Summary
Aneuploidi fører til ustabilitet, genom, som i sidste ende producerer cellecyklus-anholdt celler med komplekse karyotypes. Dette papir giver en enkel og bekvem metode til at isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes, at ophøre med at opdele.
Abstract
Kromosom mis segregation fører til aneuploidi, en tilstand, hvor celler havnen en ubalanceret kromosom nummer. Flere linjer af beviser tyder kraftigt på at aneuploidi udløser genom ustabilitet, i sidste ende generere celler med komplekse karyotypes, at arresterer deres spredning. Isolering og karakterisering af celler husly komplekse karyotypes er afgørende for at studere virkningerne af en ubalanceret kromosom nummer på celle fysiologi. Til dato, er ingen metoder fastlagt pålideligt isolere sådanne aneuploid celler. Dette papir giver en protokol for berigelse og analyse af aneuploid celler komplekse karyotypes udnytte standard, billig vævskultur teknikker. Denne protokol kan bruges til at analysere flere funktioner af aneuploid celler med komplekse karyotypes herunder induceret gulne-associerede sekretoriske fænotype, pro-inflammatoriske egenskaber, og evnen til at interagere med immunceller. Fordi kræftcellerne ofte harbor ubalancer i Kromosomtal, er det afgørende at dechifrere, hvordan aneuploidi påvirker celle fysiologi i normale celler, med det endelige mål med afsløring både pro og anti tumorigenic virkninger.
Introduction
Fejl i kromosom segregation føre til aneuploidi, en tilstand karakteriseret ved en Kromosomtal, der ikke er en flere haploide supplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes udløser replikering stress, der genererer yderligere genomisk ustabilitet5,6,7,8,9,10, øger karyotype kompleksitet, og i sidste ende fører til celle cyklus anholdelse af en delpopulation af celler10. Formålet med metoden præsenteres her er at skabe og adskille sådan en delpopulation fra cykling celler. Ved at ansætte billig vævskultur teknikker, letter denne protokol isolering og karakterisering af cellecyklus-anholdt aneuploid celler med komplekse karyotypes. Disse celler kaldes ArCK (anholdt med komplekse Karyotype) celler og deres euploid cykling modparter som kontrol.
Denne protokol er den første til at blive etableret til dette formål og giver mulighed for isolation og yderligere undersøgelse af ArCK linjer, herunder, men ikke begrænset til, deres induceret gulne og gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP), deres pro-inflammatoriske funktioner, og deres evne til at engagere sig med immunceller. Metoden præsenteres her er udviklet i untransformed, udødeliggjort menneskelige celler, men endnu ikke er blevet testet i kræft linjer. Nogle transformerede celler kan være ufølsom over for celle cyklus anholdelse på grund af undertrykkelse af én eller flere veje; Derfor, yderligere validering skal udføres i andre cellelinjer.
Protocol
Kultur tilstand
ÅV-1 hTERT cellelinje var kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (Table of Materials) suppleret med 10% føtal bovint Serum, 2 mM L-glutamin og 100 U/ml penicillin/streptomycin. Celler blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2 i en fugtig miljø. Protokollen beskrevet nedenfor er blevet udviklet ved hjælp af 10 cm retter og alle tekniske detaljer rapporteret henvise til disse retter. Hvis du bruger forskellige retter, skalere op eller ned i overensstemmelse hermed.
1. synkronisering af ÅV-1 celler
- Brug frisk optøede celler, der ikke har gennemgået mere end 15 passager for alle eksperimenter. På dag 1, tø og dispensere ~2.5 - 5,0 x 105 ÅV-1 hTERT celler i en 10-cm vævskultur skål. Tilsæt 8 mL af standard vækstmediet og inkuberes natten over. Bestemme celle nummer ved hjælp af en standard celle counter (f.eks. en hemocytometer).
Bemærk: Celle tæthed refererer til vækstbetingelser af ÅV-1 celler. Vækstbetingelser kan variere blandt forskellige cellelinjer; Overvej at justere dem i overensstemmelse hermed. - På dag 2, synkronisere celler på G1/S grænsen ved sugning regelmæssig vækstmediet og tilføje 8 mL medium indeholdende 5 mM thymidine.
Bemærk: Thymidine koncentration og længde af behandlingen kan variere på tværs af forskellige cellelinjer. Det er tilrådeligt at udføre pilotforsøg for at bestemme de bedste betingelser for celle/kladdelinjerne skal testes. - På dag 3, 24 timer efter tilsætning thymidine medium (trin 1.2), frigive fra thymidine blok ved sugning medium og vaske cellerne tre gange med 1 x PBS. Tilføje 8 mL af regelmæssige vækstmediet og returnere plader til rugemaskine.
2. generation af Aneuploid celler ved indgreb i aktiviteten af mitotiske Kinase Mps1
- På dag 3, 6 h efter løsladelse fra thymidine blok (trin 1.3; Dette er omkring 3-6 h før celler Angiv mitose), Aspirér medium, vaske en gang med 1 x PBS og erstatte med medium indeholdende 500 nM reversine (Mps1-hæmmer).
Bemærk: ÅV-1 celler indtaste mitosen 9-12 h efter thymidine wash-out10,11. Men, celle cyklus kinetik varierer blandt forskellige cellelinjer. Derfor er det afgørende at bestemme disse kinetik i pilotforsøg udfører cellecyklus analyse af etablerede metoder (f.eks.ved måling af DNA-indhold via FACS-analyse). Derudover kan optimal arbejder koncentrationen af Mps1 inhibitor variere mellem cellelinjer. Tidligere eksperimenter ved hjælp af RPE1 celler har været succes at bruge reversine på en arbejdende koncentration af 500 nM10,11,12. Det er tilrådeligt at udføre pilotforsøg for at bestemme den optimale koncentration for cellelinie skal testes. - Dag 4, 12 h efter reversine behandling (omkring 6 h efter celler var i mitosen), Aspirér reversine medium og vaske cellerne tre gange med 1 x PBS. Tilføje 8 mL almindelig vækstmediet til pladen og returnere celler til rugemaskine.
3. fjernelse af Aneuploid cykling celler og berigelse af ArCK befolkning
- Dag 6, om 72 h efter celler indtaste den første mitosen (trin 2.2; Dette er omkring 66 h efter reversine wash-out, hvilket svarer til omkring 2-3 celle cyklusser), Aspirér medium, vaske en gang med 1 x PBS og erstatte med medium indeholdende 300 nM nocodazole.
Bemærk: Seneste arbejde har vist, at RPE-1 celler husly aneuploid karyotypes gentisk ustabile og arrestere deres spredning om 2-3 celle cyklusser efter den første defekt mitosen10. Men denne kinetik kan variere blandt forskellige cellelinjer. Derfor er det afgørende at udføre pilotforsøg for at bestemme den rette timing for fjernelse af aneuploid cykling celler. - På dag 7, 12 h efter nocodazole behandling, Aspirér medium og Tilføj 3 mL 1 x PBS til pladen. Ryste de mitotiske celler ved at trykke på siden af pladen. Rotere pladen mellem hver hanen så selv fjernelse af mitotiske celler.
- For at sikre fuldstændig fjernelse af mitotiske celler, skal du gentage processen shake-off for flere runder (3 - 5 gange anbefalet), sugning og tilsætning af 3 mL 1 x PBS mellem hver runde.
- Efter shake-off, forsigtigt Aspirér enhver væske, der levet op til låget eller kanten af pladen. Kort, check plade under et mikroskop ved 10 X forstørrelse. Sikre at få mitotiske celler overholdes. Hvis mere end fem mitotiske celler ses under 10 X mål, skal du gentage en anden runde af shake-off.
Bemærk: Mitotiske celler ville vises afrundet og kan være delvist aftagne efter shake-off. Det er afgørende at sikre en fuldstændig fjernelse af mitotiske celler før udsætter celler til den næste runde af nocodazole behandling. Modsat fald kan føre til mitotiske celledød og/eller resultere i generation af tetraploide celler. - Efter sidste shake-off, vaske cellerne en gang med 5 mL af 1 x PBS. Tilsæt 8 mL medium indeholdende 330 nM nocodazole i pladen og inkuberes i 12 timer.
- Gentag nocodazole behandling/shake-off (trin 3.1-3.5) hver 12 h indtil ingen mitotiske celler er observeret efter inkubation. Normalt anbefales 4-5 runder af behandling/shake-off.
Bemærk: Oplysningerne her henvise til RPE-1 celler. Antallet af runder af behandling/shake-off kan variere blandt forskellige cellelinjer. For at undgå langvarig og unødvendig eksponering for nocodazole er det afgørende at omhyggeligt i et pilotprojekt, bestemme antallet af runder kræves til effektiv og fuldstændig fjernelse af aneuploid cykling celler. - Efter 4-5 runder af nocodazole behandling/shake-off (trin 3.1-3.6), der tilsættes 10 mL af regelmæssige vækstmediet og der inkuberes. Tillad celler til at hvile i 12-24 timer før fremtidige manipulation eller assay brug.
Bemærk: Efter sidste shake-off, celler tilbage på pladen er cellecyklus anholdt og, som for nylig vist10, havnen komplekse karyotypes. Disse celler kaldes ArCK (anholdt med komplekse Karyotype) celler. Det er tilrådeligt at udføre assays ArCK populationer inden for en uge af isolation. - Valgfrit, for at vurdere procentdelen af anholdte celler med komplekse karyotypes, indsamle og tælle celler fra hver shake-off ved hjælp af en standard celle counter.
Fig. 1: samlede skematisk af metoden bruges til at generere og isolere aneuploid celler komplekse karyotype (ArCK) og repræsentative billeder. (A) skematisk af ArCK celler generation og isolation protokol. (B) repræsentative billeder af ÅV-1 hTERT celler i hver fase af behandlingen. Den sidste panel (beskrevet i rød) repræsenterer de isolerede ArCK celler. Skala bar 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. karakterisering af ArCK befolkning
- Bekræft vellykket isolation af ArCK befolkning ved at udføre følgende-assays.
- Æsler beta-galactosidase farvning (markør af gulne) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (se tabel af materialer).
- Måle udskillelsen af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom CCL2, ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (se tabel af materialer).
- Bekræfte øget niveauer af cellecyklus hæmmere p53, p21, p16 af Western Blot.
Bemærk: For at korrekt kontrollere disse assays, ArCK befolkninger bør sammenlignes med både euploid og aneuploid cykel celler. Førstnævnte er lav passage, wild-type ÅV-1 hTERT celler eksponentielt voksende. Sidstnævnte kan opnås ved at inducere kromosom mis adskillelse i ÅV-1 hTERT og høst celler 72 h efter den første afvigende mitosen. For at gøre det, skal du følge protokollen beskrevet ovenfor fra trin 1.1 og høst celler lige før den første nocodazole behandling (trin 3.1).
- Udføre encellede sekventering for at vurdere karyotype af de anholdte celler.
Bemærk: Encellede sekventering er en veletableret metode til at bestemme kromosomale og sub kromosomale ændringer på tværs af en celle population på enkelt celle niveau13. Detaljerede procedurer for hvordan man udfører encellede sekvensering kan findes andetsteds10.
Representative Results
Denne metode udnytter en in vitro- vævskultur system for at isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes, at arresterer deres spredning. Denne population er benævnt ArCK (anholdt med komplekse Karyotypes) celler. Figur 1A viser ordningen af eksperimentet. Wild-type cykel ÅV-1 hTERT celler er synkroniseret på grænsen G1/S med thymidine og behandlet med en Mps1-hæmmer til at fremkalde kromosom mis adskillelse. Spindel gift nocodazole føjes til celler 72 h efter induktion af kromosom mis adskillelse. 12 timer efter nocodazole behandling, de aneuploid celler, der stadig i stand til at formere sig Angiv mitosen og er fanget i denne celle cyklus fase på grund af interferens med mikrotubulus polymerisering. Disse fanget celler fjernes derefter let af blid shake-off. Shake-off-processen er gentaget 3 - 5 gange til at sikre fuldstændig fjernelse af cykling celler. Figur 1B viser de repræsentative billeder af ÅV-1 celler i hver fase af behandlingen.
ArCK celler viser øgede niveauer af cellecyklus hæmmere, såsom p53, p21 og p16 i forhold til euploid og aneuploid cykling celler, som vist i figur 2A. Derudover viser figur 2B positive β-galactosidase farvning i ArCK celler i forhold til euploid kontrol celler, en veletableret markør for cellulære ældning.
Figur 2: repræsentative resultater udnytter ArCK celler. (A) Western blot vurderingen af celle cyklus hæmmer niveauerne i euploid, aneuploid, cykling og ArCK celler. Niveauer af p53, p21 og p16 blev bestemt af western blot analyse. Aktin fungerede som en loading kontrol. (B) β-galactosidase farvning vurdere gulne i ArCK celler. Gulne-associerede β-galactosidase (β-Gal) aktivitet blev fastsat i euploid celler og ArCK celler. Skala bar 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Denne celle cyklus anholdelse er en fremtrædende del af aneuploid celler med komplekse karyotypes, som det fremgår af repræsentative karyotype analyse fra encellede sequencing i figur 3, hvor ArCK celler vise flere, tilfældige kromosom gevinster og tab. Denne konstatering er i fuld enighed med tidligere rapporter10.
Figur 3: repræsentant encellede sekventering af ArCK celler. Segmentering observationsområder viser karyotype af seks repræsentativt ArCK celler. Segmentering parceller Vis kopi antallet af alle kromosomer fra 1 til X i forhold til en euploid reference på en log2 skala (vilde type ÅV-1 er en diploide cellelinie af kvindelige oprindelse). Kromosom gevinster er fremhævet med rød, kromosom tab i grøn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne nye metode til at generere og berige for anholdt celler med komplekse karyotypes (ArCK) giver mulighed for undersøgelse af celler, der har flere kromosom gevinster eller tab og ophøre med at opdele. Opsætningen metode er udviklet til at lette isolationen af ArCK celler i en hurtig og pålidelig måde.
Det mest afgørende skridt i denne analyse er strengt kontrollere tidslinjen af narkotikabehandling, og vigtigst, fjernelse af aneuploid cykling celler. For optimale resultater er timingen af nocodazole behandling og shake-off af særlig betydning at sikre, at cykling celler er fjernet fra pladen, mens de er stadig afrundede og mitotiske, at forebygge risikoen for mitotiske celledød eller skred i G1, potentielt skabe en tetraploide befolkning. Det anbefales ikke, at timingen af shake-off afviger mere end to timer fra anbefalede 12-h nocodazole inkubation.
Fremtidige undersøgelser af ArCK celler har potentiale til at fremme en dybere forståelse af hvordan kompleks karyotypes påvirke celle fysiologi. Især vist en nylig undersøgelse, at celler i immunsystemet er i stand til at interagere med og udløser immunsystemet clearance af ArCK celler10. Metoden beskrevet her giver et udmærket udgangspunkt for yderligere karakterisering af ArCK celler, herunder afklaring af de molekylære mekanismer bag immun clearance i untransformed celler og studiet af hvordan mutationer transformation kan omgå denne overvågningsmekanisme, et afgørende spørgsmål i felt14,15.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist understøttet af Koch instituttet Support (kerne) Grant P30-CA 14051 fra National Cancer Institute, ved de nationale institutter for sundhed Grant (CA206157-22 og GM118066) og Curt marmor Cancer Research Fund til Angelika Amon. Angelika Amon er også en investigator af Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for biomedicinsk forskning. S. S. blev støttet af det amerikanske italienske Cancer Foundation (AICF), af et stipendium i kræftforskning fra Marie Curie-aktionerne og den italienske forening for kræft forskning (AIRC), og en KI femårige Cancer Research Fellowship. E.M. blev støttet af et stipendium fra Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |
References
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754 (2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
