Summary
Aneuploidy fører til genomet ustabilitet, som til slutt produserer celle syklus-arrestert celler med komplekse karyotypes. Dette dokumentet gir en enkel og praktisk metode for å isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes som slutte å dele.
Abstract
Kromosom mis segregering fører til aneuploidy, en tilstand der cellene havn en ubalanserte Kromosom nummer. Flere linjer av bevisene indikerer sterkt at aneuploidy utløser genomet ustabilitet, til slutt generere celler med komplekse karyotypes som arrestere deres spredning. Isolering og karakterisering av celler skjuler komplekse karyotypes er avgjørende for å studere virkningen av en ubalanse Kromosom nummer på cellen fysiologi. Hittil har ingen metoder etablert pålitelig isolere slike aneuploid celler. Dette papiret gir en protokoll for berikelse og analyse av aneuploid celler komplekse karyotypes bruker standard, billig vev kultur teknikker. Denne protokollen kan brukes til å analysere flere funksjoner i aneuploid celler med komplekse karyotypes inkludert indusert senescence-assosiert sekretoriske fenotype, pro-inflammatoriske egenskaper, og evnen til å samhandle med immunceller. Fordi kreftceller havn ofte ubalanser i Kromosom nummer, er det avgjørende å dechiffrere hvordan aneuploidy påvirker celle fysiologi i normale celler, med det endelige mål å avdekke begge sin pro - og anti - tumorigenic effekter.
Introduction
Feil under kromosom segregering føre til aneuploidy, en tilstand preget av et kromosom tall som ikke er et multiplum av haploid supplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes utløser replikering stress som genererer ytterligere genomisk ustabilitet5,6,7,8,9,10, øker Karyotype kompleksitet, og til slutt fører til celle syklus arrestasjon av en subpopulasjon av celler10. Formålet med metoden som presenteres her er å generere atskilt slik en subpopulasjon fra sykling celler. Ved å bruke billig vev kultur teknikker, forenkler denne protokollen isolering og karakterisering av cellen syklus-arrestert aneuploid celler med komplekse karyotypes. Disse cellene kalles ArCK (arrestert med komplekse Karyotype) celler og deres euploid sykling kolleger som kontroller.
Denne protokollen er den første som opprettes for dette formålet og gir isolasjon og videre studier av ArCK linjer inkludert, men ikke begrenset til, deres indusert senescence og senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP), deres pro-inflammatoriske funksjoner og deres evne til å engasjere seg med immunceller. Metoden som presenteres her er utviklet i transformeringsinstruksjonene, udødeliggjort menneskelige celler, men ennå ikke er testet i kreft linjer. Noen transformert celler kan være ufølsom for celle syklus arrestasjon på grunn av undertrykkelse av ett eller flere baner; Derfor skal videre validering utføres i andre linjer.
Protocol
Kultur tilstand
RPE-1 hTERT celle linje ble kultivert i Dulbeccos endret Eagle Medium (Tabell for materiale) med 10% fosterets Bovine Serum, 2 mM L-glutamin og 100 U/ml penicillin/streptomycin. Cellene ble inkubert på 37 ° C med 5% CO2 i en fuktet miljø. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt utviklet ved hjelp av 10 cm retter og alle tekniske detaljer rapportert se dem retter. Hvis bruker forskjellige retter, skalere opp eller ned tilsvarende.
1. synkronisering av RPE-1 celler
- Bruk ferske tinte celler som ikke gjennomgått mer enn 15 passasjer for alle eksperimenter. På dag 1, tine og dispensere ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT celler i en 10 cm vev kultur parabol. Legg 8 mL av standard oppblomstringen medium og ruge over natten. Bestemme celle nummer ved hjelp av en standard celle telleren (for eksempel en hemocytometer).
Merk: Cellen tetthet refererer til vekst forhold av RPE-1 celler. Vekst forhold kan variere mellom forskjellige linjer; Vurder å justere dem tilsvarende. - På dag 2, synkronisere celler på G1/S grensen ved aspirating vanlig oppblomstringen medium og legge til 8 mL middels med 5 mM thymidine.
Merk: Thymidine konsentrasjon og lengden på behandling kan variere på tvers av forskjellige linjer. Det anbefales å utføre piloten eksperimenter for å finne de beste forholdene for den celle linjene skal testes. - Dag 3, 24 timer etter thymidine medium (trinn 1.2), slipp av thymidine av aspirating medium og vaske celler tre ganger med 1 x PBS. Legge til 8 mL av vanlige oppblomstringen medium og tilbake platene til inkubator.
2. generasjon av Aneuploid celler av innblanding med aktiviteten til mitotisk Kinase Mps1
- Dag 3, 6 h etter utgivelsen av thymidine (trinn 1.3, dette er ca 3-6t før celler angir mitose), Sug opp medium, vask en gang med 1 x PBS og erstatte med medium som inneholder 500 nM reversine (den Mps1 inhibitor).
Merk: RPE-1 celler angi mitose 9-12 h etter thymidine vask ut10,11. Men cellen syklus kinetics varierer blant forskjellige linjer. Derfor er det viktig å fastslå som kinetics i piloten eksperimenter ved å utføre celle syklus analyse av etablerte metoder (f.eksved å måle DNA innhold via FACS analyse). I tillegg kan optimale arbeider konsentrasjonen av Mps1 hemmer variere mellom linjer. Tidligere eksperimenter ved hjelp av RPE1 celler har vært vellykket med reversine på en arbeider konsentrasjon av 500 nM10,11,12. Det anbefales å utføre piloten eksperimenter for å bestemme optimale konsentrasjonen for cellen linjen skal testes. - På dag 4, 12 h etter reversine behandling (ca 6 h etter celler var i mitose), Sug opp reversine medium og vask celler tre ganger med 1 x PBS. Legge til 8 mL vanlige oppblomstringen medium til plate og tilbake celler til inkubator.
3. fjerning av Aneuploid sykling celler og anriking av ArCK befolkningen
- På dag 6, omtrent 72 h etter celler angir den første mitose (trinn 2.2; Dette er ca 66 h etter reversine vask, som tilsvarer ca 2-3 cellen sykluser), Sug opp medium, vask en gang med 1 x PBS og erstatte med medium som inneholder 300 nM nocodazole.
Merk: Siste arbeid har vist at RPE-1 celler skjuler aneuploid karyotypes genomically ustabil og arrestere deres spredning om 2-3 cellen sykluser etter den første feil mitose10. Men kan denne kinetics variere mellom forskjellige linjer. Derfor er det avgjørende å utføre piloten eksperimenter for å finne riktig tidspunkt for fjerning av aneuploid sykling celler. - På dag 7, 12 h etter nocodazole behandling, Sug opp middels og legge 3 mL 1 x PBS til platen. Riste av mitotisk cellene ved å tappe siden av tallerkenen. Rotere tallerkenen mellom hvert trykk tillate selv fjerning av mitotisk celler.
- For å sikre fullstendig fjerning av mitotisk celler, gjenta riste av prosessen for flere runder (3 - 5 ganger anbefalt), aspirating og legge 3 mL 1 x PBS mellom hver runde.
- Etter riste-off, forsiktig Sug opp væske som overholder lokket eller kanten av platen. Kort, sjekk platen under et mikroskop på 10 X forstørrelse. Kontroller at mitotisk cellene er observert. Hvis mer enn fem mitotisk celler er sett under 10 X mål, gjenta en ny runde med shake-off.
Merk: Mitotisk celler ville komme avrundet og kan være delvis frittliggende etter riste-off. Det er avgjørende å sikre fullstendig fjerning av mitotisk celler før du utsetter cellene til neste runde nocodazole behandling. Gjør det kan føre til mitotisk celledød og/eller føre til generering av tetraploid celler. - Etter siste riste-off, vask celler når med 5 mL 1 x PBS. Legg 8 mL medium som inneholder 330 nM nocodazole inn platen og ruge 12 h.
- Gjenta nocodazole behandling/riste-off (trinn 3.1-3,5) hver 12t til noen mitotisk celler er observert etter inkubasjon. Vanligvis anbefales 4-5 runder av behandling/riste-off.
Merk: Informasjonen her refererer til RPE-1 celler. Antall runder av behandling/riste-off kan variere mellom forskjellige linjer. For å unngå lengre og unødvendig eksponering for nocodazole er det avgjørende å nøye bestemme, i et pilotprosjekt, antall runder kreves for effektiv og fullstendig fjerning av aneuploid sykling celler. - Etter 4-5 runder av nocodazole behandling/riste-off (trinn 3.1-3.6), tilsett 10 mL av vanlige oppblomstringen medium og ruge. Lar celler hvile for 12-24 h før fremtidig manipulasjon eller analysen bruk.
Merk: Etter siste riste-off, celler igjen på platen er cellen syklus arrestert og som vist sist10, havn komplekse karyotypes. Disse cellene kalles ArCK (arrestert med komplekse Karyotype) celler. Det anbefales å utføre analyser på ArCK bestander innen en uke av isolasjon. - Eventuelt for å vurdere andelen arrestert celler med komplekse karyotypes, samle og telle celler fra hver riste-off som bruker en standard celle teller.
Figur 1: Total skjematisk av metoden som brukes til å generere og isolere aneuploid celler med komplekse karyotype (ArCK) og representative bilder. (A) skjematisk av ArCK celler generasjon og isolasjon. (B) representant bilder av RPE-1 hTERT celler i hvert trinn av behandlingen. Den siste panelet (uthevet i rødt) representerer isolert ArCK cellene. Skala bar 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. karakterisering av ArCK befolkningen
- Bekrefte vellykket isolering av ArCK befolkningen ved å utføre følgende analyser.
- Esler beta-galactosidase flekker (markør for senescence) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit (se tabell for materiale).
- Måle utskillelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, slik som CCL2, ved å bruke kommersielt tilgjengelige kits (se tabell for materiale).
- Bekreft økte nivåer av cellen syklus hemmere p53, p21, p16 ved Western Blot.
Merk: Riktig bestemme disse analyser, ArCK bestander skal sammenlignes både euploid og aneuploid sykling celler. Førstnevnte er lav passasje, vill-type RPE-1 hTERT celler eksponensielt voksende. Sistnevnte kan oppnås ved inducing kromosom mis segregering i RPE-1 hTERT og høste celler 72 h etter den første avvikende mitose. For å gjøre så, følg protokollen beskrevet ovenfor fra trinn 1.1 og høste celler rett før første nocodazole behandling (trinn 3.1).
- Utføre encellede sekvensering å vurdere karyotype arrestert cellene.
Merk: Encellede sekvensering er en veletablert metoden for å bestemme chromosomal og sub chromosomal en celle populasjon på enkeltcelle nivå13. Detaljerte fremgangsmåter for hvordan du utfører encellede sekvensering kan finnes andre steder10.
Representative Results
Denne metoden bruker en i vitro vev kultur system for å isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes som arrestere deres spredning. Denne befolkningen er referert til som ArCK (arrestert med komplekse Karyotypes) celler. Figur 1A viser oppsettet av eksperimentet. Vill-type sykling RPE-1 hTERT celler synkroniseres G1/S grensen til thymidine og behandlet med en Mps1 hemmer å indusere kromosom mis raseskille. Spindel gift nocodazole legges til cellene 72 h etter induksjon av kromosom mis raseskille. 12 h etter nocodazole behandling, aneuploid cellene fremdeles sprer angi mitose og er fanget i denne cellen syklus stadiet grunn innblanding microtubule polymerisasjon. Dette fanget celler er så lett fjernes ved forsiktig riste av. Riste av prosessen er gjentatt 3 - 5 ganger å sikre fullstendig fjerning av sykling celler. Figur 1B viser representant bilder av RPE-1 celler på hvert trinn i behandlingen.
ArCK cellene viser økte nivåer av cellen syklus hemmere, som p53, p21 og p16 sammenlignet med euploid og aneuploid sykling celler, som vist i figur 2A. I tillegg viser figur 2B positiv β-galactosidase farging i ArCK celler i forhold til euploid kontroll celler, en veletablert markør for mobilnettet senescence.
Figur 2: representant resultater utnytte ArCK celler. (A) Western blot vurdering celle syklus hemmer nivåer i euploid, aneuploid sykling og ArCK celler. Nivåene av p53 og p21 p16 ble fastsatt av western blot analyse. Utgangen servert som en lasting. (B) β-galactosidase flekker vurdere nivået på senescence i ArCK celler. Senescence-assosiert β-galactosidase (β-Gal) aktivitet ble bestemt i euploid celler og ArCK celler. Skala bar 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne celle syklus arrestasjon er et fremtredende trekk ved aneuploid celler med komplekse karyotypes, som vist av representative karyotype analyse fra encellede sekvensering i Figur 3, der ArCK cellene viser flere tilfeldige kromosom gevinster og tap. Dette funnet er i full enighet med tidligere rapporter10.
Figur 3: representant encellede sekvensering av ArCK celler. Segmentering tomter viser karyotype med seks representant ArCK celler. Segmentering tomter vise kopi av alle kromosomer fra 1 x i forhold til en euploid referanse i loggen2 skala (wild type RPE-1 er en diploide celle linje av kvinnelige opprinnelse). Kromosom gevinster er uthevet i rødt, kromosom tap i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne romanen metoden å generere og berike for arrestert celler med komplekse karyotypes (ArCK) gjør studiet av celler som har flere kromosom gevinst eller tap og slutte å dele. Metoden oppsettet er utviklet for å lette isolering av ArCK celler i en rask og pålitelig måte.
Det viktigste trinnet i denne analysen er strengt kontrollere tidslinjen i behandling og, viktigst, fjerning av aneuploid sykling celler. For optimale resultater er tidspunktet for nocodazole behandling og riste-off spesielt viktig å sikre at sykling celler er fjernet fra platen, mens de fortsatt avrundet og mitotisk, hindre muligheten for mitotisk celledød eller forsinkelse i G1, potensielt skape en tetraploid befolkning. Det anbefales ikke at tidspunktet for riste av avviker mer enn to timer fra anbefalt 12-h nocodazole inkubasjon.
Fremtidige studier av ArCK celler har potensial til å lette en dypere forståelse av hvor komplekse karyotypes påvirke celle fysiologi. Spesielt viste en fersk studie at celler i immunsystemet kan samhandle med og utløser immunsystemet klarering av ArCK celler10. Metoden beskrevet her gir et utmerket utgangspunkt for videre karakterisering av ArCK celler, inkludert avklaring av molekylære mekanismer underliggende immun klarering i transformeringsinstruksjonene celler og studiet av hvordan kreftfremkallende transformasjon kan omgå denne overvåking mekanismen, en avgjørende spørsmålet i feltet14,15.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av Koch Institute støtte (kjernen) Grant P30-CA 14051 fra National Cancer Institute, den nasjonale institutter for helse Grant (CA206157-22 og GM118066) og Curt marmor Cancer Research Fund å Angelika Amon. Angelika Amon er også en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for biomedisinsk forskning. S. S. ble støttet av den amerikanske italienske Cancer Foundation (AICF), av et fellesskap i kreftforskning fra Marie Curie handlinger og italiensk Association for Cancer Research (AIRC), og en KI Quinquennial Cancer Research Fellowship. E.M. ble støttet av et fellesskap fra Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |
References
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754 (2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
