para os olhos para evitar ressecamento. Quando a anestesia é considerada suficiente para a cirurgia, assepticamente prepare o abdômen, raspar os cabelos e pulverizar a área cirúrgica duas vezes com etanol a 70%. Armar o abdômen com cortinas de papel estéril. Use uma técnica asséptica e manter o campo estéril durante todo o ato cirúrgico.
  3. Fazer uma incisão abdominal de 5 cm, com um tamanho de lâmina cirúrgica estéril 10 e estender a incisão com uma tesoura de Metzenbaum. Identificar e exteriorize o cólon e embalar o cólon do restante da cavidade abdominal com solução Salinas gazes umedecidas. Identificar o meio certo e deixou as artérias cólica no mesentério, sem rodeios dissecar ao redor de cada vaso utilizando mosquito de Halsted e ligar cada nave individual com seda trançada não absorvível 4/0.
  4. Isole o segmento do cólon entre 1,0 cm aborally ao ceco e 0,5 cm acima da artéria mesentérica caudal. Transecto através do cólon saudável com uma tesoura de Metzenbaum. Após a ressecção do segmento do cólon, unir as extremidades proximais e distais do cólon introduzindo dois cotonetes longos trans-anal através do cólon distal e em seguida na extremidade proximal do cólon.
  5. Usando um microscópio cirúrgico, crie uma anastomose to-end insuficientemente suturada invertendo-se uma camada suturar usando 5 suturas interrompidas (poliamida monofilamento não absorvível 8/0). Coloque as suturas interrompidas através de todas as camadas da parede do cólon e posicione o extraluminally knots.
  6. Divida os ratos aleatoriamente em controle ou grupo de folha ASC.

4. ASC folha transplante

  1. Permitir que os pratos de cultura arrefecer à temperatura ambiente 40 min antes no vivo transplante, a fim de facilitar o desprendimento de folha ASC.
    Nota: Após o desprendimento, folhas ASC encolhem a aproximadamente 2 cm de diâmetro. Viabilidade de folha ASC permanece elevada pelo menos 3-6 h após o desprendimento de20.
  2. Retire do meio de cultura e substitui-lo com 1 mL de soro livre LG-DMEM.
  3. Delicadamente, pegue as bordas da folha ASC com Pinças atraumáticas e coloque o prato do lado da folha em cima da linha anastomótica de ASC.
  4. Cuidadosamente, para esticar o ASC folha cerca de 0,25 cm acima e abaixo da linha anastomótica usando as Pinças atraumáticas e envoltório da folha em torno do cólon. Levante o cólon até envoltório de folha de ASC em torno do lado dorsal.
    Nota: Folhas ASC espontaneamente aderirem à linha anastomótica, não há nenhuma necessidade de usar cola de tecido ou qualquer outro biomaterial. O grupo de controle não recebe qualquer tratamento adicional.
  5. Remover os cotonetes de algodão e trocar as luvas e instrumentos. Substitua o cólon no abdômen. Fechar o abdome-linea alba com uma camada de execução usando de Suturas absorvíveis trançado polyglycolic ácido 5/0. Suture subcutis e juntos em uma camada de execução suturas usando poliglicólico trançado absorvível ácido 5/0 a cútis.

5. acompanhamento e avaliação pós-operatório

  1. Imediatamente Re-hidratar os animais com uma injeção subcutânea de solução salina quente 5ml no pós-operatório. Coloque os animais sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal e monitorar os sinais vitais até animais recobrar a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
    Nota: Os animais que tinham sido submetidos a cirurgia não foram devolvidos para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente. Após a recuperação, permitem o livre acesso à água e comida de rato normal. Para alívio da dor pós-cirúrgica, administre a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea cada 6-8 h por 3 dias. Sem antibióticos foram administrados a qualquer momento neste estudo.
  2. Obter avaliações clínicas diárias de peso e bem-estar. No caso de uma pontuação muito baixa de bem-estar ou perda de peso severa, animais deveriam ser sacrificados por perda de sangue através de punção cardíaca enquanto ainda está sob anestesia.
  3. No dia 3 ou dia 7 de pós-operatório, anestesiar os ratos novamente com 1 L/min de isoflurano (inalação de 1.5-5%)/oxygen sem a buprenorfina e realizar uma re-laparotomia com uma incisão em forma de U. Verifique o abdómen para os sinais de peritonite, estenose, aderências fibrosas e a presença de abscessos. Marcar a severidade das adesões e abscesso no abdômen e na área anastomótica.
  4. Determine a pressão de rotura anastomótica, a insuflação de ar em um segmento fechado do cólon incluindo a anastomose. Grave a pressão do ar e o local da ruptura, quando o ar a primeiro fuga como estourando a pressão.
  5. Remover os dois pontos de cada animal sacrificado e consertar o corte segmento do cólon - contendo a anastomose colorretal - com formol 4% tamponado, seguindo por parafina incorporação e corte do cólon em 4 μm de seções espessas.
  6. Eutanásia dos animais enquanto sob anestesia diretamente após a colheita do segmento anastomose por perda de sangue através de punção cardíaca. Confirme a morte de animais com ausência de respiração, movimento e num piscar de olhos.
  7. Realize colorações histoquímicas como hematoxilina & eosina e Picro Sirius vermelho e colorações imuno-histoquímica com anticorpos contra mitocôndrias humanas, células endoteliais de rato (anti-CD34) e células do sistema imunológico (CD3 +, CD163 +).
  8. Digitalizar slides para análise computadorizada e comparar os grupos de animais.

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Representative Results

Um fluxograma deste estudo descrevendo tanto cultura folha ASC e o procedimento de ressecção do cólon e anastomose é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra a morfologia microscópica de folha ASC e a aparência macroscópica da folha ASC durante e após o desprendimento. A Figura 3 mostra os diferentes passos do destacamento de folha ASC e transplante de órgãos. A Figura 4 mostra a presença da folha na linha anastomótica e prevenção de vazamento de ASC 3 dias no pós-operatório.

O período de seguimento permitido para avaliação de anastomose colorretal. As avaliações diferentes são mostradas na tabela e figuras. Em comparação com animais controle, os grupos de animais transplantados mostraram menos frequente deiscência anastomótica e vazamento no 3 dia de pós-operatório e menos formação de abscesso frequente no 7º dia pós-operatório. Em comparação com animais controle, animais transplantados não desenvolveu adesões significativas ou formação de estenose. A tabela 1 mostra os achados macroscópicos no final do seguimento períodos em animais transplantados e não transplantados.

Figure 1
Figura 1: fluxograma do estudo. A) ASCs foram isoladas e expandiu-se antes da semeadura para pratos de cultura thermo-responsivo. ASCs foram semeadas em uma densidade de 400.000 células/cm2 e cultivados por 48 h antes do transplante. No dia do transplante, folha do ASC foram desanexados, permitindo que o prato de cultura thermo-responsivo arrefecer à temperatura ambiente por 30 min. B) esquema de procedimento cirúrgico; após a ligadura dos vasos de fornecimento é realizada uma colectomia parcial e anastomose colorretal. Uma folha ASC foi enrolada a anastomose no grupo folha ASC; a) o ceco, íleo b) terminal, c) ânus. A visão esquemática do procedimento cirúrgico foi parcialmente adaptado com permissão de Wu Z. et al. 24 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: folha ASC antes e depois do desprendimento. A) folha de ASC em pratos de cultura thermo-responsiva após 48 h de ampliação de 40 x cultura. Folhas ASC foram obtidas pelo cultivo ASCs em pratos de cultura comercial thermo-responsivo. B-C) folha ASC durante (B) e após descolamento (C). Quando os pratos de cultura thermo-responsivos foram autorizados a arrefecer à temperatura ambiente, a folha ASC espontaneamente retirado da superfície do prato como uma folha ASC intacta. O tratamento enzimático não era necessário. O tamanho da folha do ASC reduzido após o desprendimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: transplante de folha ASC. A) Descrição de orientação de folha ASC no prato cultura thermo-responsivo. Folha de orientação de ASC 26 B) após o transplante. O lado do prato da ASC folha foi colocado em cima da superfície serosas da linha anastomótica (linha anastomótica é indicado com cruzes). C) intra-operatória vistas das diferentes etapas da transplantação. Duas Pinças atraumáticas foram usadas para levantar a folha ASC e envolvê-la em torno da linha anastomótica. As setas brancas indicam local de folha ASC. As imagens de transplante foram parcialmente adaptadas com permissão de Sukho, P., et al. 20 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: avaliação macroscópica e histológica de anastomose colorretal. Capotinha) comparado ao grupo controle, observação macroscópica mostrou reduzida formação de escapamento e abscesso no pós-operatório dia 3 (A) e 7 (B), respectivamente. Setas brancas apontam na área anastomótica e setas pretas ponto folhas de ASC transplantado. Secções transversais C) representante do site da anastomose colorretal em animais transplantados corados com H & E. A estrutura da folha pode ser identificada no local da anastomose acima de 7 dias no pós-operatório. As imagens foram parcialmente adaptadas com a permissão de Sukho, P., et al. 20 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3º dia de pós-operatório 7º dia pós-operatório
Controle (%) Folha de ASC (%) p-valor Controle (%) Folha de ASC (%) p-valor
Peritonite 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Ruptura anastomótica 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Estenose 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Abscesso na anastomose 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Adesão na anastomose 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Abscesso em outro lugar 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Adesão em outro lugar 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Tabela 1: Achados macroscópicos no pós-operatório.

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Discussion

Escapamento anastomótica é o efeito adverso mais grave após a ressecção do cólon com uma anastomose primária. Técnicas ideais para impedir fugas e ruptura anastomótica ainda estão faltando. Aplicação local de uma matriz de biomateriais tem sido conduzida, com resultados variados25,26,27. O objetivo das terapias com células é facilitar o reparo do tecido por substituição de tecido ou a estimulação da cicatrização local através de secreção parácrina.

Neste modelo de rato, transplante de folha ASC foi tecnicamente bem sucedida. Avaliações clínicas e histológicas demonstraram a eficácia da folha do ASC na redução de vazamentos após a ressecção do cólon com anastomose primária.

O transplante de uma folha ASC para anastomose colorretal é uma nova abordagem em cirurgia colorretal. Neste estudo, pela primeira vez, uma folha de alta densidade de ASC foi transplantada. A escolha para ASCs entregado como uma camada de células baseou as vantagens anteriormente relatadas de célula folha tecnologia28,29 sobre as técnicas de transplante de célula convencional. Além disso, a escolha de ASCs baseou-se em vários estudos que demonstraram suas capacidades anti-inflamatórias e tróficas, especialmente no músculo cardíaco-pele-cura e11,12,19,32 .

Desprendimento e preparação de folha ASC podem ser desafiadoras. Em alguns doadores ASC, folhas ASC retirado prematuramente o prato de cultura em dobrada, impossibilitando sua utilização. Neste estudo, a causa exata para esse problema destes doadores específicos não foi identificada. Desde que um consumo elevado de meio de cultura foi notificado destes doadores, supunha-se que as variações individuais na taxa de proliferação podem desempenhar um papel importante. Revestimento de soro assistida na adesão de células para a superfície. Juntamente com cuidado distribuição das células na cultura do prato e minimizando a abertura da porta de incubadora após semeadura ASCs (evitando quedas de temperatura), menos o dobramento das folhas de ASC ocorreram. Desta forma, folhas ASC de todos os doadores com êxito foram transplantadas, confirmando a viabilidade da técnica.

No dia do transplante, a maioria das folhas ASC desanexado espontaneamente após permitir o prato de cultura thermo-responsivo arrefecer à temperatura ambiente. No entanto, um número limitado de folhas não totalmente desanexar. Agitação suave do prato de cultura ou rubor macio na borda usando uma pipeta eventualmente assistida em destacamentos completos.

Para bem sucedido transplante de folha ASC para anastomoses Colorretais, vários passos críticos precisam ser abordadas. Primeiro, o excesso de sangue no local da anastomose deve ser removido para garantir o contato entre a folha ASC e a superfície serosas. Em segundo lugar, o lado do prato de folha de ASC deve ser colocado na superfície serosas da anastomose. Postula-se que a função de folhas de célula após a colheita é mantida devido a preservação das proteínas de superfície celular e proteínas de junção de célula para célula. Além disso, a capacidade de folhas ASC espontaneamente aderir à superfície serosas em um curto período de tempo pode ser facilitada pela presença de ECM depositado que é produzido durante a cultura in vitro de19,20,21. Em terceiro lugar, o tamanho da folha o ASC e o diâmetro do cólon deve ser comparável ao permitir a cobertura completa do site da anastomose. Quando superfícies maiores precisam ser cobertos, pode ser considerado o uso de várias folhas.

Existem algumas limitações do presente protocolo para preparação de folha ASC e transplante de órgãos. Quando usando pratos de cultura thermo-responsivo para preparar a folha ASC, a temperatura estritamente deve ser mantida a 37 ° C durante todo o processo para evitar descolamento prematuro. Após o transplante, a taxa de sobrevivência de folha ASC é desconhecida. Apesar de experiências anteriores mostraram que ASCs eram viáveis aos 3 dias no pós-operatório, atividade mitocondrial destas ASCs foi diminuída em 7 dias no pós-operatório17. O efeito célula de sobrevivência taxa e a dose da transplante são importantes questões que precisam ser abordadas no futuro estudos. Viés do observador não podem ser completamente descartada desde a folha ASC pode ser identificada macroscopicamente e microscopicamente a avaliações pós-operatórias. Embora animais transplantados não mostrou mais pós-operatória formação de aderência em comparação para controlar animais17, a avaliação da anastomose colorretal pode ser prejudicada pela presença destas aderências intra-abdominais.

Uma vantagem desta técnica de aplicação é que é simples e fácil de executar. Com apenas uma pequena quantidade de prática e usando Pinças atraumáticas universal, cirurgiões intestinais devem ser capazes de envolver a folha ASC em torno a anastomose. Além disso, tempo de cirurgia não é grandemente afetado desde folhas ASC imediatamente aderem aos tecidos do hospedeiro. Além disso, quando usando folhas de ASC, nenhum biomaterial sintético permanece no organismo, minimizando o risco de uma reação de corpo estranho.

Transplantado ASCs organizados em folhas de célula demonstraram sua capacidade para reduzir o vazamento de anastomose colorretal. Tendo em conta estes promissores resultados, estudos futuros devem ser conduzidos para avaliar os efeitos a longo prazo para terapêutica e razões de segurança. Além disso, vários métodos têm sido descritos para modificar os efeitos terapêuticos de folhas ASC como induzindo a superexpressão de fator de crescimento endotelial vascular30. Esses métodos podem aumentar ainda mais o reparo do tecido usando folhas de ASC e devem ser considerados, no futuro, estudos.

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Disclosures

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que poderia ser interpretada como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Prof. Dr. S.E.R. Hovius, Dr. M.A.M. Mureau e todos os cirurgiões do departamento de cirurgia plástica para a coleção de tecido adiposo subcutâneo. P. Sukho é suportado por uma concessão do programa The Netherlands Fellowship (NFP-12/435), durante a realização do estudo. Y.M. Bastiaansen-Jenniskens é suportado por doações da Fundação holandesa de artrite (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57 (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26 (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38 (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19 (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9 (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. , 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20 (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36 (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91 (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11 (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95 (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28 (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46 (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3 (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. , (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15 (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13 (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15 (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21 (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. , http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50 (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6 (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8 (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11 (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).

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Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato
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Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, … More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

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