Summary
Aneuploïdie leidt tot instabiliteit van het genoom, die uiteindelijk celcyclus-gearresteerd cellen met complexe karyotypes produceert. Dit witboek biedt een eenvoudige en handige methode om te isoleren van de aneuploid cellen met complexe karyotypes dat niet langer verdelen.
Abstract
Verkeerde segregatie van chromosomen leidt tot aneuploïdie, een aandoening waarbij cellen een onevenwichtige chromosoom nummer haven. Meerdere lijnen van bewijsmateriaal blijkt sterk dat aneuploïdie triggers genoom instabiliteit, uiteindelijk het genereren van cellen met complexe karyotypes die hun verspreiding te arresteren. Isolatie en karakterisatie van complexe karyotypes herbergen cellen zijn cruciaal voor het bestuderen van de impact van een onevenwichtige chromosoom nummer op celfysiologie. Tot op heden hebben geen methoden opgezet om op een betrouwbare manier isoleren dergelijke aneuploid cellen. Dit witboek biedt een protocol voor de verrijking en de analyse van aneuploid cellen met complexe karyotypes met behulp van standaard, goedkope weefselkweek technieken. Dit protocol kan worden gebruikt voor het analyseren van verschillende functies van aneuploid cellen met complexe karyotypes met inbegrip van hun geïnduceerde senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, pro-inflammatoire eigenschappen en vermogen tot interactie met immune cellen. Omdat kankercellen vaak onevenwichtigheden in het aantal chromosomen haven, is het van cruciaal belang om te ontcijferen hoe aneuploïdie invloed celfysiologie in normale cellen, met het uiteindelijke doel van het blootleggen van zowel de pro - en anti - tumorigenic effecten.
Introduction
Fouten in het proces van chromosoom segregatie leiden tot aneuploïdie, een conditie die gekarakteriseerd wordt door een aantal chromosomen thats niet een veelvoud van het haploïde aanvulling1,2,3,4. Aneuploid karyotypes trigger replicatie benadrukken dat verdere instabiliteit van het genoom5,genereert6,7,8,9,10, verhoogt karyotype complexiteit, en uiteindelijk leidt tot de arrestatie van de celcyclus van een subpopulatie van cellen10. Het doel van de methode die hier gepresenteerd is dergelijke een subpopulatie van fietsen cellen scheiden te genereren. Door gebruik te maken van goedkope weefselkweek technieken, vergemakkelijkt dit protocol de isolatie en de karakterisering van de celcyclus-gearresteerd aneuploid cellen met complexe karyotypes. Deze cellen zijn ArCK (gearresteerd met complexe Karyotype) cellen en hun tegenhangers euploïde fietsen als besturingselementen genoemd.
Dit protocol is de eerste die voor dit doel worden vastgesteld en zorgt voor de isolatie en verdere studie van ArCK lijnen met inbegrip van maar niet beperkt tot, hun geïnduceerde senescentie en het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP), hun pro-inflammatoire functies en hun vermogen om te gaan met immune cellen. De methode die hier gepresenteerd is ontwikkeld in de niet-getransformeerde, vereeuwigd menselijke cellen maar heeft nog niet getest in kanker lijnen. Sommige getransformeerde cellen mogelijk ongevoelig voor celcyclus arrestatie als gevolg van de onderdrukking van één of meerdere trajecten; dus moet verdere validatie worden uitgevoerd in andere cellijnen.
Protocol
Cultuur voorwaarde
RPE-1 hTERT-cellijn werd gekweekt in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (Tabel of Materials) aangevuld met 10% foetale runderserum, 2 mM L-glutamine en 100 U/ml penicilline/streptomycine. Cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO2 in een bevochtigde omgeving. Het protocol die hieronder beschreven is ontwikkeld met behulp van 10-cm schotels en alle technische details gemeld verwijzen naar die schotels. Als u verschillende gerechten, schaal omhoog of omlaag dienovereenkomstig.
1. synchronisatie van RPE-1 cellen
- Gebruik vers ontdooid cellen die niet meer dan 15 passages voor alle experimenten hebben ondergaan. Op dag 1, ontdooien en afzien van ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT cellen in een schaal 10-cm weefselkweek. Voeg 8 mL standaard groeimedium, en na een nacht bebroeden. Bepalen van het aantal cellen met behulp van een standaard cel counter (zoals een hemocytometer).
Opmerking: Celdichtheid verwijst naar groei omstandigheden van RPE-1 cellen. Groei voorwaarden kunnen variëren tussen verschillende cellijnen; kunt u overwegen hen dienovereenkomstig aan te passen. - Op dag 2, synchroniseren cellen aan de grens van de G1/S door regelmatige groeimedium zuigen en het toevoegen van 8 mL medium met 5 mM thymidine.
Opmerking: Thymidine concentratie en duur van behandeling kunnen variëren tussen verschillende cellijnen. Het is raadzaam voor het uitvoeren van proefprojecten om te bepalen van de beste voorwaarden voor de cel (s) te worden getest. - Op dag 3, 24 h na het toevoegen van thymidine medium (stap 1.2), vrijwaart van thymidine blok door zuigen medium en cellen drie keer met PBS 1 x wassen. Voeg 8 mL regelmatige groeimedium en platen terugkomen in de incubator.
2. productie van Aneuploid cellen door interferentie met de activiteit van de mitotische Kinase-Mps1
- Op dag 3, 6 uur na de release van thymidine blok (stap 1.3; dit is ongeveer 3-6 h voordat cellen mitose invoert), middellange gecombineerd, spoel één keer met 1 x PBS en vervangen met medium dat 500 nM reversine (de Mps1-remmer).
Opmerking: RPE-1 cellen invoeren mitose 9-12 h na thymidine wash-out10,11. Kinetiek van de celcyclus variëren echter onder verschillende cellijnen. Daarom is het cruciaal om te bepalen die kinetiek in proefprojecten door het uitvoeren van analyses van de celcyclus door gevestigde methodes (b.v., door het meten van de DNA-inhoud via FACS-analyse). Bovendien, kan de optimale concentratie van de werken van Mps1-remmer variëren tussen cellijnen. Eerdere experimenten met behulp van RPE1 cellen erin geslaagd met behulp van reversine met een concentratie van de werken van 500 nM10,-11,12. Het is raadzaam voor het uitvoeren van proefprojecten om te bepalen van de optimale concentratie voor de cellijn te beproeven. - Op dag 4, 12 uur na de reversine behandeling (ongeveer 6 h na cellen in de mitose waren), reversine medium gecombineerd en cellen drie keer met PBS 1 x wassen. 8 mL regelmatige groeimedium toevoegen aan de plaat en cellen terug naar de incubator.
3. verwijdering van Aneuploid fietsen cellen en verrijking van ArCK bevolking
- Op dag 6, ongeveer 72 uur nadat cellen de eerste mitose invoeren (stap 2.2; Dit is ongeveer 66 h na reversine wash-out, hetgeen overeenkomt met ongeveer 2-3 cel cycli), middellange gecombineerd, spoel één keer met 1 x PBS en vervangen met medium dat 300 nM nocodazole.
Opmerking: Recente werk heeft aangetoond dat RPE-1 cellen herbergen aneuploid karyotypes genomically onstabiel zijn en arresteren van hun verspreiding over 2-3 cel cycli na de eerste defecte mitose10. Deze kinetiek kan echter variëren tussen verschillende cellijnen. Het is daarom van cruciaal belang voor het uitvoeren van proefprojecten om te bepalen van de juiste timing voor de verwijdering van aneuploid fietsen cellen. - Op dag 7, 12 h na de nocodazole behandeling, gecombineerd middellange en voeg 3 mL 1 x PBS aan de plaat. De mitotische cellen afschudden door te tikken op de kant van de plaat. Draai de plaat tussen elke tap toe zelfs verwijdering van mitotische cellen.
- Herhaal het proces shake-off voor meerdere rondes (3 - 5 keer aanbevolen), zuigen en het toevoegen van 3 mL 1 x PBS tussen elke ronde om ervoor te zorgen volledige verwijdering van de mitotische cellen.
- Na schudden-off, zachtjes gecombineerd iedere vloeistof die aan het deksel of de rand van de plaat vastgehouden. Kort, controleren de plaat onder een microscoop op 10 X vergroting. Ervoor zorgen dat enkele mitotische cellen in acht worden genomen. Als meer dan vijf mitotische cellen worden gezien onder 10 X doelstelling, herhaal nog een ronde van schudden-off.
Opmerking: Mitotische cellen lijkt afgeronde en kunnen gedeeltelijk vrijstaand na schudden-off. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen de volledige verwijdering van de mitotische cellen voor het blootstellen van de cellen naar de volgende ronde van de nocodazole behandeling. Niet te doen kan leiden tot mitotische celdood en/of resulteren in het genereren van tetraploïde cellen. - Wassen na definitieve shake-off, cellen eenmaal met 5 mL 1 x PBS. Voeg 8 mL medium met 330 nM nocodazole in de plaat en incubeer gedurende 12 h.
- Herhaal de nocodazole behandeling/shake-off (maatregelen 3.1-3.5) elke 12 h geen mitotische cellen worden waargenomen na incubatie. Meestal, zijn 4-5 rondes van behandeling/shake-off aanbevolen.
Opmerking: De hier verstrekte informatie verwijzen naar RPE-1 cellen. Het aantal rondes van behandeling/shake-off kan variëren tussen verschillende cellijnen. Voorkom langdurig en onnodige blootstelling aan nocodazole is het van cruciaal belang voor het zorgvuldig bepalen, in een proefproject, het aantal rondes dat nodig is voor de efficiënte en volledige verwijdering van aneuploid fietsen cellen. - Na 4-5 rondes van nocodazole behandeling/shake-off (stappen 3.1-3.6), voeg 10 mL van regelmatige groeimedium en uit te broeden. Cellen om uit te rusten voor de 12-24 h vóór toekomstige manipulatie of assay gebruik toestaan.
Opmerking: Na definitieve shake-off, cellen nog op de plaat zijn celcyclus gearresteerd en, zoals onlangs10, haven complexe karyotypes. Deze cellen zijn cellen ArCK (gearresteerd met complexe Karyotype) genoemd. Het is raadzaam voor het uitvoeren van tests op ArCK populaties binnen een week na isolatie. - Optioneel, om te beoordelen het percentage aangehouden cellen met complexe karyotypes, verzamelen en cellen van elke shake-uitschakelen met behulp van een standaard cel teller tellen.
Figuur 1: algemeen schema van de methode die wordt gebruikt voor het genereren en isoleren van aneuploid cellen met complexe karyotype (ArCK) en representatieve beelden. (A) schematische van ArCK cellen generatie en isolatie protocol. (B) representatieve beelden van RPE-1 hTERT cellen in elk stadium van de behandeling. Het laatste deelvenster (aangegeven in rood) voorstelt geïsoleerde ArCK cellen. Schaal bar 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. karakterisering van ArCK bevolking
- Bevestig succesvolle Isolatievan ArCK bevolking door de volgende tests uit te voeren.
- Ezels beta-galactosidase kleuring (de markering van senescentie) met behulp van een commercieel beschikbare kit (zie tabel van materialen).
- Meet de afscheiding van pro-ontsteking cytokinen, zoals CCL2, door gebruik te maken van commercieel beschikbare kits (zie tabel van materialen).
- Bevestigen van de celcyclus remmers p53, p21, p16 door Western Blot wordt verbeterd.
Opmerking: Om naar behoren deze testen, ArCK populaties moeten worden vergeleken met zowel euploïde als aneuploid fietsen cellen. Eerstgenoemde is lage passage, wild-type RPE-1 hTERT cellen exponentieel groeit. De laatste kan worden verkregen door inducerende chromosoom verkeerde segregatie in RPE-1 hTERT en het oogsten van cellen 72 uur na de eerste aberrant mitose. Voor verrichten zodoende, volgen het protocol uit stap 1.1 en oogst cellen vlak voor de eerste nocodazole behandeling (stap 3.1) beschreven.
- Uitvoeren van eencellige rangschikkend om te beoordelen van het karyotype van de gearresteerde cellen.
Opmerking: Eencellige rangschikken is een gevestigde methode om te bepalen van chromosomale en sub chromosomale veranderingen over een celpopulatie in het eencellige niveau13. Gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van eencellige sequencing kunnen worden gevonden elders10.
Representative Results
Deze methode maakt gebruik van een systeem van weefselkweek in vitro te isoleren aneuploid cellen met complexe karyotypes die hun verspreiding te arresteren. Deze bevolking wordt aangeduid als ArCK (gearresteerd met complexe Karyotypes) cellen. Figuur 1A blijkt de opzet van het experiment. Wild-type fietsen RPE-1 hTERT cellen worden gesynchroniseerd op de grens van de G1/S met thymidine en behandeld met een Mps1-remmer voor het opwekken van verkeerde segregatie van chromosomen. De spindel vergif nocodazole wordt toegevoegd aan de cellen 72 h na de inductie van een verkeerde segregatie van chromosomen. 12 uur na de behandeling van de nocodazole, de aneuploid cellen die nog kunnen vermenigvuldigen Voer mitose en zitten in deze fase van de celcyclus als gevolg van interferentie met de microtubuli polymerisatie. Deze gevangen cellen zijn vervolgens gemakkelijk te verwijderen door zacht schudden-off. Het proces shake-off is herhaalde 3 - 5 keer om ervoor te zorgen volledige verwijdering van fietsen van cellen. Figuur 1B toont de representatieve beelden van RPE-1 cellen in elk stadium van de behandeling.
ArCK cellen weergeven celcyclus-remmers, zoals p53 p21 en p16 vergeleken met euploïde en aneuploid cellen, Fietsen, zoals weergegeven in figuur 2Awordt verbeterd. Bovendien, toont figuur 2B positieve β-galactosidase kleuring in ArCK cellen ten opzichte van euploïde cellen, een gevestigde marker voor cellulaire senescentie.
Figuur 2: representatieve resultaten met behulp van ArCK cellen. (A) Western blot beoordeling Inhibitor van de omwenteling van de celcyclus niveaus in euploïde, aneuploid, fietsen en ArCK cellen. De niveaus van p53, p21 en p16 werden vastgesteld door westelijke vlekkenanalyse. Actin diende als een besturingselement laden. (B) β-galactosidase kleuring beoordeling van het niveau van senescentie in ArCK cellen. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (β-Gal) activiteit werd vastgesteld in euploïde cellen en ArCK cellen. Schaal bar 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Deze arrestatie celcyclus is een opvallende kenmerk van aneuploid cellen met complexe karyotypes, zoals blijkt uit de analyse van de representatieve karyotype van eencellige sequencing in Figuur 3, waarin ArCK cellen meerdere weergeven, random chromosoom winsten en verliezen. Deze bevinding gaat volledig akkoord met vorige verslagen10.
Figuur 3: vertegenwoordiger eencellige sequentiebepaling van ArCK cellen. Segmentatie percelen tonen het karyotype van zes representatieve ArCK cellen. Segmentatie percelen Toon de exemplaaraantal van alle chromosomen van 1 tot en met X ten opzichte van een euploïde verwijzing op een2 de logschaal (wild type RPE-1 is een diploïde cellijn van vrouwelijke oorsprong). Chromosoom winsten worden gemarkeerd in rood, chromosoom verliezen in het groen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Deze nieuwe methode te genereren en te verrijken voor gearresteerde cellen met complexe karyotypes (ArCK) zorgt voor de studie van cellen die hebben meerdere chromosoom winsten of verliezen en niet langer te verdelen. De methode setup is ontworpen om de isolatie van ArCK cellen in een snelle en betrouwbare manier.
De meest kritische stap in deze test is streng controleren van de tijdlijn van medicamenteuze behandeling en, het belangrijkst, de verwijdering van aneuploid fietsen cellen. Voor een optimaal resultaat is de timing van de behandeling van de nocodazole en shake-off van bijzonder belang om ervoor te zorgen dat fietsen cellen worden verwijderd uit de plaat, terwijl ze nog steeds afgerond en mitotische, de mogelijkheid van mitotische celdood of ontsporing in de G1, voorkomen potentieel het creëren van een tetraploïde bevolking. Het is niet raadzaam dat de timing van shake-off meer dan twee uur rijden van de aanbevolen 12-h nocodazole-incubatie afwijkt.
Toekomstige studies over ArCK cellen het potentieel hebben om een dieper begrip van hoe complex karyotypes beïnvloeden celfysiologie. In het bijzonder, een recente studie aangetoond dat cellen van het immuunsysteem zijn in staat om te communiceren met en trigger immuun Goedkeuringvande ArCK10 cellen. De hier beschreven methode biedt een uitstekend uitgangspunt voor verdere karakterisering van ArCK cellen, met inbegrip van de verduidelijking van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuun mijnen in niet-getransformeerde cellen en de studie van hoe oncogene transformatie Dit mechanisme van toezicht, een cruciale vraag in het veld14,15kan omzeilen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Koch Instituut steun (klokhuis) Grant P30-CA 14051 uit het National Cancer Institute, door de nationale instituten van gezondheid Grant (CA206157-22 en GM118066) en Curt marmer Cancer Research Fund aan Angelika Amon. Angelika Amon is ook een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute en de Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. werd gesteund door de Amerikaanse Italiaanse Cancer Foundation (AICF), door een Fellowship in kankeronderzoek van Marie Curie-acties en de Italiaanse vereniging voor kanker onderzoek (AIRC), en door een KI vijfjaarlijkse Cancer Research Fellowship. E.M. werd gesteund door een beurs van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |
References
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754 (2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
